JPH0313877B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明はガラクトオリゴ糖（ガラクトース残基
を含むオリゴ糖）の製造法に関し、さらに詳しく
はクリプトコツカス（Cryptococcus）属に属す
る微生物を利用してＯ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法に
関する。 ［従来の技術］ 近年、ガラクトオリゴ糖は腸内有用細菌である
ビフイズス菌の増殖因子として有効であると認め
られ、その製造法が種々検討されている。 ガラクトオリゴ糖を含む糖混合物の製造法とし
ては、ラクトースを原料として特定の微生物を培
養し、培養物中にガラクトオリゴ糖を蓄積せしめ
る直接発酵法や、ラクトースにβ−ガラクトシダ
ーゼを作用させる酵素法が知られている。 直接発酵法としては Penicillium ChrysogenumによるＯ−β−
Ｄ−Gal−（１→６）−Ｏ−β−Ｄ−Gal−（１→
４）−Ｄ−Glc（Tetrahedron、1960、vol.9、
p125〜129） Sporobolomyces SingularisによるＯ−β−
Ｄ−Gal−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−Gal−（１→
４）−Ｄ−Glc、Ｏ−β−Ｄ−Gal−（１→４）−
Ｏ−β−Ｄ−Gal−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−
Gal−（１→４）−Ｄ−Glc（Can.J.Chemistry、
1964、vol.42、p1341〜1344） Bacillus sp.No177−８によるガラクトース、
グルコース（β−Ｄ−結合）からなる三糖類
（特開昭56−115796） （以上、Galはガラクトース基、Glcはグルコ
ース残基を表わす） などの方法が報告されている。 一方、酵素法に関しては、ラクトースまたはラ
クトース含有物にアスペルギルス・オリゼの生産
したβ−ガラクトシダーゼを作用させることによ
つて得られる一般式Gal−（Gal）ｎ−Glc（式中、
Galはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、
ｎは１〜４の整数を表わす）で示されるオリゴ糖
や一般式Ｏ−β−Ｄ−Gal−（１→４）−［Ｏ−β
−Ｄ−Gal−（１→６）］−Ｄ−Glc（式中Galはガラ
クトース残基、Glcはグルコース残基）で示され
るオリゴ糖をビフイズス菌増殖因子として用いる
ことが提案されている（特公昭58−20266、特開
昭58−99497）。 ［発明が解決しようとする問題点］ 上記従来の直接発酵法では、オリゴ糖の収率が
低いか、培養条件が限定されているなど、実用化
の要請に応じられないものである。 また酵素法は、ラクトースにβ−ガラクトシダ
ーゼを作用させる時に起こるガラクトース基の転
移反応によつてガラクトオリゴ糖を生成させるも
のであるが、上記従来の酵素法では反応生成物中
にラクトースの分解生成物であるグルコースやガ
ラクトースなどの単糖がかなりの量含まれてお
り、ガラクトオリゴ糖のみを精製するのが困難で
あるとともに、上記従来法ではガラクトオリゴ糖
が10数種程度生成してくるので、単位物質として
のガラクトオリゴ糖を分離することは極めて難し
く、実用化する上で問題であつた。 本発明者らは、ビフイズス菌増殖因子として有
用であると考えられているガラクトオリゴ糖の生
産能の強い微生物を求めて、広く自然界より微生
物の検索を行つた結果、クリプトコツカス属に属
する微生物を炭素源としてラクトースを含有する
培地で培養することにより、培養物中に下記式 で表わされるＯ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グルコース（以下4′−ガラクトシ
ルラクトースまたは4′−GLという）を大量に蓄
積すること、およびこの微生物の菌体から得られ
るβ−ガラクトシダーゼとラクトースまたはその
含有物とを反応させることによりこのガラクトオ
リゴ糖を効率よく生産できることを見い出した
（特願昭59−108547（特開昭60−251896）、特願昭
60−76767（特開昭61−236790）、特願昭60−
248885（特開昭62−11685）。 しかしながら、培養物中にガラクトオリゴ糖を
蓄積する上記方法では、培養物中に上記ガラクト
オリゴ糖以外の多糖を副生し、上記ガラクトオリ
ゴ糖の精製にあたり、クロマト分離、限外口過な
どの操作が必要となり、実用上未だ問題を残して
いた。 また、β−ガラクトシダーゼを用いる方法にお
いても、ラクトースの分解生成物であるグルコー
スやガラクトース、その他受容体として存在して
いる糖にガラクトース基が転移するので、上記
（）式で表わされるガラクトオリゴ糖以外の転
移オリゴ糖が副生され、所望の上記ガラクトオリ
ゴ糖の収率増加に限界があつた。 本発明は上記の事実を考慮し、ビフイズス菌増
殖因子として有用である上記（）式で表わされ
るガラクトオリゴ糖の収率の良い製造法を提供す
ることを目的とする。 ［問題点を解決するための手段および作用］ 本発明者らは上記目的を達成するために鋭意研
究を重ねた結果、クリプトコツカス属に属する微
生物の菌体から得られるβ−ガラクトシダーゼと
ラクトースまたはその含有物とを酵素反応させる
際に、サツカロミセス（Saccharomyces）属、
シゾサツカロミセス（Shizosaccharomyces）
属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、
カンジダ（Candida）属、ロデロミセス
（Lodderomyces）属、ハンゼニアスポラ
（Hanseniaspora）属からなる群から選択され、
ラクトース及び4′−ガラクトシルラクトースを消
費せずグルコース及びガラクトースを消費する少
なくとも１種類の微生物を存在させることによ
り、目的生成物であるガラクトオリゴ糖が高収率
で得られることを見い出し本発明に至つた。 すなわち、本発明に係るガラクトオリゴ糖の製
造法は、サツカロミセス（Saccharomyces）属、
シゾサツカロミセス（Shizosaccharomyces）
属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、
カンジダ（Candida）属、ロデロミセス
（Lodderomyces）属、ハンゼニアスポラ
（Hanseniaspora）属からなる群から選択され、
ラクトース及び4′−ガラクトシルラクトースを消
費せずグルコース及びガラクトースを消費する少
なくとも１種類の微生物と、クリプトコツカス
（Cryptococcus）属に属する微生物から得られる
β−ガラクトシダーゼとを用いてラクトースまた
はその含有物から上記（）式で表わされるガラ
クトオリゴ糖を製造することを特徴とする。 これは、上記β−ガラクトシダーゼと併存させ
る微生物が、反応の基質であるラクトース、目的
生成物である4′−ガラクトシルラクトースは消費
せず、ラクトースの分解あるいは4′−ガラクトシ
ルラクトース生成時に生ずる単糖類（グルコー
ス、ガラクトース）のみをよく消費するために、
ラクトースのガラクトース残基を転移させる際の
受容体としてはラクトースのみとなり、4′−ガラ
クトシルラクトースの収率が向上し、それ以外の
転移オリゴ糖が副生し難くなるものと推察され
る。 以下本発明について詳細に説明する。 () 本発明に用いるβ−ガラクトシダーゼ (イ) 由来する微生物 本発明で用いるβ−ガラクトシダーゼはク
リプトコツカス属に属する微生物の菌体内で
生産される。該微生物の一例としてクリプト
コツカス・ローレンテイ・バラエテイ・ロー
レンテイ（Cryptococcus laurentii var.
laurentii）OKN−４（以下OKN−４という）
は、本発明者らにより栃木県那須郡の土壌中
より発見された菌種であり、工業技術院微生
物工業技術研究所へ微工研菌寄第7629号とし
て寄託されている。 OKN−４は次の菌学的性質を有する。 なお、以下に記載の菌学的諸性質の試験
は、 J.Lodder；The Yeast（1970） 飯塚広、後藤昭二；酵母の分類同定法
（1969） 長谷川武治；微生物の分類と同定
（1975） に準拠し、また分類方法はJ.Lodder；The
Yeast（1970）に準拠して行なつた。 ［OKN−４の菌学的性質］ (a) 各培地における生育状態 MY液体培地：25℃３日間培養で、細胞
の形態は球、楕円形、伸長形 大きさは（3.0〜5.3）×（4.0〜5.3）μ 多極出芽、islet状の皮膜形成 培地はにごり沈澱を形成 MY寒天培地：25℃１か月培養で、コロ
ニーは淡いオレンジ色から黄褐色光沢があ
り、軟質で、粘稠である。 スライド培養：ポテト・デキストローズ
培地で菌糸、偽菌糸は形成しない。 (b) 子のう胞子の形成： 通常の胞子形成培地上では認められない。 (c) 射出胞子の形成： MY寒天平面培養で認められない。 (d) 生理的性質 (1) 最適生育条件：PH６〜７、温度30℃ (2) 生育の範囲：PH３〜９、温度20〜40℃ (3) 硝酸塩の同化：同化しない (4) 脂肪の分解：分解しない (5) 尿素の分解：分解する (6) ゼラチンの液化：液化しない (7) カロチノイドの生成：生成しないか生
成してもごく僅か (8) 有機酸の生成：生成しない (9) デンプン様多糖類の生成：生成する (10) ビタミンの要求性：ビタミン欠培地で
生育しない (11) アルブチンの分解：分解する (12) シクロヘキシミド耐性：生育しない (13) 37℃での生育：生育する (14) 50％グルコース酵母エキス培地での
生育：生育しない (e) 各炭素源に対する同化性 (1) Ｄ−アラビノース ＋ (2) Ｌ−アラビノース ＋ (3) Ｄ−リボース ＋ (4) Ｄ−キシロース ＋ (5) Ｄ−グルコース ＋ (6) Ｄ−ガラクトース ＋ (7) Ｌ−ラムノース ＋ (8) Ｌ−ソルボース ＋ (9) 麦芽糖 ＋ (10) シヨ糖 ＋ (11) 乳糖 ＋ (12) メリビオース ＋ (13) セロビオース ＋ (14) トレハロース ＋ (15) ラフイノース ＋ (16) メレジトース ＋ (17) α−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ (18) 可溶性デンプン ± (19) イヌリン − (20) エタノール ＋ (21) アドニツト ＋ (22) エリトリツト ＋ (23) イノシツト ＋ (24) Ｄ−マンニツト ＋ (25) Ｄ−ソルビツト ＋ (26) ズルシツト ＋ (27) グリセリン ＋ (28) DL−乳酸塩 − (29) コハク酸塩 ＋ (30) クエン酸塩 − (31) サリシン ＋ （＋：よく同化する ±：同化が疑わしい
−：同化しない） なお、対類に対する発酵性はない。 以上の菌学的性質により本菌株はクリプト
コツカス・レーレンテイ・バラエテイ・ロー
レンテイに属するものと同定された。 本発明で使用するβ−ガラクトシダーゼが
由来する微生物としてはOKN−４はその一
例であり、その自然的及び人工的変異株は勿
論、クリプトコツカス属に属する微生物に由
来するβ−ガラクトシダーゼは総て本発明方
法において使用することができる。 上記微生物の培養は、通常用いられる固体
培地、液体培地のどちらを用いてもよいが液
体培地の方が好ましい。微生物の培養に使用
される培地は、炭素源としては微生物が同化
し得る炭素源を用いることが可能であるが、
好ましくはラクトース、または全乳、脱脂乳
のようにラクトースを一成分として含有する
物質、ソルビツト、ラクチツトなどである。
窒素源としては、酵母エキス、カゼイン、コ
ーンスチープリカー、大豆粉、綿実粉、小麦
グルテン、ペプトン、肉エキスなどの窒素化
合物や（NH₄）₂SO₄、NH₄Cl、尿素などの無
機窒素化合物を、無機塩類としてナトリウム
塩類、カリウム塩類、マグネシウム塩類、リ
ン酸塩類などを適宜に用いることができる。
さらにビタミン類や微量金属塩を追加して使
用菌の生育を良好ならしめることができる。 炭素源の濃度は１〜40重量％の範囲で、培
養温度は20〜40℃、培養液のPHは２〜９の範
囲内で、培養時間は１〜６日間程度である。
静置培養または通気撹拌、振とう培養のいず
れかの方法でも行なうことができる。 (ロ) β−ガラクトシダーゼ 上記微生物の菌体内で生産されたβ−ガラ
クトシダーゼは、該微生物の培養を終了した
培養液から遠心分離またはケイ藻土ロ過など
の分離手段によつて得られた微生物の菌体、
およびその菌体を凍結した凍結菌体、乾燥手
段によつて得られる乾燥菌体、菌体を物理的
手段によつて破壊した菌体残渣、その乾燥
物、そして菌体および菌体残渣から抽出手段
によつて抽出した水溶性物質、塩析法、透析
法、担体吸着法、電気泳動法、ゲルロ過法な
どの手段を用いて精製した精製酵素、あるい
はこれら酵素または菌体を公知の固定化手段
によつて固定化した固定化酵素、固定化菌
体、固定化増殖菌体として用いることができ
る。 () 併存させる微生物 上記β−ガラクトシダーゼと併存させる微生
物は、サツカロミセス（Saccharomyces）属、
シゾサツカロミセス（Shizosaccharomyces）
属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、
カンジダ（Candida）属、ロデロミセス
（Lodderomyces）属、ハンゼニアスポラ
（Hanseniaspora）属からなる群から選択され、
ラクトース及び4′−ガラクトシルラクトースを
消費せずグルコース及びガラクトースを消費す
る微生物であり、下記の保存菌株を用いること
ができる。 サツカロミセス・セレビシエ （Saccharomyces cerevisiae） IFO−0309 シゾサツカロミセス・マリデボランス Shizosaccharomyces malidevorans） IFO−1608 クリベロマイセス・ドロソフイラルム （Kluyveromyces drosophilarum） IFO−1012 カンジダ・ブラシカ （Candida brassicae） IFO−1664 ロデロミセス・エロンギスポルス （Lodderomyces elongisporus） IFO−1676 ハンゼニアスポラ・オスモフイラ （Hanseniaspora osmophila） IFO−1754 上記菌体は、予め固体培地、液体培地などで
培養した１種類以上の菌体の培養物をそのまま
用いることができるが、微生物の培養を終了し
た培養液から遠心分離またはケイ藻土ロ過など
の分離手段によつて得られた微生物の菌体、お
よびその菌体を凍結した凍結菌体、凍結乾燥手
段によつて得られる凍結乾燥菌体、菌体を公知
の固定化手段によつて固定化した固定化菌体、
固定化増殖菌体として用いてもよい。 () 反応条件 本発明に用いる上記β−ガラクトシダーゼお
よび菌体の量は、反応条件によつて適宜好まし
い量を加えることができる。 本発明に用いる反応温度およびPHは、本発明
に使用する微生物が生存できるか、若しくは微
生物の持つ酵素群が失活しない温度およびPHが
用いられる。通常、温度は25〜45℃、PHは2.5
〜7.0の範囲である。 反応時間は、反応条件によつて異なるが、６
時間から７日程度である。 ラクトースまたはラクトース含有物の濃度
は、ラクトース分として通常、１〜40重量％が
用いられる。 反応が終了した反応液は、必要に応じて遠心
分離またはケイ藻土ロ過等により固形分を除去
し、また必要に応じて公知の精製手段を用いて
さらに4′−ガラクトシルラクトースを精製す
る。 本発明方式によれば、4′−ガラクトシルラク
トースの収率が高く、また副生成物も極めて少
ないので、精製操作が極めて容易である。酵素
および菌体を固定化しておけば、分離精製操作
がさらに一段と容易なものとなる。 ［実施例］ 以下に、本発明の実施例を示す。 下記の実施例および比較例における糖類の定量
は、高速液体クロマトグラフイー（ポンプは日立
製作所製655型、検出器は昭和電工製SE−31、カ
ラムはLichrosorb−NH₂（5μｍ）CicaMerk製、
溶媒はアセトニトリル：水＝65：35を用い、流速
は0.7ml／min）を実施し、ピーク面積より求め
た。 実施例 １ β−ガラクトシダーゼの調製 (1) 菌体の生産 下記の組成の培地100mlを500ml容三角フラス
コに仕込み、120℃で20分間殺菌後冷却し、ク
リプトコツカス・ローレンテイ・バラエテイ・
ローレンテイOKN−４株を植菌し、30℃で１
日間振とう培養して種菌とした。 培地組成 ラクトース 50ｇ NH₄Cl ２ｇ KH₂PO₄ 0.8ｇ Na₂HPO₄・12H₂O 0.3ｇ MgSO₄・7H₂O 0.02ｇ 酵母エキス ３ｇ 水 １ PH 6.0 本培養は上記と同様の培養条件で種菌を2.5
ml接種し、30℃で２日間、毎分160回転で振と
う培養した。培養終了後、100mlの培養液から
遠心分離（5000rpm10分間）して菌体を集め、
蒸溜水にて５回洗浄後、水16mlに再懸濁した。
この菌体懸濁液の酵素活性はＯ−ニトロフエニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（以下
ONPGという。）を基質として0.6U／mlであつ
た。（この菌体を以下菌体Ａという。） なお、ONPGに対する力価は、５ｍＭの
ONPG1.0ml、マツクルベン（Macllvaine）緩
衝液（PH5.0）2.0ml、酵素溶液1.0mlを混合し、
40℃で30分間反応させた後、1.0Mの
Na₂CO₃1.0mlを添加して反応を停止させ、生成
したＯ−ニトロフエノールを波長420nｍにお
ける吸収より測定した。１分間に1μモルの
ONPGを分解する能力を１ユニツト（Ｕ）と
した。 (2) 酵素の精製 上記の方法で培養した菌体209ｇ（湿重量）
を蒸溜水でよく洗浄した後、160mlの酢酸エチ
ルと40mlの20ｍＭリン酸緩衝液（PH5.8）を加
え、よく懸濁し、４℃で24時間往復振とうし
た。得られた菌体を蒸溜水でよく洗浄した後、
蒸溜水に懸濁し、800mlの菌体懸濁液を得た。
これを氷水中でマントン・ゴーリング菌体破砕
機により破砕（8000psi10回通液）した後、遠
心分離（5000rpm10分間）して菌体破砕液を得
た。菌体破砕液中の細胞壁画分を蒸溜水でさら
に１回洗浄した後、凍結乾燥し、27.6ｇの凍結
乾燥品を得た。この細胞壁画分の酵素活性は、
ONPGを基質として10U／ｇであつた。 次に、上記細胞壁画分の凍結乾燥品27.6ｇを
690mlのマツクルベン緩衝液（PH6.0）で懸濁
し、ザイモリエース20−Ｔ（生化学工業製）を
0.01重量％となるように添加し、30℃で３時間
往復振とうし、酵素を可溶化させた。反応後、
得られた溶液を東洋瀘紙（商品名）No.２でロ過
し、ロ液を蒸溜水に対し１昼夜透析した。透析
後、凍結乾燥により4.0ｇの粗酵素品を得た。
この粗酵素の活性は、ONPGを基質として
25U／ｇであつた。 さらにこの粗酵素品を20ｍＭリン酸緩衝液
（PH5.8）340mlに溶解し、予め同緩衝液で平衡
化したDEAE−セフアデツクスＡ−50（50mmφ
×740mmＨ）カラムに吸着させ、次いで同緩衝
液（０〜1.0MNaClグラデイエント）にて70
ml／Hrの流速で溶出した。活性画分900mlを蒸
溜水に対し透析後、凍結乾燥し、1.75ｇの粗酵
素を得た。さらにこれを20ｍＭにリン酸緩衝液
（PH5.8）24mlで溶解し、氷水中で１時間放置し
て白色の沈澱物を除去し、上澄液24mlのうち４
mlを20ｍＭのリン酸緩衝液（PH5.8）で予め平
衡化したトーヨーパールHW−55Sのカラム
（22mmφ×750mmＨ）に注入して吸着させ、その
後、同緩衝液1.0ml／minで溶出した。この操
作を６回繰り返して合計108mlの活性画分を得
た後、これを蒸溜水にて透析し、凍結乾燥した
ところ、90mgの精製酵素を得た。この酵素はデ
イスク電気泳動法で単一のバンドを示した。精
製酵素の酵素活性はONPGを基質として
4.86U／mgであつた。（この精製酵素を以下精
製酵素Ｂという。） (3) 固定化菌体の調製 (1)で調製した菌体懸濁液16mlにアクリルアミ
ドモノマー3.0ｇ、Ｎ，N′−メチレンビスアク
リルアミド0.16ｇ、５重量％Ｎ，Ｎ，N′，
N′−テトラメチレンジアミン溶液２ml、2.5重
量％過硫酸カリウム溶液２mlを加え、０℃で20
分反応させ、ポリアクリルアミドゲルを調製し
た。これをカツターで細砕し、約5.0mm×1.0mm
φの顆粒に成型した後、純水でよく洗浄して凍
結乾燥したもの1.8ｇを固定化菌体として用い
た。この菌体のONPG活性は9.0U／ｇであつ
た。（この固定化菌体を以下固定化菌体Ｃとい
う。） 実施例 ２ 併存微生物の調製及び4′−GLの生産 (1) サツカロミセス・セレビシエの調製 サツカロミセス・セレビシエIFO−0309を
MY寒天斜面培地で30℃、３日間前培養した
後、500ml三角フラスコにグルコース10重量％、
酵母エキス0.4重量％、ポリペプトン0.4重量
％、KH₂PO₄0.1重量％から成る培地100mlを入
れ滅菌したものに一白金耳植菌し、30℃で48時
間、毎分160回転で振とう培養した。培養後遠
心分離機にて菌体を回収し、純水で２回洗浄
後、水20mlに懸濁した。 (2) 4′−GLの生産 実施例１で得られたβ−ガラクトシダーゼ群
（菌体Ａ、精製酵素Ｂ、固定化酵素Ｃ）を、10
重量％ラクトース（酵母エキス0.1重量％含有、
PH5.5）100ml当り、ONPG活性で4.5U加え、さ
らに上記(1)で調製したサツカロミセス・セレビ
シエIFO−0309の菌体懸濁液を、反応液100ml
当り１ml添加し、40℃で24時間および48時間反
応させた。反応後の糖含有量を高速液体クロマ
トグラフイー法にて定量した時の結果を第１表
に示した。単糖および転移オリゴ糖の生成は殆
どなく、また多糖の生成もみられず、高収率で
4′−GLが得られた。

【表】 併存微生物はサツカロミセス〓セレビシエ
を使用
実施例 ３ 併存固定化菌体の調製および4′−GLの生産 (1) サツカロミセス・セレビシエの固定化 実施例２の(1)で調製したサツカロミセス・セ
レビシエIFO−0309の菌体懸濁液20mlにアクリ
ルアミドモノマー3.0ｇ、Ｎ，N′−メチレンビ
スアクリルアミド0.16ｇ、５重量％Ｎ，Ｎ，
N′，N′−テトラメチレンジアミン溶液２ml、
2.5重量％過硫酸カリウム２mlを加え、０℃で
20分反応させポリアクリルアミドゲルを調製し
た。これをカツターて細砕し、約5.0mm×1.0mm
φの顆粒に成型した後、純水でよく洗浄した。
湿重量で27ｇの固定化菌体が得られた。 (2) 4′−GLの生産 実施例１で調製した固定化菌体Ｃ（ONPG活
性4.5U）をβ−ガラクトシダーゼとして、ま
た、サツカロミセス・セレビシエとしては上記
(1)の固定化菌体を反応液100ml当り1.5ｇ使用し
て、実施例２の(2)と同一条件で反応させ、4′−
GLを生産した。24時間目の糖含量は、単糖０
mg／ml、ラクトース59mg／ml、4′−GL30mg／
ml、転移オリゴ糖０mg／mlであつた。 実施例 ４ その他の微生物の調製および4′−GLの生産 (1) その他の微生物の調製 サツカロミセス・セレビシエIFO−0309の代
りに第２表に示す微生物を実施例２の(1)と同様
に培養した。 (2) 4′−GLの生産 β−ガラクトシダーゼとして実施例１で調製
した固定化菌体Ｃを用い、上記(1)で培養した微
生物を添加し、実施例２と同一条件で反応させ
た。24時間後の糖含有量を第２表に示した。い
ずれも、単糖および転移オリゴ糖の生成は少な
く、高収率で4′−GLが得られた。

【表】 比較例 β−ガラクトシダーゼ群のみによる4′−GLの
生産 実施例１で得られたβ−ガラクトシダーゼ群
を、10重量％ラクトース（酵母エキス0.1重量％
含有、PH5.5）100ml当り、ONPG活性で、4.5U加
え、40℃、毎分160回転の条件でロータリーシエ
ーカーで振とうしながら24時間または48時間反応
した。反応終了後の糖含量を高速液体クロマトグ
ラフイー法にて定量した結果を第３表に示した。

【表】 この結果と上記実施例２〜４とを比較すれば、
クリブトコツカス属に属する微生物から得られた
β−ガラクトシダーゼと上記併存菌体とを併用す
ることにより、4′−ガラクトシルラクトースの収
率および選択性を高めることができることが判
る。 ［発明の効果］ 以上説明した通り、本発明のガラクトオリゴ等
の製造法によれば、ビフイズス菌増殖因子として
有用である前記（）式で表わされるガラクトオ
リゴ糖を収率良く、高い選択率で得ることができ
る。したがつて、後に続く精製工程が極めて簡単
になり、実用化する上で多大な効果をもたらすも
のである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サツカロミセス（Saccharomyces）属、シ
   ゾサツカロミセス（Shizosaccharomyces）属、
   クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、カン
   ジダ（Candida）属、ロデロミセス
   （Lodderomyces）属、ハンゼニアスポラ
   （Hanseniaspora）属からなる群から選択され、
   ラクトース及び4′−ガラクトシルラクトースを消
   費せずグルコース及びガラクトースを消費する少
   なくとも１種類の微生物と、クリプトコツカス
   （Cryptococcus）属に属する微生物から得られる
   β−ガラクトシダーゼとを用いてラクトースまた
   はその含有物から下記式 で表わされるＯ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
   （１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
   （１→４）−Ｄ−グルコースを製造することを特徴
   とするガラクトオリゴ糖の製造法。 ２ クリプトコツカス属に属する微生物が、クリ
   プトコツカス・ローレンテイ・バラエテイ・ロー
   レンテイ（Cryptococcus laurentii var.
   laurentii）OKN−４である特許請求の範囲第１
   項に記載のガラクトオリゴ糖の製造法。 ３ サツカロミセス（Saccharomyces）属、シ
   ゾサツカロミセス（Shizosaccharomyces）属、
   クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、カン
   ジダ（Candida）属、ロデロミセス
   （Lodderomyces）属、ハンゼニアスポラ
   （Hanseniaspora）属からなる群から選択される
   少なくとも１種類の前記微生物が固定化されてい
   る特許請求の範囲第１項または第２項に記載のガ
   ラクトオリゴ糖の製造法。 ４ β−ガラクトシダーゼが固定化されている特
   許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載
   のガラクトオリゴ糖の製造法。