JPH0330671A - 新規エキソ―β―Ｄ―グルコサミニダーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、キトサンオリゴ糖やキトサンに作用し、これ
を加水分解してグルコサミンを生じる、新規なエキソ−
β−Ｄ−グルコサミニダーゼ及びその製造法に関するも
のである。

〔従来の技術及び問題点〕

キトサンは、グルコサミンがβ−１，４結合した直鎖状
の多糖であり、キチンを脱アセチル化することによって
得られるほか、天然には接合菌類の細胞壁などに存在し
ている。

近年の研究により、キトサンの抗菌作用やキトサンオリ
ゴ糖のエリジター活性などの生理活性が見出され、その
構造と機能に関する研究が進められている。これら構造
と機能の関連を研究する手段として、キトサンオリゴ糖
やキトサンを分解する特異性の高い酵素が要求されてい
る。

従来、このキトサンを分解する酵素として数種のキトサ
ナーゼが知られているが、これらはすべてエンド型キト
サナーゼで主としてオリゴ糖を生成し、単糖であるグル
コサミンを生成する酵素は見出されていなかった。

そこで、本発明者らはグルコサミン生産型のキトサン分
解酵素を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、ノカルディ
ア属に属する放線菌の培養物中から、新規な酵素（エキ
ソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼと命名）を採取するこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。

〔発明の構成〕

本発明のエキソ−β’−Ｄ−グルコサミニダーゼは、次
の理化学的性質を有する。

（ａｌ　作　　用　：キトサンオリゴ糖とキトサンの分
解作用。

ｌｂ）基質特異性：キトサンオリゴ糖やキトサンに作用
し、これを加 水分解してグルコサミン を生じる。

ｔｃ＞至適ｐＨ：　ｐ）１５．０〜６．０゜［ｄ）ｐＨ
安定性＝４℃、９６時間の処理において、ｐＨ３，０〜
１Ｏ１０で 安定。

（ｅ）至適温度　＝６０℃付近。

［ｆｌ熱安定性　：ｐＨ５，５，１５分間の処理におい
て、５０℃以下で安定。

（ｇ１分　子　量：　９７．０００　（Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポ
リアクリルアミド電気泳動）６ ｔｈ）等　電　点：ｐＨ９，１付近。

本発明に使用する微生物は、ノカルディア属に属するエ
キソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの生産菌であればい
ずれのものでも良い。

例えば、ノカルディア・オリエンタリス（Ｎ。

−ｃａｒｄｉａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）　　［新分類
名二組匹虹旦−ｏ　ｓｉｓ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　］
が挙げられ、具体的には、Ａｍ　ｃｏｌａｔｏ　ｓｉｓ
　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　ＩＦＯ１２３６０゜ＩＦＯ１
２３６１，ＩＦｏ　１２３６２．１Ｆ０１２８０６．Ｊ
ｃＭ　３１２８゜ＪＣＭ　４２３５．ＪＣＭ　４６００
などである。上記ＩＦＯナンバーの株は、財団法人醗酵
研究所のリスト・才ブ・カルチャー１）９８８年第８版
（Ｉｎ５ｔｉｔ−ｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎ、０ｓａｋａ、Ｌｉ５ｔ　ｏｆ　Ｃｕｔ−ｔｕｒ
ｅｓ、１９８８．８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉ、ｏｎ　）に記載
されている。また、ＪＣＭナンバーの株は、理化学研究
所微生物系統保存施設のカタログ・才ブ・ストレインズ
、１９８６年第３版（Ｊａｐａｎ　Ｃｏ１）ｅｃｔｉ−
ｏｎ　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｃａｔ
ａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　５ｔｒａ−ｉｎｓ、１９８６＋　
３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されている。

本発明に使用する微生物は、培養液中に高単位のエキソ
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを生産するものであり、
その培養には炭素源として、エキソ−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼの誘導基質であるキトサンを加えることが好
ましく、また窒素源としては、ペプトン、肉エキスなど
の有機物、また微量のビタミン類、成長促進因子（例え
ばイースト・エキスなど）、無機金属類等を添加すると
良い。培養に当たっては、液体培地、固体培地のどちら
を使用してもよいが、高単位のエキソ−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼを得るには液体培地を用い、振盪ないし通
気撹拌培養を行うのが好ましい、培養条件は培地の組成
や菌株の種類によって異なるが、通常２０〜３５°Ｃで
、２〜５日程度の培養で目的のエキソ−β−Ｄ−グルコ
サミニグーゼを得ることができる。

本酵素は菌体外に生産されるので、公知の分離・精製法
が適用できる１例えば、培養液を濾過あるいは遠心分離
によって培養濾液および菌体に分ける６次に培養濾液か
ら硫安塩析法・溶剤沈澱法などにより粗酵素標品を得、
さらにこれをイオン交換、ゲル濾過、アフィニティー等
の各種クロマトグラフィを適宜組み合わせることによっ
て精製を行うことができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、か
かる説明によって本発明が何ら限定されるものではない
。

〔実施例〕

グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、
リン酸２水素カリウム０．０３％、リン酸水素２カリウ
ム０．０７％と硫酸マグネシウム・７永和物０．０５％
を含む前培養培地（ｐＨ７，０）　５００ｎｌを５００
ｍＩ２容三角フラスコ５本に１００ｍ　Ｉｌずつ入れ、
これにノカルディア・オリエンタリスＩＦ０１２８０６
株を２白金耳ずつ接種し、３０℃で２日間振盪して前培
養を行った。

次に、コロイダルキトサン　１．０％、酵母エキス０．
０１％、リン酸２水素カリウム０，０３％、リン酸水素
２カリウム０．０７％と硫酸マグネシウム・７永和物０
．０５％（ｐＨ７，ｏ）の組成の本培養培地４．５２を
含むジャーファーメンタ−に、前記のようにして得られ
た前培養液を接種し、３０℃で４日間通気攪拌培養した
。

培養終了後、培養液５Ｉ２をｌＯ，０００ｒｐｎ、　２
０分間、４°Ｃで遠心分離して菌体を除去し、得られた
上清液に８０％飽和となるように固形硫安を加え、冷蔵
庫中に一夜静置した。生じた沈澱物を　ｉｏ、ｏｏｏｒ
ｐｍ、　１５分間、４℃で遠心分離して集め、これを少
量の２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５１に溶解後、同緩
衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５のカラム（２
，２ｘ　８４ｃｍ１に展開して脱塩し、粗酵素液を得た
。

この粗酵素液を２５ｍ　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５１で
平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−５０カラム（１，
８Ｘ　２５ｃｍ）に展開しイオン交換クロマトグラフィ
ーを行った。カラムを上記緩衝液で洗浄後、蛋白質を０
から０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液による直線
濃度勾配により、流速８０ｍｎ／時で溶出した。エキソ
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性を有する画分を集め
、硫安塩析（８０％飽和）により蛋白質を沈澱させた０
次に、遠心分離により集めた沈澱を少量の５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解し、同緩衝液で平衡化した
トヨパールＨＷ５５Ｓカラム（２，７ｘ　７８ｃｍ）に
展開し、ゲル濾過を行った。溶出は同緩衝液を用いて、
流速２０ｍＪ２／時で行った。活性画分を集め、そのう
ち半分を上記緩衝液で平衡化したキトトリイトール−セ
ファロースＣＬ−４Ｂカラム（２，２Ｘ　８４ｃ＋ｉ）
に展開し、アフィニティークロマトグラフィーを行った
。カラムを同緩衝液で洗浄後、蛋白質を２ｍＭキトトリ
イトールを含む同緩衝液により流速１６０ｍρ／時で溶
出した。残り半分も同様に行い、活性画分を集め硫安塩
析（８０％飽和）により蛋白質を沈澱させた。沈澱を少
量の５０ｍ　Ｍホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ９，０）に溶解し
同緩衝液５００ＩＩ１）２中で５時間透析した。この透
析液を上記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデック
ス八−５０カラム（１，８Ｘ　９．５　ｃｍｌ　に展開
し、同緩衝液を３０ｍＱ１時で流して蛋白質を溶出した
。活性画分を集め硫安塩析（８０％飽和）により蛋白質
を沈澱させた。沈澱を少量の５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５，５）に溶解し、同緩衝液中で透析して精製酵素標品
を得た。

以上の精製操作によって得られたエキソ−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼ標品は、ポリアクリルアミドスラブゲル
電気泳動で均一であった・ 本酵素の精製の要約を表に示す。

表 ［コロイダルキトサンの調製］ キトサンの塩酸溶液を希水酸化ナトリウム溶液で中和後
、不溶化したキトサンをミキサーで粉砕してコロイダル
キトサンを得た。

［キトトリイトールの調製］ キトトリオース（グルコサミン３量体）をＮＡＢ）１．
で還元し、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗ−Ｘ４イオン交゛換樹脂
を用いて脱塩後、メタノール−アセトン系で結晶化させ
た。この結晶を濾取し、真空乾燥してキトトリイトール
を得た。

〔アフィニティ吸着体の調製１ ＡＨ−セファロースＣＬ−４Ｂをグルタルアルデヒドで
活性化後、キトトリオースを結合させ、ＮａＢＨ４で還
元してキトトリイトールセファロースＣＬ−４Ｂを得た
。

〔酵素活性測定法］ エキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性は、下記の方
法で測定した。

２ｍＭキトトリイトールを含む口、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
　Ｈ５，５）　１．ＯｍＩ！、に、酵素液を加えて４０
℃で５分間反応させる。この反応溶液にシャール試薬３
．０ｍ１２を加え、沸騰湯浴中で１５分間加熱する。冷
却後、分光光度計で４２０ｎｍの吸光度を測定し生じた
グルコサミンを定量する。

酵素活性ＩＵは、１分間に１μｍｏｌｅのグルコサミン
を生成する酵素量と定義した。

以上のようにして得られたエキソ−β−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ標品を、キトサンオリゴ糖とキトサンに作用さ
せ、その分解物を薄層クロマトグラフィーにより分析し
た。その結果、図に示すように、本酵素はキトサンオリ
ゴ糖とキトサンに作用して、グルコサミンを生じている
ことがわかる。

【図面の簡単な説明】

図面はエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ標品を、キ
トサンオリゴ糖とキトサンに作用させた分解物の分析結
果を示したものである。 図面の？７ｉ１）Ｆ 手続補正書（方式） ％式％ ５；ヘト欠ンタオース ７；キト（ンタオース輛２４時間改 ９；午トサノ分解１時間＋（ ６；キトペンタオースを嘱１）時Ｆｌｌ夏８；キトナン １０；キトブシ分解２４時間褒 １．４ｉ！件の表示　　平成　１年特許願第１６７９０
０号２、発明の名称　　新規エキソ−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーセ及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　（特許出願人） 住　所　　　静岡県焼津市小用新町５丁目８番１３号氏
名（名称）　焼津水産化学工業株式会社代表者松本圭一
部 ４、代理人　〒１８２電０４２４−８９−６３１）平成
元年　９月１）日　発送口・・・９月２６日６、補正の
対象 図　　面

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の理化学的性質を有するエキソ−β−Ｄ−グル
   コサミニダーゼ （ａ）作用：キトサンオリゴ糖とキトサ ンの分解作用。 （ｂ）基質特異性：キトサンオリゴ糖やキトサンに作用
   し、これを加水分解してグルコサミンを生じる。 （ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ５．０〜６．０。 （ｄ）ｐＨ安定性：４℃、９６時間の処理において、ｐ
   Ｈ３．０〜１０．０で安定。 （ｅ）至適温度：６０℃付近。 （ｆ）熱安定性：ｐＨ５．５、１５分間の処理において
   、５０℃以下で安定。 （ｇ）分子量：９７，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
   ミド電気泳動）。 （ｈ）等電点：ｐＨ９．１付近。
2. （２）ノカルディア属に属し、エキソ−β−Ｄ−グルコ
   サミニダーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、
   培養物よりエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを採取
   することを特徴とするエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダ
   ーゼの製造方法。