JPH062057B2 - 新規β−ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造法 - Google Patents
新規β−ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造法Info
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- JPH062057B2 JPH062057B2 JP60248885A JP24888585A JPH062057B2 JP H062057 B2 JPH062057 B2 JP H062057B2 JP 60248885 A JP60248885 A JP 60248885A JP 24888585 A JP24888585 A JP 24888585A JP H062057 B2 JPH062057 B2 JP H062057B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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- C12N1/145—Fungi isolates
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野】 本発明は新規β−ガラクトシダーゼＡ及びその製造法に
関し、さらに詳しくはクリプトコッカス（Ｃryptococcu
s）属に属する微生物によって生産される新規β−ガラ
クトシダーゼＡ及びその製造法に関する。
関し、さらに詳しくはクリプトコッカス（Ｃryptococcu
s）属に属する微生物によって生産される新規β−ガラ
クトシダーゼＡ及びその製造法に関する。
本発明において、「β−ガクトシダーゼＡ」とは、後述
する理化学的性質を有する酵素を指称するものとする。
する理化学的性質を有する酵素を指称するものとする。
［従来の技術］ β−ガラクトシダーゼは、β−Ｄ−ガラクトシド結合を
加水分解してＤ−ガラクトースを遊離する酵素で、動植
物中に広く存在している。微生物にもβ−ガラクトシダ
ーゼを生産するものがあり、これまで、酵母、カビ、細
菌などの酵素が広く研究されており、食品、医薬品用に
利用されている。また、この酵素は加水分解と同時にガ
ラクトシド結合を転移させる能力をも有しており、この
能力を利用してガラクトオリゴ糖（ガラクトース残基を
有するオリゴ糖）を製造することが知られている（−島
英治編「食品工業と酵素」第68頁、朝倉書店）。具体的
には、アスペルギルス・オリーゼ（Ａspergillus oryza
e）の生産したβ−ガラクトシダーゼでラクトースまた
はラクトース含有物質を処理して一般式Ｇal−（Ｇal）
ｎ−Ｇlc（但し式中Ｇalはガラクトース残基、Ｇlcはグ
ルコース残基、ｎは１〜４の整数を表わす）で示される
ガラクトオリゴ糖を製造する方法が知られている（特公
昭58−20266）。このガラクトオリゴ糖はビフィズス菌
増殖因子として注目されており、腸内の菌叢改善目的へ
の利用が期待されているものである。
加水分解してＤ−ガラクトースを遊離する酵素で、動植
物中に広く存在している。微生物にもβ−ガラクトシダ
ーゼを生産するものがあり、これまで、酵母、カビ、細
菌などの酵素が広く研究されており、食品、医薬品用に
利用されている。また、この酵素は加水分解と同時にガ
ラクトシド結合を転移させる能力をも有しており、この
能力を利用してガラクトオリゴ糖（ガラクトース残基を
有するオリゴ糖）を製造することが知られている（−島
英治編「食品工業と酵素」第68頁、朝倉書店）。具体的
には、アスペルギルス・オリーゼ（Ａspergillus oryza
e）の生産したβ−ガラクトシダーゼでラクトースまた
はラクトース含有物質を処理して一般式Ｇal−（Ｇal）
ｎ−Ｇlc（但し式中Ｇalはガラクトース残基、Ｇlcはグ
ルコース残基、ｎは１〜４の整数を表わす）で示される
ガラクトオリゴ糖を製造する方法が知られている（特公
昭58−20266）。このガラクトオリゴ糖はビフィズス菌
増殖因子として注目されており、腸内の菌叢改善目的へ
の利用が期待されているものである。
ガラクトオリゴ糖を製造するβ−ガラクトシダーゼとし
てはこのほかにもバシルス・サーキュランス（Ｂacillu
s circulans）のβ−ガラクトシダーゼが知られている
（中西一弘ら、「農化関西支部第325回例会報告」1982
年5.22） ［発明が解決しようとする問題点］ 上記のほかにも多くのβ−ガラクトシダーゼの転移作用
によるガラクトオリゴ糖の生成が報告されているが、そ
れらの多くは、ガラクトオリゴ糖の収量が低い、菌体外
酵素であるため温度、pH安定性に欠ける等、ガラクトオ
リゴ糖の大量生産に用いるには不適当なものであった。
てはこのほかにもバシルス・サーキュランス（Ｂacillu
s circulans）のβ−ガラクトシダーゼが知られている
（中西一弘ら、「農化関西支部第325回例会報告」1982
年5.22） ［発明が解決しようとする問題点］ 上記のほかにも多くのβ−ガラクトシダーゼの転移作用
によるガラクトオリゴ糖の生成が報告されているが、そ
れらの多くは、ガラクトオリゴ糖の収量が低い、菌体外
酵素であるため温度、pH安定性に欠ける等、ガラクトオ
リゴ糖の大量生産に用いるには不適当なものであった。
本発明は上記事実を考慮し、ガラクトオリゴ糖の生成に
適したβ−ガラクトシダーゼ、特にビフィズス菌増殖因
子として有用なガラクトオリゴ糖を収率よく生成するβ
−ガラクトシダーゼ及びその製造法を提供することを目
的とする。
適したβ−ガラクトシダーゼ、特にビフィズス菌増殖因
子として有用なガラクトオリゴ糖を収率よく生成するβ
−ガラクトシダーゼ及びその製造法を提供することを目
的とする。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は、ガラクトース基転移能を有する各種のβ
−ガラクトシダーゼについて鋭意研究した結果、クリプ
トコッカス（Ｃryptococcus）属に属する微生物が、β
−１，４ガラクトシド結合を有するガラクトオリゴ糖を
主に生成する転移作用の強いβ−ガラクトシダーゼＡを
菌体内に生産することを見い出し、本発明を完成した。
−ガラクトシダーゼについて鋭意研究した結果、クリプ
トコッカス（Ｃryptococcus）属に属する微生物が、β
−１，４ガラクトシド結合を有するガラクトオリゴ糖を
主に生成する転移作用の強いβ−ガラクトシダーゼＡを
菌体内に生産することを見い出し、本発明を完成した。
本発明のβ−ガラクトシダーゼＡは後述する理化学的性
質を有する新規なβ−ガラクトシダーゼであって、特に
ラクトースを基質とした場合に、分解して生成したガラ
クトース基を転移し、Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１
→４）−Ｄ−グルコースを主とするガラクトオリゴ糖を
生成する作用を有するものである。この新規β−ガラク
トシダーゼＡは、クリプトコッカス属に属するβ−ガラ
クトシダーゼＡ生産菌を培養し、該培養物からβ−ガラ
クトシダーゼＡを分離、採取することにより生産され
る。
質を有する新規なβ−ガラクトシダーゼであって、特に
ラクトースを基質とした場合に、分解して生成したガラ
クトース基を転移し、Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１
→４）−Ｄ−グルコースを主とするガラクトオリゴ糖を
生成する作用を有するものである。この新規β−ガラク
トシダーゼＡは、クリプトコッカス属に属するβ−ガラ
クトシダーゼＡ生産菌を培養し、該培養物からβ−ガラ
クトシダーゼＡを分離、採取することにより生産され
る。
以下、本発明について詳述する。
（Ｉ）本発明に用いる微生物 本発明で用いる微生物は、β−ガラクトシダーゼＡ生成
能を有するものであり、クリプトコッカス属に属する菌
種である。その一例としてクリプトコッカス・ローレン
ティ・バラエティ・ローレンティ（Ｃryptococcus laur
entii var. laurentii）ＯＫＮ−４（以下ＯＫＮ−とい
う）は、本発明者らにより栃木県那須郡の土壌中より発
見された菌種であり、工業技術院微生物工業技術研究所
へ微工研菌寄第7629号として寄託されている。
能を有するものであり、クリプトコッカス属に属する菌
種である。その一例としてクリプトコッカス・ローレン
ティ・バラエティ・ローレンティ（Ｃryptococcus laur
entii var. laurentii）ＯＫＮ−４（以下ＯＫＮ−とい
う）は、本発明者らにより栃木県那須郡の土壌中より発
見された菌種であり、工業技術院微生物工業技術研究所
へ微工研菌寄第7629号として寄託されている。
ＯＫＮ−４は次の菌学的性質を有する。
なお、以下に記載の菌学的諸性質の試験は、 Ｊ． Ｌodder；Ｔhe Ｙeast(1970) 飯塚広，後藤昭二；酵母の分類同定法（1969） 長谷川武治；微生物の分類と同定（1975） に準拠し、また分類方法はＪ．Ｌodder；Ｔhe Ｙeast
(1970)に準拠して行なった。
(1970)に準拠して行なった。
（イ）ＯＫＮ−４の菌学的性質 （ａ）各培地における生育状態 ＭＹ液体培地：25℃３日間培養で、細胞の形 態は球，楕円形，伸長形 大きさは（3.0〜5.3）× （4.0〜5.3）μ 多極出芽、islet状の皮膜形 成 培地はにごり沈澱を形成 ＭＹ寒天培地：25℃１か月間培養で、コロニー は淡いオレンジ色から黄褐色 光沢があり、軟質で、粘稠で ある。
スライド培養：ポテト・デキストローズ培地 で菌糸、偽菌糸は形成しない。
（ｂ）子のう胞子の形成： 通常の胞子形成培地上では認 められない。
（ｃ）射出胞子の形成： ＭＹ寒天平面培養で認められ ない。
（ｄ）生理的性質 (1)最適生育条件：pＨ 6〜7、温度30℃ (2)生育の範囲：pＨ 3〜9、温度20〜40℃ (3)硝酸塩の同化：同化しない (4)脂肪の分解：分解しない (5)尿素の分解：分解する (6)ゼラチンの液化：液化しない (7)カロチノイドの生成：生成しないか生成し てもごく僅か (8)有機酸の生成：生成しない (9)デンプン様多糖類の生成：生成する (10)ビタミンの要求性：ビタミン欠培地で生育 しない (11)アルブチンの分解：分解する (12)シクロヘキシミド耐性：生育しない (13)37℃での生育：生育する (14)50％グルコース酵母エキス培地での生育： 生育しない （ｅ）各炭素源に対する同化性 1)Ｄ−アラビノース ＋ 2)Ｌ−アラビノース ＋ 3)Ｄ−リボース ＋ 4)Ｄ−キシロース ＋ 5)Ｄ−グルコース ＋ 6)Ｄ−ガラクトース ＋ 7)Ｌ−ラムノース ＋ 8)Ｌ−ソルボース ＋ 9)麦芽糖 ＋ 10)シヨ糖 ＋ 11)乳糖 ＋ 12)メリビオース ＋ 13)セロビオース ＋ 14)トレハロース ＋ 15)ラフィノース ＋ 16)メレジトース ＋ 17)α−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ 18)可溶性デンプン ± 19)イヌリン − 20)エタノール ＋ 21)アドニット ＋ 22)エリトリット ＋ 23)イノシット ＋ 24)Ｄ−マンニット ＋ 25)Ｄ−ソルビット ＋ 26)ズルシット ＋ 27)グリセリン ＋ 28)ＤＬ−乳酸塩 − 29)コハク酸塩 ＋ 30)クエン酸塩 − 31)サリシン ＋ （＋：よく同化する ±：同化が疑わしい −：同化しない） なお、糖類に対する発酵性はない。
以上の菌学的性質により本菌株はクリプトコッカス・ロ
ーレンティ・バラエティ・ローレンティに属するものと
同定された。
ーレンティ・バラエティ・ローレンティに属するものと
同定された。
本発明における使用微生物としてはＯＫＮ−４はその一
例であり、その自然的及び人工的変異株は勿論、クリプ
トコッカス属に属する菌種でβ−ガラクトシダーゼＡ生
成能を有する微生物は総て本発明方法において使用する
ことができる。
例であり、その自然的及び人工的変異株は勿論、クリプ
トコッカス属に属する菌種でβ−ガラクトシダーゼＡ生
成能を有する微生物は総て本発明方法において使用する
ことができる。
（ロ）培養方法 上記微生物の培養は、通常用いられる固体培地、液体培
地のどちらを用いてもよいが液体培地の方が好ましい。
微生物の培養に使用される培地は、炭素源としては微生
物が同化し得る炭素源を用いることが可能であるが、好
ましくはラクトース、または全乳、脱脂乳のようにラク
トースを一成分として含有する物質、ソルビット、ラク
チットなどである。窒素源としては、酵母エキス、カゼ
イン、コーンスチープリカー、大豆粉、綿実粉、小麦グ
ルテン、ペプトン、肉エキスなどの窒素化合物や（ＮＨ
4）2ＳＯ4、ＮＨ4Ｃｌ、尿素などの無機窒素化合物を、
無機塩類としてナトリウム塩類、カリウム塩類、マグネ
シウム塩類、リン酸塩類などを適宜に用いることができ
る。さらにビタミン類や微量金属塩を追加して使用菌の
生育を良好ならしめることができる。
地のどちらを用いてもよいが液体培地の方が好ましい。
微生物の培養に使用される培地は、炭素源としては微生
物が同化し得る炭素源を用いることが可能であるが、好
ましくはラクトース、または全乳、脱脂乳のようにラク
トースを一成分として含有する物質、ソルビット、ラク
チットなどである。窒素源としては、酵母エキス、カゼ
イン、コーンスチープリカー、大豆粉、綿実粉、小麦グ
ルテン、ペプトン、肉エキスなどの窒素化合物や（ＮＨ
4）2ＳＯ4、ＮＨ4Ｃｌ、尿素などの無機窒素化合物を、
無機塩類としてナトリウム塩類、カリウム塩類、マグネ
シウム塩類、リン酸塩類などを適宜に用いることができ
る。さらにビタミン類や微量金属塩を追加して使用菌の
生育を良好ならしめることができる。
炭素源の濃度は１〜40重量％の範囲で、培養温度は20〜
40℃、培養液のpＨは２〜９の範囲内で、培養時間は１
〜６日間程度である。静置培養または通気撹拌、振とう
培養のいずれの方法でも行なうことができる。
40℃、培養液のpＨは２〜９の範囲内で、培養時間は１
〜６日間程度である。静置培養または通気撹拌、振とう
培養のいずれの方法でも行なうことができる。
（II）β−ガラクトシダーゼＡ β−ガラクトシダーゼＡは上記微生物の菌体内で生産さ
れ、該微生物の培養物から分離、採取する。培養物から
の分離手段としては公知の酵素精製方法を用いることが
できる。微生物の培養物を濾過、遠心分離して粗酵素と
して用いてもよく、また、塩析法、透析法、担体吸着
法、電気泳動法、ゲル濾過法などの精製手段を用いて精
製酵素として用いることもできる。
れ、該微生物の培養物から分離、採取する。培養物から
の分離手段としては公知の酵素精製方法を用いることが
できる。微生物の培養物を濾過、遠心分離して粗酵素と
して用いてもよく、また、塩析法、透析法、担体吸着
法、電気泳動法、ゲル濾過法などの精製手段を用いて精
製酵素として用いることもできる。
β−ガラクトシダーゼＡは以下の理化学的性質を有する
新規な酵素である。
新規な酵素である。
＜理化学的性質＞ (1)作用及び基質特異性 β−ガラクトシド結合を有するラクトース、Ｏ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（以下ＯＮＰ
Ｇという）などのβ−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に
作用し、そのβ−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解し
て、ガラクトースとグルコース、ガラクトースとＯ−ニ
トロフェノールなどに分解すると同時に、生成したＤ−
ガラクトース基を移転する。
フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（以下ＯＮＰ
Ｇという）などのβ−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に
作用し、そのβ−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解し
て、ガラクトースとグルコース、ガラクトースとＯ−ニ
トロフェノールなどに分解すると同時に、生成したＤ−
ガラクトース基を移転する。
ラクトースを基質とした場合に、生成したＤ−ガラクト
ース基を転移して、Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコースを主とするオリゴ糖を生成する。
ース基を転移して、Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコースを主とするオリゴ糖を生成する。
(2)至適pＨ及び安定pＨ範囲 ＯＮＰＧを基質として各pＨにおいて30℃で30分間反応
させた結果、第１図に示す通り、至適pＨはpＨ 4.0〜
5.0であった。また、ＯＮＰＧを基質として各pＨにおい
て30℃で60分間インキュベートした後の残存活性を測定
した結果、第２図に示す通り、pＨ 2.7〜9.3の範囲で9
0％以上の残存活性を示した。
させた結果、第１図に示す通り、至適pＨはpＨ 4.0〜
5.0であった。また、ＯＮＰＧを基質として各pＨにおい
て30℃で60分間インキュベートした後の残存活性を測定
した結果、第２図に示す通り、pＨ 2.7〜9.3の範囲で9
0％以上の残存活性を示した。
(3)力価の測定方法（ＯＮＰＧに対する力価） ５mＭのＯＮＰＧ 1.0ml、マックルベン（Ｍacllavin
e）緩衝液（pＨ 5.0）2.0ml、酵素溶液1.0 mlを混合
し、40℃で30分間反応させた後、1.0ＭＮａ2ＣＯ3 1.0
mlを添加して反応を停止させ、生成したＯ−ニトロフ
ェノールを波長420nmにおける吸収より測定した。１分
間に１μモルのラクトースを分解する能力を１ユニット
（Ｕ）とした。
e）緩衝液（pＨ 5.0）2.0ml、酵素溶液1.0 mlを混合
し、40℃で30分間反応させた後、1.0ＭＮａ2ＣＯ3 1.0
mlを添加して反応を停止させ、生成したＯ−ニトロフ
ェノールを波長420nmにおける吸収より測定した。１分
間に１μモルのラクトースを分解する能力を１ユニット
（Ｕ）とした。
(4)作用適温の範囲 ＯＮＰＧを基質として各温度においてpＨ 5.0で30分間
反応させた結果、第３図に示す通り、作用適温は50〜60
℃の範囲であった。
反応させた結果、第３図に示す通り、作用適温は50〜60
℃の範囲であった。
(5)熱安定性 ＯＮＰＧを基質として各温度においてpＨ 5.0で加熱し
た結果、第４図に示す通り、10分間加熱では、57.5℃ま
で安定であり、60℃で約30％失活した。
た結果、第４図に示す通り、10分間加熱では、57.5℃ま
で安定であり、60℃で約30％失活した。
(6)阻害 0.05〜0.5mＭの水銀イオン、銀イオン、0.5mＭのメルカ
プトエタノールにより阻害を受ける。また、グルコー
ス、マルトースによっても阻害される。
プトエタノールにより阻害を受ける。また、グルコー
ス、マルトースによっても阻害される。
(7)精製方法 前記微生物を培養物を破壊し、この破壊物を細胞壁溶解
酵素ザイモリエース20−Ｔ（商品名）により処理し、こ
の処理液の上澄みをＤＥＡＥ−セファデックス（Sephad
ex）Ａ−50（商品名）及びトーヨーパールＨＷ−55Ｓ
（商品名）カラムに吸着させて分離できる。
酵素ザイモリエース20−Ｔ（商品名）により処理し、こ
の処理液の上澄みをＤＥＡＥ−セファデックス（Sephad
ex）Ａ−50（商品名）及びトーヨーパールＨＷ−55Ｓ
（商品名）カラムに吸着させて分離できる。
(8)分子量 トーヨーパールＨＷ−55Ｓを用いたゲル濾過方で測定し
た結果、分子量は約20万であった。
た結果、分子量は約20万であった。
［実施例］ 下に、本発明の実施例を示す。
(1)菌体の製造 下記の組成の培地100mlを500ml容三角フラスコに仕込
み、120℃で20分間殺菌後冷却し、クリプトコッカス・
ローレンティ・バラエティ・ローレンティＯＫＮ−４株
を植菌し、30℃で１日間振とう培養して種菌とした。
み、120℃で20分間殺菌後冷却し、クリプトコッカス・
ローレンティ・バラエティ・ローレンティＯＫＮ−４株
を植菌し、30℃で１日間振とう培養して種菌とした。
培地組成 ラクトース 50ｇ ＮＨ4Ｃｌ ２ｇ ＫＨ2ＰＯ4 0.8ｇ Ｎa2ＨＰＯ4・12Ｈ2Ｏ 0.3ｇ ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.02ｇ 酵母エキス ３ｇ 水 １ pＨ 6.0 本培養は上記と同様の培養条件で種菌を2.5ml接種し、3
0℃で２日間、毎分160回転で振とう培養した。培養終了
後、100mlの培養液から遠心分離（5000r.p.m10分間）し
て菌体を集め、蒸溜水にて５回洗浄後、水40mlに再懸濁
した。この菌体懸濁液の酵素活性はＯＮＰＧを基質とし
て0.08Ｕ／mlであった。
0℃で２日間、毎分160回転で振とう培養した。培養終了
後、100mlの培養液から遠心分離（5000r.p.m10分間）し
て菌体を集め、蒸溜水にて５回洗浄後、水40mlに再懸濁
した。この菌体懸濁液の酵素活性はＯＮＰＧを基質とし
て0.08Ｕ／mlであった。
(1)酵素の精製 上記の方法で培養した菌体200g（湿重量）を蒸溜水でよ
く洗浄した後、160mlの酢酸エチルと40mlの20mＭリン酸
緩衝液（pＨ 5.8）を加え、よく懸濁し、４℃で24時間
往復振とうした。得られた菌体を蒸溜水でよく洗浄した
後、蒸溜水に懸濁し、800mlの菌体懸濁液を得た。これ
を氷水中でマントン・ゴーリング菌体破砕機により破砕
（8000psi 10通液）した後、遠心分離（5000r.p.m.10分
間）して菌体破砕液を得た。菌体破砕液中の細胞壁画分
を蒸溜水でさらに１回洗浄した後、凍結乾燥し、27.6g
の凍結乾燥品を得た。この細胞壁画分の酵素活性は、Ｏ
ＮＰＧを基質として10Ｕ／ｇであった。
く洗浄した後、160mlの酢酸エチルと40mlの20mＭリン酸
緩衝液（pＨ 5.8）を加え、よく懸濁し、４℃で24時間
往復振とうした。得られた菌体を蒸溜水でよく洗浄した
後、蒸溜水に懸濁し、800mlの菌体懸濁液を得た。これ
を氷水中でマントン・ゴーリング菌体破砕機により破砕
（8000psi 10通液）した後、遠心分離（5000r.p.m.10分
間）して菌体破砕液を得た。菌体破砕液中の細胞壁画分
を蒸溜水でさらに１回洗浄した後、凍結乾燥し、27.6g
の凍結乾燥品を得た。この細胞壁画分の酵素活性は、Ｏ
ＮＰＧを基質として10Ｕ／ｇであった。
次に、上記細胞壁画分の凍結乾燥品27.6gを690mlのマッ
クルベン緩衝液（pＨ 6.0）で懸濁し、ザイモリエース
20−Ｔ（生化学工業製）を0.01重量％となるように添加
し、30℃で３時間往復振とうし、酵素を可溶化させた。
反応後、得られた溶液を東洋瀘紙（商品名）Ｎo.２で濾
過し、濾液を蒸溜水に対し１昼夜透析した。透析後、凍
結乾燥により、4.0gの粗酵素品を得た。この粗酵素の活
性は、ＯＮＰＧを基質として25Ｕ／ｇであった。
クルベン緩衝液（pＨ 6.0）で懸濁し、ザイモリエース
20−Ｔ（生化学工業製）を0.01重量％となるように添加
し、30℃で３時間往復振とうし、酵素を可溶化させた。
反応後、得られた溶液を東洋瀘紙（商品名）Ｎo.２で濾
過し、濾液を蒸溜水に対し１昼夜透析した。透析後、凍
結乾燥により、4.0gの粗酵素品を得た。この粗酵素の活
性は、ＯＮＰＧを基質として25Ｕ／ｇであった。
さらにこの粗酵素品を20mＭリン酸緩衝液（pＨ 5.8) 3
40mlに溶解し、予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ−50 （50mmφ×740mmＨ）カラムに吸
着させ、次いで同緩衝液（０〜1.0ＭＮａＣｌグラディ
エント）にて70ml／Ｈｒの流速で溶出した。活性画分90
0mlを蒸溜水に対し透析後、凍結乾燥し、1.75gの粗酵素
を得た。さらにこれを20mＭのリン酸緩衝液（pＨ5.8）2
4mlで溶解し、氷水中で１時間放置して白色の沈澱物を
除去し、上澄液24mlのうち４mlを20mＭのリン酸緩衝液
（pＨ 5.8）で予め平衡化したトーヨーパールＨＷ−55
Ｓのカラム（22mmφ×750mmＨ）に注入して吸着させ、
その後、同緩衝液1.0ml／minで溶出した。この操作を６
回繰り返して合計108mlの活性画分を得た後、これを蒸
溜水にて透析し、凍結乾燥したところ、9.0mgの精製酵
素を得た。この酵素はディスク電気泳動法で単一のバン
ドを示した。精製酵素の酵素活性はＯＮＰＧを基質とし
て4.86Ｕ／mgであった。
40mlに溶解し、予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ−50 （50mmφ×740mmＨ）カラムに吸
着させ、次いで同緩衝液（０〜1.0ＭＮａＣｌグラディ
エント）にて70ml／Ｈｒの流速で溶出した。活性画分90
0mlを蒸溜水に対し透析後、凍結乾燥し、1.75gの粗酵素
を得た。さらにこれを20mＭのリン酸緩衝液（pＨ5.8）2
4mlで溶解し、氷水中で１時間放置して白色の沈澱物を
除去し、上澄液24mlのうち４mlを20mＭのリン酸緩衝液
（pＨ 5.8）で予め平衡化したトーヨーパールＨＷ−55
Ｓのカラム（22mmφ×750mmＨ）に注入して吸着させ、
その後、同緩衝液1.0ml／minで溶出した。この操作を６
回繰り返して合計108mlの活性画分を得た後、これを蒸
溜水にて透析し、凍結乾燥したところ、9.0mgの精製酵
素を得た。この酵素はディスク電気泳動法で単一のバン
ドを示した。精製酵素の酵素活性はＯＮＰＧを基質とし
て4.86Ｕ／mgであった。
(3)酵素の転移作用 2.5重量％ラクトース溶液１mlを基質として、これに
上記の方法で精製した酵素0.02Ｕを加え、pＨ 5.0、50
℃で酵素反応を行った。反応液組成の経時変化を第５図
に示した。図中、ＧＯ−１は下記式 で表わされるＯ−β−Ｄガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｏ−β−Ｄガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ
−グルコースであり、これはビフィズス菌増殖因子とし
て有用なものである。
上記の方法で精製した酵素0.02Ｕを加え、pＨ 5.0、50
℃で酵素反応を行った。反応液組成の経時変化を第５図
に示した。図中、ＧＯ−１は下記式 で表わされるＯ−β−Ｄガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｏ−β−Ｄガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ
−グルコースであり、これはビフィズス菌増殖因子とし
て有用なものである。
この結果からわかるように、本発明の酵素β−ガラクト
シダーゼＡは、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解し
て、（１→４）結合のガラクトオリゴ糖を選択的に収率
よく生成するもので、他のβ−ガラクトシダーゼ、例え
ばＫ．fragillis、Ｋ．lactis、Ａsp.oryza、Ｂ．circu
lans等に由来するβ−ガラクトシダーゼは生成するオリ
ゴ糖の収量が低く、種類も多いこと、また、至適pＨ、
至適温度、温度安定性等の理化学的性質も異なることか
ら、β−ガラクトシダーゼＡは明らかに新規の酵素であ
るといえる。
シダーゼＡは、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解し
て、（１→４）結合のガラクトオリゴ糖を選択的に収率
よく生成するもので、他のβ−ガラクトシダーゼ、例え
ばＫ．fragillis、Ｋ．lactis、Ａsp.oryza、Ｂ．circu
lans等に由来するβ−ガラクトシダーゼは生成するオリ
ゴ糖の収量が低く、種類も多いこと、また、至適pＨ、
至適温度、温度安定性等の理化学的性質も異なることか
ら、β−ガラクトシダーゼＡは明らかに新規の酵素であ
るといえる。
［発明の効果］ 以上説明したとおり、本発明のβ−ガラクトシダーゼＡ
は新規な酵素であり、この酵素を用いれば、ビフィズス
菌増殖因子として有用であるガラクトオリゴ糖を収率よ
く、高い選択率で得ることができ、しかも、本酵素はp
Ｈ安定性、温度安定性も高いので、ガラクトオリゴ糖の
工業的生産に多大な効果をもたらすものである。
は新規な酵素であり、この酵素を用いれば、ビフィズス
菌増殖因子として有用であるガラクトオリゴ糖を収率よ
く、高い選択率で得ることができ、しかも、本酵素はp
Ｈ安定性、温度安定性も高いので、ガラクトオリゴ糖の
工業的生産に多大な効果をもたらすものである。
第１図乃至第４図はそれぞれβ−ガラトクシダーゼＡの
pＨに対する活性、pＨに対する安定性、温度に対する活
性、温度に対する安定性を示すグラフ、第５図はラクト
ースを基質とするβ−ガラクトシダーゼＡによる酵素反
応の反応液組成の経時変化を示すグラフである。
pＨに対する活性、pＨに対する安定性、温度に対する活
性、温度に対する安定性を示すグラフ、第５図はラクト
ースを基質とするβ−ガラクトシダーゼＡによる酵素反
応の反応液組成の経時変化を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】下記の性質を有するβ−ガラクトシダーゼ
Ａ。 作用及び基質特異性 β−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に作用して、そのβ
−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解するとともに、分解
して生成したＤ−ガラクトース基を転移する。 ラクトースを基質とした場合に、Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−Ｄ−グルコースを主とするオリゴ糖
を生成する。 至適pＨ及び安定pＨ範囲 至適pＨをpＨ 4.0〜5.0に有し、安定pＨをpＨ 2.7〜
9.3（30℃60分間処理）に有する。 作用適温の範囲 50〜60℃に最適作用温度を有する。 熱安定性 10分間処理の場合、57.5℃まで安定である。 阻害 水銀イオン、銀イオン、メルカプトエタノール、グルコ
ース及びマルトースにより阻害される。 分子量 ゲル濾過法による測定で約20万である。 - 【請求項２】クリプトコッカス（Ｃryptococcus）属に
属する新規β−ガラクトシダーゼＡ生産菌を培養し、該
培養物から新規β−ガラクトシダーゼＡを分離、採取す
ることを特徴とする新規β−ガラクトシダーゼＡの製造
法。 - 【請求項３】クリプトコッカス属に属する新規β−ガラ
クトシダーゼＡ生産菌がクリプトコッカス・ローレンテ
ィ・バラエティ・ローレンティ（Ｃryptococcus lauren
tii var. laurentii）ＯＫＮ−４である特許請求の範囲
第(2)項に記載の新規β−ガラクトシダーゼＡの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60248885A JPH062057B2 (ja) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | 新規β−ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60248885A JPH062057B2 (ja) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | 新規β−ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62111685A JPS62111685A (ja) | 1987-05-22 |
| JPH062057B2 true JPH062057B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=17184886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60248885A Expired - Lifetime JPH062057B2 (ja) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | 新規β−ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062057B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5643756B2 (ja) * | 2009-06-05 | 2014-12-17 | 天野エンザイム株式会社 | バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ |
| JP7122114B2 (ja) | 2015-12-29 | 2022-08-19 | 天野エンザイム株式会社 | 新規β－ガラクトシダーゼ |
-
1985
- 1985-11-08 JP JP60248885A patent/JPH062057B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62111685A (ja) | 1987-05-22 |
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