JPH03143393A - 糖転移活性の強いα―ガラクトシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［）産業上の利用分野］ 本発明は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　Ｈ−６
０１株による糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼの
製造法に関するものである。

［従来の技術］ 近年、各種オリゴ糖類がビフィズス因子など新たな機能
性をもつ物質として注目されている。このようなオリゴ
塘あるいは配糖体の合成法としては糖転移酵素または加
水分解酵素の糖転移作用を利用する方法や縮合反応を利
用する方法が開発されている。糖転移作用を利用する方
法は、縮合反応によるオリゴ糖あるいは配糖体の合成と
は違い特定の結合様式を持ったオリゴ糖あるいは配糖体
のみを特異的に合成できる。例えばβ−フラクトフラノ
シダーゼによるフラクトオリゴ糖、β−ガラクトシダー
ゼによるβ−ガラクトオリゴ糖の製造がある。一方、α
−ガラクトシダーゼは、動物組織、微生物、高等植物の
神子等に広く存在し、α−Ｄ−ガラ・クトシド結合を加
水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触媒す
る酵素である。

この酵素は、１９世期末にメリビオースを加水分解する
酵素（メリビアーゼ）として酵母から抽出されて以来、
種々の起源のものが単離され研究されてきた。特に利用
面では、甜菜糖からの蔗糖の分離精製工程において、蔗
糖の結晶化を妨げるラフィノースを蔗糖とガラクトース
に効率的に加水分解することを目的として利用されてい
る。しかしながら、α−ガラクトシダーゼの軸転移作用
については、基質となるα−ガラクトシル基をもつ化合
物の安価な０（給源が知られていなかった為にほとんど
研究されていなかった。さらに、大豆オリゴ糖を中心に
α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が強いビフィズス因
子活性をもつ物質として注目されているにもかかわらず
、α−ガラクトシタ゛−ゼの拡転移作用を利用するオリ
ゴ糖の工業的製造法は確立されていない。そこで、本発
明者らは、このα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の合
成とその有効利用を目的に土壌から糖転移活性の強いα
−ガラクトシダーゼを生産する菌の分離を試みた。

［発明が解決しようとする問題点］ したがって本発明の目的は、糖転移活＋１三の強いα−
ガラクトシダーゼを安価に且つ大量に生産し得る方法を
提供することにある。

本発明者らは、先に広く自然界よりα−ガラクトシル基
の転移作用を持つα−ガラクトシダーゼを生産する微生
物を求めて検索したところ、シュードモナス属菌が転移
活性を有するα−ガラクトシダーゼを生産する能力を有
することを見出し、Ｈ−１と命名して研究発表［日本農
芸化学会１９８８年度大会講演要旨集　第２９６ページ
］した。

しかしながら、このシュードモナス・フルオレッセンス
Ｈ−１が生産するα−ガラクトシダーゼは、基質として
メリビオースを用いた場合、基質濃度が１０前後で生じ
たガラクト−スの６０％程度しか転移できないという問
題点があった。

［問題点を解決する手段］ 本発明者らは、その後さらにα−ガラクトシル基わ転移
作用のより強いシュードモナス属菌を求めて検索を続け
た結果、転移活性の極めて強い新規な菌株を見出し、シ
ュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　Ｈ−６０１株と命名
して、本発明を完成した。すなわち、本発明は、糖転移
活性の強いα−ガラクトシダーゼを生産するシュードモ
ナス・フルオレッセンスＨ−６０１株を培養し、培養上
清から糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼを採取す
ることを特徴とする糖転移活性の強いα−ガラクトシダ
ーゼの製造法に関するものである。

なお、本発明でいう糖転移活性の強いα−ガラクトシダ
ーゼとは、基質としてメリビオースを用いた場合、基質
濃度が１０前後でもほとんど基質附害を受けず、生じた
ガラクトースの６５％以上を転移することができる活性
を有するα−ガラクトシダーゼをいう。

以下に本発明の内容を更に具体的に説明する。

本発明においては、その例示菌株としてシュードモナス
◆フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕ
ｏｒｅ−ｓｃｅｎｓ）　Ｈ−６０１株が有効に利用され
る。シュードモナス・フルオレッセンスは、土壌・河川
・食品等から分離され、蛍光性色素を生成することがよ
く　５− 知られている。しかしながら、α−ガラクトシダーゼを
生産する能力を有するシュードモナス・フルオレッセン
スの菌株は本発明者らが見出した前記２株以外は未だ報
告されていない。

次に、本発明者らの見出した菌株の開学的性質を示すと
、下記の通りである。

（ａ）形態学的性質 ■細胞の形　　　　　　　桿菌 ■ダラム染色　　　　　　陰性 ■胞子の有無　　　　　　無し ■運動性　　　　　　　　有り （ｂ）培地での生育 寒天平面培地　　　　円形、規則的、周囲は円滑表面は
滑らか、偏平状 半透明で、淡黄色 （Ｃ）生育の温度 ３７℃　　　　　　　　　　生育する ４１°Ｃ生育せず （ｄ）生化学的性質 カタラーゼ　　　　　　　＋ 　− オキシダーゼ（Ｋｏｖａｃｓ）　　＋ ０−Ｆテスト　　　　　　０ （ｅ）ラビッドテスト（ＡＰＩ） ［３０℃　４８時間培養］ 硝酸塩の還元 インドールの生！戊 グルコースから酸の生成 アルギニンデヒドラーゼ ウレアーゼ エスクリンの加水分解 ゼラチンの加水分解 β−ガラクトシダーゼ 糖の同化 グルコース の結果 アラビノース マンノース マンニトール Ｎ−アセチルグルコサミン マルトース グルコン酸塩 カプリン酸塩　　　　　　十 アジピン酸塩 リンゴ酸塩　　　　　　　十 クエン酸塩　　　　　　　１− 酢酸フェニルエステル チトクロムオキシダーゼ　　　＋ ［３０°Ｃ７日間培養］ ゼラチンの加水分解　　　　　十 ビオベルデインの生成　　　　十 レバンの生成 硝酸塩の還元 亜硝酸塩の生成 残留窒素 以上の諸性状をバージエイのマニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー　第８版（１９７４）
の記載と照合することにより、本菌がシュードモナス・
フルオレッセンスであることを確認しシュードモナス・
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ）　Ｈ−６０１と命名した。

なお、本菌株は、微工研菌寄第１１０２７号（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−１１０２７）として、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。

本発明のシュードモナス・フルオレッセンスＨ−６０１
株により糖転移活性の極めて強いα−ガラクトシダーゼ
を生産するためには、通常、メリビオース、ラフィノー
ス、スタキオース、ガラクトマンナンやその分解物単独
、あるいは、蔗判１ｉ、粉飴、ラクトース、澱粉に誘導
物質としてメリビオース、ラフィノース、スタキオース
、ガラクトマンナンやその分解物を添加したものを炭素
源として用い、全脂あるいは脱脂大豆、コーンステイー
プリカーポリペプトン、ソイトン、あるいは、酵母エキ
スのような有機または無機の窒素源を含む液体１苦地を
用いて、２０〜４０℃で、２〜１４日間程度、好気的に
培養すればよい。糖転移活性の強いα−ガラクトシダー
ゼは菌体外に生産される酵素である為、液体培地の場合
、培養後濾過、あるいは、遠心分離によって得た培養上
清を相醇素液としてそのまま利用できる。粗酵素液は、
そのまま使用できるが、例えば硫安沈殿法や溶媒沈殿法
または限外濾　− 適法等の公知の方法により、粗酵素濃縮液を得ることも
できる。このようにして得られた、本発明の糖転移活性
の強いα−ガラクトシダーゼ標品は次の様な諸性質を有
する。

（１）作用 α−ガラクトシダＬセは、α−Ｄ−ガラクＩ・シト結合
を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触
媒する酵素である。本酵素は、終濃度４４ｍＭのα−ガ
ラクトシル基を持つ化合物にパラニトロフェニル−α−
ガラクトシド〉オルトニ］・ロフェニルーα−ガラクト
シド〉メリビオース〉ラフィノース〉スタキオースの順
でよく作用した。

（２）最適作用ｐＨ範囲 本酵素の最適作用ｐＨ範囲は、約６〜７に認められた。

（３）安定ｐＨ範囲 ＭｃＨｖａｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｇｌｙｃｊ
ｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液の下で４０℃２時間放置した場合
の本酵素の安定性は、ｐＨ６〜９であった。

（４）作用温度範囲及び最適作用温度 ０ 本酵素は、約６０℃までの温度で良く作用するが、最適
作用温度は約４５°Ｃであった。

（５）熱安定性 本酵素を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）の下で
各温度で１５分間加熱処理した結果、４０°Ｃまでは９
０％以」二の活性が維持された。

（６）糖転移活性 α−ガラクトシル基の供与体としては、本酵素が基質と
するα−ガラクトシル基を含むオリゴＩｊｆあるいは配
塘体全てが利用できる。ここでは、基質としてメリビオ
ースを用いて本酵素の糖転移活性を測定した。各種の濃
度のメリビオースに本酵素を作用させ、反応によって生
じた遊離のグルコースと、ラクト−スをベーリンガー・
マンハイムのＦキット（商品名）を用いて定量した。第
１図に示したように本酵素は、基質濃度が５０ｍＭ前後
から基質の切断によって生じたガラクトースを転移反応
に利用し始め、１Ｍ前後でも基質■害を受けず生じたガ
ラクトースの６５％以上を転移するという強い転移活性
を有していた。なお、第１図において、横軸は基質濃度
を、縦軸は生成物の量を示し、口はメリビオースの分解
によって生じたグルコース量を、十はガラクトース量を
示す。すなわち、この差が糖転移作用に使われたガラク
トース量を示すものである。

（７）受容体特異ヤ１三 丞質として１％パラニトロフェニル−α−ガラクトシド
、受容体として４％のガラクＩ・−ス、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、シュークロース、グリセリン
に本酵素を作用させ反応生成物を薄層クロマトグラフィ
ーにより確認した。その結果、この受容体の全ての場合
に転移生成物が確認され、本酵素は広い受容体特異性を
持つことが確認された。

（８）α−ガラクＩ・シダーゼの活性測定法１０ｍＭバ
ラニトロフェニル−α−ガラクトシド０２ｍ１と４０ｍ
Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　０．２ｍｌにα−ガ
ラクトシダーゼ溶液０　、０５ｍ１を加えて４０’Ｃ１
，Ｏ分間反応させる。反応後、０．２Ｍ炭酸すトリウム
０　、５ｍｌを加えて反応を止め、遊離してくるパラニ
トロフェノール量を分光光度計にて４００ｎｍの吸光度
を計ることにより測定した。酵素活性１単位は、この条
件下で１分間に１μｍｏｌｅのパラニＩ・ロフェノール
を生成する酵素量と定義した。

（９）精製法 遠心分離によって得た培養上清を０２飽和硫安存在下で
疎水クロマトグラフィー（東ソー（株）製ブチルトヨバ
ール６５０Ｍ）　、イオン交換クロマトグラフィー（東
ソー（用製ＤＥＡＥ−トヨバール６５０Ｍ）、および、
ゲルクロマトグラフィー（東ソー（ａ）製トヨバールＨ
Ｗ−５５Ｆ）を行ない本酵素を精製した。

この操作によりディスクゲル電気泳動的に単一なα−ガ
ラクトシダーゼの標品を得ることかできた。

（１０）分子量 本酵素について東ソー（用架　トヨバールＨＷ−５５Ｆ
（商品名）を用いたゲル濾過法より分子量を測定したと
ころ、分子量は３．９Ｘ１０’に相当した。

（１１）等電点 本酵素についてファルマシアＰｈａｓｔＧｅｌ　ＩＥＦ
３−９（商品名）を用いた等重点電気泳動により等電点
３ を測定したところ６３であった。

［発明の効果］ 以」二のとおり、本発明の転移活性の強いα−ガラクト
シダーゼは基質濃度が１Ｍ前後でも基質■害を受けず、
基質の切断によって生じたガラクトースの６５％以上を
転移するという極めて強い転移活性をもっていた。また
、受容体特異性もガラクトース、グルコース、マンノー
ス、フラクトース、シュークロース、グリセリンと非常
に広くその酵素的性質がこれまで知られている酵素に較
べて優れていた。そして、このような本酵素の特徴は、
α−ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用したαガラク
トシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体の合成において
者しい技術進歩をもたらしたものである。また、本酵素
は加水分解酵素であるため当然の事ながら縮合反応を利
用したα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖
体の合成においても利用できる。

［実施例］ 次に本発明を実施例により説明するが、本発明４ はこれらに限定されるものではない。

実施例１ １％メリビオース、１％ポリペプトン、０．０５％に２
ＨＰ０４０．０１％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７）１．０．０
．０１％ＫＣＩを含む液体培地（ｐＨ７，０ＨＯＯｍＬ
を５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、常法によるオートク
レーブにより殺菌後シュードモナス・フルオレッセンス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
Ｈ−６０１株を接種し、３０℃で４日間振盪培養した。

培養後、遠心分離により除菌し、得られた培養土ｌ＋’
ｊについてα−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

その結果、酵素活性は培養液１ｍｌ当り０７５単位であ
った。

実施例２ 実施例１において、メリビオースに代えて、１％粉飴に
０．１％メリビオースを誘導源として添加した培地にシ
ュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　トロ０１株を植菌し
、３０℃で４日間振盪培養した。培養後遠心分離によっ
て得た培養上清についてα−ガラクトシダーゼ活性を測
定した。その結果、酵素活性は培養液１ｍｌ当り０．３
８単位であった。

実施例３ 実施例２で４”Ｊたα−ガラクトシダーゼ７６０単位を
含む粗酵素標品２０００ｍ１を０２飽和硫安存在下で疎
水クロマトグラフィー（東ソー■製　ブチルトヨバール
６５０Ｍ）　、イオン交換クロマトグラフィー（東ソー
（（転）製　ＤＥＡＥ−）ヨパール６５０Ｍ）　、およ
び、ゲルクロマトグラフィー（東ソー（（資）製　トヨ
バールＨＷ−５５Ｆ）により３００単位の酵素標品１０
ｍ１を得た。

この酵素標品は、ディスク電気泳動的に単一であった。

この様な精製によるα−ガラクトシダーゼの収率は約４
０％であった。

実施例４ １ｇのメリビオースと１ｇのシュークロースを含むｐＨ
６、５のリン酸緩衝液５ｍｌに実施例３によって得られ
た精製酵素標品５単位を添加し、４０℃で５０時間反応
させた。反応液を１０分間煮沸加熱し酵素を失活させた
後、反応液１μｌを濾紙にスポットしｎ−７’’ｌ／−
ル゛ｌ：’ｌＩシ゛７水・６：４３の組成の溶媒系で４
重展開後、フロログルシン法によるケトース呈色を行な
うと、ラフィノースに相当する位置にスボ・ソトが検出
された。この反応液を活性炭カラムクロマトグラフィー
にかけ、オリゴ籾ｉ類を吸着させた後、エチルアルコー
ルの濃度勾配により溶出させた。

この３量体画分を集め、濃縮し凍結屹燥標品０　、８ｇ
を得た。本標品は、（ａ）α−ガラクトシダーゼで加水
分解するとガラクトースとシュークロースを等モル生成
すること、（ｂ）β−フラクトシダーセで加水分解する
と、等モルのメリビオースとフラクトースを生成するこ
と、（ｃ）α−ガラク１〜シダーゼとβ−フラクトシダ
ーゼとで加水分解するとガラクトース、グルコース、フ
ラクトースを１モルずつ生成すること、（ｄ）ペーパー
クロマトグラフィーの移動度がラフィノースと一致する
こと、以上のことからラフィノースであると同定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、基質にメリビオースを用いて本酵素の糖転移
作用に及ぼす基質濃度の影響を調べた結果を示した図で
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス・フルオレッセンス（￥Ｐｓｅｕ
   −ｄｏｍｏｎａｓ￥￥ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ￥）Ｈ−
   ６０１株を培養することからなる糖転移活性の強いα−
   ガラクトシダーゼの製造法
2. （２）α−ガラクトシダーゼがシュードモナス・フルオ
   レッセンス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥￥ｆｌｕｏｒ
   ｅｓｃｅｎｓ￥）Ｈ−６０１株の培養上清液である請求
   項第（１）項記載の糖転移活性の強いα−ガラクトシダ
   ーゼの製造法