JPH03143398A - イプシロン―ポリ―ｌ―リシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〉 本発明はイプシロン−ポリ−ルーリシン（以下εＰＬと
略記する）の製造方法に関する。

（従来の技術とその問題点） εＰＬは以下の構造式で表されるよう番こ、Ｌリシンの
ε位のアごノ基が、隣り合うＩ、−リシンのカルボン酸
とアミド結合で結合した高分子化合物である。

＋１Ｊ”−（ＣＨｚ）　ｔ−ｃｏｃｏ　＋ＮＨ（ＣＨ２
）　４−Ｃ）ＩＣＯ＋ｎ０当該物質は必須アミノ酸であ
る■、−リシンのポリマーであるので安全性が高くかつ
カチオン含量が高いので特異な物性を有する。従って、
それらの性質を利用してトイレタリー用品、化粧品、飼
料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途
が期待できる。

従来、当該物質はストレプトマイセス属に属するεＰＬ
産生菌であるストレプトマイセス・アルプラス・サブス
ピーシーズ・リジノボリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｌｙｓｉｎｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｕｓ）陥、３４６−Ｄ株（微工研菌寄第３
８３４号）を培地に培養して、得られる培養物から分離
精製して得られている（特公昭５９−２０３５９号〉。

しかし、この先願の菌株では培養液１１当りせいぜい０
．５ｇ程度のεＰＬの生産性しかなく、従って生産コス
トが高く、当該物質の広範な利用が妨げられていた。

本発明者らは、εＰＬを著量に生産する株を得、これを
用いてεＰＬを多量に製造することを目的として研究を
重ね、以下に述べる発明に到達した。

（問題点を解決するための手段） 本発明はストレプトマイセス・アルプラス・サブスピー
シーズ・リジノボリメラス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｍｙｃ
ｅｓａｌｂｕｌｕｓ　５ｕｂｓｐ、　Ｉｙｓｉｎｏｐｏ
ｌｙｍｅｒｕｓ）菌株をＬ−リジンのアナログ物質に耐
性を有する変異株に変異処理し、得られた該変異株を培
地に培養し、培養液中にイプシロン−ポリ−ルーリジン
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする８
ＰＬの製造方法である。

Ｌ−リシンのアナログ物質は、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−
システィン、または、このＳ−ア多ノエチルーＬ−シス
ティンにＩ、−スレオニン、グリシン、Ｌ−ホモセリン
およびＩ、−メチオニンの中から選ばれる一種または数
種の物質を添加したものが好ましい。

変異株は、ストレプトマイセス・アルプラス・サブスピ
ーシーズ・リジノボリメラスＮ［Ｌ３４６−り株のＳ−
アミノエチル−Ｌ−システィンにグリシンを添加したも
のに耐性をもつ変異株１１０１１Ａ−１株（微工研条寄
第１１０９号）が好ましい。

以下に本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明の菌株の取得方法を述べる。Ｌリジンのア
ナログ物質に耐性を有する変異株、例えばＳ−アξノエ
チルーＬ−システィンのｍｌ性変異株は、例えば以下の
方法で取得する。

ストレプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・
リジノボリメラスＮ１３４６−Ｄ株の胞子をトリス−マ
レイン酸緩衝−？＆　（ｐ　Ｈ９，０）に懸濁し、これ
にＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎｏ　−二トロソグアニジ
ンを添加する。

これを振とう後、遠心分離機により胞子を集め、滅菌水
で洗浄し、培地に接種し、振とう培養して菌を生育させ
る。菌を含む培地（以下、培養液という）を希釈する。

次に、Ｓ−アミノエチル−Ｌシスティン、あるいはこれ
にグリシン、Ｉ４−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−
メチオニンのアミノ酸類から一種あるいは数種を選んで
前記培地と同じ組成の寒天培地に添加する。

その際、寒天培地１　ｒｄ当り０．５〜１０ｍｇ、好ま
しくは２ｍｇの濃度になるようにＳ−ア多ノエチルＬ−
システィン、または同じ濃度になるようにＳア〈ノエチ
ルーＬ−システィンと寒天培地１　ｍｌ当り０．２〜５
ｍｇ、好ましくは１ｍｇの濃度になるように前記ア逅ノ
酸頻を加えたものを用いる。この寒天培地に、先の培養
希釈液を塗布する。この寒天ｆｔｆ地を保温した後、：
！口二一として生育した菌株がＳ−アミノエチル−Ｌ−
システィン耐性変異株である。このとき、Ｓ−アミノエ
チル−■、−システィンのみを添加した寒天培地で生育
した菌株が耐性変異株８１５１２株であり、Ｓ−アミノ
エチル−Ｌ−システィンにグリシンを添加した寒天培地
に生育した菌株が耐性変異株１１０１１Ａ１株（微工研
条寄第１１０９号）であり、さらに、Ｓ−アミノエチル
−Ｌ−システィンにＬ−スレオニンを添加した寒天培地
で生育した菌株が耐性変異株８１５０２株である。

また、プラスミド増幅性変異株は、例えば以下の方法で
取得する。ストレプトマイセス・アルプラス・サブスピ
ーシーズ・リジノボリメラス隘３４６−Ｄ株あるいは、
Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性変異株を培地に
接種し、振とう培養した後にクロラムフェニコールを添
加し、培養を続ける。遠心分離して菌体を集め、洗浄し
た後、寒天培地に菌を塗布する。静置培養した後、ブド
ウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ
）を含む普通寒天培地を重筋し、さらに量合養し生成し
たブドウ球菌の生育阻止円の大きな株が、目的のブラズ
ξＦ増幅性ｃＰＬ高生産株、すなわち、プラスごド増幅
性変異株５０８３３株（微工研条寄第１１１Ｏ号）であ
る。これらの変異株のうち、ｌｌｏＩＩＡｌ株および５
０８３３株の菌学的性質を示すと次の通りである。

（１）形態学的性質 シュークロース・硝酸塩寒天培地上で３０℃、１０日間
生育した１１０１１Ａ−１株および５０８３３株の気菌
糸および基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。

■　胞子猛威菌糸の分枝法および形態：単純分枝、閉鎖
らせん状（ｃｌｏｓｅｄ　５ｐｉｒａ＋）■　胞子の数
二　数十個 ■　胞子の表面構造および大きさ： 胞子は円ないし楕円形で大きさは約１．２〜１．５μで
あり、その表面構造はスバイニ（Ｓｐｉｎｙ）である。

■　鞭毛胞子、菌核および胞子のうの有無存在が認めら
れない。

■　胞子柄の着生位置：　気菌糸」二 （２）各種培地上における生育状態 下記の各種培地上における性状はそれぞれ３０℃で１０
〜１４日間培養後の観察結果である。

口） ５０８３３株（微工研条寄第１ ０号） 生理的性質 １０１１Ａ １株および５０８３３株の生理 的性質は次の通りである。

■ 生育温度範囲 約１５〜４０℃。

生育最適温度： ３０’Ｃ付近。

■　ゼラチンの液化、でん粉の加水分解および脱脂牛乳
のペプトン化；　すべて陽性 ■　脱脂牛乳の凝固：　陰性 ■　メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地上では褐色の色素を生成する。

■　細胞壁組成 細胞壁組！ｙ、戒分中のジアミノピメリン酸の型につい
てベラカー（Ｂｅｃｋｅｒ）らの方法〔アプライド・マ
イクロバイオロジー第１３巻第２３６頁（１９６５年）
参照〕により分析した結果、Ｌ、　　Ｌ型であった。

（４）各種炭素源の同化性（ブリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地上〉 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース　　　　　　　　＋ Ｄ−フラクトース　　　　　　　＋ Ｌ−ラムノース Ｄ−ガラクトース　　　　　　　＋ シュークロース ラフィノース Ｄ−マンニトール　　　　　　　＋ ｉミーイノシトール　　　　　　−１ サリシン 註〉＋；同化する、　−二同化しない。

以上記述したように、変異株の菌学的性質は原菌株であ
るストジブＩ・マイセス・アルプラス・サブスピーシー
ズ・リジノボリメラスｆｋ３４６−Ｄ株の菌学的性質と
類似している。

次にこれらの方法で得られた変異株を用いて本発明方法
によりεＰＬを製造する。なお、文中の％は特に記さな
いかぎり重量（ｇ）／容量（ｍｆｆｉ）％を示す。

まず、得られた変異株を培地に接種して培養し、培養液
から生成蓄積したεＰＬを分離・精製する。

培地は炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンが含まれてい
れば、いかなるものでもよいが、好ましくは炭素源とし
てブドウ＠５％、あるいはグリセリン５％を含み、窒素
源として硫酸アンモニウム、■ あるいはＬ−リシンあるいはペプトンを含むものが良い
。培養途中で炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。ｐ
）ｌは培養初期はｐＨ４，０になるまで下がるにまかせ
、その後水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリでｐＨ４
，０を維持するようにしても良い。培養液から遠心分離
機あるいはフィルターで菌体を除いた後、濾過液を精製
・脱色し、これを濃縮する。濃縮液からアセトン、エタ
ノール等の有機溶媒でεＰＬを晶析する。

（発明の効果） 本発明によれば、ストレプトマイセス・アルプラス・サ
ブスピーシーズ・リジノボリメラス菌株をＬ−リシンの
アナログ物質に耐性を有する変異株に変異処理し、該変
異株を培養することによって公知の菌株を用いるよりも
、生産性が改良され著量にεＰＬを産生ずることができ
るので、εＰＬの生産コストを従来に比べて大幅に引き
下げることができる。

（実施例〉 以下、本発明を実施例につき詳細に述べる。

実施例Ｉ Ｓ−ア多ノエチルーＬ−システィン耐性株の取得： ストレプトマイセス・アルプラス・ザブスピーシーズ・
リジノボリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂ
ｕｌｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｕｓ）　ｔ’ｈ　３４６−　Ｄ株の胞子ｌ白金耳量をト
リス−マレイン酸緩衝液（ｐ　Ｈ９，０）５ｍｌに懸濁
し、これにＮ−メチル−Ｎ−ニド０−Ｎ”　−ニトロソ
グアニジンを１．５ｎｗ／ｍ＃の濃度になるように添加
した。これを、３０分間、３０℃で振とうした後、遠心
分離機により胞子を集め、滅菌水で洗浄し、ブドウＩ７
！５％、硫酸アンモニウム１％、酵母エキス０．５％、
リン酸二水素−カリウム・７水塩０．１３６％、リン酸
−水素二ナトリウム・１２水塩０．１５８％、硫酸マグ
ネシウム・７水塩０．０５％、硫酸亜鉛・７水塩０．０
０４％、硫酸第一鉄・７水塩０．００３％、ｐＨ６，８
の培地（以下第１培地と呼ぶ）５ｍＡ！に接種し、−昼
夜３０℃で振とう培養し、菌を生育させた。

その培養液をＭＳ溶液（Ｉ戒は硫酸マグネシラム・７水
塩０．０５％、塩化ナトリウム０．５％、ツイーン８０
０．０５％）で５００倍に希釈する。次いで、この希釈
培養液を、寒天培地１　ｍｌ当り２にの濃度になるよう
にＳ−アミノエチル−Ｌ−システィン、またはこの濃度
になるようにＳ−アミノエチルし一システィンおよび寒
天培地ｌ　ｍｌ当り１■の濃度になるようにグリシンま
たはＬ−スレオニンを添加した前述の第１培地と同じ組
成の寒天培地に塗布した。この寒天培地を、３０’Ｃで
４８時間保温し、コロニーとして生育させ、Ｓ−アミノ
エチル−Ｌシスティン耐性変異株を得た。

このうち、Ｓ−ア逅ノエチルーＬ−システィンのみ添加
した寒天培地中の１株が８１５１２株である。Ｓ−アミ
ノエチル−Ｌ−システィンにグリシンを添加した寒天培
地中の１株が１１０１．１　Ａ１株（微工研条寄第１１
０９号）である。Ｓアミノエチル−Ｌ−システィンに■
、−スレオニンを添加した寒天培地中の１株が８１５０
２株である。

εＰ　Ｌの生産： 前記第１培地と同し組成の培地５−にＳ−アミノエチル
−Ｌ−システィン耐性株８１５１２株を１白金耳量接種
し、３０℃で８日間振とう培養した。培養終了後、培養
液中のεＰＬの濃度をイツアキ（ｒｔｚｈａｋｉ）の方
法で測定した。

その結果を表１に示す。

実施例２および３ Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性変異株８１５１
２株の代わりに、Ｓ−ア尖ノエチルーＬシスティン→−
グリシン耐性変異株１　］、　Ｏｌ　］、　Ａ１株（微
工研条寄第１１０９号）（実施例２）、Ｓ〜７５ノエチ
ル−し一システィン＋Ｌ−スレオニン耐性変異株８１５
０２株（実施例３）を用いた以外は、実施例１と同様の
方法で培養し、ｃｌ）Ｌの濃度を同様の方法で測定した
。

その結果を表１に示す。

実施例４ プラスごド増幅性変異株の取得： 実施例１で得られたＳ−ア飽ノエチルーＬ−システィン
耐性変異株を、実施例１に記載した第１培地と同し組成
の培地５　ｍｌに接種する。

これを３０℃２日間振とう培養した後に、クロラムフェ
ニコールを培養液１１Ｖ当り５０から５００■、好まし
くは１００■の濃度になるように添加し、さらに５から
１０時間好ましくは８時間培養を続ける。

遠心分離して菌体を集め、滅菌水あるいは生理食塩水で
洗浄した後、第１培地と同し１ＩＪ１戒の培地に寒天１
．７％を加えた寒天培地に菌を塗布する。

８日間３０℃で静置培養した後、ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）を含む普通寒天
培地を重層し、さらに１夜培養し生成したブドウ球菌の
生育阻止円の大きな株がプラスミド増幅性εＰＴ、高生
産株である。この中の１株が、５０８３３株（微工研条
寄第１１１０号）である。

εＰＬの生産： 得られたプラス多ド増幅性変異株５０８３３株を用いた
以外は、実施例１と同様の方法で培養し、εＰＬの濃度
も同様の方法で測定した。

その結果を表１に示す。

比較例１ Ｓ−アごノエチルーＬ−システィン耐性変異株８１５１
２株の代わりに、ストレプトマイセス・アルプラス・サ
ブスピーシーズ・リジノポリメラスＮａ３４６−Ｄ株を
用いた以外は、実施例Ｉと同様の方法で培養し、εＰＬ
の濃度を同様の方法で測定した。

その結果を表１に示す。

表１ 番号　　　εＰＬ生産性 実施例１　　　　０．６７ ２　　　　０．８８ ３　　　　０．７２ ４　　　　１．８０ 比較例１　　　　０．２０ （ｇ／　ｅ　） 実施例５ 実施例１に記載した第１培地と同じ組成の培地１．５１
に０．０５容量％のポリオキシアルキレングリコール誘
導体消泡剤を加え、Ｓ−ア旦ノエチルＬ−システィン耐
性変異株１１０１１Ａ−１株を前培養した培養液５０ｍ
ｊ！を接種し、６００ｒｐｍ　、通気量２６／ａ＋ｉｎ
、、３０℃で培養した。

２４時間後に、ブドウ糖５％、硫酸アンモニウム１％を
無菌的に添加した。ｐ　Ｈ低下後、ｐ　Ｈが４．０以下
にならないように６Ｎ水酸化す１〜リウムをｐ）（コン
トローラーで自動的に連続制御しながら加えた。培養後
、遠心分離機で菌体を除去し培養液中のεＰＬをアニオ
ン交換樹脂ＩＲＡ−４０２、カチオン交換樹脂ＩＲＣ−
５０、活性炭カルポラフィン５０ｗで精製して表２に示
す結果を得た。

比較例２ Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性変異株１１０１
１Ａ−１株の代わりに、ストレプトマイセス・アルプラ
ス・サブスピーシーズ・リジノボリメラスＮＣｌ３４６
−Ｄ株を用いた以外は実施例５と同様の方法で培養し、
同様に精製して表２に示す結果を得た。

表２ 番号　　　　収Ｎ　（ｇ）　　純度（％）実施例５　　
４．．７７　　９９．９ 比較例２　　０．５６　　９７．８

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシ
   ーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ
   ｌｂｕｌｕｓｓｕｂｓｐ．ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒ
   ｕｓ）菌株をＬ−リシンのアナログ物質に耐性を有する
   変異株に変異処理し、得られた該変異株を培地に培養し
   、培養液中にイプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを生成蓄積
   せしめ、これを採取することを特徴とするイプシロン−
   ポリ−Ｌ−リシンの製造方法。
2. （２）Ｌ−リシンのアナログ物質が、Ｓ−アミノエチル
   −Ｌ−システイン、または、このＳ−アミノエチル−Ｌ
   −システインにＬ−スレオニン、グリシン、Ｌ−ホモセ
   リン、およびＬ−メチオニンの中から選ばれる一種また
   は二種以上の物質を添加したものである特許請求の範囲
   第１項記載の製造方法。
3. （３）変異株が、ストレプトマイセス・アルブラス・サ
   ブスピーシーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
   ｙｃｅｓａｌｂｕｌｕｓｓｕｂｓｐ．ｌｙｓｉｎｏｐｏ
   ｌｙｍｅｒｕｓ）Ｎｏ．３４６−Ｄ株のＳ−アミノエチ
   ル−Ｌ−システインにグリシンを添加したものに耐性を
   持つ変異株１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９
   号）である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。