JPH03133396A - アンモニア分析用試薬組成物及びそれを含む一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は尿素窒素、アンモニア、クレアチニン等のアン
モニウムイオンを生成しうる被分析成分（アナライト）
を測定するための試薬系及びそれを含む一体型多層分析
要素に関するものである。

〔従来の技術〕

蛋白質代謝の中間体及び最終生成物である尿素窒素（Ｂ
ＵＮ）、アンモニア、クレアチニン等の測定は腎疾患の
診断、治療経過の判断等のために必要である。従来、こ
れらは湿式法で分析され、例えば尿素窒素は強酸性条件
下でテレフタルアルデヒド及びフェニレンジアミン誘導
体を直接反応させて発色を比色定量する方法（Ｄ、Ｊ、
Ｊｕｎｇ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、、２Ｌ　１１３６（１９７５））　、尿素に
ウレアーゼを作用させて生成したアンモニウムイオンを
ネスラー試薬を用いるかあるいはインドフェノール法で
比色定量する方法で定量されていた。インドフェノール
法はその後多くの研究者によって改良がなされている（
例えば、Ｈ，０ｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、Ｔｏｋｕｓｈｉ
ｍａＪ、Ｅｘｐｔｌ、Ｍｅｄ、、　１２．（１）、１ｌ
−２３（１９６５））　。この方法は強酸性条件下で反
応させるので装置が腐蝕しやすいという問題があり、感
度が低いこと及び測定に時間を要することも問題であっ
た。

酵素法についても、グルタミン酸脱水素酵素を利用して
ＮＡＤＰＨの減少量をＵ■吸収の測定して求める方法が
開発されている（Ａ、Ｍｏｎｄｚａｃ　ｅｔａｌ、　Ｊ
、Ｌａｂ、ＣＩｉＣｌｌｎｏ、、６６、５２６（１９６
５））。この方法も感度及び精度に問題があった。グル
タミン酸及びＡＴＰの存在下でグルタミン合成酵素を作
用させ、さらにピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキ
シダーゼを作用させて生成した過酸化水素をペルオキシ
ダーゼと４−アミノアンチピリンを利用して比色定置す
る方法も開発されている（特開昭６２−３８００号公報
）。

一方、簡便な操作で迅速に定量できる方法として乾式法
も知られている。乾式法に用いる分析器具の例として、
日本分析化学会編分析ライブリー３「臨床化学分析■含
窒素成分」第２版（東京化学同人、１９７９年発行）１
３〜１４頁、「臨床検査」第５巻（第６号）３８７〜３
９１頁（１９６１年発行）米国特許３０１１８７４号等
には、濾紙片に細帯状の試薬層（ウレアーゼとアルカリ
剤を含み、尿素からアンモニアガスを生成させる）、細
帯状の障壁物層、細帯状の指示下層（ｐｌ（指示薬ブロ
ムクレゾールグリーンを含む）がこの層に設けられたＢ
ＵＮ定量分析用試薬片が開示されている。特開昭５０−
９３４９４号公報には、濾紙片にｐＨ支支持ジブロムチ
モールブルー含浸し、ついでウレアーゼと親水性ポリマ
ーからなる障壁形成体との混合物をさらに含浸し、最後
にエチルセルロース半透膜を設けたＢＵＮ定量分析用試
験片が開示されている。また、特開昭５２−３４８８号
公報（特公昭５８−１９０６２号）には水平浸透性の透
明支持体の上に支持薬層、アンモニア薄層が均一に浸透
可能で液体状水およびアルカリ性妨害物が浸透不可能な
セルロースアセテートブチレート等の疎水性ポリマーの
均質（非孔性）薄層からなる障壁物層、ウレアーゼおよ
びアルカリ剤を含む試薬層、および多孔性展ＩＩｎ層を
この順に一体に積層してなるＢＵＮ定量定量分析体型多
層分析要素等が提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の乾式法においてはいずれもアンモニアガスを試験
片ないし分析要素内を拡散させており、二の拡散が定量
性に欠けるという問題があった。

本発明の目的は蛋白質代謝の中間体及び最終生成物であ
る尿素窒素（ＢＵＮ）　、タレアチニン、アンモニア等
を簡便な方法で高精度で定量できる分析用試薬組成物と
分析要素を提供することにある。

本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討を行った
結果、基本的には蛋白質代謝中間体や最終生成物の測定
に共通的に利用できるアンモニウムイオン検出法であっ
て発色反応に結びつけられる反応原理として、前述のグ
ルタミン合成酵素にピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸
オキシダーゼを組合せ、生成した過酸化水素を比色定置
する方法を開発した（特願平１−　　　　　　　号、同
号）。しかしながら、公知のピル ビン酸オキシダーゼは熱安定性に劣るという欠点が判明
した。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはさらに検討を進め、熱安定性の優
れたピルビン酸デヒドロゲナーゼ反応系をピルビン酸オ
キシダーゼの代わりに用いる手段を案出するに至り、こ
れによって前記目的を達成することができた。

かかる本発明は、少なくともＬ〜グルタミン合成酵素、
ＡＴＰ、ピルビン酸キナーゼ、フォスフオニノールピル
ビン酸、ピルビン酸脱水素酵素、ＦＡＤ、ＴＰＰ、２価
陽イオン、燐酸イオン、電子伝達剤及び電子受容性指示
薬からなる、体液中のアンモニアを又はアンモニア生成
基質を分析するためのアンモニア又はアンモニア生成基
質分析用試薬組成物及びそれを含む一体型多層分近要素
に関するものである。

本発明の試薬組成物及び分析要素においてアンモニウム
イオンを検出する反応系は下記のように進行する。

Ｓ グルタミン酸−１−ＡＴＰ　＋Ｎｌ＋４°＝グルタミン
＋ＡＤＰ±燐酸 Ｋ ＡＤＰ＋フォスフオニノールピルビン酸→Ａ　Ｔ　Ｐ−
←ピルビン酸 十ＣＯ２ 還元された電子受容体 ＧＳ：グルタミン合成酵素 ＰＫ：ピルビン酸キナーゼ ＰＤＨｎピルビン酸脱水酸酢水 素酵素ルタミン合成酵素（Ｅ　Ｃ６，３，１，２）はＢ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。

１ｉ　ＡＴＣＣ９６３７等）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等が産生じ、羊脳、
牛脳等からも分離しうる。Ｂ。

ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの産生ずる酵素
は耐熱性酵素であって市販されており、本発明の試薬組
成物及び分析要素に特に好ましい。

ピルビン酸キナーゼ［Ｅ　Ｃ２，７，１，４０）はＢａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ等が産生しうるほか、ラット、ウサギ、イヌ、ニ
ワトリ等の動物の筋肉、ブタの心臓などから取得しうる
。特に好ましいピルビン酸脱水素酵素として非ＮＡＤＨ
依存性のものを挙げることができる。

ピルビン酸脱水素酵素はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉなどの諸種の細菌から抽出され
た酵素や動物臓器から抽出された酵素を用いることがで
きる。

好ましいＰＤＨはＮＡＤＨ非依存性のものである。

諸種の生物起源のＰＤＨのうちでり、　ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉ起源の酵素（例えば東洋紡績■から市販されて
いる。）は好ましい酵素である。この酵素は分子量約１
６万、等電点ｐＨ４，４±０．１で、ＦＡＤ、ＴＰＰ等
の補酵素を必要とするが、燐酸をも基質とする点で従来
のピルビン酸デヒドロゲナーゼと異なる酵素である。Ｍ
ｉｃｈａｅｌ　ｉｓ定数はピルビン酸に対して４．４　
Ｘｌ０−’Ｍ　、燐酸に対して１．４　Ｘｌ０−２Ｍで
ある。また、４５°Ｃの５０ｍＭ　ｐＨ７，０燐酸緩衝
液中での活性値減少は極めて少なく、少なくとも３時間
にわたって実質的に活性値の減少は見られなかった。

この酵素に限らず一般にＰＤＨは熱安定性が良く、約５
０°Ｃの周囲温度（緩衝液中など）で活性値の減少は僅
少なものが多い。またいずれも市販されており、購入し
て用いることができる。一方、本発明の分析要素用とし
てはこれらの酵素は純品でなくともよ（、例えば微生物
の発酵液あるいはそれから沈澱等の手段で得た粗製酵素
を利用することもできる。

２価陽イオンは前記の共役酵素を活性化させるものであ
り、Ｍｇｇ＋、Ｍｎ２＋等を含む。ホスホエノールピル
ベートはピルビン酸キナーゼの基質であり、チアミンピ
ロ燐酸はピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性化に必要な
試薬成分である。アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）はＬ−グ
ルタミン合成酵素の基質であり、燐酸イオンはピルビン
酸脱水素反応において燐酸源として使用されるものであ
る。電子伝達剤と電子受容性指示薬からなっている。

電子伝達剤としてはＪ、　Ｆ、Ｂｕｒｄ、ｅｔ　ａ！、
Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ　　Ａｃｔａ、　　４６　．２３
　　（１９７３）　　、　Ｓ、　　Ｎａｋａｍｕｒａ、
ｅｔ　　ａｌＣｌｉｎ、　Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、　１０
１，３２１　（１９８０）等に記載の電子伝達剤やジア
ホラーゼ（ＥＣ１，６，４，３３等の酵素が使用できる
。例えば、■−メトキシー５−メチルフェナジニウムメ
チルサルフエート（１−メトキシＰＭＳ）　、メクロラ
スブルー（９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾニ
ウムクロリド）、５−メチルツェナジニウムメチルサル
フェート（ＰＭＳ）等である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉＩｕｓの産生ずるジアホラ
ーゼは５０’Ｃでも活性が低下しない程熱安定性が高く
、特に好ましい。

電子受容性Ｉ旨示薬としては還元性発色剤として公知の
テトラゾリウム塩類やレサズリン誘導体を使用できる。

テトラゾリウム塩類の例としては、３−（ｐ−インドフ
ェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル−５−フェニル−
２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−　（４
，５−ジメチル−２チアジル）−２，５−ジフェニル−
２Ｈ−テトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）、３．３’　
−（４，４“−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェ
ニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）（ネオ−ＴＢ）
、３．３’−（３，３°−ジメトキシ−４，４′ビフエ
ニレン）ビス（２−（ｐ−ニトロフェニル）５−フェニ
ル−２Ｈテトラヅリウムクロリド〕にドローＴＢ）、３
．３’　−（３，３’　　−ジメトキシ−４，４゛−ビ
フェニレン）ビス（２，５ジフェニル−２Ｈテトラゾリ
ウムクロリド）（ＴＢ）、３．３’　−（３，３’−ジ
メトキシ４．４”−ビフェニレン）ビスＣ２，５−ビス
（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈテトラゾリウムクロリド
）（ＴＮＴＢ）等々を挙げることができる。

アンモニアを生成する基質とアンモニアを生成させる酵
素としては、 Ｌ−アスパラギン：アスパラギナーゼ（ＥＣ３，５，１
，１）Ｌ−アスパラギン酸：アスパルターゼ（ＥＣ４，
３，１，１）アデニン：アデニンデアミナーゼ（ＥＣ３
，５，４，２）アデノシン：アデノシンデアミナーゼ（
ＥＣ３，５，４，４）アデノシンモノ燐酸：アデノシン
モノ燐酸デアミナーゼ（ＥＣ３，５，４，１７） 尿素：ウレアーゼ（ＥＣ３，５，１，３）グアニン：グ
アニンデアミナーゼ（ＥＣ３，５，４，３）グルタミン
：グルタミナーゼ（ＥＣ３，５，１、２）クレアチニン
：クレアチニンデイミナーゼ（ＣＣ３，５，４，２１） 笠の組合せが挙げられる。

本発明の一体型多層分析要素は少なくとも光透過性水平
透過性支持体、試薬層及び展開層がこの順に積層されて
いる。

光透過性水平透過性支持体は一般の多層分析要素に使用
されている公知のものを利用すればよい。

その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテ−１−プロピオネ
ート等）などのポリマーからなる厚さ約５０ｐｍから約
１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲
の透明支持体を用いることができる。支持体の表面には
必要により前記の諸特許明細書等により公知の下塗層ま
たは接着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等
との接着を強固にすることができる。

試薬層は前記の酵素及び試薬組成物の全部又は一部を含
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。

実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる親水性ポ
リマーバインダーは水吸収時の膨潤率が３０°Ｃで約１
５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約
１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーであ
る。その例として、ゼラチン（酸処理ゼラチン、脱イオ
ンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラチン、
ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロ
ース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあ
げることができる。実質的に非孔性の試薬層の乾燥厚さ
は約３μｍから約５０１！ｍ、好ましくは約５μ印から
約３０鐸の範囲であり、被覆量で約３ｇ／イから約５０
ｇ／ポ、好ましくは約５ｇ／ｒｒｆから約３０ｇ／ｒｒ
ｆの範囲である。試薬層は実質的に透明であることが好
ましい。

微多孔性で水浸透性の試薬層は後述する布地展開層と同
様の布地、特開昭５７−１４８２５０に記載の有機ポリ
マー繊維バルブ含有抄造紙、特開昭５７−１２５８４７
等に記載の繊維と親水性ポリマーの分散液を塗布して形
成した多孔性層等の繊維質多孔性層；特公昭５３−２１
６７７、米国特許３９９２１５８等に記載のメンブラン
フィルタ−層（プラッシュポリマー層）、ポリマーミク
ロビーズ等の微粒子が親水性ポリマーバインダーで点接
触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔性層、
特開昭５５−９０８５９に記載のポリマーミクロビーズ
が水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接触され
てなる連続空隙含有等方的多孔性層（三次元格子状粒状
構造物層）等の非繊維等方的多孔性層等の微多孔性層に
試薬組成物を含有させた層又は固体微粒子と親水性ポリ
マーバインダーから構成される微多孔性構造体に試薬組
成物を含有させた層である。微多孔性試薬層の乾燥時の
層厚は約７μｍから約２５０μｍ、好ましくは約１０μ
ｍから約２５０　μｍの範囲である。微多孔性試薬層の
上に展開層を設ける場合には、両層の間は特開昭６１−
４９５９　、特開昭６２−１３８７５６等に記載の多孔
性接着によるのが好ましい。

本発明の多層分析要素の１態様として、展開層に前述の
試薬組成物を含有させ、展開層の下に（必要におうじて
接着層を介して）吸水層又は検出層を設けた構成の多層
分析要素がある。別の１態様として、試薬層のポリマー
バインダーとして、水性液体試料の溶媒に溶解又はゾル
化するポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリビ
ニルピロリドン、カルホキシミチルセルロース、アルギ
ン酸ナトリウム、非硬化ゼラチン、寒天等を用いて試薬
層を形成し、その上に前記の微多孔性試薬層として用い
る微多孔性の薄シート状部材を多孔性検出層として積層
接着した構成の多層分析要素がある。

試薬層には公知のｐＨ緩衝剤組成物、高分子ｐＨ緩衝剤
、塩基性ポリマー、酸性ポリマー、高分子媒染剤等を含
有させることができる。

展開層としては特公昭５３−２１６７７号公報等に開示
のメンブランフィルタ（プラッシュポリマー層）、ポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５−９０８５９号公報に開示のポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ笠で水が膨潤し
ないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物Ｎ）等の非
繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３５６
号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に開示の織物
展開層、特願昭５９−７９１５８号明細書に開示の織物
展開層、特願昭５７−１４８２５０号公報に開示の有機
ポリマー繊維バルブを含む抄造紙からなる展開層等の繊
維質多孔性展開層等があげられる。

展開層は直接あるいは必要により接着層を介して積層さ
れる。

多層分析要素には前述の諸層のほかに必要に応じて特開
昭５１−４０１９１、特開昭５３−１３１０８９等に開
示の検出層または媒染層、特開昭５４−２９７００等に
開示のミグレーション阻止層、特開昭５１−４０１９１
等に開示の中間層、特開昭５６−８５４９に開示の試薬
含有微粒子分散層等を組み込んで設けることができる。

展開層、試薬層、吸水層、検出層、接着層等には界面活
性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を含有させるこ
とができる。ノニオン性界面活性剤の例として、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニル
フェノキシポリグリシドール、ポリオキシエチレンオレ
イルエーテル、ポリオキシエチレンソルビクンモノラウ
レート、オキチルグルコシド等がある。ノニオン性界面
活性剤を試薬層、吸水層又は検出層に含有させることに
より分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層、吸水層
又は検出層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また
展開層との液体接触が迅速かつ実質的に一様になる。ノ
ニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水
性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好
になる。ノニオン性界面活性剤の展開層における含有量
は展開層１ｒ′Ｉ′ｒ当り約１０■〜約３．０ｇ、好ま
しくは約１０■〜約２．０ｇの範囲である。

本発明の分析要素を尿素窒素分析用とする場合には例え
ばウレアーゼを、クレアチニン分析用とする場合にはク
レアチニンディミナーゼあるいはタレアチニンアミドヒ
ドロラーゼ、タレアチンアミジノヒドロラーゼ及びウレ
アーゼを試薬層、展開層あるいはその他の適当な層へ含
有せしめればよい。

本発明の一体型多層分析要素は」二連のような分析要素
において、ピルビン酸を基質とするが電子伝達剤と電子
受容性指示薬反応系に作用する反応生成物を与えない酵
素反応試薬組成物を含有するピルビン酸除去層を試薬層
の支持体と反対側に設けることができる。

このような酵素反応試薬組成物としては、フォスフオニ
ノールピルビン酸合成酵素〔Ｅ　Ｃ２，７，９゜２〕と
ＡＴＰの組合せ、ピルビン酸燐酸ジキナーゼ（ＥＣ２，
７，９，１）とＡＴＰと燐酸塩の組合せ、ピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（ＥＣ６，４，１，１）とＡＴＰと炭酸
塩の組合せ等を挙げることができる。

フォスフオニノールピルビン酸合成酵素とＡＴＰの組合
せを用いることによって２価のマンガン・ｆオンの存在
下で試料中のピルビン酸をフォスフオニノールピルビン
酸に変えることができ、ピルビン酸燐酸ジキナーゼとＡ
ＴＰと燐酸塩の組合せを用いることによってマグふシウ
ムイオンとアンモニウムイオン又はカリウムイオンの存
在下でピルビン酸をフォスフオニノールピルビン酸に変
えることができる。ピルビン酸カルボキシラーゼとＡＴ
Ｐと炭酸塩の組合せを用いることによってビオチンとマ
グネシウムイオンの存在下でピルビン酸をオキサロ酢酸
に変えることができる。ピルビン酸を除去する反応系は
逆反応の起こらないものあるいは起こりにくいものが好
ましい。

また、上記の酵素反応と共役した反応系をさらに導入し
て生成物をさらに別生成物に変えあるいは副生成物を反
応前の化合物に戻してやることも好ましい。例えば、ピ
ルビン酸デカルボキシレートでアセトアルデヒドと炭酸
に分解する反応は逆反応が起らない点で好ましい。前記
の共役反応系は数多く存在し、それらのなかから本発明
に適当なものを選択することができる。

酵素反応試薬組成物にはｐｌ＋緩衝剤、酵素活性化剤等
をさらに組合せることができる。

上記の酵素反応試薬組成物を含むピルビン酸除去層は試
薬層の支持体と反対側に設けて試料中のあるいは目的成
分から生じたアンモニアから生成されたピルビン酸を酵
素反応させる前に試料に予め含まれていたピルビン酸を
他の物質に変えるようにする。このピルビン酸除去層は
新たに独立して設けてもよく、展開層、光遮蔽層等に酵
素反応試薬組成物を含有させて兼用させることもできる
。

新たに設ける場合には例えば前述の試薬層で説明した親
水性ポリマーバインダー層又は微多孔性層を利用するこ
とができる。また、ピルビン酸除去層は１層に限られる
ものではなく、酵素反応試薬組成物の各成分を２層以上
に分けて含有せしめてもよい。

一方、グルタミン合成酵素、ピルビン酸キナーゼ、ピル
ビン酸脱水素酵素、電子伝達剤、電子受容性指示薬等も
成分の一部は試薬層以外の層に含有させてもよいが、そ
の場合であっても試料中のあるいは目的成分から生じた
アンモニアをピルビン酸に変える反応がピルビン酸除去
層によって試料中に予め含まれていたピルビン酸が除去
された後に起こるように配置する必要がある。

本発明の一体型多層分析要素における含有量はグルタミ
ン合成酵素が２００〜３万Ｉｌｌ／ｒ７ｆ程度、好まし
くは５００〜２万ＴＯ／ｒｎ程度、ピルビン酸キナーゼ
が２０００〜６万ＩＵ／Ｍ程度、好ましくは３０００〜
４万／ｎ（程度、ピルビン酸脱水素酵素が３０００〜１
０万■口／ｒＴｆ程度、好ましくは５０００〜５万ＩＵ
／　ｍ程度がｊ適当である。

本発明の分析要素においてはまたグルタミン合成酵素、
ピルビン酸キナーゼ又はアンモニア生成基質をアンモニ
アに変換する酵素の含有量の少なくとも一つを速度限定
量（ｒａｔｅ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ａｍｏｕｎｔ）とす
る。これはピルビン酸脱水素酵素の量（活性値）に対し
てグルタミン合成酵素、ピルビン酸キナーゼ又はアンモ
ニア生成基質をアンモニアに変換する酵素の量（活性値
）が前記の反応の進行する速度を支配するような量であ
ることを意味する。

速度限定量は試料が血漿または血清の場合には一般に、
グルタミン合成酵素は２００〜２万ＩＵ／ｒｄ程度、ピ
ルビン酸キナーゼは２００〜２万ＩＩ／ｒＴＩ程度そし
てアンモニア生成基質をアンモニアに変換する酵素は２
００〜２００００／　ｒｒｆ程度である。ピルビン酸脱
水素酵素は充分量あればよく、通常３０００〜１０万１
０／イ程度、好ましくは５０００〜５万ＩＩ／耐程度で
ある。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍ
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭５７−２８３３１、実公昭５６−１４２４５４、
特開昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特
表昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて
化学分析スライドとして用いることが、製造、包装、輸
送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的
によっては長いテープ状でカセットまたはマガジンに収
めて用いること、または小片を開口のあるカードに貼付
または収めて用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細３等に記載の
操作により液体試料中のアナライトの分析を実施できる
。例えば約５μｅから約３０μｅ、好ましくは８μｒか
ら１５μｅの範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液体
試料摘を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、約
２０’Ｃから約４０’Ｃの範囲の実質的に一定の温度で
、好ましくは３７°Ｃ近傍の実質的に一定の温度でイン
クベーションし、要素内の発色または変色を可視光又は
紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用い
て光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量
線を用（Ａで比色測定法の原理により液体試料中のアナ
ライトの含有量を求めることができる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３、特開昭６０−２
２０８６２、特開昭６１−２９４３６７、特開昭５８−
１６１８６７、特開昭６３−３１３０６３等に記載の化
学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析
を実施できる。

〔作用〕

本発明の分析要素で採用されているアンモニア測定用の
反応試薬系はアンモニウムイオンをグルタミン合成酵素
がグルタミン酸と反応させてグルタミンに変換し、その
際生成したＡＤＰをピルビン酸キナーゼがフォスフオニ
ノールピルビン酸ト反応させてピルビン酸を生成させる
。このピルビン酸をピルビン酸脱水素酵素がアセチル燐
酸に変えその際に電子受容性化合物が還元される。この
電子受容性化合物に電子伝達剤と電子受容性指示薬を用
いることによって比色定量するのである。

このような反応系では試料中に予め含まれているピルビ
ン酸も検出されて誤差の原因となる。そこで、このピル
ビン酸を試料中のあるいは目的成分から生じたアンモニ
アからピルビン酸が生成される前にピルビン酸除去用の
酵素反応試薬組成物で他の物質に変えて誤差を除いてい
る。例えば、この酵素反応試薬組成物にピルビン酸デカ
ルホキシラーゼ（ＥＣ４，１，１，１）を用いた場合に
はピルビン酸をオキサロ酢酸に変えてアンモニア測定分
析用の反応系で反応しないようにしている。また、グル
タミン合成酵素、ピルビン酸キナーゼあるいはアンモニ
ア生成基質をアンモニアに変換する酵素の含有量を規制
することによって被分析物の発色速度を規制し、この発
色速度を求めることによって試料中に含まれているピル
ビン酸による発色の影響を排除している。

本発明の好ましい実施態様は次の通りである。

実施態様１ （１）少なくともＬ−グルタミン合成酵素、ＡＴＰ、ピ
ルビン酸キナーゼ、フォスフオニノールピルビン酸、ピ
ルビン酸脱水素酵素、ＦＡＤ、ＴＰＰ。

２価陽イオン、燐酸イオン、電子伝達剤及び電子受容性
指示薬からなる電子受容性指示薬組成物、体液中のアン
モニアを又はアンモニア生成基質を分析するためのアン
モニア又はアンモニア生成基質分析用試薬組成物。

実施態様２ （２）体液中のアンモニア生成基質を分析するための一
体型多層分析要素であって水平透過性支持体、Ｌ−グル
タミン合成酵素、ＡＴＰ、ピルビン酸キナーゼ、フォス
フオニノールピルビン酸、ピルビン酸脱水素酵素、ＦＡ
Ｄ、、ＴＰＰ、２価陽イオン、燐酸イオン、電子伝達剤
及び電子受容性指示薬からなる電子受容性指示薬組成物
とを含む１以上の試５層、並びに多孔性展開層から構成
され、かつ検体中のアンモニア生成基質をアンモニアに
変換する酵素を試薬層又は展開層に律速量含有する一体
型多層分析要素。

（３）体液中のアンモニア又はアンモニア生成基質を分
析するための一体型多層分析要素であって水平透過性支
持体、Ｌ−グルタミン合成酵素、ＡＴＰ、ピルビン酸キ
ナーゼ、フォスフオニノールピルビン酸、ピルビン酸脱
水素酵素、ＦＡＤ、ＴＰＰ、２価陽イオン、燐酸イオン
、電子伝達剤及び電子受容性指示薬からなる電子受容性
指示薬組成物とを含む１以上の試薬層、検体が試薬層へ
到達する以前にアナライトを含んだ検体が一様に通過し
得る検体中の内因性ピルビン酸除去層並びに多孔性展開
層を有する一体型多層分析要素。

（４）　Ｌ　−グルタミン合成酵素、ピルビン酸キナー
ゼ及び該電子伝達剤がジアホラーゼであり、ジアホラー
ゼがいずれもバチルス・ステアロサーモフィルス由来の
耐熱性酵素であって、かつピルビン酸脱水素酵素がラク
トバチルス・デルブルエキイ由来の５０°Ｃ以下で熱的
に安定な酵素であることを（１）、（２）又は（３）に
記載の試薬組成物又は分析要素。

〔実施例〕

実施例１　〔アンモニア定量用一体型多層分析要素〕ゼ
ラチン下塗層を有する厚さ１８５μｍの無色透明ポリエ
チレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム支持体の上に
下記組成のアンモニア測定用試薬層を乾燥後の層厚が約
１５μｍになるようにして塗布し乾燥した。

アンモニア測定用試薬組成（１ボ当りの被覆量）Ｌ−グ
ルタミン酸　　　　　　　０．０４４　　ｇフォスフオ
ニノールピルビンＭＯ，７５ｇＡＴＰ　　　　　　　　
　　　　　２　　　　ｇ燐酸緩衝剤（ｐｌ＋７．０）　
　　　　０．２　　ｍｏｌこの試薬層の上に０．２ｇの
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均１０オ
キシ工チレン単位含有）、８ｇの二酸化チタン微粒子（
ルチル型、粒子径０．２５〜０，４０μｌ）および１ｇ
の脱イオンゼラチンの割合の水分散液を塗布し乾燥して
乾燥層厚が約５μｍの光遮蔽層を設けた。

次いで、この光遮蔽層の上に下記組成の内因性ピルビン
酸除去層を乾燥後の層厚が１０μｍになるようにして塗
布し乾燥した。

ピルビン酸除去層用試薬組成（１ポ当りの被覆量）チア
ミンピロ燐酸（ＴＰＰ）　　　６００　　ｍｇＦＡＤ　
　　　　　　　　　　　　４００　　ｍｇＭｇ”’　　
　　　　　　　　　　　１００　　ｍｇＮＴＢ　　　　
　　　　　　　　　　　　　８００　　　ｍｇ脱イオン
ゼラチン　　　　　　　１０　　ｇ燐酸（ｐＨ７，０燐
酸緩衝液）　　　　　　　０．２　　ｍｏｌ脱イオンゼ
ラチン　　　　　　　　　７ｇ更にこの内因性ピルビン
酸除去層上には、４ｇ（２，７ｇ／ｎｉ）の脱イオンゼ
ラチンと０　、２　ｇ　（１３５ｍｇ／　ｒｒｆ　）の
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均１０オ
キシ工チレン単位含有）を１００ｍｊ！の水に熔解させ
た溶液を塗布し乾燥して乾燥層厚約２μｍの接着層を設
けた。

一方、太さ約５００相当のＰＥＴ紡績糸からなる厚さ約
２５０−の水洗脱脂済トリコット編生地で、その片面を
６０秒グロー放電処理（１，６ｋＷ／ｒｒｆ　；酸素濃
度は減圧調整）した編物生地を用意した。

次いで、接着層を水でほぼ・均一に湿潤させ、その上に
前述のトリコント編物生地をグロー放電処理時の電極側
表面を接着層に向きあわせてかさね全体を加圧ローラー
間を通過させ接着層に均一にラミネートして編物展開層
を設けた。

次いで、劇物展開層の上から下記組成の馬物展開層含浸
処理用水溶液を１ｒｒｆ当り　１５０ｍｆｆ１の８１１
合で塗布し乾燥してアンモニア濃度定量用一体型多層分
析要素を調製した。

織物展開層含浸処理用水溶液の組成 水 １０００　　ｇ この分析要素を１５ｍｍ　Ｘ　１５ｍ＋ｎの正方形のチ
ップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に記載の
有機ポリマー製スライド枠に収めて性能評価のための測
定を行った。検体として、健康で正常な成人の血液をヘ
パリン採血遠心分離して得た血漿を用いた。

この血漿に塩化アンモニウム及びピルビン酸カリウムを
各々添加し、各々のアンモニア及びピルビン酸濃度を溶
液法による標準測定法で測定しておいた。反射光学濃度
値の測定は、血漿検体を１０μＬ点着し、３７“Ｃで６
分インクベーションし、透明支持体側から要素内の発色
を波長５４０　ｎｍで反射測光したところ、下記の結果
を得た。

実施例２〔タレアチニン定量用一体型多層分析要素］実
施例１と同様にして、透明支持体上に、クレアチニンデ
イミダーゼを速度限定量にした下記組成の第１試薬層、
第２試薬層の順に塗布し、さらに光遮蔽層、展開層を塗
布してタレアチニン分析用一体型多層分析要素を作製し
た。

第２試薬層 タレアチニンデイミダーゼ　　　１５００　　Ｕ／ｎ（
Ｌ−グルタミン酸 フォスフオニノールピルビン酸 ＴＰ 脱イオンゼラチン 第１試薬層 チアミンピロ燐酸 ＡＤ Ｍｇ” ＴＢ イミダゾール緩衝剤（ｐＨ７，０） ０．２１ ０．０８ ０．０３ ｍｏｌｅ／ボ ｍｏｌｅ／ボ ｍｏｌｅ／ボ ｇ／ボ ０．００１ｍｏｌｅ／　ｒｄ Ｏ，０９ｍｍｏｌｅ／　ｒｄ Ｏ，０５ｕ　１Ｗｏｌｅ／　ｎｊ ｏ、０８　ｍｏｌｅ／ｍ ０、１　　ｍｏｌｅ／　ｒｒｆ 脱イオンゼラチン　　　　　　　７　　　　ｇ／ボこの
ようにして調整されたタレアチニン定量用一体型多層分
析要素は、実施例１と同様にして打機ポリマー製スライ
ド枠に収めて性能評価のための測定を行った。検体とし
て、健康で正常な成人の血液をヘパリン採血し、遠心分
離して得た血漿を用いた。得られた血漿にクレアチニン
を添加し、下表のクレアチニン濃度の血漿を調製した。

血漿のクレアチニン濃度とピルビン酸濃度を溶液法によ
る標準測定法で測定しておいた。反射光学濃度値の測定
は、血漿検体を１０μＬ点着し、３７°Ｃでインクヘー
ションしながら、点着後２分後と５分後の時点で透明支
持体側から要素内の発色を波長５４０　ｎｎ＋で反射測
光した。得られた５分後と２分後の反射光学濃度値の差
（下表ではΔＯＤ、（５分−２分）と記す）を求めた。

なお、反射光学濃度値の測定は富士写真フィルム■製Ｆ
ＤＣ５０００アナライザーを用いて行った。

評価結果を下記に示す。

〔発明の効果］ 本発明の分析要素は熱安定性が良好であり、試料に含ま
れているピルビン酸の影古を排除してアンモニア及びそ
の測定試薬系を利用した尿素窒素、クレアチニン等を正
確に定量することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−グルタミン合成酵素、ピルビン酸キナーゼ、
   ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、及び電子受容性指示薬組
   成物を含むアンモニア分析試薬組成物
2. （２）水平透過性光透過性支持体の上に少なくとも１層
   の試薬層及び展開層がこの順に積層されている一体型多
   層分析要素であって、前記試薬層にＬ−グルタミン合成
   酵素、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナー
   ゼ、及び電子受容性指示組成物を含むアンモニア分析試
   薬組成物が含有されていることを特徴とするアンモニア
   又はアンモニア生成基質分析用一体型多層分析要素