JPH0314524A - 基質細胞を用いた遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は，遺伝的欠陥を正すための組換え技術の使用
に関するものである。

（従来の技術） Ａ型血友病は、特定の凝固タンパク質、■−Ｃ因子の欠
陥筐たぱ異常によって釦こる出血異常であり、１００，
０００人男性中１０−２０人の割合で釦こる。これに苦
しむ人々はコントロールされていない出血症状の発現に
悩んでかり、今のところヒト血漿由来のＶＩＩＩ−Ｃ因
子濃縮液によって治療されている。組換えＤＮＡ技術が
、培養細胞から精製されたヒトＶＩＩＩ−Ｃ因子の供給
に有効であり、血友病の他に採りうる治療法として提案
された（トール（　Ｔｏｏｌｅ　）ら、１９８４、ネイ
チア−（Ｎａｔｕｒｅ）３１２：３４２）。

ルイス（　Ｌｏｕｔｓ　）ら（１９８８、Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．　８　５　：　３　１　５　
０　）は、ヒト■因子ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ含む組祷えレ
トロウイルスに感染した、ネズミ初代培養皮膚線維芽細
胞をコラーゲン中に包埋してネズミの表皮に植えつけ、
血清中のヒト■因子を１０−１２日間検出した。

ガーバー（　Ｇａｒｙｅｒ　）ら（１９８７、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　２３７　：７６２）は、ヒト
αｌ一抗トリプシンをコードする組換えＤＮＡを含む、
ハツカネズミ線維芽細胞をヌードマウスの腹腔内に移植
し、血清と肺の上皮表面にヒトαｌ一抗トリプシンを検
出した。ガーバー（　Ｇａｒｖｅｒ　）らは、”線維芽
細胞のような標的細胞中での遺伝子発現のレベルは一般
に霊長類の骨髄幹細胞よう良い”ことを観察した。

（発明が解決しようとする課題） 概して本発明は、欠陥に苦しむ患者のために、生物学的
に活性のある酵素を産生させ、患者の血流内に分泌する
方法を特色とする；この方法は、その酵素をコードする
遺伝子でトランスフエクトされた、供給骨髄基質細胞を
、患者の骨腔表面に付着して活性のある酵素を産生、分
泌できるよう患者に導入することを含んでいる。

（課題を解決するための手段） 好涜しい態様にかいて、トランスフエクトされる遺伝子
はリンフオカイン、成長因子、造血因子、あるいは凝血
因子のような他の血液関連タン／ミク質、例えばヒトＶ
ＩＩＩ−Ｃ因子や抗トロンビン■などをコードする。植
えられた供給細胞の免疫的拒絶を最小にするため、供給
基質細胞は、好１しくは自己由来細胞、即ち受容細胞と
遺伝的に同一であるような細胞である；もし供給細胞が
自己由来でない場合は、不要な免疫反応を避けるため、
好１しくは受容者に充分遺伝的に相似であるような細胞
；即ち組織適合性の（　ｈｉｓｔｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂ
ｌｅ　）細胞が使われてよい。自己性の、あるいは組織
適合性の細胞の使用は、受容者の一般的な免疫抑制を不
必要にする。

好１し〈ぱ、供給基質細胞が動物内に導入されるとただ
ちに、それらの細胞が移動する受容骨地点を照射（好１
しくはＸ＠照射）することによって、供給基質細胞と受
容骨の間の相互作用は、付着と安定な移植が容易となる
よう変化をうける。

使われるＸ線照射の線量は、急速に分裂する細胞の大多
数がその部分から一掃されるように、造血細胞を殺すの
には充分高く、しかしそれら基質細胞の死は避ける程度
には低い。その部分は、好ましくは大腿骨、脛骨、ある
いは肋骨のような長骨である。

本発明は、■因子遺伝子の受容者への移植方法が、■因
子遺伝子を発現できる細胞の自己移植によるものである
が故に、再補充された■因子に対する不要な免疫反応を
ひき釦こすことなしに、■因子欠陥血友病の治療に用い
られることが可能である。これは深刻な不利益をもたら
す他の血友病治療法と好対照を示す。例えばヒト血漿は
、非効率的かつ高価な■因子源で、わずか１００−２０
０ｎｆ／一のタンパク質を含んでいるにすぎない（フエ
イ（Ｆａｙ）ら、１９８２、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．Ａｃ
ａ．　Ｓｃｉ．　７９：７２００）。利用できる療法は
、それなりに有効ではあるが、非常に高価であり、高い
感染の危吟が伴う。現在入手できる血漿由来製品はひど
く不純で（〈１％■因子）、たいてい数千人の供血者に
由来するプールされた血漿ロットからつくられる。これ
らの製品はタン・ミクの沈降によって生ずるあらゆる深
刻な合併症を伴って釦９、しばしば肝炎ウイルスやヒト
免疫不全ウイルス、後天性免疫不全症候群（エイズ）な
どの不定要因で汚染されている。＆−［？’え体■因子
は、ヒト■−Ｃ遺伝子でトランスフエクトされた真核細
胞によって産生されたが（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、１９
８４、ネイチアー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２：３３０；ト
ール（　Ｔｏｏｌｅ　）ら、同上）、均質にまで精製さ
れてなく、それは訃そらく自然のヒト■因子とは例えば
免疫原性いｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）であるかもしれない
グリコシル化のパターンなどに釦いて異なるせいであろ
う。

本発明はさらに、寿命が長く、急速に分裂しない、そし
てそれ故移植後に長い期間望む酵素を発塀、分泌させる
ことができる、基質細胞を有効的に使用している。

本発明の他の特色と有効性は、以下の好ましい態様の記
述と請求とから明らかになるだろう。

１ず簡単に図を説明する。

図１は、植えつけ後１カ月で移植された供給マウスから
（上）、又は非移植・照射マウスから（下）、外植（　
ｅｘｐｌ．ａｎｔｅｄ　）　　された付着細胞の図であ
る。

図２はＳ　１／Ｓ　１ｄマウスから確立されたＬ　Ｔ　
Ｂ　Ｍ　Ｃからの造血原細胞の成長の図式である。

図３は、ヒト■因子を含むレトロウイルスベクターの図
式的表示である。

上で律べられているように、ヒトＶＩＩＩ−Ｃ因子遺伝
子を含むばクターで自己性ヒト基質細胞をトランスフエ
クトし、その後それらのトランスーフエクトされた基質
細飽を適切に準備された患者、例えば長骨の標的部位の
照射を行った患者に植えつける、本発明に従えば、例え
ば正常ＶＩＩＩ−Ｃ因子の欠陥によって生ずる血友病の
ような、正常に機能する酵素の欠陥によってかこる遺伝
的欠陥疾患で苦しむ患者は、治療可能である。

本発明に従ったヒト血友病の治療過程を詳細にわたって
記述する前に、用いられる技術のいくつかを可能にする
目的で、ネオマイシン耐性基質細胞がマウスに植えつけ
られた実験について述べる；この仕事はアンクレサリア
（　Ａｎｋｌｅｓａｒｉａ　）ら（１９８７）　Ｐｒｏ
ｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｔ．　　ＵＳＡ８４
、７６８１による、以前の発表内に記載されている。そ
の後形質転換成長因子−α（　Ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍｉ
ｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ　−　ＣＩ，Ｔ　
Ｇ　Ｆ　−　（１　）をコードする遺伝子Ｋよるネズミ
（　ｍｕｒｉｎｅ　）基質細胞のトランスフエクション
と、それに続く、それら基質細胞の植えつけが述べられ
る；植えつけられた細胞は、導入された遺伝子にコード
されているＴＧＦ一αを発現・分泌することが見い出さ
れた。最後に、１ず■因子遺伝子を含む基質細胞をマウ
スに植えつけて始１り、続いて■因子を含む自己ヒト細
胞をヒト患者に植えつける、本発明に従ったヒト血友病
の治療過程が記述される。

実施例１ アンクレザリア（　Ａｎｋｌｅｓａｒｉａ　）らの実験
長期性ｉｔ’：｛’Ｂ胞培養 Ｂ６Ｄ２Ｆ１　（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＸＤＢＡ／２Ｊ）マ
ウス（ジャクソン　ラボラトリー（　ＪａｃｋｓｏｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）バーハ−／’　−　（　Ｂ
ａｒ　Ｈａｒｂｏｒ）、メイン（　Ｍａｉｎｅ　）　）
　　が長期性骨髄培養（　ｌｏｎｇｔｅｒｍ　ｂｏｎｅ
　ｍａｒｒｏｗ　ｃｕｔｕｒｅｓ　（ＬＴＢＭＣ　））
に使われた。フィッシャー培地（ギブコ　Ｇｉｂｃｏ　
）の入った２５ｃｒｎコーニングフラスコ内に大腿骨と
脛骨の細胞内容物が入れられ、２５多ウマ血清（ハゼル
トン　ＨａｚｅｌＬｏｎ　）と１　０−’　Ｍのハイド
ロコルチゾンコハク酸ナトリウムが加えられた。

２週間後ウマ血清に代わって胎児性コウシ血隋が用いら
れた。この方法は、培地の寿命金延ばすものとして示さ
れた（サヵキーニ　Ｓａｋａｋｅｅｎｙら、１９８２、
Ｊ，　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｎｓｔ．　６　８
　：３０５）。ＬＴＢＭＣは培養７日後から連続して３
週間、紳粋欠陥ウィルスとしてノ（ツヶージされたウイ
ルスと２μｙ／一　のボリブレン（　ｐｏｌｙｂｒｅｎ
ｅ）（シグマ　Ｓｉｇｍａ　）を含んだウイルス上澄で
感染させられた。

ＬＴＢＭＳの確立後６１日目に、０．２５多トリプシン
（ギブコ　ＧＩＢＣＯ）処理によって代表的なＬＴＢＭ
Ｓフラスコから付着細胞がはずされて８−のフィッシャ
ー培地（ギプコ）の入った２５ｄ　フラスコ（ファルコ
ン　Ｆａｌｃｏｎ）に３　Ｘ　１　０６又はＩＸＩＯ６
細胞のいずれかの割合で入れられ、熱で非活性化した胎
児性コウシ血清（ＦＣＳ）（ハゼルトン　Ｈａｚｅｌｔ
ｏｎ　）　　２　５％と、１０　　Ｍのハイドロコルチ
ゾンコハク酸ナｌ・リウムが追加された。培養細胞は３
　３％Ｃ、７％ＣＯ２で保持され週毎に同じ密度で継代
（　ｐａｓｓａｇｅ）される。８継代目（　ｐａｓｓａ
ｇｅ　８　）に各々の発育した細胞株は特定の希釈倍数
でプレートされ、ぱニシリンダーヲ用いてクローン化さ
れ、コロニー由来の単細胞が分離される。その後の細胞
株はそれぞれ更に特定の希釈で２回サブクローンされる
。細胞株はそれらが密集状態に達すると接触が禁じられ
た。

テストされた基質細胞株はすべてマイコブラズマも、道
転写酵素も持たないことが判明した。逆転写酵素活性は
グリーンバーガー（　Ｇｒｅｅｎ　ｂｅｒｇｅｒ　）の
、１９８４、ゴルデ（　Ｇｏｌｄｅ　）　（編集）Ｍｅ
ｔｈ．Ｈｅ＋ｙｔｏｔｏｌ．　１　１、Ｎ．Ｙ．；　　
チャーチルリビングストン（　Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌ
ｉｖｉｎｇｓｔｏｎ　）、Ｐ，２０２、に記載されてい
る方法に従ってＮ　Ｉ　Ｈ／３　Ｔ　３細胞を負のコン
トロールとして用いて測定された。

２つのクローナルネズミ（　ｍａｒｉｎｓ　）　　骨髄
基質細胞株、Ｇ　Ｂ　Ｌ／６とＧ　Ｂ　Ｌ　／　６　ｎ
ｅｏｒが、Ｂ６，型（ＧＰＩＡ（Ｇｌｕ６ＰＩ−α、　
Ｄ−グルコース−６−ケトリン酸−イソメラーゼ　Ｄ−
ｇ１ｕｃｏ８ｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｋｅｔｏｌ
　−　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ＥＣ　５．　３．１，９）
ネズミ（グリーンバーガー（　Ｇｒｅｅｎ　ｂｅｒｇｅ
ｒ）、１９７８、ネイチャー　Ｎａｔｕｒｅ　２　７　
５　：　７　５　２）の連続した骨髄培養組織から発育
された。内皮様特徴と、インビトロで多型潜在性の（　
ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎ−ｔｉａｌ　）　　造血原細胞を
維持できることから、Ｇ　Ｂ　Ｌ／６細胞株がこれらの
研究用に選択された。

安定したクローナル基質細胞株ＧＢＬ／６ＵＧｌｕ６Ｐ
Ｉ　　のαインメラーゼを発現する。

パース（　Ｐｅａｒｓｅ　）、１９８６、Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ．，ｊ’，チャーチル（　Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　
）、ロンドン（　Ｌｏｎｄｏｎ）、３　ｒｄ　ｅｄ．に
記述されているように、この細胞株はアルカリフオスフ
ァターゼ，酸フオスファターゼ、ぼルオキシターゼ、α
−ナフチルエステラーゼ、そしてライソザイムを染色し
て特徴づけられた。細胞外殼マトリックスタン・互ク質
であるラミニン（　ｌａｍｉｎｉｎ　）、　フイブロネ
クチン（　ｆ　ｉｂｒｏ−ｎｅｃｔｉｎ　）　（コラボ
レーティブ・リサーチＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，ワルサムＷａ　１　ｔｈ　ｕｍ　，マ
サチューセッツＭＡ），コラーゲン１ｍとＩＶ型、そし
てアロ酵素マーカーのＧ１ｕ６ＰＩ−α（チャールズＣ
ｈａｒｌｅｓら、１９８０、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ　．　２　９　：　１　１　）などに対する
抗血清がＧＢＬ／６細胞株内の各タンパク質を同定する
ため、それぞれの特異的抗血清とハミ冫（　Ｈａａｊ　
ｉ　）ら、１９８３、Ｌａｂ．　Ｍｅｄ．　　１４　：
　７６７の免疫ぼルオキシダーゼ（　ｉｍｍｕｎｅ　ｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅ　）法を用いて使用された。Ｇ　Ｂ
　Ｌ／６細胞はフイブロネクチン“、ラミニン“、そし
てコラーゲン■型“、コラーゲンＩ型−であった。免疫
血液学的研究用に脛骨近位端が集められ、縦に割られて
、２％パラフォルムアルデヒド／　０．　Ｉ　Ｍカコデ
イレート（　ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　）バツファ−　ｐ
Ｈ７．４中で１８時間固定された。骨は０．３　Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ／０．Ｉ　Ｍカコディレート／Ｚツ７アー　ｐＨ
７．４中で４日間脱カルシウムが行われた。パラフィン
に埋められた骨は５μｍの厚さに切断されて、マウスＧ
ｌｕ　６ＰＩ−αに対するウサギ抗血清との反応性と、
間接性免疫ぱルオキシダーゼ染色性を調べるため染色さ
れた。

優性（　ｄｏｍｉｎａｎｔ　）選択マーカーを持つ基質
細胞株を確立するため、ホ乳動物細胞に抗生物質、Ｇ４
１８耐性（Ｇ４１８ｒ）を与える優性選択マーカーをコ
ードするネオマイシン耐性遺伝子が、レトロウイルスの
ベクターを用いて最初はＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、その後
細胸株Ｇ　Ｂ　Ｌ／６にトランスフエクトされた。トラ
ンスフエクションはリン酸カルシウム沈降法によった（
グラハムＧ　ｒ　ａ　ｈ　ａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏ
ｌ．　５２　：　４５６）。

ベクターｐ　Ｚ　Ｉ　Ｐ　−　Ｎｅｏ　（ＳＶ）　（Ｘ
）　ＤＮＡ（下参照）１０μ１がマウスＮ　Ｉ　Ｈ／３
　Ｔ　３細胞を１・ランスフエクトするのに用いられた
。このベクターＵＳＶ．４０プロモーターのコントロー
ル下にネオマイ７ン耐性遺伝子を持っている。トランス
フエクトされた細胞株は６２５μ？　／　ｍｌの　０４
１８（ギブコ）で選択され、個々のＧ４１８ｒコロニー
をクローニングして、ウイルスを高いタイター値で産生
ずるクローンが分離された。欠陥ウイルスを産生ずる細
胞株で、テストされた１９コから常に３Ｘ　１　０６Ｇ
４　１　８　ｒＣＦＵ／Ｐ／！の高いウイルスタイター
値を示すｌコが選択され、長期間骨髄培養の感染に使用
された。この上澄はｐ　Ｓ　ＶＸ　−　ｎｅｏｒ　　ウ
イルスと命名された。ｐｓＶＸ−　ｎｅｏｒ　ウイルス
はＧＢＬ／６細胞の感染に用いられた。サブクローンの
Ｇ　Ｂ　Ｌ　ｎｅｏｒは５００μ２／ｄＧ　４　１　８
中で選択され、インビト口で増殖された。Ｇ　Ｂ　Ｌ　
／　６　ｎｅｏｒ細胞はＧ　Ｂ　Ｌ／６細胞と判別不能
な細胞化学的（　ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　）％徴と
細胞外殼マトリックスタンパクを持っていた。

ＧＢＬ／６細飽ぱ、牌臓細胞と（ＣＦＵ−Ｓ）、顆粒球
、赤血球、そしてマクロファージ／巨核球（ＣＦＵ−Ｇ
ＥＭＭ）のコｏ＝一形成単位（　Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒ
ｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ，　Ｃ　ＦＵ　）を形成する造血性
基質細胞の成長を、インビトロで、検出可能な量の成長
因子、例えばインター口イキン３（マルチコ口ニーステ
イミュレーテイングファクター）、顆粒球マクロファー
シコロニーステイミュレーテイングファクター、顆粒球
ステイミュレーテイングファクターなど、が欠除した状
態で維持する。

Ｇ　Ｂ　Ｌ／６細胞あるいはＧ　Ｂ　Ｌ／　６　−　ｎ
ｅｏｒ細胞の、インビトロに釦ける造血細胞維持能力は
、マルチーＣＳＦ活性を持ついかなる既知のへマトポエ
チン（　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ　）の検出可能量
１での合成によるものではアう得えない。

ＧＢＬｎｅｏｒ基質細胞から分離された全細胞性ＲＮＡ
’！：用いて、塩酸グアニジン抽出法の変法によってｐ
ｏｌｙ（Ａ）＋の　ｍＲＮＡが精製された（マニアテイ
スＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２、モレキュラークロー
ニングＭｏｌｅ；ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：ラボ
？ニュアル　Ａ　Ｌａｂ．　Ｍａｎｕａｌ，　コールド
スプリングハ−　／Ｓ−ラボＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　，コールドスフリングハーバ
、ニューヨークＮＹ）。

インターロイキン３　（ＩＬ−３）（ファングＦｕｎｇ
ら、１９８４、ネイチアー　Ｎａｔｕｒｅ　　３　０　
７　：２　３　３　）、顆粒球／マクロファージコロニ
ースティ■ユレーティングファクター（ＧＭ−ＣＳＦ）
（ガフ　Ｇｏｕｇｈら、１９８４、ネイチア−３０９：
７６３），マクロファージコロニースティミュレーナイ
ングファクター（Ｍ−ＣＳＦ）（カワサキ　Ｋａｗａ　
ｓ　ａｋ　ｉら、１９８５、サイエンスＳｃ　ｉｅｎｃ
ｅ２３０：２９１）、ＩＬ−１（アウロンＡｕｒｏｎら
、１９８４、ＰＮＡＳ　８１　：　７９０７），そして
顆粒球コロニーステイミュレーテイングファクター（Ｇ
−（’ＳＦ）（イスチャ　Ｉｓｕｃｈｉｙａ　　ら、１
９８６、ＰＮＡＳ　　８３：７６３３）の特異的メッセ
ージが、マニアテイスら、同上、に記述されているよう
な、特異的ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブ（）１０’ｃｐｍ／
μ２）とのハイプリダイゼーションによって同定された
。

Ｇ　Ｂ　Ｌ／　６　−　ｎｅｏｒ細胞由来のｍＲＮＡは
、゜既知の成長因子のｐｏｌｙ　（Ａ”）　ｍ　Ｒ　Ｎ
　ＡについてＲＮＡブロットハイブリダイゼーションに
よって分析された。Ｇ　Ｂ　Ｌ　／　６　−　ｎｅｏｒ
細胞はＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ、又はＩＬ
−１の検出可能なｐｏｌｙ（Ａ”）　ｍ　Ｒ　Ｎ　Ａを
持たず、Ｍ−ＣＳＦ’の検出可能なｍＲＮＡ’ｉ持って
いた。ＧＢＬ／６細胞は構成的に（　ｃｏｎａｔｉｔｕ
ｔｉｖｅｌｙ　）　　マクロファージコロニーステイミ
ュレーテイングファクターを産生じていた。ＧＢＬ／６
細胞株の維持能力は、Ｍ−ＣＳＦがインビボとインビト
ロにふ・いて付属（　ａｃｃｅｓｓａｒｙ　）　　細胞
から他のＣＳＦｉ放出させる引きかねになることができ
ることに起因するか、あるいは他の成長ファクターに起
因するのかのどちらかであるかもしれない。

付着性と非付着性の細胞がＬＴＢＭＣから毎週とり除か
れて、インビトロに釦ける、Ｇ４１８存在下、非存在下
のＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成能がアツセイされた（
ジョンソンＪｏｈｎｓｏｎら、１９７７、Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔ．　Ａｃａ．　Ｓｃｉ．　７４：３８７９；？カ
ハタ　Ｎａｋａｈａｔａら、１９８２、Ｐ＝ｒｏｃ．　
Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｅｔ．７９：３８４３）。Ｇ４１８
の各ロットの生物学的活性が、非感染性培養細胞上のコ
ロニーアツセイで測定された。すべてのＧ４１８一度は
一あたシの実際の重さで報告されたものである。原細胞
アツセイは１０１ＢＳＡ（コウシ血清アルブ■ン　ｂｏ
ｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　）、３０％Ｆ
ＢＳ　（胎児性コウシ血清ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅｓ
ｅｒｕｍ）、メチルセルロースを半固体ヘースとして含
んだ１０−２Ｍｌ−メルカプトエタノールの培地中で、
３種類の条件別培地：ＷＥＨＩ−３８ＣＭ（イーレ（　
Ｉｈｌｅ　）ら、１９８３、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３１　：２８２）、Ｌ一細胞ＣＭをマクロファージコロ
ニーステイミュレーテイングファクター（Ｍ−ＣＳＦ’
）源として（スタンレー　Ｓｔａｎｌｅｙら、１９７７
、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｒｎ．　２５２：４３０５
）、又ｉ，−１１０％ボークウイード（ｐｏｋｅｗｅｅ
ｄ　）マイトジェン誘発牌臓細胞ＣＭと２．０μｍ／ｍ
ｌ　Ｅ　Ｐ　Ｏ（ハンフイリーズ　Ｈｕｒｎｐｈｒｉｅ
ｓ　　ら、１９７９、ブラツド　Ｂｌｏｏｄ　５　３　
：　７　４　６　）が更に加えられて行われた。

インビボに釦けるＣＦＵ−Ｓアツセイがテイルとマツク
ロツシュ（　Ｔｉｌｌ　＆　Ｍｃ　Ｃｕｌｌｏｃｈ　）
（１９６１　；Ｒａｄｉａ．　Ｒｅｓ．　１４　：２１
３）によって記述されたように行われた。各グループに
ついて、５−１０匹のマウスが１０００ｒａｄ．１　４
　０　ｒａｄ　／　ｍｉｎ　（セシウム源）照射され、
５×１０５細胞／マウスが注射された。原細胞を受けな
かったマウスは照射径１２日以内に死亡し、牌臓あたり
≦０１±０３の内在性コロニーを持っていた。

インビボに釦いて、注入された基質細胞が髄腔内に安定
に根づく能力は、最初インビボ免疫血液化学技術によっ
て判定された。Ｇｌｕ　６　Ｐ　Ｉα”基質細胞は、マ
ウスのＲＨＬ髄腔に移植されて２カ月後に、インサイツ
において確認された。移植２カ月後に、植えつけられた
マウスも、あるいは照射された植えつけられていない対
照マウスも、どちらも牌臓、肝臓、肺、あるいは腹膜洗
滌液中に、検出し得る量の供給由来Ｇｌｕ　６　Ｐ　Ｉ
一α細胞は見い出せないことを示した。表１に示されて
いるように、移植１カ月では移植されたマウスから外植
された骨髄培養細胞中、付着性基質細胞の２６優が供給
由来であった。付着性基質細胞外植が確立され、１８日
目にＧ１ｕ６ＰＩ−αアロ酵素マーカーに対する特異的
抗血清（チャールズＣｈａｒｌｅｓら、１９８０、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２９、１１）と、
免疫ベルオキシダーゼ染色（ｐＡｐ）ｅ用いて供給由来
の基質細飽が確認された。これらの細胞は図１の上方パ
ネルに図示されて釦り、移ＷＩ後１カ月に移植を受けた
マウスのＲＮＡからインビトロで外植された付着性骨髄
細胞を示している。

図１の下方パネルは、照射はされているが移植を受けて
いない対照マウスから１カ月後にインビトロで外植され
た骨髄細胞を示している。供給由来の細胞はインビトロ
にかいて抗ネズミＧｌｕ６ＰＩ−α特異的ウサギ抗血清
と免疫ベルオキシダーゼ染色を用いて確認された。矢印
は染色性陽性細胞を示す。表１はｌた移植後２カ月と３
カ月の骨髄外植にかいて供給由来細胞の最も高い割合は
、それぞれ総付着性細胞の８　２．　５　％と６２．５
％であったことを示す。Ｇｌｕ６ＰＩ−α細胞は、移植
を受けたマウスのＲ｝｛Ｌ（１３−Ｇｙ照射）から確立
されたＬＴＢＭＣ中の付着性細胞７８ダを構成してい六
。７０日目のＬＴＢＭＣからとれた付着性基質細飽はト
リプシンで処理され、カノＺ−スリップ上に置かれてＰ
ＡＰ用の過程ケ受けた。供給由来のＧ１ｕ６ＰＩ−α１
細胞の割合は、非付着性細胞と、こ力らのＬＴＢＭＣに
由来する個々のＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーにｋいて０．
０１％以下であった。一方これらの同じＬＢＭＳからと
れた非付着性造血原細胞中に検出し得るＧｌｕ６ＰＩ−
α細胞はなかつｔｒ０照射、非移植の対照マウスからイ
ンサイツ、又はＬＴＢＭ（４１−いて検出し得るＧ　１
　ｕ６　　ＰＩ−α基質細胞は確認されなかった（図１
、下、表ｌ）。

照射、非移植の対照マウスとＧ　Ｂ　Ｌ　／　６　ｎｅ
ｏｒ細胞を移植されたマウスから外植された培養細胞中
、供給由来のＧ　Ｂ　Ｌ　ｎｅｏｒ細胞の回復はＧ４１
８（５００μｆ　／一）存在下での成長で選択される。

マウスは下に記述されているように、マウスあたり５Ｘ
１　０５ＧＢＬｎｅｏｒ細胞の移Ｓを受ける。

移植後２カ月で回復した細胞総数は以下の通りであった
：照射、非移植対照マウスでｉｄＲＨＬ（１３Ｇｙ）あ
たり５．８Ｘ１０ｇと左後肢（　３　Ｇｙ）あたり８．
６Ｘ１０６；移植を受けたマウスではＲＨＬ（１３Ｇｙ
）あたり６．５Ｘ１０’と左後肢（　３　Ｇｙ）あたり
６．９Ｘ１０’。付着性基質細胞の外植体がディッシュ
（６０Ｘ１０＋ｍ）あたり５Ｘ１０６細胞の割で確立さ
れた。いくつかはＧ４１８（５００μ２／一）が隔週お
きに与えられた。インビトロで培養細胞が確立してから
１７日間、Ｇ４１８抵抗性コロニーの数が数えられた。

表２は、移植を受けたマウスでは０４１８耐性基質細胞
コロニーが外植されたＲＨＬ骨髄中に見い出され、照射
された対照マウスでは見い出されなかったことを示して
いる。

カツコの中の値は、５Ｘ１０’細胞あたりの０４１８耐
性基質細胞コロニーの数を、５Ｘ１０”細胞あたシの基
質細胞コロニーの総数で割って１００をかけｆ，Ｇ４１
８耐性コロニーのパーセントコントロールを表わしてい
る。

移植されたＧ　Ｂ　Ｌ／６基質細胞の、インビトロにお
ける生理学的機能が判定された。月毎の間隔を釦いて、
Ｇ　Ｂ　Ｌ／６移植マウス、又は照射、非移植の対照マ
ウスのそれぞれの後肢からＬＴＢＭＣが個々に確立され
た。付着性基質細胞の機能的統合性は、インビトロに釦
いて７０日以上産生された非付着性細胞と多型潜存性原
細胞の加算総数で造血作用の寿命を測り、定量化された
。Ｇ　Ｂ　Ｌ／６細胞を移植されたマウスのＲＨＬから
外植した後、１、２、３カ月後、確立された骨髄培養あ
たりの産生される有効非付着性細胞の加算総数は、照射
、非移植の対照マウスからの培養細胞によって産生され
たものよう高かった。移植されたマウスから１、２、３
カ月後に確立された、下に記述されている過程を用いて
混在したＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーを形成する、多型潜
在性造血原細胞のＲＨＬ（１３Ｇｙ）あたりの加算総数
はそれぞれ３　０．５＋／　−　３．７　Ｘ　１　０”
　、４　５．６＋／−２．５Ｘ１　０”３　４．７＋／
−４．２　Ｘ　１　０２・であシ、照射、非移植対照マ
ウスの骨髄培養の５．１　３＋／−２．２Ｘ１０２７．
３＋／−０．９Ｘ１０２　　　６．０４＋／−〇．１３
Ｘ１０２と比較された（Ｐ＜，０．０５）。

供給基質細胞数の効果が照射マウスに訃ける造血作用の
回復でテストされた。マウスはＩＸＩＯ’５Ｘ１０５、
又１ｄｌＸ１０’　　の細胞を植えられた。

Ｇ　Ｂ　Ｌ／６細胞移植後２カ月で、長期性骨髄培養が
確立された。７０日間にわたってフラスコあたりの産生
される生存非付着性細飽が、それぞれＲＨＬ（１３Ｇｙ
）又はＬＨＬ（３Ｇｙ）培養でＣＦ’Ｕ−ＧＥＭＭにつ
いて行ったように定量化された。検出可能な、キメラの
基質細胞母集団が最底ＩＸＩＯ５基質細胞で確立された
。

移ｍ’ｉ受けたマウスのＲＨＬ培養による造血原細胞の
産生は、照射、非移植マウスの骨髄培養で５％であった
のに比べ、非照射マウスの培養で４８％のレベルに達し
た。左後肢に対する３　ＧＭのＸ線線量は、照射、非移
植マウスの骨髄培養に釦ける造血幹細胞産生を、非照射
マウスの培養の３５優に筐で減少させた。しかしながら
、ＧＢＬ／６＃Ｉ胞の植えつけは、この線量で照射され
た肢のＬＴＢＭＣにふ−ける細胞産生を検出し得る程に
は増加させなかった。

次に内在性ＣＦＵ−ＳによるＲＨＬ（１３Ｇｙ）の髄腔
内回復の効率と、末梢血球数の回復がＧＢＬ／６細胞移
植マウスと照射、非移植の対照マウスとに耘いて測定さ
れた。表３に示されるように、Ｃ　５　７　Ｂ　Ｌ／６
　Ｊマウスのグループが３Ｇｙから７Ｇｙ壕で２Ｇｙず
つ増加させて、かつＲＨＬぱ１０から１２．５Ｇｙ受け
るように照射された。各照射グループは、１グループに
つき５−１０匹のマウスを含む。すべてのマウスは更に
１０−１２．５ａｙ　ｆｎＨＬに受けた。１グループは
マウスあたり５Ｘ１０’ＧＢＬ／６の基質細胞が注射さ
れた。

カツコ内の値は、細胞を受けず、対照照射されたグルー
プのものである。照射と移植後６週間で、各グループの
サブグループが犠牲となった；各ＲＨＬから細胞が採取
されＣＦＵ−Ｓについてアツセイされた。結果は３から
５匹のマウスの平均±ＳＤで表現されている。平均４。

４±２．９の内在性ＣＦＵ−Ｓコロニーが、照射、非移
植マウスの牌臓で見られた。それぞれの照射線量グルー
プのサブグループは、マウスあたり５Ｘ１０５ＧＢＬ／
６細胞を注射された。照射と移植後６週間で、各線量グ
ループのそれぞれの動物からのＲＨＬは、ＣＦＵ−Ｓを
形成する多型潜在性幹細胞の数についてアツセイされた
。結果は、１グループにつき少なくとも３匹のマウスの
平均±ＳＤで表わされている。非照射マウスは白血球（
ＷＢＣ）数８．８±１．　６　Ｘ　１　０　／ｔｔｓ３
、血小板（ＰＬＴ）数１７３７±２８．７Ｘ１０３／洞
３、赤血球（ＲＢＣ）数７．８±０．０５Ｘ１０’／埴
３であった。

表３に示されているように、３から５Ｇｙの低いＴＢＩ
線量では、Ｇ　Ｂ　Ｌ／６移植マウスと照射、非移植マ
ウスに釦いてＲＨＬあたりのＣＦＵ−Ｓ形戊性多型潜在
幹細胞の数は似ていた。ところが一方，ＧＢＬ／６ＭＰ
Ｉ胞を移植されて致命的に近い１でに照射された（７−
Ｇｙ　　ＴＢＩ）マウスは、照射、非移植対照マウスの
ＲＨＬから回復したＣＦＵ−８形成幹細胞の数と比較し
て顕著に高いＣＦＵ−Ｓ形成性幹細胞数を示した（Ｐ（
０．０１照射、非移植の対照マウスの値と比較して）。

３から５ＧｙｏＴＢｆｉｌ量の後、マウスの末梢血球数
回復のキネティクスは、移植を受けたマウスと照射、非
移植対照マウスとで類似であった。

対照的に、照射、非移植対照と比べて（白血球数４±０
．０５Ｘ１０３細胞／１！！！＋３；血小板数５０±３
血小板／咽３；Ｐ（０．０５；表３）、末梢血白血球数
（６．９±１．ＯＸ１０３）と血小板数（１１２．５±
２．　５　Ｘ　１　０３／　ｍｎ３）の著しい回復が、
７Ｇｙ照射ＧＢＬ／６移植マウスに釦いて見られた。

このデータは、先行する照射が造血環境にある基質細胞
に損傷を与えることを示し、高い線量によって内在性造
血幹細胞がなくなった部位（ｎｉｃｈｅ）は、注入され
た供給細胞により効果的な接種部位を提供することを示
唆している。

ＴＧＦ−α　ｃＤＮＡを含む欠陥レトロウイルスベクタ
ーは、アンクルサリア　Ａｎｋｌｅｓａｒｉａら、同上
、に示されている、同系マウスに釦いてインビボで高線
量照射部位に植えつけが可能である、造血作用を支える
骨髄基質細胞株Ｇ　Ｂ　Ｌ／６に、エレクトロポレーシ
ョン（　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　）によって
トランスフエクトされた。植えつけられた、ＴＧＦ−ｄ
によってトランスフエクトされたＧＢＬ／６細胞株（Ｇ
ｐ−ＴＧＦα）は、照射部位に何カ月もの間安定して維
持され、表皮性或長因子（　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒ
ｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　　Ｅ　Ｆ　Ｇ　）と、そして
同じレセプターとに機能的に相同である成長因子のＴＧ
Ｆ一αリガンドを産生ずることが見い出された。

ＩＬ−３依存性造血原細胞株（３２ＤＣ１３）が、イン
ビトロでＧｐ−ＴＧＦα細胞上に植えつけられ、増殖す
る能力を持つことが選択遺伝子（大腸菌ｇｐｔ）とＥＧ
Ｆレセプター（ＥＧＦＲ）をコードする遺伝子の両方を
含む真核細胞用発現ベクターに３２ＤＣ１３をのせてト
ランスフエクトすることによって示された。ＥＧＦＲ遺
伝子の発現ハ、ＥＧＦへの反応に訃いて細胞分裂促進性
シグナルの活性化が結果として見られた（ピアスＰｉｅ
ｒｃｅら参照、サイエンスＳｃｉｅｎｃｅ　，　１　９
　８　８、２３９：６２３）。トランスフェクトされな
い対照３　２　Ｄ　Ｃ　１　３Ｍ胞ｔ６．、Ｇｐ−ＴＧ
Ｆｆｆ細胞株か又ＨＧＢＬ／６のいずれかと共培養され
ているのだが、増殖せずあるいはコブレストーン（ｃｏ
ｂｂｌｅ一ｓｔｏｎｅ　）領域も形或しなかった。ＥＧ
ＦＲがトランスフエクトしている３２ＤＣ１３細胞（３
２ＤＥＧＦＲ）は、インビト口で７週間以上Ｇｐ−ＴＧ
Ｆα細胞上で大量に増殖するが、Ｇ　Ｂ　Ｌ／６上では
増殖しない。対照的に、ＬＴＢＭＣ由来の造血原細胞は
、Ｇｐ−ＴＧＦα細胞よりＧ　Ｂ　Ｌ／６細胞上でよシ
効果的に増殖しＣＦＵ−ＧＥＭＭ原細胞を産生じたつこ
のように、レセプ倉／リガンド相互作用を確立すること
のできる細胞のみが、インビト口で植えつけと大量増殖
が可能であった。

これらの結果は表４に示されている。

３２Ｄ−ＥＧＦＲの、インビボで植えついたＧｐ−ＴＧ
Ｆα基質細胞に着床する能力がテストされた。照射済み
Ｃ５７Ｂ１／６マウスが５Ｘ１０’コのＧｐ−ＴＧＦα
細胞／マウスの割で移植を受けた。移植２カ月後にマイ
コフエノリン酸（ｍｙｃｏ−ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉ
ｄ　）耐性の３２Ｄ−ＥＧＦＲ細胞（１．ＯＸ１０７細
胞／マウス）がＧｐ−ＴＧＦα移植されたマウスと、照
射、非移植の対照マウスに注射された。供給由来である
ｎｅｏｒＴＧＲ−α産生性コロニー（１１．５±２．５
ＣＦＵ−Ｆ／肢）が照射、Ｇｐ−ＴＧＦα移植マウスの
骨髄外植体中に検出されたが、照射、非移植の対照マウ
スでは検出されなかった。３２Ｄ−ＥＧＦＲ１５．２±
８．ＯＸ１０’細胞／肢が、照射、Ｇｐ−ＴＧＦα移植
マウスの後肢外植体から回復し、照射、非移植の対照マ
ウスの後肢外植体からの０．５５＋０．１．ＯＸＩＯ５
３２Ｄ−ＥＧＦＲ細胞と比較された。これらのデータは
、トランスフエクトされた酵素をコードする遺伝子を含
む骨髄基質細胞が、照射済み骨腔内で確立され始め、着
床後その酵素が発現され始めたことを示唆する。

ｃＤＮＡクローンｐＳＰ６４−■（トールＴｏｏｌｅら
、１９８４、同上）由来のヒト凝固因子■−Ｃ遺伝子は
あらゆる適切なホ乳類発現ベクター、例えばベクターｐ
ＣＶＳＶＬ，内に導入し、ヒ１・基質細胞内で発耕させ
ることができる（ｐＣＶＳＶＬでの遺伝子発現はカウフ
マンＫａｕｆｍａｎｎ　ら、１９８２、Ｍｏｌ．　Ｃｅ
ｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２　：　１　３　０　４　；とク
ラークＣｌａｒｋら、１９８４、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．
Ａｃａ．　Ｓｅｔ．　８　１　：　２　５　４　１によ
って記述されている）。ヒト■−Ｃ因子遺伝子のコーデ
ィング領域のＤＮＡ配列がウッドＷｏ　ｏ　ｄら、１９
８４、同上、によって与えられてかり、ここで参考文献
中に付記されている。トールＴｏｏｌｅら、同上、によ
って記述されているように、因子ＶＩＩＩ−Ｃ遺伝子は
、遺伝子をＳａｌ　Ｉ断片としてとり出してＳａｌＩ接
着末端を含む合成オリコ゛ヌクレオチドを用いてｐｃＶ
ｓＶＬのＰｓｔ　Ｉ　　部位内にクローン化することが
できる。図３Ｋ示されているように、ｐｃＶｓＶＬ−Ｆ
■内のＶＩＩＩ−Ｃ因子遺伝子はアデノウイルス・メジ
ャー後期プロモーターの調制下に釦かれる。このプラス
ミドは壕たＳＶ４　０ポリアテニレーション部位（ＳＶ
４０　ｐｏｌｙ　Ａ），二つのＳ’Ｖ４０複製オリジン
（ＳＶ４００ｒｉ）、そして動物細胞に釦いてこのよう
なプラスミト゛の複製を促進する、ｐＢＲ３２２の欠失
（ラスキーＬｕｓｋｙら、１９８１、ネイチャーＮａｔ
ｕｒｅ　２　９　３　：７９）を含む。このベクター内
の選択遺伝子は、テトラサイクリン耐性（ＴｅｔＲ）と
マウスダイ／・イドロフオレート還元酵素（　Ｄ　Ｈ　
Ｆ　Ｒ　）をコードする。同様な■−Ｃ因子ホ乳類細胞
発現ベクターがカウフマンＫａｕｆｍａｎｎらによって
ＷＯ８７／０４１８７、ｐｕｂ．　　７月１７日、１９
８７、で詳細にわたって記述されてかり、ここで参考文
献中に付記されている。

培養体上澄中の■−Ｃ因子活性は、感度が００５ｍａ／
一　以上になるよう改良されたカビ・コーテスト　Ｋａ
ｂｉ　Ｃｏａｔｅｓｔ　）ＶＩＩＩ−〇因子法と、ＶＩ
ＩＩ−〇因子欠損血漿を用いた、一段階活性化部分トロ
ンポプラステン時間（　ｏｎｅ　−　ｓｔａｇｅ　ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄｐａｒｔｉａｔ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａ
ａｔｉｎ　ｔｉｍｅ）　（ＡＰＴＴ）凝固アツセイ（り
−Ｌｅｅら、１９８３、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．３０：
５１１）によって決定可能である。

コーテストアツセイは■α）因子による自然因子Ｘ（　
ｎａｔｕｒａｌ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｘ　）　　の活性に基
づいている；■ａ因子は■因子依存性である。ＡＰＴＴ
アツセイは、トロンビン存在下で■因子の凝固活性が著
明に増加することに基づいている。トロンビン活性化の
ために、試料は０．　２単位／ｍｔのトロンビンで１−
１０分間室温で前処理される。この代わシとして■因子
は、ウッドＷｏ　ｏ　ｄら、１９８４、同上、によって
記述されているように、■因子に特異的抗体を用いたラ
ジオイムノアツセイによって定量化することもできる。

ヒトＶＩＩＩ−Ｃ因子遺伝子とｎｅｏｒマーカー遺伝子
ヲ含ムヘクターを，エレクトロポレーション、レトロウ
イルスベクタートランスファー、あるいは他の適当な常
套のベクタートランスファー技術によってネズミ基質細
胞（ψ１１えばＧＢＬ／６細胞を含む）ヲトランスフエ
クトするのに使うことができる。

検出可能なレベルのヒ｝　Ｍｌｌ　−　Ｃ因子を発現す
る、Ｇ　Ｂ　Ｌ　／　６　ｎｅｏｒ細胞のサブクローナ
ル株はインビトロで、一貫したネオマイシン耐性と、こ
れらサブクローンの非血清に条件づけられた培地中でウ
エスタンプロット分析あるいは生化学的アツセイによっ
て検出し得るヒトＶＩＩＩ−Ｃ因子産生によって選択さ
れる。

Ｃ５６ＢＬ／６Ｊオスマウスが受容者として使用される
。これらの動物の細胞は、Ｙ染色体、リン酸化グルコー
スインメラーゼ（ＧＰＩＡ）のβ型、そして検出し得る
ネオマイシン耐性活性の欠除の３種類の″受容者″マー
カーを持つ。供給者由来細胞はＧＢＬ／６ｎｅｏｒ■−
Ｃ−１クローナル株からとられて、検出し得るＹ染色体
の欠除、ＧＰＩＡに対するヘテロ抗血清による検出可能
な免疫ベルオキシダーゼ染色、インビトロでの生物学的
ネオマイシン耐性、そしてヒト■−Ｃ因子の検出可能な
産生、０４種類の供給者由来マーカーを持つ。これらの
細胞の照射済みマウスへの植え付けのための投与量反応
曲線（　ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｃｕｒｖｅ　）は
以下のように作られた。

受容者マウスは、＋３？ｃｓγ細胞４０照射体による３
　０　０　ｃ　Ｇｙの全体照射（ＴＢＩ）と右後肢（Ｒ
ＨＬ）のみへの１０００ｃＧｙの照射を受ける。照射の
翌日動物たちは、ＩＸＩＯ’　　５Ｘ１０’、ＩＸ１０
５、あるいは５Ｘ１０５　　の高産生性ＧＢＬ／６ｎｅ
ｏｒ■Ｃクローナル株の単一細胞浮遊液を、尾の血管か
ら静脈注射される（ｌグループにつき１０匹のマウスの
プールされた細胞）。

マウスはその後カゴに帰され、血漿中の検出し得る■−
Ｃ因子について毎週モニターされる。代表的なマウスが
異なる時間点で犠牲にされ、心臓穿刺によって血漿が取
り除かれてウエスタンプロット分析によるヒト■−Ｃ因
子アッセイが行われる。

ヒト■−Ｃ因子は、モノクローナル抗ヒト■−Ｃ抗血清
（いくつかの公供施設から手に入る）に対する特異的反
応性の違いによってマウス■−Ｃ因子と判別可能である
。

各投与量グループのマウスを殺す時に、核を持つ細胞が
それぞれの動物の右と左の後肢から取シ除かれ、上に記
述されているように、継続的なネズミ骨髄培養を作り上
げるのに用いられる。右後肢からの骨髄培養は、供給者
由来のネオマイシン耐性基質細胞が高い割合で含１れて
いることが期待され、この月支の継続性骨髄培養はイン
ビトロで検出可能なヒトＶＩＩＩ−Ｃ因子を産生ずるこ
とが期待されるだろう。植え付けられたネズミの骨髄を
外植する時点は、他の中間時点と同様に基質細胞移植後
１週間、２カ月、４カ月、６カ月が選ばれる。

ヒト■−Ｃ因子の血漿レベルが測定され、期間中産生さ
れる■−Ｃ因子のレベルがグラフで示される。移植され
る基質細胞の至適数は１後肢のＶＩＩＩ−Ｃ因子産生の
最高レベルとの関連で決定される。

もし、１後肢の高線量照射後に供給細胞でその肢を再構
築した後、マウス血漿中のヒト■１−ｃ因子が検出でき
ないようならば、両後肢を照射して植え付けのためのよ
シ大きなニツチを調製するための連続的な”ニツチ（ｎ
ｉｃｈｅ）”調製プロトコールを使うことができる。こ
の試みは、総骨髄容量中のおきかわった供給基質細胞の
割合をよう太き〈する目的で、マウスのＳ　１／Ｓ　１
　　の大赤血球性貧血を検出可能レベルで変化させるた
めに使われた。

この株は骨髄微環境に遺伝的欠陥を持ち、戒熟赤血球前
駆体の欠除と多型潜在性造血幹細胞数の減少が結果とし
て見られる。

Ｓ　１／Ｓ　１ｄマウスの骨髄微環境の優勢なフラクシ
ョンは、２ＧｙＴＢＩと両後肢（ＢＨＬ，１回）への２
　０　ａｙか、あるいは連続した照射移植（複数回数）
で調製したマウスでお・きかえられた。成人受容者のＳ
１／ｓ１ｄマウスぱ１−２ＧｙＴＢ工と１　０．０　−
　２　０．Ｏ　Ｇｙを右後肢（ＲＨＬ）又は両後肢（　
Ｂ　Ｈ　Ｌ　）に、アンクレサリアＡｎｋｌｅｇａｒｉ
ａら、１９８７、同上、にょって記述されたように直線
的な増量を伴う照射を受けた。ＩＧｙ　ＴＢ■ト１　０
　Ｇｙ　Ｘａｍ舟カ、ｓ１／ｓ１ｄマウスのＴＢＩに対
する相対的感受性の故に、望１しい。

照射されたマウスに静脈注射によって５ＸＩＱ５基質細
胞（ＧＢＬｎｅｏ’）が移植された（１回）。

Ｓ　１／Ｓ１ｄマウスを用いた、連続した照射量増加と
移植実験のためＩＧｙＴＢＩとＲＨＬへの１０ＧｙがＯ
日目に直線的増量を伴って供給された。ＧＢＬｎｅｏｒ
細胞株の単一細胞浮遊液が４８時間後静脈注射された。

最初の照射から２カ月後、同じグループのマウスがＩＧ
ｙＴＢＩと左後肢（Ｌ｝ＩＬ）に１０Ｇｙを受けた。Ｇ
ＢＬｎｅｏｒ細胞株の再度の注射が４８時間後に予定さ
れた（複数移植）。照射、非移植の対照マウスは２Ｇｙ
ＴＢＩと１０Ｇｙを両後肢（ＢＨＬ）に受けた。

照射、非移植の対照マウスのうち生き残ったものは皆無
であった。ＧＢＬｎｅｏｒ移植マウス（２ＧｙＴＢＩと
２０ＧｙＢＨＬ）の５カ月目から確立されたＬＴＢＭＣ
は、右（　２　９　８．　８±３２．７）と左（４１５
．８±３６．５）後肢培養両者とも非照射Ｓｌ／Ｓｌ　
　マウスと比較して増加した加算ＣＦＵ−ＧＥＭＭ形成
原細胞数／フラスコを示した（Ｐ（０．０５、図２）。

照射と移植後２カ月、又は４カ月に３匹のマウス／グル
ープからＬＴＢＭが確立された。別の実験で、マウスが
２回目の照射と移植を受けてから２カ月後に、ＧＢＬｎ
ｅｏｒ移植されたマウスの植えつけられた右（１３６．
１±３２）と左（７８６±１５．４）後肢から確立され
たＬＴＢＭＣにかいてフラスコあたり得られたＣＦＵ−
ＧＥＭＭ形成原細胞の加算数は非照射の対照、Ｓｌ／Ｓ
ｌ　　マウスからのものに比べて高かった。図２におい
てそれぞれの細胞を、非照射対照マウスは白丸で、ＧＢ
Ｌｎｅｏｒ移植されたＲＨＬ−２０Ｇｙマウスは白四角
で、ＧＢＬｎｅｏｒ移植されたＬＨＬ−２０Ｇｙマウス
は黒三角で、そしてＧＢＬｎｅｏｒ移植されたＬ｝｛Ｌ
−１０Ｇｙは黒四角で表わしてある。

このように、Ｓ１／Ｓ１ｄマウスにかいて高線量の照射
は、移植された基質細胞を支持する髄腔内゜゛ニツチ”
を作るのを助けるかもしれなく、１た造血作用を抑制す
る内在性基質細胞を除くのかもしれない。

インビボにふ・いて植えつけられた供給基質細胞数は上
で記述されたようにネオマイシン耐性基質細胞のコロニ
ーアツセイによって定量される。このアツセイは、外植
された有核骨髄細胞について一連の１０倍希釈をある一
定希釈数１で行い、１００μｆ／ｒｎ７！のＧ４１８濃
度下でぱトリ皿ヘプレートし、５０細胞以上のコロニー
を７日目に数えて行われる。

ヒト■−Ｃ因子産生レベルを植えつけられた基質細胞数
に相関させて定量化するために、植えつけられたコロニ
ー形成性基質細胞数が上記のように決定され、外植に続
いて、インビボとインビトロで検出できるヒトＶＩＩＩ
−Ｃ因子のレベルが、同じ〈上記のように決定される。

これらの実験は、インビボのマウスに訃いて■−Ｃ因子
が６カ月にもわたって安定したレベルで検出できること
を示している。

次の過程は、上で述べられたネズミ組織のためのプロト
コールと同様な基質細胞着床プロトコールを用いて，ヒ
トに釦けるＡ型血友病がインビボで是正されることを示
すためにデサインされた。

受容者は同じような高線量照射技法で調製される。

以前ＫＨＩＶ汚染血漿誘導品からヒト免疫不全ウイルス
に感染したＡ型血友病患者からの有核骨髄細胞が、同意
を得た後外植さＤる。これらの骨髄は、適当な培地にハ
イドロコルチゾン・ヘミコハク酸ナトリウムを加えた調
製技術でヒト継続性骨髄培地に確立される。

移植を受ける患者の骨髄が腸骨稜から約３Ｘｌ０８Ｏ有
核細胞を含んで吸い上げられる。骨髄細胞収集技術はこ
こに参考文献として記載されているバツハナ−Ｂｕｃｈ
ｎｅｒら、１９８４、ブラツドＢｌｏｏｄ６４　：　６
３０、とトーマスＴｈｏｍａｓら、１，９７０，ブラッ
ド３６：５０７、が、ジンＪｉｎらによる変法．１９８
５、Ｅｘｐ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　１　３　：　８　７
　９として記述されて釦り、ここに参考文献として記載
されている。

簡単に述べると、腰部の施術によって切開手術なしで得
られた骨髄標本はマツコイ（　Ｍｅ　Ｃｏｙ　）の５Ａ
培地中ではさみできざ１れて骨片なしに精製され、髄は
３０ゲージ１での漸次的に小さなゲージ針を通過させて
単一細胞の浮遊液が調製される。３Ｘ１０’から４Ｘ１
０’の有核骨髄細胞を、すでに記述されたように（グリ
ーン／ζ−グＧｒｅｅｎ−ｂｅｒｇら、ブラツドＢｌｏ
ｏｄ　　５８：７２４、１９８１）、マツコイの５Ａ培
地に１２５％の熱非活性化された胎児性コウシ血清、１
２、５％の熱非活性化されたウマ血゛清、１０−’ｍｏ
ｌ／Ｌのハイドロコルチゾンを追加してコーニン゜グＣ
ｏｒｎｉｎｇの２５ＣＣプラスチックフラスコ各々に接
種し、培養体が確立される。培養細胞は３３℃でインキ
ユベートされ７から１４日間静置してかかれる；この時
間は、長期造血作用に伴う造血基質細胞島の付着に絶対
的に要求される。この初期インキュベーションの後、す
べての非付着性細胞はアスピレーションで移動させられ
、赤血球を除くためにファイコール・ハイパークＦｉｃ
ｏｌ　１　−　Ｈｙｐａｑｕｅ　　比重分離が行われる
。すべての有核細飽ぱそのちと新鮮な培地の入った個々
の培養フラスコに戻される。培養細胞はそれから最初の
４週間は週に２回、その後は週に１回、毎回すべての培
地と非付着性細胞がとり除かれ、８．０−の新鮮な培地
が入れられて給餌される。それからヒト基質細胞が、ネ
ズミ細胞について上で記述されたように、ヒトＶＩＩＩ
−Ｃ因子遺伝子を含むベクターで、エレクトロ　ポレー
ション、レトロウイルスベクタートランスファー、ある
いは他の適当な技術によって１・ランスフ″エクトされ
る。

トランスフエクトされてＶＩＩＩ−Ｃ因子を発現してい
る基質細胞の数は、上に記述されているように、ＶＩＩ
Ｉ−〇因子遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子につないで
ｎｅｏ　　耐性コロニーを選択するか、あるいは株を培
養細胞にサブクローニングしてその上澄中の検出可能な
レベルの■因子κついてアツセイ／一 するかのいずれかか、あるいは渣さ抗ヒト■−Ｃ因子の
モノクローナル抗体を使って、検出可能な■Ｃ因子を産
生ずる細胞を免疫ベルオキシダーゼ技法で染色して、定
量化が行われる。ベクターのトランスフエクション系は
、トランスフエクトされた基質細胞のＶＩＩＩ−Ｃ遺伝
子発現の頻度が最犬になるような方法が選択される。ネ
オマイシン耐性遺伝子を持つベクターｐ　Ｚ　Ｉ　Ｐ　
−　Ｎｅｏ　ＳＶ（Ｘ）が新鮮ヒト基質細胞にトランス
フエクトされた時、ネオマイシン耐性は、通常ネオマイ
シン類似体の０４１８に感受性を持つ細胞の約１０−１
５％に釦いてインビトロで安定に発現された。このｎｅ
ｏｒ実験に基づいて、ヒト基質細胞の少なくとも１０％
は安定にＶＩＩＩ−Ｃ因子を発現することが期待される
。もしこれよシ低い数字が検出されたなら、クローン化
された永続ヒト骨髄基質株、ＫＭＩＯＩ、ＫＭ１０２、
ＫＭ１０３、ＫＭ１０４、ＫＭ１０５がトランスフエク
ションと、インビトロでのＶＩＩＩ−Ｃ因子遺伝子の検
出の見込みを最大にするため使用される（フィツツジエ
ラルドＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ　Ｃ）、１９８８、Ｉｎｔ
．　Ｊ．　Ｒａｄ．　Ｏｎｃｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｐｈ
ｙｓ．１５：１１５３）。ＶＩＩＩ−〇因子の産生はク
ローナル株で定量され、Ｇ　Ｂ　Ｌ　／　６　ｎｅｏｒ
マウス株で検出される■Ｃ因子と細胞あたりで比較され
る。毒物性と発癌性の実験が下記のように行われる。

ヒト基質細胞株のイ／ビドロでの成長は、工４プスタイ
ン●バーウイルス（　Ｅｐｓｔｅｉｎ　−　Ｂａｒｒ　
）（ロースタインＲｏｔｈｓｔｅｉｎら、１９８５、ブ
ラツドＢｌｏｏｄ　６　５　：　７　４　４　）の活性
化や、マイコプラズマ、細菌、あるいは真菌の感染を含
む病原体によるインビトロ培養中の基質細胞の汚染、１
た腫膓誘発性株への自然発生的形質転換などを含む潜在
的問題を伴っている。基質細胞の微生物による汚染は、
材料を微生物、ウイルス、そしてマイコプラズマについ
てアツセイすることでモニターされる。細胞はエプスタ
インノＺ−ウィルス核抗原について、ロースタインＲｏ
ｔｈｓｔｅｉｎら、同上、によって記述されているよう
にテストされ、さらに電子顕微鏡によってエプスタイン
・バーウイルス活性化の証拠のあるなしを決定してスク
リーンされる。ＥＢＶはヒト骨髄基質細胞では、継続性
のインビトロ培養の２０−２５週以前には全く検出され
ていない。ＥＢＶ活性の機序は知られていないが、対照
ヒト骨髄培養中に低い頻度で検出される。

自然発生的な腫膓形成性がＶＩＩＩ−Ｃ因子遺伝子の挿
入に続いてひき訃こされるものであるかどうかを決定す
るため■−Ｃ因子を発現している基質細胞培養体をヌー
ドマウスに１×１０７細胞腹膜、静脈、あるいはカテー
テルから植えつける。これらの動物は６カ月間腫膓が検
出されるかどうかモニターされる。ヌードマウスでのこ
れらの実験の陽性対照は、ヒト旺膓細胞株ＨＬ６０とＵ
９３７（グリーンバーガーＧｒｅｅｎ　ｂｅｒｇｅｒら
、１９７８、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　　３　８　：　
３　３　４　０　）　ｆ含む。これらの基準を用いて、
ＶＩＩＩ−〇因子を発現しているヒト骨髄基質細胞の腫
膓形成性の証拠を検出することが可能になる；新しく外
植されたヒト基質細胞の１０％が、そしておそら＜５０
−６０％に及んでトランスフエクトされたＶＩＩＩ−Ｃ
因子遺伝子を発現させるためであろう。

各患者は、自分自身の■−Ｃ因子トランスフエクトされ
た基質細胞の自家移植のため１つの腸骨稜を照射して調
製される。照射療法部位ｉ４１Ｏｍ幅Ｘ１０ｚ長さを越
えない範囲で腸骨稜と坐骨の一部を合わせて選択されて
膀胱と直腸は片側だけ？！，蔽されるか，あるいはそこ
の領域の腸、膀胱、他の通常柔い組織の容積を最小限に
するため、角度をつけたＡＰ−ＰＡ範囲が選ばれる。１
０００ｃＧｙの１回分の画分ｉ　（　ｆｒａｃｔｉｏｎ
　　ｓｉｚｅ　）が、ＡＰ−ＰＡ又は反対の斜角法によ
って骨髄のこの部分に与えられる。何回かに分けられた
（　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ　）放射療法はより適切
テアり、》そらくヒトが高線量照射ニツチを調製するの
により容易に耐えられる。基本的なヒト放射線生物学的
パラメーターは、１日５００ｃＧｙ２日間か、あるいは
１日３　０　０　ｃ　Ｇｙを１０日間は、１０００ｃＧ
ｙを１回と等しい同位効果（　ｉｓｏｅｆｅｃｔ　）を
産むはずである、と示唆している（フレツチャーＦｌｅ
ｔｃｈｅｒ，　ｅｄ．，　　テキストブツクオブラジオ
セラピー　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｔｈｅ
ｒａｐｙ，１９８０、３　ｒｄｅｄ．，　　りーとフエ
ビンジャー　Ｌｅｅ　　ａｎｄＦｅｂｉｎｇａｒ，　Ｐ
ｈｉｌａ，　Ｃｈｐ．　２、ｐｐ．１８０一２１９参照
）。（腸骨稜１カ所に与えられる１　０　０　ｃ　Ｇｙ
は不都合な効果を生豊ないと期待され、一般に苦痛を伴
う転移を持つ単独の骨に軽減放射療法として用いられる
。）腸骨稜の１回分照射の翌日、患者はヒトＶＩＩＩ−
Ｃ因子を発現している自己骨髄基質細胞の単一浮遊液の
静脈注入を受ける。それから患者の血漿は毎週検出でき
るヒト■−Ｃ因子レベルについてモニターされる。

もし選択された、ＩＸＩＯ’の注入細胞数が高線量照射
ニツチに選択的に接種するのに適切であるならば植えら
れた自己基質細胞によるヒトＶＩＩＩ−Ｃ因子産生が検
出されることが期待される。もし血漿中にＶＩＩＩ−Ｃ
因子が検出されなければ、照射された部位への適切な接
種が行われたかどうか決定することが必要になる。

患者は植えつけに先がけてインビボ接種を供給基質細胞
のインジウムオキシン（　ｉｎｄｉｕｍ　ｏｘｉｎｅ　
）ラベルによってモニターされる。ガンマカメラの全身
スキャンが、植えつけ後２４時間行われ、細胞が優先的
に高＃！量照射骨に接種するかどうかが決定される。ネ
ズミのモデルで行われたアッセイはすでに高線量照射肢
が優先的に注入基質細胞を取シこみ、インジウムのラベ
ルは４８時間安定であることを示した。インジウムオキ
シンのｉｔはホジキン病Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ　ｄｉｓｅ
ａｓｅ　でリンパ球のシ 定着のための核医学のリンフオ牛ントグラムｌｙｍｐｈ
ｏｓｃ　ｉｎｔｏ　−　ｇｒａｍスキャンニング技術で
、筐た、脊髄の変質形成や骨髄伊維症の患者のための赤
血球腐骨形成実験で使われるものと同程度の量が使用さ
れる。

もし■−Ｃ因子レベルが当初血漿中に検出されて、それ
から急速に減少するなら、その原因が細−胞接着の不安
定性のせいなのかあるいはベクターの発現不安定がこの
失敗の原因であるのかが決定される。ベクター不安定性
は標準的方法で、即ちインビト口でのＶＩＩＩ−Ｃ因子
遺伝子の発現ベクターの変形あるいは入れ換えで正すこ
とができる；いかなる変形も新しく外植されたヒト骨髄
又はクローナルヒト骨髄基質細胞株によって行われる作
業に由来するデータを使用する。接着の不安定性は、イ
ンビボで植えつけられて３５８の半減期と同じ期間の１
００日間観察されたＳ３６標識されたヒト骨髄基質細胞
を用いたインビボにかける実験によって決定される。最
初に高線量照射骨で検出されるＳ３５ぱ、その高線量領
域で１００日間継続して検出されるはずである；スキャ
ンによって検出できるＳ３５の減少は、接着部位での細
胞の不安定性を示唆する。１０００ｃＧｙ後接着は適切
に行われ、安定であることが期待されるのだが、もしこ
のことがかこるなら、ニツチを調製する他の方法を使う
ことができる。

基質細胞の高線量照射骨への適切な着床と安定なベクタ
ー発現にもかかわらず、適切なレベルのＶＩＩＩ−Ｃ因
子検出の失敗は、相対的基質細胞数の不適切を伴ってい
るかもしれない。この問題はｓ１／Ｓ１　マウス変異モ
デルで要求されたものと同様なニツチをいくつか調製す
ることによって是正されるかもしれない。この方法論に
従えば、上で記述されたものと同じ高線量照射概要、何
回かに分けられた照射概要を用いて両方の腸骨稜か又は
１腸骨稜と１大腿骨がよジ大きなニッチとして調製され
る。それぞれトランスフェクトされ■−Ｃ因子を発現す
る、ヒト骨髄培養由来の供給基質細胞の１回、又は複数
回の植えつけがそれから行われる。

ＶＩＩＩ−〇因子遺伝子を含むウィルスベクターが、感
染あるいはトランスフェクションいずれかによってヒト
基質細胞内に導入することができる。組換えウイルスＤ
ＮＡは、適当なヘルパーウィルスの存在下で増殖でき、
感染ビリオン（　ｖｉｒｉｏｎ　）にパッケージされる
ことができる、１たあるいはパツケージングー欠陥ウイ
ルス産生株に訃いて増殖されることができる。感染ウイ
ルスは、例えばマウスＮ　Ｉ　Ｈ／３　Ｔ　３や１２の
ような組換え体ウイルスＤＮＡにトランスフエクトされ
た細胞株から産生ずることができる。細胞はセプコ　Ｃ
ｅｐｋｏら、１９８４、セル　Ｃｅｌｌ　　３７：１０
５７、に記述されたように育つことができて、感染は８
μ２／一のポリープレン　ｐｏｌｙ　ｂｒｅｎｅ　（シ
グマＳｉｇｍａ）存在下で行われる。

レトロウイルスは、１本鎖ＲＮＡ分子を含み、ウイルス
感染に用いることができる；それらのＲＮＡは細胞内で
２本鎖プロウイルスＤＮＡに変換され、ロングターミナ
ルリピート（Ｉ，ＴＲ）１作るためウイルスの配列の１
末端が重複化（　ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）　された
後宿主のゲノムに組み込１れる。組換え体レトロウイル
スのヘルパー抜きのストックは、ヘルパー細胞株を組換
え体レトロウイルスベクターでトランスフエクションシ
タ後、その細胞株で産生される。ヘルパー細胞株はその
レトロウイルスゲノムの組みこ１れたコピーを持ってい
る。そのプロウイルスは、組換見体ゲノムの複製とカプ
シド化（　ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ　）に必要な実
行機能のすべてを供給するが、自分自身のＲＮＡをカプ
シド化する能力に欠けている。

ＳＶ４０由来のプラスミドベクターは、サルＣＯＳ細胞
内で外染色体的に（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
ｌｙ）複製することができる（グルツマン　Ｇｌｕｚｍ
ａｎ，１９８１、セルＣｅｌｌ　　２３：１７５）ｏ様
々な真核細胞内で（例えばヒト、サル、イヌなど）自律
的に複製できるベクターがパウエルズＰｏｕｗｅｌｓら
、ｅｄｓ．，”クローニングベクターズＣｌｏｎｉｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒｓ　　　１　９　８　５、Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ　Ｓｅｔ．　Ｐｕｂ．，Ｂ，Ｖ．，に記述されてかっ
、ここでは参考文献として付記されている。動物細胞用
の、レプリコン（　ｒｅｐｌｉｃｏｎ　）なしのベクタ
ーはたいてい大腸菌用のレプリフンを持つ。そのような
ベクターは、パウエルズＰｏｕｗｅｌｓらによってやは
シ記述されているのだが、動物細胞内で外染色体的に複
製することができない；トランスフオーマント（　ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　）は宿主ゲノムに組みこ捷れて
選択マーカーが発現した時のみ分離され得る。

動物細胞ベクターの詳細な記述はライビーＲｉｇｂｙ，
１９８３、Ｊ，　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６　４　：
　２　５　５　：エルダ−　Ｅｌｄｅｒ　ら、１９８１
、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．１５：２９５；サ
ブラマニＳｕｂｒａｍａｎｉら、１９８３、Ａｎａｌ．
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１　３　５　：　１　　に見い出
される。

安定なトランスフオーマントの選択はたくさんの遺伝的
マーカーを用いて行うことができる、例えばマイコフエ
ノリン酸（　ｍｙｃｏ−ｐｈｅｎｏｌｉｎ　ａｃｉｄ）
耐性をコードする大腸菌ｇｐｔ遺伝子、抗生物質０４１
８耐性をコードするＴＮ５由来のｎｅｏ　　遺伝子、Ｄ
　Ｈ　Ｐ　Ｒ−細胞の表現型をＤＨＦＲ＋に変えるネズ
ミ細胞又は大腸菌由来のｄｈｆｒ配列、そしてＴＫ一細
胞の表現型をＴＫ＋細胞にするヘルぱスシンプレクス　
ウイルスｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘｙｉｒｕｓ　　
のｔＫ遺伝子など。

強力なプロモーター、例えばＳＶ４０ウイルスの初期（
ｅａｒｌｙ）と後期（　ｌａｔｅ　）　プロモーター（
Ｐｓｖ４ｏＥ，　ＰｓｖｉｏＬ）、アデノウイルスの主
要後期プロモーター（　ｍａｊ’ｏｒ　ｌａｔｅ　ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ　）（ＰＡｄｍｌ，）、７．　５　Ｋ　Ｄ
のタンパク質をコードするバクシニ″ア（　ｖａｃｃｉ
ｎｉａ　）遺伝子のプロモーター、そしてネズミ　メタ
ロサイオナイン（　ｍｅｔａｌｌｏ−ｔｈｉｏｎｅｉｎ
　）遺伝子のプロモーターなど、の条件下で興味の対象
の遺伝子を入れることによってその遺伝子が効果的に発
現するような、安定したヒト基質細胞株を作り上げるこ
とが可能である。

望む遺伝子のトランスフエクションに用いられるだろう
もう１つのベクターは、レトロウイルスｐＮ２　−　Ｆ
’ＡＴ　（ガーバー　Ｃａｒｖｅｒら、１９８Ｉ、同上
）で、これは挿入された遺伝子、この場合ヒトαビ抗ト
リプシンをコードする遺伝子、の転写のためのＳＶ４０
初期プロモーターを含んでいる。

このα１　抗トリプシン遺伝子は制限酵素Ｈｉｎｄ　■
とＸｈｏｌＫよる切断（部分的）と、もし必要ならばこ
れらの末端又は挿入遺伝子の末端の、常套技術に従った
変形によってとり除き望む遺伝子でかき変えられること
ができる。

レトロウイルス仲介の遺伝子移動は、例えばウィルソン
ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａ．　Ｓｃ
ｉ８５：３０１４に、複製欠陥レトロウィルスを用いて
大人のラット肝細胞内に遺伝子を導入する方法が記述さ
れているように、あらゆる適切な方法によって行うこと
ができる。

表２． 表　２ 移植を受けたネズミから外植された培養にかける供給由
来ＧＢＬｎｅｏｒ細胞の回復表１ 表１．移植を受けたマウスから外植された骨髄中の供給
由来基質細胞の同定 供給由来Ｇ１ｕ６ＰＩ−α“細胞、多 １ ２ ３ ０ ＩＸＩＯ’ ０ １×１０５ ５Ｘ１０５ ＩＸＩＯ’ ０ １×１０６ （０．　０１ ２６．２±　３．２ （０．０１ ７５．５±　９．５ ８２．５±　０．５ ５９．０±１４．４ ＜ｏ．ｏｉ ６２．５±１２．５ （０．０１ ２８．４±４．４ （０．０１ ６５．０±２ ３２．５±３．５ １６　±Ｏ （０．０１ （０．０１ 未試験 末試験 （０．０１ ７６．７±１５．７ ７８０±０ 未試験 （０．０１ 未試験 グループ 右 左 右 左 表３． 表　　３ Ｇ　Ｂ　Ｌ／６基質細胞株を移植されたＣ５７ＢＬ／６
Ｊマウスに釦ける造血機能の回復３．０　　　９２．０
±２４．５ （１０４．６±２６．０） ５．２　　１０８。３±９．２ （１３２．５±２４．４） ７．０　　１０１．８±１１．Ｐ （４９．１±９．５） ８３±１．５　　１５６．５±６．５ （７．２±０．３）　（１２６．５±５．５）６．８±
０．３　　１３１．５±１０．５（５．７±０．６）　
（１０８．０±１．０）６．９±１．０　　１１２．５
±２．５（４．０±０．０５）　（５０．０±３０）７
．７±００３ （８．２±００２） ８．２±０，Ｏ５ （７．４±０．１２） ７．５±０．５ （５．９±１．３）

【図面の簡単な説明】

第１図は、植えつけ後１ケ月で移植された供給マウスか
ら、または非移植照射マウスから外植された付着細胞の
説明図である。 第２図は、Ｓ１／Ｓ１ｄマウスから確立されたＬＴＢＭ
Ｃからの造血原細胞の成長を示すグラフである。 第３図は、ヒト第■因子を含むレトロウイルスベクター
の模式図である。 （外４名） ＦＩＧ．３ 〜 手 続 補 正 書 平成 ２年特許願第２４３０４号 ２，発明の名称 基質細胞を用いた遺伝子治療 ３． 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 氏　名　　ジョエル・エス・グリーンバーガー（外１名
） ４．代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号 新大手町ビル　２０６区 ５． 補正の対象 委任状及訳文 タイプ印書により浄書した明細書 手 続 補 正 書（方式） 平成 ２年 ６月２１Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、患者が欠陥に苦しんでいる、生物学的に活性のある
   酵素の産生とヒト患者血流内に分泌をおこす方法であつ
   て、上述の方法は上述の酵素をコードする遺伝子でトラ
   ンスフエクトされた供給骨髄基質細胞の上述ヒト患者へ
   の導入よりなり、上述の導入された供給細胞は上述ヒト
   患者の骨腔内表面に付着する能力を持つ上記方法。 ２　上述の酵素がリンフオカイン、成長因子、造血因子
   、あるいは通常は血漿中に見い出される、例えば血液凝
   固因子のような欠陥タンパク質である、請求項１記載の
   方法。 ３、上述の血液凝固因子がヒト第VIII−Ｃ因子である、
   請求項２記載の方法。 ４、上述の供給基質細胞が自己細胞である、請求項１記
   載の方法。 ５、上述の供給基質細胞のヒト患者の骨への付着が、造
   血細胞を殺し上述の基質細胞は殺さない照射の範囲での
   線量で上述の骨を照射して容易化される請求項１記載の
   方法。 ６、上述の骨が上述ヒト患者の長骨である、請求項５記
   載の方法。