JPH0314814A - 化学的に変性した親水性ポリ尿素―ウレタンプレポリマーおよびポリマーからなる細胞増殖エンハンサーおよび／または抗体産生刺激因子 - Google Patents

化学的に変性した親水性ポリ尿素―ウレタンプレポリマーおよびポリマーからなる細胞増殖エンハンサーおよび／または抗体産生刺激因子

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JPH0314814A
JPH0314814A JP2050850A JP5085090A JPH0314814A JP H0314814 A JPH0314814 A JP H0314814A JP 2050850 A JP2050850 A JP 2050850A JP 5085090 A JP5085090 A JP 5085090A JP H0314814 A JPH0314814 A JP H0314814A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、培養した細胞系のために使用する戊長培地に
おける付加物に関する。とくに、本発明は、変性または
誘導したグレポリマーおよびポリマーの独特の系列から
なる、啼乳動物の細胞の増殖エンハンサーおよび抗体産
生刺激因子に関する。
プレポリマーは、実質的にエチレンオキシドに基づく単
位である、イソシアネート末端キャップドモノマーおよ
びポリオールから形成する。変性は、少なくとも１つの
ＮＣＯ反応性基を有する反応性化合物とプレポリマーを
接触させることによって達成される。ＮＣＯ反応性は、
スルフヒドリル（−ＳＨ），アミン（一ＮＨ２）、また
はカルボキンル（−ＣＯＯＨ）基において見いだすこと
ができる。ＮＣＯ基を変性すると、誘導化合物は追加の
「遊離」官能基を発現し、そして細胞増殖エンハンサー
の性質により特徴づけられる。これは、変性されたプレ
ポリマーまたはポリマー上の遊離官能基がスルフヒドリ
ル，（−ＳＨ）、スルホン酸基（ＳＯ．ＯＨ）または遊
離アミノ（ＮＨ２）であるとき真実である。ある場合に
おいて、例えば、スルフヒドリルまたはスルホン酸が発
現されるとき、細胞の抗体の産生は刺激される。さらに
、変性されたプレポリマーまたはポリマーは２またはそ
れ以上の上の官能基を発現することができる。
特許請求の範囲の細胞増殖エンハンサ−および／または
抗体産生刺激因子の最終の形態は、変性プレポリマー、
変性プレポリマーの重合からの変性ポリマー単位、また
は変性プレポリマーから形成されたポリウレタンゲルか
らの溶解生成物からなる変性ポリマー単位の形態である
ことができる。
本発明は、要約すれば、次の通りである：変性親水性プ
レポリマーおよびポリマーを開示し、ここでプレポリマ
ーおよびポリマーは細胞増殖の増強および、ある場合に
おいて、抗体産生刺激により特徴づけられる。イソシア
ネートキャップドオキシエチレンに基づくプレポリマー
は、少なくとも１つのイソシアネート（ＮＣＯ）反応性
基を有する化合物との反応性より変性される。好ましく
は、ＮＣＯ反応性基は、スルフヒドリル基、アミン基ま
たはカルボキシル基であり、プレポリマー〇イソシアネ
ート基の少なくとも一部分を変性するために十分な量で
存在する。プレポリマーおよびポリマーは、また、遊離
官能基、好ましくはアミノ、スルホン酸またはスルフヒ
ドリルを発現する。遊離官能基がスルフヒドリルまたは
スルホン酸であるとき、抗体産生刺激、ならびに細胞増
殖の増強が観測される。
Ａ，先行技術のプレポリマーおよび生ずるヒドロゲル 発泡および非発泡である、多数のポリウレタンポリマー
は従来同定されてきている。非発泡材料のうちで、種々
のプレポリマーから調製された、非常にわずかのヒドロ
ゲルポリマーは、調製され、そして広く変化する用途に
ついて使用されてきている。典型的には、ヒドロゲルは
親水性モノマーを水溶液中で、プレポリマーが架橋する
ようになる条件下に重合させ、溶液をゲル化する三次元
のネットワークを形成することによって形成される。
ポリウレタンのヒドロゲルは、イソシアネート末端キャ
ップドプレポリマーを重合させて、尿素およびウレタン
の結合を形成することによって形成される。
前に開示されたポリウレタンのヒドロゲルの代表例は、
次のものを包含する：米国特許第４．２４１，５３７号
（Ｗｏｏｄ）は、連鎖延長ポリオールから調製された親
水性ポリウレタンゲル組或物からなる植物戊長培地を開
示している；プレポリマーが室温において液体であるよ
うに、５０％までのプロピレンオキシド単位を使用する
、ランダム共重合は好ましい。米国特許第３．９３９，
１２３号（Ｍａｔｔｈｅｖｓ）は、３５％までのポリ（
エチレンオキシ）グリコールまたはポリ（プチレンオキ
シ）グリコールを有するポリ（エチレンオキシ）グリコ
ールからなる、イソシアネート末端プレポリマーの軽度
に架檎したポリウレタンポリマーを開示している。この
米国特許のポリマーの調製において、有機ポリアミンを
架橋剤として使用する。
この米国特許のプレポリマーは、それが教示するように
重合すると、架橋した三次元の構造を形成する。米国特
許第４，１８２．８２７号（　Ｊ　ｏｎｅｓ）は、ポリ
ウレタンヒドロゲルの形成におけるポリアミンの同様な
使用を開示している。
Ｂ．先行技術の変性ポリマーおよび生ずるポリマいくつ
かのタイプの化合物を、プレポリマーまたはマトリック
スのベースと反応させて、生物学的活性剤の取り付けま
たは固定化においてスペースまＩ；はカップリング化合
物として作用させてきている。例えば、米国特許第４．
２２６，９３５号（　Ｆ　ｕｓｅｅ）は、アミノ酸およ
び／またはタンパク質を過剰のウレタンプレポリマーと
反応させ、生ずる生成物を硬化してポリマーマトリック
スを形威し、そして酵素をそれにカーポジイミドの使用
によりカップリングすることを開示している。米国特許
第４，１７７．０３８号（　Ｂ　ｉｅｂｒｉｃｈｅｒら
）は、ジアミン、アミノーアルコールまたはジオールで
あることができる、スペーサーの使用を教示している。
変性ポリウレタンポリマーは、また、調製されてきてい
る。米国特許第４．４３９．５８５号（Ｇｏｕｌｄら）
は、親水性ポリウレタン樹脂の存在下にジアクリレート
を反応させて得られた、ポリウレタンジアクリレート組
戊物を教示している。米国特許第４．４８５．２２５号
（　Ｆ　ａｘ）は、プレポリマーを第一アミンと、次い
でアミン反応剤と縮合させることによって調製された、
ポリ（エーテルーウレタンー尿素）を開示している。米
国特許第４．５６９．９８１号（Ｗｅｎｚｅｌら）は、
イオン性基および／またはエチレンオキシド基で親木的
に変性された、イソシアネート末端プレポリマーに基づ
く水分教性プラスチック前駆体を開示している。
先行技術の細胞増殖エンハンサー 細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生刺激因子の先行技
術は、多数の組戊物を開示している。これらの組戊物は
、媒質中に存在する血清の量を減少するか、あるいはそ
の存在のすべてを排除して、この分野においてよく知ら
れている問題、例えば、動物の病原体による汚染、細胞
増殖の阻害への寄与などを解決する試みの結果である。
しかしながら、血清は、また、細胞の増殖を促進すると
き非常に有用であることが証明され、そして細胞の抗体
の産生を最大にするための細胞にとって好都合な環境を
提供する。こうして、血清を欠失する試みは、ちょうど
有益である他の媒質で血清を置換する試みに導いｔ：。
例えば、シャクタ−（　Ｓ　ｃｈａｃｔｅｒ）は、「発
育因子一依存性および一独立のプラスマ細胞腫およびハ
イブリドーマのための血清不含培地（　Ｓ　ｅｒｕｍ−
Ｆｒｅｅ　　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　　Ｇｒｏｗｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　−　１　
ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐ　ｌａｓｍａｃｙｔｏｍａｓ
　ａｎｄｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）Ｊ　、Ｊ　ｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏ
ｄｓ％Ｖｏｌ．　９　９、ｐｐ．２５９−２７０（１９
８７）において、次のものを含有する培地を開示してい
る：細胞増殖添加剤、例えば、Ｌ−グルタミン、ベータ
ーメノレカプトエタノーノレ、へペス緩衝液、グルタチ
オン、ナトリウムセレナイトおよびナトリウムピルベー
ト。トランスフェリン（ヒト、鉄飽和した）、アルブミ
ン（ウシ血清、ＢＳＡ）、大豆脂質、および低い密度の
りポタンパク質（ＬＤＬ）は、また、二次培養前に添加
された。シャクタ−（　Ｓ　ｃｈａｃｔｅｒ）は、グラ
スマ細胞腫およびハイブリドーマのための他の共通の発
育因子が次のものであると開示している：脂肪酸不含Ｂ
ＳＡとカブリングしたリノール酸、インスリン、ヒドロ
コルチゾン、グロスタグランジンＥ，、カタラーゼ、ア
スコノレビン酸、ＳＧＦ−９、エタノールアミンおよび
プトレシン。
ベレズ（　Ｖ　ｅｌｅｚ）ら、「低い血清の戊長培地中
でモノクローナル抗体の産生の速度論（Ｋ　ｉｎｅｔｉ
ｃｓｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ
　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎＬｏｗ　　Ｓｅｒｕｍ
　　Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｍｅｄｉｕｍ）Ｊ　、Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ，　Ｖｏｌ．　８　６、ｐｐ．４５−５２　（１
９８６）は、プリマトンＲＬ，プルロニックＦ−６８、
および１％の胎児子ウシ血清を含有する細胞戊長培地（
ダルベツコ変性イーグル培地）を開示している。ベレズ
（Ｖｅｌｅｚ）　ラは、プリマトンＲＬがタンパク質ヒ
ドロリゼイトであり、そしてプルロニックＦ−６８がポ
リオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンのブロッ
クコポリマーであることを開示している。また、彼らは
、これらの戊分の存在下の細胞の増殖が５％の胎児子ウ
シ血清を含有する培地中で経験する細胞増殖に等しいこ
とを開示している。　ＰＣＴ出願ＡＵＳ７／００２４８
は、エチレンオキシド（Ｅ　Ｏ）およびプロピレンオキ
シド（ＰＯ）戊分からなるポリマー材料を含有する、血
清不合組織培地を開示している。詳しくは、プルリオー
ルＰＥ６８００、ＥＯおよびＰＯに基づくポリオールを
、通気した反応器においてヒト生長ホルモン（ｈＧＨ）
の産生のための血清不合培地中で使用した。この出願は
、アルキレンオキシドのポリマーは、支持培地からの細
胞の解離、ならびに細胞を通気に暴露するとき細胞の溶
菌を防止する細胞保護剤として作用すると思われるから
、取り付けを必要とする細胞の培養においてとくに有用
であると開示している。取り付けを必要とする細胞は、
細胞が凝集するとき、よりよく増殖することが発見され
た。
欧州特許出願第２４８．６５６号は、細胞培養のための
組戊物を開示しており、ここで組戊物は、他の添加剤の
なかでも、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコ
ールおよびポリプロピレングリコール、および、必要に
応じて、低い密度のりポタンパク質（Ｌ　Ｄ　Ｌ）を含
有する。
ミズラヒ（　Ｍ　ｉｚｒａｈｉ）は、「啼乳動物細胞の
培地中でプリマトンＲ　Ｌ　（Ｐｒｉｍａｔｏｎｓ　　
Ｒ　Ｌ　　ｉｎＭａｍｍａｌｉａｎ　　Ｃｅｌｌ　　Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ　　Ｍｅｄｉａ）Ｊ　、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ，　Ｖｏｌ．　ｌ　９、ｐｐ．１５５７〜１５６１　
（１９７７）において、リンパ球の増殖のためのＲＰＭ
Ｉ　１６４０の基礎培地中のプリマトンＲＬの使用を開
示している。
前述したように、プリマトンＲＬはタンパク質加水分解
物である。ミズラヒ（　Ｍ　ｉｚｒａｈｉ）は、プリマ
トンは少なくとも１％の胎児仔ウシ血清とともに使用し
なくてはならないことを開示している。
「ヒトリンパ球の細胞系の培養におけるプルロニックポ
リオール（　Ｐ　）ｕｒｏｎｉｃ　　Ｐ　ｏｌｙｏｌｓ
　　ｉｎＨ　ｕｍａｎ　　Ｌ　ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　　
Ｃ　ｅｌｌ　　Ｌ　ｉｎｅ　　Ｃ　ｕｌｕｔｕｒｅｓ）
Ｊ　、Ｊｏｕｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．　２、ｐｐ．　　
ｌ　ｌ−１　３　（Ｊｕｌｙ，　　ｌ　９７５）におい
て、ミズラヒ（Ｍｉｚｒａｈｉ）は、また、哺乳動物細
胞の培地中のポリオキシプロピレン／ボリオキシエチレ
の縮合物の使用を開示している。前述のように、使用す
るポリオール縮合物は、ＢＡＳＦ　（Ｗｙａｎｄｏｔｔ
ｅ　　Ｃｏｒｐ．）からのプルロニック系列のＰＩ　　
Ｆ６８、Ｆ８８およびＦｌ０８ポリオールであった。ミ
ズラヒ（Ｍｉｚｒａｈｉ）は、０．０５および０．１％
のＦ６８およびＦ８８ポリオールの存在下に、細胞は基
礎培地において得られるものに等しいか、あるいはそれ
よりすぐれることを示している。しかしながら、０．２
％のＦ６８およびＦ８Ｂ、ならびに０．０５〜０．２％
のＦ７７およびＦｌ０８において、増殖の阻害が起こっ
た。
しかしながら、この出願が認識しているかぎりにおいて
、プレポリマーまたはポリマーがイソシアネートキャッ
プドアルコールまたはポリオールである、変性されたプ
レポリマーまたはポリマーの使用の教示は存在しない。
本発明の細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生刺激因子
は、変性されたプレポリマーおよびポリマーを提供する
ポリウレタンポリマー系の結果である。本発明の細胞増
殖エンハンサーは、水溶液または有機溶液中でイソシア
ネート末端キャップド（　ｅｎｄ　−　ｃａｐｐｅｄ）
ポリオールを変性または誘導化することによって調製さ
れる。とくに適当なポリオールは、エチレンオキシド単
位から実質的にまたはもっぱらなる。次いで、ポリオー
ルをイソシアネート基（ＮＣＯ）でキャッピング（　ｃ
ａｐ）し、次いでこれを変性して、遊離アミノ、スルホ
ン酸またはスルフヒドリルの官能基が発現されるように
する。
特許請求の範囲の細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生
刺激因子を構戊する変性されたプレポリマーまたはポリ
マーの生或の２つのルートが存在する。第１に、変性水
利ポリマーは、水膨潤性の三次元のヒドロゲルまたはフ
ォームの形態を取ることができる。引き続いて、ゲルを
溶解し、そして生ずる水溶性ポリマー単位の調製物を培
養した細胞に添加して、本発明の効果を生成することが
できる。同様に、水和したポリマーは、希釈条件下に、
単一の層または実質的に単一の層を包含する、基質上の
密なまたは薄い被膜または含漫の形態を取ることができ
る。本発明の被膜または含浸はゲルまたはヒドロゲルと
考えられそして、特記しない限り、それらの用語により
包含される。用語ゲルまたはヒドロゲルは、構造が実質
的に非発泡であるポリマーを意味する。種々の理由で、
生ずるゲルはすべてが「ゲル」でなく、そして多少の７
才一ムが存在することができる。
第２実施態様において、より高い比率のプレポリマーの
イソシアネートを変性し、こうして水溶性でありかつ通
常ポリマーの構造を形成することができない、個々の変
性プレポリマーの分子を生ずることができる。しかしな
がら、多少の重合が起こり、こうして変性ポリマーの単
位を生ずることができる。したがって、第２ルートは、
ほとんどプレポリマーであるが、またポリマー単位を含
む、水溶性単位を生成する。
ある場合において、合或の第３方法は細胞増殖エンハン
サーを生成し、これは、引き続いて化学的に変性すると
、細胞の増殖を増強すばかりでなく、かつまた抗体の産
生を刺激する。後述するように、イソシアネートキャッ
プドプレポリマーは、アミノ基、例えば、シスタミンを
有するジサルファイド含有化合物により変性するとき、
ジサルファイド結合の引き続く還元は抗体の産生を刺激
する変性されたプレポリマーまたはポリマーを生成する
。換言すると、ある場合において、最初の２つのルート
の１つにより生或される細胞増殖エンハンサーは、抗体
産生刺激因子を提供する第３生成ルートのための中間体
または出発物質であることができる。
したがって、本発明の１つの特定の目的は、新規な変性
されたプレポリマーおよびポリマーから新規な増殖エン
ハンサーおよび／または抗体産生刺激因子を提供するこ
とである。
また、本発明の目的は、抗体産生刺激因子であるように
適合することができる細胞増殖エンハンサーを提供する
ことである。
本発明の他の目的は、先行技術の組或物により得られる
ものより大きい増殖の増強および抗体の刺激を誘発する
、細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生刺激因子を生成
することである。
最後に、本発明の目的は、これらの効果をもたない化合
物から、細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生刺激因子
を生或することである。これは、非反応性プレポリマー
が特許請求の範囲の変性または誘導化反応を行わないと
き、とくに有効である。
本発明の細胞増殖エンハンサーおよびアミノペプチダー
ゼは、変性親水性ポリ尿素一ウレタンプレポリマーおよ
び関連する変性ポリマーの新しいクラスを構或する。細
胞増殖の増強および抗体産生刺激は、特定の官能基をプ
レポリマーの分子に付加するためである。変性した化合
物を調製するプレポリマーは、ポリイソシアネートでキ
ャッピングされたアルコールのヒドロキシルのいくつか
または本質的にすべてをもつｌ官能性のアルコール、ジ
オールまたはポリオールのプレポリマー単位を包含する
、オキシエチレンに基づくアルコールである。プレポリ
マーは、少なくとも１つのイソシアネート（Ｎ　Ｇ　Ｏ
）反応性官能基を有する化合物との反応により変性また
は誘導化する。用語「変性」または「誘導化」は、ここ
で互換的に使用する。変性化合物は、プレポリマーのＮ
ＣＯ基と非反応性であるか、あるいはＮＣＯ反応性基（
すなわち、第１官能基）よりＮＣＯ基と反応性が低い、
好ましくは実質的に反応性が低い、第２官能基を有する
。ＮＣＯ反応性基はスルフヒドリル（一ＳＨ）、アミノ
（ＮＨ２）またはカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基である
ことができる。
水または水溶液中の部分的に変性されたプレポリマーの
重合は、前述の生成の第１ルートを表し、そして溶液ま
たは組戊物の付着層をゲル化する作用をする。引き続い
て、ゲルを水溶性ポリマー単位中に溶解する。生或の第
２ルートにおいて、完全に変性されたプレポリマーおよ
びポリマーの単位が形成する。単位は水溶性であり、そ
してＮＣＯ基の重合によりゲルを形成しない。
プレポリマーの調製 細胞増殖の増強として使用するプレポリマーは、オキシ
エチレンに基づくアルコールから調製する。
これらはジオールまたはポリオールであることができ、
エチレンオキシドモノマー単位から構或されたジオール
またはポリオールを包含し、そしてある程度、同一七ノ
マー単位から構或されたｌ官能性のアルコールを包含す
る。エチレンオキシド単位の比率は、変化することがで
き、そしてより詳しく後述する。後述するようにジオー
ルおよび／またはポリオールが二官能性イソシアネート
または多官能性イソシアネートで末端キャッピングする
とき、プレポリマーが形成する。ある実施態様（すなわ
ち、重合を必要としない第２ルート）において、ｌ官能
性アルクールは本発明における使用のため二または多官
能性イソシアネートで末端キャッピングすることができ
る。これらの化合物は、厳格には、「プレポリマー」で
はない。しかしながら、それらは類似の方法で調製し、
そして使用されので、ここで使用するとき用語「プレポ
リマー」はイソシアネートキャップドｌ官能性アルコー
ルならびにジオールまたはポリオールを呼ぶ。
親水性、イソシアネートキャップド未処置プレポリマー
は米国特許第４．１３７．２００号（Ｗ００ｄら）に記
載されており、その教示をここに引用によって加える。
この米国特許のプレポリマーはモノマーのポリオールお
よびポリオキシアルキレングリコールのブレンドであり
、このブレンドのヒドロキシル基はポリイソシアネート
でキャッピングされている。ポリオキシエチレンポリオ
ーノレは、約１００〜約２０．０００，好ましくは約６
００〜約６０００の重量平均分子量を有することができ
、２以上、好ましくは約２〜約８のヒドロキシル官能価
をもつ。ポリオールは、望ましくは、約４０〜約１００
モル％のエチレンオキシド含量を有する。
種々の量の比較的親水性のコモノマーを組み込むことが
可能であり、そして望ましいことがある。
こうして、コモノマー、例えば、プロピレンオキシドま
たはプチレンオキシドをランダムコボリマ、ブロックコ
ポリマー、または両者として共重合することができる。
脂肪族、芳香族または脂肪族一脂肪族のイソシアネート
、例えば、下に列挙するものを使用することができる。
必要に応じて、架橋剤を含めることができる。
イソ７アネートキャッブドウレタンプレポリマーのこの
第１クラスにおける他の群は、イソシアネートキャップ
ドポリエステルからなる。このようなプレポリマーは、
次のようにしてつくることができる。すなわち、多価ア
ルコールをポリカルポン酸と縮合させて線状ポリエステ
ルを形成し、次いでこれをわずかにモル過剰のポリイソ
シアネトと反応させて、本質的に線状のポリウレタンを
生成し、このポリウレタンは末端イソシアネート基を有
し、そして１００〜２０．０００１好ましくは約６００
〜約６０００の範囲内の平均分子量を有する。このよう
なプレポリマーの調製において使用することができる多
価アルコールは、ポリオキシアルキレングリコール、例
えば、エチレングリコーノレ、プロピレングリコーノレ
およびブチレングリコールおよびポリメチレングリコー
ル、エチレングリコール、例えば、テトラメチレングリ
コールおよびヘキサメチレングリコールを包含する。
イソシアネートキャップドポリエーテルは、なお、使用
することができる他の群である。これらのプレポリマー
は、例えば、ポリオキシアルキレングリコールを下に列
挙するタイプのジイソシア不−トと反応させて、末端イ
ソシアネート基を有しかつｌＯＯ〜２０，０００、好ま
しくは約６００〜約６０００の平均分子量範囲を有する
ポリウレタンを生戒することによってつくることができ
る。これらのプレポリマーの特定の例は、グレイス・ス
ペシャリティー・ケミカルス・カンバニ（　Ｇ　ｒａｃ
ｅ　　Ｓ　ｐｅｃｉａｌｔｙ　　Ｃ　ｈｅｍｉｃａｌｓ
　　Ｃ　ｏ．、Ｗ．Ｒ　．　Ｇｒａｃｅ　　＆　　Ｃｏ
．　−　Ｃｏｎｎ．）から入手可能なＨＹＰＯＬ■ポリ
ウレタンのプレポリマーの系列である。
本発明における使用に適当なプレポリマーの第２クラス
は、一般に高分子量であり、そしてエチレンオキシドか
ら主にまたはもっぱらから構戊されているポリオキシア
ノレキレンのジオーノレまたはポリオールからなる。こ
の第２クラスは、本発明における使用に多少より好まし
い。好ましくは、少なくとも７５％の七ノマー単位はエ
チレンオキシド単位であり、そしてある場合において、
ｌＯＯ％までのエチレンオキシド単位は好ましいであろ
う。このクラスのプレポリマーの特定の例として、グレ
イス●スベシャリティー・ケミカルス・カンパニー（　
Ｇ　ｒａｃｅ　　Ｓ　ｐｅｃｉａｌｔｙ　　Ｃ　ｈａｍ
ｉｃａｌｓＣｏ．、Ｗ．　Ｒ　．　Ｇｒａｃｅ　　＆　
　Ｃｏ．　−　Ｃｏｎｎ．）から入手可能なＢ　Ｉ　Ｏ
ＰＯＬ■ポリウレタンのプレポリマーの系列は、とくに
適する。後の説明するｌ官能性アルコールに基づくプレ
ポリマーを除外して、これらのプレポリマーは後述する
ように部分的に変性するときヒドロゲルを形成するであ
ろう。
高分子量のエチレンオキシドに基づくｌ官能性アルコー
ル、ジオールおよびポリオールを使用して、本発明のこ
の第２クラスのプレポリマー、誘導化プレポリマーおよ
び水和ポリマーを調製する。
ポリイソシアネートでキャッピングする前のジオールま
たはポリオールの分子量は、少なくとも約７０００〜８
０００ＭＷ，より好ましくは約１０，０００〜約３０．
０００ＭＷであるべきである。
ｌ官能性アルコールを使用する場合、アルコールの分子
量は少なくとも５００〜１０．０００である。
本発明のプレポリマー、誘導化プレポリマーおよび水和
ポリマーに対する前駆体であるポリオールの調製におい
て、トリヒドロキシ化合物（トリオール）を使用するこ
とは好ましい。例えば、グリセロールは好ましいトリオ
ールである。トリメチローノレプロパン（ＴＭＯＰ）、
トリメチローノレエタンおよびトリエタノールアミンは
他の好ましいトリアールである。さらに、トリアール、
例えば、ペンタエリスリトールを使用して、本発明にお
ける使用のためのポリオールを調製することができる。
オリオールまたはテトロールに基づくポリオールを二宮
能性または多官能性イソシアネート化合物を後述するよ
うにプレポリマーを形成する。
あるいは、適当な分子量のジオールは本発明のプレポリ
マーに対する前駆体として使用することができる。適当
な分子量のジオールは、後述するように、多官能性イソ
シアネートでキャッピングしてプレポリマーを形成する
。高分子量のポリエチレングリコールはとくに有用であ
る。弐Ｈ（ＯＣ　Ｈ　ｘ　Ｃ　Ｈ　ｚ　）　−　０　Ｈ
　，式中Ｘはグリコールが少なくとも約７　０　０　０
，好ましくは約１０，０００〜約３０．０００の平均分
子量を有するような平均の数である、のポリエチレング
リコールは、この実施態様においてことに望ましい。あ
るいは、ジオールをジイソシアネートでキャッピングし
、そして架橋化合物と組み合わせてここに記載する水和
ポリマーを生成する。この目的に有用な架橋化合物は、
多官能性アミンおよび多官能性イソシアネートを包含す
る。なお他の実施態様において、ジオールをポリオール
と混合し、そして生ずる混合物をイソシアネートと反応
させて、本発明のプレポリマーを生成する。
ｌ官能性アルコールを基本「プレポリマー」単位として
選択することができ、ここで完全に変性したプレポリマ
ー単位を意図する。例えば、モノ−メトキシボリ（エチ
レングリコール）を使用することができる。この実施態
様において、■官能性アルコールをポリイソシアネート
で末端キャッピングし、次いで本発明により変性する。
これらの変性した化合物は、生成の第２ルートで生成さ
れ、そして重合することができないであろう。むしろ、
それらは水溶性の小さい、完全に変性されたプレポリマ
ー単位を生ずるであろう。
上のポリウレタンのクラスのプレポリマーは、前述のア
ルコールのヒドロキシル基をポリイソシアネートと反応
させることによって形成される。
「ポリイソシアネート」は、ここで使用するとき、ジイ
ソシアネートおよびポリイソシアネートの両者を呼ぶこ
とを意図し、適当ならば、ジイソシアネートまたはポリ
イソシアネートの使用を特定することにより示すときを
除外する。こうして、イソシアネート末端キャップド（
すなわち、イソシアネート末端）プレポリマーが形成す
る。
プレポリマーに対する選択した前駆体はポリイソシアネ
ートの選択に影響を及ぼし、プレボリマ一の構造はそれ
自体十分に架橋して、水性プレポリマー溶液をゲル化す
るか、あるいはその性質が望ましい場合、架橋したポリ
マーの被膜を形成しなくてはならない。プレポリマーに
対する前駆体がポリオール（すなわち、トリオールに基
づくまたはテトラオールに基づく）である実施態様にお
いて、ジイソシアネートは好ましい。必要に応じて、多
官能性ポリイソシアネート化合物は、また、ポリオール
とともに使用することができる。適当なイソシアネート
の混合物を考えることができる。
トリオールをプレポリマーに対する前駆体として使用す
るとき、それらは多官能性ポリイソシアネートと反応さ
せて本発明のプレポリマーを形成する。この組み合わせ
は、水和ポリマーの形成における架橋に十分な官能基を
有するプレポリマーを生戒する。別の実施態様において
、ジオールをプレポリマーに対する前駆体として使用し
、ここでジオールをジイソシアネートでキャッピングす
ることができる。しかしながら、これらの二官能性プレ
ポリマーから十分な架橋を達戊するために、それらは架
橋化合物と組み合わせて使用する。好ましい架橋剤はト
リメチロールプロパン（ＴＭＯＰ）であるが、他のもの
を使用することができる。
例えば、別の架橋剤は、次のものを包含する：グリセロ
ール、トリメチロールエタン、ペンタエリスリトール、
トリエタノールアミン、多官能性アミン、多官能性イソ
シアネートなど。
芳香族、脂肪族または脂環族のポリイソシアネートを前
述の実施態様のいずれにおいても使用することができる
。しかしながら、プレポリマーの造形または取り扱いに
関する場合、脂肪族イソシアネートキャップドプレポリ
マーは典型的には水和ポリマーの状態にゲル化するため
に約２０〜９０分を要する′ので、脂肪族ポリイソシア
ネートの使用は望ましい。
適当なジイソシアネートおよび多官能性ポリイソシアネ
ートの例を下に列挙する： トルエン−２．４−ジイソシアネート、トルエン−２，
６−ジイソシアネート、トルエン−２．４−ジイソシア
ネートおよびトルエンー２．６−ジイソシアネート商用
混合物、イソホロンジイソシアネート、 エチレンジイソシア不−ト、 エチリデンジイソシアネート、 プロピレン−１．２−ジイソシアネート、シクロヘキシ
レンー１．２−ジイソシアネート、シクロヘキシレン−
１．４−ジイソシアネート、ｍ−７エニレンジイソシア
ネート、 ３．３″−ジ７エニノレ−４．４’−ビフエニレンジイ
ソシアネート、 ４．４’−ビフエニレンジイソシアネート、４．４′−
ジ７エニルメタンジイソシアネート、３．３″−シクロ
ロー４．４’−ビ−ｙエニレンジイソシアネート、 １．６−へキサメチレンジイソシアネート、１．４−テ
トラメチレンジイソシアネート、１．１０−デカメチレ
ンジイソシアネート、クメンー２．４−ジイソシアネー
ト、 １．５−ナフタレンジイソシアネート、メチレンジシク
ロヘキシルジイソシアネート、１．４−シクロヘキシレ
ンジイソシアネート、ｐ−テトラメチレンキシレンジイ
ソシアネート、ｐ−７エニレンジイソシアネート、 ４−メトキシー１．３−フェニレンジイソシアネート、 ４−クロロ−１．３−フエニレンジイソシアネート、 ４−プロモー１．３一フ二二レンジイソシアネート、 ４−エトキシー１．３−７ェニレンジイソシアネート、 ２．４−ジメチル−１．３−フエニレンジイソシアネー
ト、 ５．６−’；メチノレ−１．３−７エニレンジイソシア
不−ト、 ２，４−ジインシアナトジフェニルエーテル、４．４″
−ジイソシアナトジフエニルエーテル、ペンジジンジイ
ソシアネート、 ４．６−ジメチル−１．３−７二二レンジイソシアネー
ト、 ９，ｌＯ−アントラセンジイソシアネート、４．４′−
ジイソシアナトジベンジル、３，３′−ジメチル−４．
４″−ジイソシアナトジフェニルメタン、 ２，６−ジ，メチル−４．４′−ジイソシアナトジ７エ
ニル、 ２．４−ジイソシアナトスチルベン、 ３，３′−ジメトキシー４，４′−ジイソシアナトジフ
エニル、 １．４−アントラセンジイソシアネート、２，５−フル
オレンジイソシアネート、１．８一ナ７タレンジイソシ
アネート、２．６−ジイソシアナトベンズフラン、２　
．４　．６−トノレエントリイソシアネート、ｐ．ｐ．
ｐ　　−トリフェニルメタトリイソシアネート、 イソフランジイソシアネートの三官能性トリマー（イン
シアヌレート）、 ヘキサメチレンジイソシアネートの三官能性ビウレット
、 ヘキサメチレンジイソシアネートの三宮能性トリマー（
インシアヌレート）、 ポリマーの４．４′−ジフエニメタンジイソシアネート
。
アルコールのヒドロキシル基をキャッピングするとき、
イソ７アネート対ヒドロキシル基の比は好ましくは約１
．８〜約２．２であるべきである。
より高い比は使用することができるが、最終生成物中に
存在する過剰の七ノマーに関連する問題に導くことがあ
るので、好ましくない。キャッピング反応は任意の便利
な方法または手順であることができる。例えば、この反
応は約２０〜約１５０℃において、乾燥窒素下に、約２
時間〜約１４日間、好ましくは触媒の不存在下に実施す
ることができる。この期間は使用する多官能性ポリイソ
シアネートおよび反応を実施する温度の関数であろう。
ｌ官能性アルコールを前駆体として使用とき、本発明の
プレポリマーを形成するための多官能性ポリイソシアネ
ートとのキャッピングは、化学量論的量の反応或分を使
用して実施する。
プレポリマーの調製において、過剰の多官能性ポリイソ
シアネートの使用を回避することは好ましい。好ましく
は、２：ｌのイソシアネート対ヒドロキシル基の比（例
えば、１つのジイソシアネート分子／ポリオールのヒド
ロキシル基）を使用して、ポリオールの完全な末端キャ
ッピングを保証する。完全な末端キャッピングは、不都
合な量の連鎖延長を回避することによって、プレポリマ
ーの過度に高い粘度を排除する。しかしながら、わずか
に過剰の、すなわち、約ｌＯ％までのイソシア不−トを
使用することができる。
好ましいポリマー系は、また、低いインシアネ−ト含量
を有する。これは、高分子量のポリオールを使用するこ
とによって、および末端キャッピング反応における過剰
量のイソシアネートを回避して、遊離のイソシアネート
モノマーが存在しないようにすることによって達或され
る。プレポリマー中のイソシアネート濃度は、約７．０
００〜３０，ＯＯＯＭＷのジオールまたはポリオールか
ら形成されるプレポリマー、ならびに約５００〜１０．
ｏ００ＭＷの１官能性アルコールから形成されるプレポ
リマーについて、約０．１〜約０．５３ミリ当量／ｇで
あるべきである。
さらに、すべてのヒドロキシル基が末端キャッピングさ
れることは絶対必要であることはない。
ある場合において、例えば、化学量論的量より少ないイ
ソシアネートを使用するとき、末端キャッピングはヒド
ロキシル基のすべてより実質的に少ない程度にのみ起こ
ることができる；しかも、変性化合物による変性のため
に有効なＮＣＯ基の十分な数がなお存在し、こうして変
性されたプレポリマーは有効な細胞増殖エンハンサーお
よび／または抗体産生刺激因子を生ずるであろう。
低いイソシアネート含量が好ましいにもかかわらず、こ
こに記載する好ましいポリマーポリマー系は、有機溶媒
とともに使用することができるので、これに関して従来
の系より大きい程度の柔軟性を与える。プレポリマーの
調製および取り扱いにおける有機溶媒の存在は、より高
い分子量または増加したＥＯ含量のポリオールの使用か
らか、あるいはジオールまたはポリオールの完全な末端
キャッピングのために不十分の量の使用から生ずる過剰
の粘度に対して保護する。すなわち、有機溶媒は化学量
論的（２：ｌ）量より少ないイソシア不−１・七ノマー
の使用を可能とする。不完全な末端キャッピングから生
ずる連鎖延長は、典型的には、プレポリマーの取り扱い
を困難または不可能とすることができる、増加した粘度
を生ずる。
対照的に、本発明において使用する系は、連鎖延長のた
めに増加した粘度により、あるいは他の原因から、マイ
ナスに作用する煩向はない。なぜなら、溶媒はプレポリ
マーの便利な取り扱いのために適当な範囲内に粘度を維
持するからである。
プレポリマーの調製に使用する有機溶媒は、反応成分と
適合性でなくてはならない。主に、溶媒はｌ官能性のア
ルコール、ジオールまたはポリオールおよび／まＩ；は
プレポリマーが、好ましくは周囲温度において、容易に
溶解することができるものでなくてはならない。プレポ
リマーの調製に適当な溶媒は、次のものを包含する：ア
セトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、テトラヒドロ７ラン、ジオキサン、ジクロロメ
タン、アセトンおよびメチルエチルケトン、またはそれ
らの混合物。アセトニトリルは好ましい。
有機溶媒を使用する１つの実施態様において、アノレコ
ーノレ、ジオーノレまたはポリオーノレそれ自体は溶媒
中に溶解し、そして溶液である間にポリイソシアネート
と反応させて、イソシアネート末端キャッグドプレポリ
マーを生ずる。この実施態様は、ジオールまたはポリオ
ールが周囲温度においてにおいて固体または結晶である
場合、すなわち、実質的にまたはもっぱらエチレンオキ
シドからなるジオールまたはポリオールについておよび
高分子量のジオールまたはポリオールについて、とくに
好ましい。このようにして、結晶質のジオールまたはポ
リオールでさえ、それらのそれぞれの融点に加熱しない
で、容易に取り扱いすることができる。プレポリマーの
生或反応は高温において実施するが、有機溶媒を使用し
てまずジオールまたはポリオールを液体にすることはす
ぐれた反応およびプレポリマーの生成を保証する。
有機溶媒を使用する他の実施態様において、イソシアネ
ート末端キャップドプレポリマーをまず調製し、次いで
有機溶媒中に溶解する。この実施態様は、ジオールまた
はポリオールがすでに液体であるか、あるいは周囲温度
においてペースト状であり、そしてプレポリマーの調製
のために溶解を必要としない場合、有用であろう。例え
ば、低分子量またはより高いプロピレンオキシドまたは
ブチレンオキシド含量のジオールまたはポリオールをこ
の方法で処置することができる。プレポリマーの段階に
おける溶媒の使用は、不完全に末端キャップドジオール
またはポリオールの連鎖延長のために粘度が増加する場
合、有利であり。有機溶媒を使用するとき、溶媒を除去
した後、変性プレポリマーまたは変性ポリマーを添加し
て細胞増殖を増強する。
酸化防止剤を、好ましくはプレポリマーの調製前に、添
加することが望ましいであろう。酸化防止剤は、本発明
のグレポリマーまたはポリマーの調製または使用に必要
ではない。しかしながら、このような添加により、ポリ
マーまたはその前駆体の酸化的破壊を防止することによ
って、貯蔵および取り扱いの性質を増強することができ
る。適当な酸化防止剤は立体障害フェノール系化合物を
包含する。特定の例は、イルガノックス（　Ｉ　ｒｇａ
ｎｏｘ＠　）　　（　Ｃ　ｉｂａ　−　Ｇ　ｅｉｇｙ　
　Ｃ　ｏｒｐ−）およびサントノクス（　Ｓ　ａｎｔｏ
ｎｏｘ■）　　（Ｍｏｎｓａｎｔｏ　　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣ　ｏ．）である。酸化防止剤は、ポリオールまたは
プレポリマーに対する前駆体の重量に基づいて、約０．
０１〜約１．０％、好ましくは約０．０２〜約０．１％
の量で添加することができる。
変性化合物 細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生刺激因子は、前述
のポリマーを変性することによって調製する。プレポリ
マーは、それらがスルフヒドリル、スルホン酸またはア
ミノ官能基を発現するように、変性または誘導化する。
これらの官能基とエチレンオキシドに基づポリオールと
の組み合わせは、基本プレポリマーおよびポリマー化合
物、ならびに変性化合物に特徴ある細胞増殖の増強また
は抗体の刺激を提供する。したがって、特定の官能性お
よび反応性は無効または限界的に有効な細胞増殖促進因
子および／または抗体産生刺激因子に付与し、ならびに
反応性をそうでなければ非反応性の生物適合性ポリマー
に付与することができる。
例えば、重合した構戊体が形成するとき、ポリマーの表
面は、ここに記載する方法によりポリマーに所望の官能
性を挿入しないかぎり、一般に非吸着性および非反応性
であろう。
プレポリマーは、それを少なくとも１つのイソシアネー
ト（ＮＣＯ）反応性官能基を含有する化合物と反応させ
ることによって、変性される。したがって、ＮＣＯ反応
性官能基はポリマーと変性化合物との間の結合点として
作用する。変性化合物は、また、第２官能基を有し、こ
の官能基はイソシアネート反応性であることができるが
、好ましくは反応性が低く、こうしてイソシアネートは
第ＩＮＣＯ反応性官能基により変性される。イソシアネ
ート基を変性すると、「遊離の」官能基は発現される。
発現された遊離の官能基は第２の、低いＮＣＯ反応性の
、官能基であるか、あるいは後述するように、内部の結
合が還元または破壊される結果、発現される官能基であ
ることができる。
下の実施例において、シスタミン中のジサルファイド結
合は還元されてスルフヒドリルを発現する。
いったんプレポリマーが変性されて遊離の官能基を発現
すると、所望の効果が達或される。遊離の官能基の特定
の例は、アミノ、スルホン酸およびスルフヒドリルを包
含する。例えば、遊離の官能基がアミノであるとき、遊
離の官能基は他の化学的部分と組み合って培地中の細胞
の増殖を４０〜１００％だけ増加する作用をする。他の
場合において、例えば、変性されたプレポリマーまたは
ポリマーはーＳＨを発現し、変性されたプレポリマーま
たは生ずるポリマーは免疫学的ポリマーの抗体の産生を
４〜５倍まで増加する。
前述したように、ＮＣＯ反応性官能基はスルフヒドリル
（−ＳＨ）、アミノ（−Ｎｔｉｔ）またはカルボキシル
（−ＣＯＯＨ）基である。ある場合において、他の官能
基、例えば、ヒドロキシル基を有する化合物は時には使
用することができる。
これらの官能基によるイソシアネートの変性は、好まし
いルートではなく、そしてここで述べない。
変性反応の速度および程度は、一部分変性化合物のＮＣ
Ｏ反応性官能基にそして、一部分、プレポリマーおよび
変性化合物の相対的モル量に依存する。
一般に、スルフヒドリル基はプレポリマーのイソシアネ
ート基と優先的にかつ容易に反応し、このとき反応は、
後述するように、チオレートイオンを形成する条件下に
進行する。チオレートイオンはプレポリマーのイソシア
ネート基と反応して、アミノ、ヒドロキシルまたはカル
ボキシル官能基の存在下でさえ、−ＮＨＣ　（０）Ｓ−
（チオウレタン）結合を含有するする変性プレポリマー
を生成する。こうして、チオレートイオン（−Ｓ−）が
存在するとき、アミノ基は事実上非反応性とされ、こう
してーＳ−がＮＣＯ基を変性できるようにする。ＮＣＯ
反応性官能基がジアミンまたはポリアミン中に含有され
るアミノ基であるか、あるいはカルボキシルの存在下に
存在するとき、大きいモル過剰の変性化合物を使用して
、プレポリマーの実質的にすべてのイソシアネート基が
アミノ基により変性されるようにする。
しかしながら、イソシアネートキャップドプレポリマー
は、チオレートアニオン（−Ｓ−）が活性部位として形
成する条件下に反応するときにのみ、他の列挙した基を
含有する化合物とより、スルフヒドリルを含有し化合物
と実質的速く反応するであろう。結局、スルフヒドリル
を含有する培地がチオレート反応性基を容易に反応しな
い条件下に、プレポリマーの変性反応は非常にゆっくり
進行し、そして認められ得る程度に起こらないであろう
。すなわち、スルフヒドリル基単独の存在は、チオレー
トイオンを形成するために適当な条件の不存在下の変性
に不適当である。例えば、アセトニトリル中のプレポリ
マーとエタンチ才一ル（　ｃ　ｘ　Ｈｓ　ｓ　Ｈ）との
反応は、エタンチオールのスルフヒドリルをイオン化す
るための触媒の不存在下には、進行しないであろう。そ
れにもかかわらず、チオレートが存在する場合において
さえ、アミノ基とＮＣＯ基との間の多少の反応が存在す
るであろう。さらに、反応条件は変化させて、チオ１−
一トが反応の部分の間に存在しないようにし、こうして
アミノ基がＮＣＯ基と反応する機会を増加する。
チオレートアニオンは触媒の添加により接触的に形成す
ることができる。適当な触媒は、塩基触媒（好ましくは
第三アミン、例えば、トリエチルアミンまたはＮ−メチ
ルイミダゾール）または還元剤、例えば、ホウ水素化ナ
トリウムを包含するであろう。ある場合において、分子
内または自己触媒が存在してチオレートイオンを形成す
ることがある。
下に示すように、分子内触媒を行う化合物のｌ例は、シ
スタミン（（ＮＨ，ＣＨ，ＣＨ，）ａｓｓ）と還元剤と
の反応により形成する、システアミンである。
ＮＨｚ−ＣＨｘ−ＣＨｚ−Ｓ−Ｓ−ＣＨｚ−ＣＨｉ−Ｎ
ＨｉＮＨ，ＣＨ．ＣＨ．ＳＨ ＋ ＮエＣ＃Ｏ ポリオ−ｔｋ（１）主鎖↓　。
ＮＨ−Ｃ−Ｓ−ＣＩ２ＣＨＩＮＨ＊ 詳しくは、メルカプトエタノール（ＨＯＣＨ，ＣＨ２Ｓ
Ｈ）または還元剤の存在下に、シスタミンのジサルファ
イド結合は還元されて、遊離アミノ基および遊離スルフ
ヒドリル基の両者を含有するシステアミン（ＮＨ！ＣＨ
，ＣＨ，ＳＨ）を形成する。システアミン分子のアミノ
基およびスルフヒドリル基は相互作用して、分子内触媒
によりチオレートイオンを形成させる。プレポリマーの
ＮＣＯ基は自己触媒されたシステアミン分子のチオレー
ト基と優先的に反応して、チオレートを経て変性された
プレポリマーを生戒して、変性プレポリマーにより発現
される遊離の官能基に相当する遊離アミノ基を有するよ
うになる。
上の反応の機構はＮＭＲ分析により支持される．この分
析により、チオレートイオンが形成し、そしてそれがＮ
ＣＯ基と反応すると、ＮＨＣ（０）−Ｓ−ＣＨ２一結合
についてのピークが現れることが示される。
詳しくは、ＮＣＯ，ＮＨＣ（０）−Ｓ−ＣＨ，−および
ＮＨＣ（０）−ＮＨについての特性ピークは、まず、Ｉ
ＰＤＩをエタンジオール、グリコール、エタノールおよ
びアミノエタノールとの反応により確立された。生成物
を分析して形成した付加物を決定し、そして反応したカ
ルポニル炭素の化学シ７トを決定する。ＮＭＲ研究から
、ＩＰＤＩのＮＣＯ基はアセトニトリル中でエタンチオ
ールのスルフヒドリル基と反応しないが、発熱反応はイ
オン化したチオレートと事実起こるように思われる。こ
れは第三アミンを添加してエタンチオールのチオール基
をイオン化した後実施したＮＭＲ分析により示される。
例えば、エタンチオール単独では、ＩＰＤＩのＮ−Ｃ−
０基は１２３〜１２４ｐｐｒａにおける信号をつくる。
しかしながら、ＩＰＤＩのチオレート付加物について、
イソシアネートの信号は消失し、そしてカルボニルＮＨ
Ｃ（０）−Ｓ−ｃ｝ｆ．一基に割り当てられる新しい信
号が１　６　６．５　〜１　６　８．Ｏｐｐｍにおいて
見られる。この研究から、ＮＨＣ（０）−ＮＨ力ルボニ
ル炭素の化学シフトは１６０−１６２ｐｐｍの範囲に見
いだされる。
下表は上のシフトを記録する。
青工 種々の基質のＩＰＤＩ付加物のカルポニル炭素の化学シ
フト蒸！　　　整宜　　　　　　　　　　化学シフト（
ｐｐｍ）Ｎ−Ｃ−０　　　　　　　　　１２３〜１２４
−ＮＨ！　　ＮＨ−Ｃ（０）−ＮＨ−　　　１６０−１
６２−ＳＨ　　　ＮＨ−Ｃ（０）−Ｓ−　　　　１６７
−１６８上のパターンは、また、非変性プレポリマーお
よびプレポリマーのシスタミン誘導体のＮＭＲ分析にお
いて観測される。ポリエーテルチオールおよびＩＰＤＩ
のｌ：３モルの付加物である、非変性プレポリマーの炭
素−１３のＮＭＲスペクトルは、Ｎ＝Ｃ＝ＯおよびＮＨ
Ｃ（０）−０−カルボニル炭素の存在を示す。他方にお
いて、２−メルカプトエタノールの存在下に調製した、
チオレート（システアミン）変性プレポリマーの炭素一
１３のＮＭＲスペクトルは、チオウレタン結合の化学シ
フトの範囲における新しいカルポニル炭素の信号を示す
。
あるいは、下に示すように、シスタミンそれ自体はジサ
ルファイド結合の還元前にプレポリマーと反応させ、こ
うしてアミノ基（　−　Ｎ　Ｈ　Ｘ）により変性すべき
ＮＣＯ基を残す。
ＮＨｚ−Ｃ｝ｌｘ−ＣＨｚ−Ｓ−Ｓ−ＣＨｚ−ＣＨｚ−
ＮＨｉ＋ Ｎ冨Ｃ＝Ｏ ポリオールの主鎖↓ ＮＨ−Ｃ−ＮＨ−ＣＨｚＣＨ２Ｓ−ＳＣＨｚＣＨｚＮＨ
２｛１ ０ ＮＨ−Ｃ−ＮＨＣＨ，ＣＨ，ＳＨ ＩＩ ０ したがって、ＮＣＯ反応性官能基およびプレポリマー上
に発現された遊離の官能基の両者は一ＮＨ２である。し
かしながら、前述しｔ；ように、遊離の官能基はシスタ
ミン中のジサルファイド結合の還元により変化すること
ができる。例えば、ジサルファイド結合を還元すると、
遊離の官能基はスルフヒドリルとして発現されるであろ
う。
また、前述したよ、うに、上は第３反応ルートのｌ例で
あり、ここで特許請求の範囲の細胞増殖エンハンサーを
変更し、そして抗体産生刺激因子となるように適合させ
ることができる。例えば、シスタミンによるプレポリマ
ーの変性後、還元剤、例えば、メルカプトエタノールを
添加してジサルファイド結合を還元し、こうしてスルフ
ヒドリル基をプレポリマー上で発現させる。ＳＨが発現
されるのは、ジサルファイド結合が還元された後のみで
ある。２−メルカグトエタノールで予備還元しないブレ
ポリマ一一シスタミン付加物の炭素一１３のＮＭＲスペ
クトルは、尿素結合（ＮＨＣ（０）ＮＨ−）を形成する
シスタミン中の一ＮＨ．とＮＣＯ基との反応と一致する
、１６０ｐｐｍにおける信号を示す。
さらに、ＮＣＯキャップドプレポリマーとアミノ基を含
有する変性化合物との反応は、ＮＣＯ反応性官能基とし
てチオレートとの反応より相対的遅いが、反応速度はな
お非常に急速である。アミノーＮＣＯ反応は一ＮＨＣ　
（０）ＮＨ−（尿素）結合を含有する変性プレポリマー
を形成する。プレポリマーとアミノ基を含有し変性化合
物との間の反応速度はｐＨとともに変化する。プロトン
化しないアミンはより速い反応速度のために好ましい。
ジアミンまたはポリアミンを変性化合物化合物として使
用するとき、それらは大過剰量で使用してプレポリマー
を変性すべきである。こうして、ｌ：１より大きいモル
比、好ましくは２：ｌより大きい、最も好ましくは約２
：ｌ〜約５＝１の一ＮＨ，対−ＮＣＯ基を有することが
好ましい。少量の第一または第二ジアミンまたはポリア
ミンの使用は、多数のプレポリマーの分子のＮＣＯ基と
の反応により変性プレポリマーを架橋する機能をするこ
とを理解すべきである。これは先行技術の特許、例えば
、前述のマテウズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）らの米国特許に
おいて教示されている。しかしながら、大過剰量で使用
するおき、いずれのポリアミン分子もｌより多いプレポ
リマー分子からのＮＣＯ基とするように思われるので、
ポリアミンは架橋機能をしない。むしろ、この反応は本
発明の方法でプレポリマーを誘導化する働きをする。
本発明の変性されたプレポリマーおよびポリマーを形成
するとき有用であるＮＣＯ反応性官能基の他のカテゴリ
ーは、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を有する化合物を
包含する。例えば、ある種のアミノ保護されたアミノ酸
およびポリペプチドはプレポリマーとカルボキシル基を
経て反応することができるであろう。他の例として、２
．２′−ジチオジエタン酸を変性化合物として使用する
ことができる。しかしながら、プレポリマーのＮＣＯ基
とカルポン酸との反応は非常に低い。反応速度は塩基、
例えば、トリエチルアミン、Ｎ−メチルイミダゾールの
添加により促進することができる。
変性プレポリマーは無水物またはアミド結合を含有する
であろう。
ジアミンまたはポリアミンの変性化合物として、カルボ
キシル基を含有する化合物はプレポリマーの変性に大過
剰量で使用すべきである。「大過剰量」とは、１：ｌよ
り大きい、好ましくは２：１より大きい、最も好ましく
は２：ｌ〜や＜５：ｌの間の−〇〇〇Ｈ対一ＮＣＯ基の
モル比を意味する。大過剰量で使用するとき、プレポリ
マーのＮＣＯ基の完全なまたは実質的に完全な変性が起
こる。
前に開示したように、変性プレポリマーは、また、細胞
増殖の増強性質、ならびに抗体産生刺激を、第２遊離の
官能基がスルホン酸部分、例えば、タウリンであるとき
、示す。十分な変性はｌ：２〜ｌ：ｌの間の５０，−　
：　ＮＣＯ比において起こることが発見された。しかし
ながら、２：ｌ以上の比が誘導化を起こさないという指
示は存在しない。
本発明によりプレポリマーと反応させるすることができ
る適当な変性化合物の例は、次のものを包含する二 ２−アミノエタノーノレ（エタノーノレアミン）、アミ
ノエチル水素サル７エート、 アミノエタンスノレホン酸（タウリン）、Ｌ一またはＤ
Ｌ−システイン（アルファーアミノーベーターチオール
プロピオン酸）、Ｌ−またはＤＬ−シスチン（ジ（アル
ファーアミノーベーターチオールプロピオン酸）、Ｌ−
またはＤＬ−システインスノレホン酸、Ｌ−またはＤＬ
−システイン酸、 シスタミン（２．２−ジチオビス（エチルアミン））、 システアミン（アミノエタンチオーノレ）、グルタチオ
ン、 ３−アミノーｌ−プロパンスルホン酸、ｐ−アミノフエ
ニルー１−チオーペーターＤ一ガラクトース、 ペニシルアミン、 ２，２゛−ジチオジエタン酸、 ３，３゛−ジチオジプロピオン酸。
これらの特定の例に加えて、次の群の化合物を使用する
ことができる： スルフヒドリルをもつヘフチド、 遊離アミン基をもつペプチド、 ポリベプチド、 動物のホルモン、 炭水化物、 多糖類、 脂質、 核酸、 アミノ糖、 アミノ酸、 アミン界面活性剤、 ジアミンおよびポリアミン（大過剰量で）。
プレポリマーのシスタミン変性についての説明に関して
、変性化合物中に存在するより反応性の官能基を一時的
にプロツキングして、所望の官能基を経てプレポリマー
の変性が起こるようにすることが望ましいことがある。
これは所望の変性されたプレポリマーの調製を、競合す
る変性反応なしに、可能とする。例えば、変性化合物が
アミノ基およびカルボキシル基の両者を含有する場合、
アミノ基をブロッキングしてカルボキシル基を経る変性
を可能とすることが望ましいであろう。種々の官能基の
ためのプロツキング手順はよく知られている。プレポリ
マーの変性後、プロッキングした官能基は、再びよく知
られた手順により、脱ブロッキングする。
プレポリマーの変性反応 プレポリマーと変性化合物との間の反応は、種々の方法
において、添加の順序（例えば、プレポリマーへの変性
化合物の添加対変性化合物へのプレポリマーの添加）な
らびに反応を実施する環境（すなわち、水性対非水性）
を操作することによって実施することができる。さらに
、プレポリマーの変性の程度は戊分の相対的モル量によ
り制御することができる。
１つの添加の順序において、反応は変性化合物をプレポ
リマーに添加して開始することができる。
好ましくは、変性化合物を非水性溶液中で使用する。こ
れは比較的低いレベルのプレポリマーの変性を生ずるが
、変性の程度は、また、モル濃度により影響を受けるで
あろう。小さい程度のみの変性を望む場合、この添加の
順序を使用することが好ましい。しかしな１がら、変性
化合物がジアミンまたはポリアミンであるとき、上のマ
テウズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）らの米国特許に記載されて
いるように、架橋が主要な反応であろうから、この順序
は好ましくない。むしろ、ジアミンまたはポリアミンを
使用するとき、それらお変性化合物として主にまたはも
っぱら使用することが好ましい。また、プレポリマーは
ｌ官能性アルコールに基づくことが好ましい。
むしろ、この添加の順序は、低い変性のレベルのみが達
或されるので、カルボキシル基を含有する変性化合物と
ともに使用することは好ましくない。高度から完全な変
性は、前述の添加の順序を使用することによって、およ
びまた、ジアミン、ポリアミンであるか、あるいはカル
ボキシル基を含有する変性化合物の大モル過剰量を使用
することによって保証される。
この第２の、好ましい添加の順序において、変性化合物
は、再び、非水性溶液中に存在するが、この場合におい
て、プレポリマーは変性化合物に添加することができる
。さらに、大モル過剰量の変性化合物を使用する。これ
は高度のまたは完全な変性を望むとき好ましい。この添
加の順序は、変性反応が有意の量の重合の前に起こるの
で、ジアミン、ポリアミンおよびカルボキシル基含有化
合物を変性化合物を使用するとき、とくに好ましい。こ
れらのクラスの変性プレポリマーの架橋または重合をの
ぞむ場合、それは別の化学を経て実施すべきである。
非水性環境の使用は、上の実施態様において、同時の重
合を回避するので好ましい。この実施態様は、また、よ
り高い程度の変性を望む場合、好ましく、例えば、変性
化合物がジアミンまたはポリアミンであるか、あるいは
カルボキシル基を含有する場合、最も好ましい。そのう
え、この実施態様は、モル比を調節することによって、
プレポリマーの特定のバーセントをより大きく調節する
ことができる。
さらに、プレポリマーおよび変性化合物は周囲条件下に
に溶媒中で接触する。プレポリマーの濃度は、大きく、
０からほぼｌＯＯ％まで変化することができるが、好ま
しくは約５．０〜約５０．０％（　Ｗ　／　Ｗ　）のプ
レポリマーを使用する。周囲雰囲気中でプレポリマーを
誘導化することは可能であるが、反応は乾燥した不活性
雰囲気、例えば、乾燥窒素中で実施して、イソシアネー
ト基を保存することが好ましい。周囲温度において、誘
導化反応は典型的には約１時間で完結するであろう。
しかしながら、この工程をより長い時間（すなわち、約
４〜２４時間）実施して、反応を完結するようにするこ
とが好ましい。
また、非水性溶媒、例えば、プレポリマーの調製につい
て述べてものを変性反応において使用することができる
。さらに、溶媒、例えば、トルエン、２−グロバノール
、メタノール、エタノール、ピリジン、および他の溶媒
を使用することができる．溶媒は使用前に乾燥し、例え
ば、モレキュラーシーブにより乾燥すべきである。メタ
ノールまたはエタノールを使用する場合、この溶媒を完
全に乾燥し、かつ使用前の貯蔵を回避するこに大きい注
意を払うべきである。プレポリマーのイソシアネートは
、変性化合物と反応するよりはむしろこの溶媒中に存在
する水反応することがある。この程度に、プレポリマー
は誘導化よりはむしろ重合するであろう。
他の製造において、プレポリマーの変性は、プレポリマ
ーおよび変性化合物を水または他の架橋剤の存在下に接
触させることによって、重合と同時に実施する。例えば
、変性化合物の水溶液、例えば、塩類溶液を使用するこ
とができる。プレポリマーは、イソシアネート基のある
ものと変性化合物とのおよびある程度水との反応のため
に、誘導化しかつある程度重合するようになる。変性の
程度は、プレポリマーに関する変性化合物の存在量、な
らびに存在する水の量により調節される。
明らかなように、この実施態様は、部分的変性を望む場
合および三次元の変性ポリマーの構造を形成しようとす
る場合、有用である。この実施態様は、また、変性化合
物が非水性溶媒中に溶解しない場合、有用である。この
実施態様のｌ工程の変性反応は、また、方法の操作を排
除するとき有利であることがある。
この製造方法は、また、細胞増殖エンハンサーおよび／
または抗体産生刺激因子の第１生成ルートの１例であり
、このルートにおいて中間体の生成物は三次元のヒドロ
ゲルである。ヒドロゲルが形成する場合、それはリン酸
塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）【Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を含有し
ないダルベツコ（Ｄａｌｂｅｃｃｏ）の処方の調製物、
ＧＩＢＣＯから入手可能である１で水和することができ
る。過剰のＰＢＳの除去後、必要に応じて、還元剤、例
えば、２ーメルカプトエタノールを添加してヒドロゲル
をシスタミンのジサルファイド結合の還元により溶解し
、こうして所望の、例えば、遊離の遊離の官能基を露出
し、そして第１生成ルートの最終生成物、例えば、水溶
性ポリマー単位を生成することができる。
変性化合物のＮＣＯ反応性官能基により変性の程度は、
変性化合物、プレポリマーおよび水の相対的モル濃度を
釣り合わすことによって調節することができる。すなわ
ち、プレポリマーおよび変性化合物を、プレポリマーの
イソシアネート基の所望の部分が反応できるように十分
な量で反応させる。これらの調節は当業者の技量の範囲
内である。周囲条件をこの実施態様における変性のため
に使用することができる。変性ポリマーの使用方法は、
プレポリマーのイソシア不−ト基が変性化合物との反応
により誘導化される所望の程度を支配するであろう。い
ずれの場合においても、イソシアネート基の１００％ま
でを本発明により変性することができる。
例えば、ＮＣＯ基の約２０％〜３０％までの変性は有意
の重合を行うことができる変性プレポリマーを生成する
であろう。重合条件（すなわち、水への暴露）下に、第
１生成ルートの三次元の、高度に架橋した構造、例えば
、フォームまたはゲルが得られるであろう。ゲルまたは
フォームが形成するかどうかは、選択したプレポリマー
に依存する。このような選択はよく知られており、そし
て当業者の技量の範囲内である。引き続いて、ゲルを溶
解して、細胞増殖を増強しかつ抗体の産生を刺激するた
めに使用するポリマー単位を形成する。
逆に、プレポリマーのイソシアネート基のすべてまたは
大部分を誘導化して、第２生或ルートを生ずることがで
き、このルートは実質的な重合が不可能であるか、ある
いは安定な三次元の構造を形成することができる変性プ
レポリマーをつくる。
詳しくは、ＮＣＯ基の約５０％より多＜　（１００％ま
で）を変性する場合、重合はほとんどあるいは全く重合
条件下に起こらないであろう。したがって、この方法は
特許請求の範囲の組戊物の直接の合或（ヒドロゲル生成
物は存在しない）であり、ここで組或物は変性プレポリ
マーの単位の形態に本質的に止まる。
完全（１００％）より少ない変性が存在する場合、多少
の架橋は水への暴露のとき起こり、小さい隔離された変
性ポリマーの単位を生ずる。さらに、変性ポリマーの単
位、ならびに前述の変性プレポリマーの単位はアセトニ
トリル中に溶解する。
しかしながら、前に述べたように、重合が他の化学によ
らない以外、これらの変性された単位からゲルまたはポ
リマーを形成することができない。
しかしながら、イソシアネート化学による実質的な重合
のためには不十分のＮＣＯ基が残ることが明らかであろ
う。ジアミンーポリアミンー、または脂肪族力ルポキシ
ルー変性プレポリマーが調製され、ならびにプレポリマ
ーが１官能性アルコールに基づくのは、この範囲（すな
わち、約５０％より大きい変性）である。
中程度の範囲、すなわち、約２０％〜３０％より大きく
かつ５０％より少ないプレポリマーのイソシアネート基
は、また、本発明よりつくることができる。参照、実施
例ＸＸＶにおけるタウリン変性プレポリマー、ここで約
５０％のＮＣＯ基を変性した。重合条件下に、ポリマー
の鎖が形成し、変性された調製物の粘度を増加すること
ができるが、安定なゲルまたは７才一ムが形成するよう
には思われない。この変性の程度はにおいて、変性され
たポリマーまたはプレポリマーは、典型的には、水の反
応性よりはむしろ水中の溶解度により特徴づけられるで
あろう。しかしながら、変性範囲の下限において、多少
のゲル化または発泡は起こるが、一般に、、多少のゲル
化または発泡は、プレポリマーの末端ＮＣＯ基の約１／
３より少なくか変性される場合にのみ起こるであろう。
１宜 前述したように、プレポリマーの約１／３までが変性さ
れる場合、重合は合計の残りの有効なイソシアネート基
に関して水または水溶液の化学量論的１こ過剰の添加に
より達戊することができる。
プレポリマーはより大きい程度に変性された場合、「重
合」は多少誤った名称であるが、組戊物は変性プレポリ
マーを最終的に水または水溶液で処置することによって
硬化することができる。この場合において、変性プレポ
リマー上の残りのイソシアネート基を水と反応させて変
性された組戊物を硬化するが、変性化合物との反応を行
ったＮＣＯ基の高いバーセントのために、重合のほとん
どあるいは全く起こらない。残りのＮＣＯ基は水と反応
する。あるいは、残りのＮＣＯ基は変性プレポリマーを
表面にあるいは他の化合物にカブリングするために使用
することができるであろう。
プレポリマーを含有する水溶液の調製において、ブレボ
リマ一対溶液の比は約ｌ：１〜約１＝２０１好ましくは
約１＝５〜約１：１５であるべきである。水溶液中でプ
レポリマーの比率が減少するとき、固化時間は増加する
。この溶液を完全に混合されるまで攪拌し、次いで放置
して三次元の変性ポリマーの構造体が形成できるように
すべきである。
未変性イソシアネート基が水と接触して、尿素結合が形
成すると同時に重合は自発的に起こり始める。触媒また
は架橋剤は必要でないが、任意であると考えられ、そし
て必要に応じて使用することができる。適当な触媒は有
機スズ塩類（例えば、ジブチルスズジラウレート）およ
び第三アミンを包含する。適当な架橋剤は、第一および
第二ポリアミンおよび多官能性イソシアネートを包含す
る。
変性ポリマーは硬化し続けて、すべての残留するイソシ
アネート基と水との化学反応は完結するか、あるいは完
結に近づく。完全な硬化反応は、使用する条件およびポ
リイソシアネートに依存して、数時間、数日間または数
週間を要するが、それは約４〜２４時間で本質的に完結
する。硬化時間は、連鎖延長なしに末端キャッピングを
引き起こす、連鎖停止剤または不活性化剤、例えば、エ
タノールアミンの添加により短縮することができる。
有機溶媒をグレポリマー、変性グレポリマーまたは変性
ポリマーの調製において使用する場合、それを除去した
後、変性された化合物を細胞増殖の増強または抗体産生
刺激のために使用する。
細胞増殖の増強の性質 前に述べたように、２つの生成ルートのいずれからの細
胞増殖エンハンサーは水溶性である。これらのポリマー
単位の溶液を透析および濾過滅菌した後、細胞増殖エン
ハンサ−および／または抗体産生刺激因子は、リンパ系
タイプの細胞およびリンパ系誘導細胞系、例えば、Ｂ細
胞分泌ハイブリドーマのための細胞培地に添加すること
ができる。
次の実施例における実験は、ＨＦＮ７．１ハイブリドー
マ細胞を使用する。血清不合培地、例えば、インスリン
、トランスフエリンおよびアルブミンを含有するＷＲＣ
■９３５［Ｆ］培地（Ａｍｉｃｏｎ）、ならびにＤＭＥ
およびＦ−１２培地（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）を使用した。し
かしながら、特許請求の範囲の細胞増殖エンハンサーお
よび抗体産生刺激因子は、血清を含有する培地中で、こ
とに培地が血清を含有してある種の細胞系を収容する場
合、使用することができる。細胞増殖エンハンサーは、
一般に、使用する細胞系および培地に依存して、１０〜
５０　ｔｔ　ｇ／ｍＱ　　（，ｕ　ｇ／１２　）または
１〜７μモルの濃度で使用する。
実施例中の表ＩＩに示すように、細胞増殖エンハンサー
の調製物は細胞の数の２倍までの増加を誘発する。この
添加剤を使用することができる、他の既知のリンパ球の
細胞系は、次のとおりである：＃ｉ乳動物、例えば、ヒ
ト、マウス、ラット、ウシ、ハムスターなどから誘導し
たもの、例えば、正常のリンパ球、骨髄腫細胞、Ｂ−リ
ンパ芽球様細胞、Ｔ−リンパ球白血病細胞など、種々の
ハイブリドーマ、例えば、マウスハイブリドーマ、マウ
スーヒトヘテロハイブリーマ、ヒトハイプリドーマなど
、正常の倍数細胞、例えば、線維芽など、種々の他の付
着細胞など。さらに、特許請求の範囲の調製物は、また
、鳥類または昆虫の細胞系の培養物中で使用することが
できる。
さらに詳しくは、ヒトリンパ球の細胞は、次のものを包
含する：　Ｎａｍａｌｖａ　　ＡＴＣＣ　　ｌ　４　３
　２［ヒトリンパ芽球様パーキット（　Ｂ　ｕｒｋｉｔ
ｔ）リンパ腫］　　（　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃ　ａｎｃｅ『、ｌ
　２　：　３９６−４０８、１９７３）；ＲａｊｉＡＴ
ＣＣ　　ＣＣＬ８６　（パーキットリンパ腫、と｝）　
　（Ｌａｎｃｅｔ％ｌ　　：　２　３　８、１９６４）
；ＷＬ−Ｌ　２　　（Ｃａｎｃｅｒ，　　２　２　：　
５　１　７、　１９６８）；Ｄａｕｄｉ　　ＡＴＣＣ　
　ＣＣＬ　　２　１　３　（パーキット、リンパ腫、ヒ
ト）　　（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２　
８　：１３００−１３１０、　１９６８）　　．ＲＰＭ
Ｉ　　　８２６６　　　ＡＴＣＣ　　　ＣＣＬ　　　１
５５（Ｍｙｅｌｏｍ，ヒト）　　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｓｏｃｉｅｔｙ　　ＥａｒＥ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ
　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ１２５　：１２４６−１２５０
、　１９６７）；ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　　　ＡＴＣＣ　　
　ＣＣＬ　　　１１６　　ＣＰｅｒｉｆｅｒａｌ　　　
ｂｌｏｏｄ，　　　ヒ　ト　；　　Ａｃｕｔｅ　　　　
ｌ　　ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃＩｕｋｅｍｉａ）　　
（　Ｃ　ａｎｃｅｒ、　１８　　：　５２２−５２９、
１９６５）　　；ＲＰＭＩ　　　１７８８　　　ＡＴＣ
Ｃ　　　ＣＣＬ　　ｌ　５　６　）（Ｐ　ｅｒｉｆｅｒ
ａｌ　　ｂｌｏｏｄ，ヒトＸ　Ｉ　ｇＭの分泌）（Ｊ　
ｏｕｒｎａｌ　　Ｃ　ａｎｃｅｒ　　Ｉ　ｎｓｔｉｔｕ
ｔａ　（米国）、４３：ｌ１１９−１１２８、　１９６
’ｌ）　　．ＣＲＣＦ−ＳＢ　　　ＡＴＣＣ　　　ＣＣ
Ｌ　　　１　　２０　　（Ｐｅｒｉｆｅｒａｌｂｌｏｏ
ｄｘヒト；Ａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｕ
ｋｅｍｉａ）　　（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，２　７　　：　　２　４　７　９−２４８２、　ｌ　
　９　６　７　）　　；　　Ｊ　ｕｒｋａｔ　（　Ｉ　
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２４７、１　９　
８　０）など。マウスのリ冫パ球細胞、例えば、次のも
のを包含する二ＭＰＣ　−　１　１　　ＡＴＣＣ　　Ｃ
ＣＬ　　ｌ　６　７　（Ｍｙｅｌｏｏ＋ａ，マウス）（
免疫グロブリンの分泌）　　（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ，　　ｌ　３　１　：５１５−５４１，１９７
０）　　；Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　（ＮＳ−１
）ＡＴＣＣ　　ＴＩＢ　　ｌ８（非分泌性マウス骨髄＠
Ｘ　Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　６　：　５　１　ｌｓ　
　１９７６）　　；Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．ｌ　（Ｐ３Ｕ
ｌ）ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５９７（マウス骨髄腫）　　
（　Ｃ　ｕｒｒｅｎｔＴ　ｏｐｉｃｓ　　ｏ（　　Ｍ　
ｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，８１：ｌ−７、１　９　８　７）など。
ハイブリドーマは、例えば、次のものを包含する：マウ
スハイブリドーマＣ　Ｅ　Ａ　（Ｔｅｘｔ　　ｆｏｒ２
ｎｄ　　Ｓｙｍｏｓｉｕｍ　　ｏｎ　　Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　　Ｐｒｏｊ
ｅｃｔ　　ｏｆ　　Ｂａｓｉｃ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　　ｒｏｒ　　Ｆ　ｕｔｕｒｅ　　Ｉ　ｎｄｕｓｔｒ
ｉｅｓ％ｌ　７　５　、ｌ　９　８　４　）、ＨＳ−１
　１　（同上）　、Ｅ２３５　１６３　（Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ，　４　：　４　７、１９８５）、マウスヒトー
ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２−１６．６３　（Ｔｅ
ｘｔｆｏｒ　　　２ｎｄ　　　Ｓｙｍｏｓｉｕｍ　　ｏ
ｎ　　　Ｒｅｓａａｒｃｈ　　ａｎｄＤ　ｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ　　　Ｐ　ｒｏｊｅｃｔ　　ｏｆ　　　Ｂ　ａ
ｓｉｃ　　　Ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ｆｏｒ　　　
Ｆ　ｕｔｕｒｅ　　　Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　　ｌ
　　７　　５、　１９８４）、Ｎ１２−１６．６３から
誘導した高い産生性の菌株、例えば、Ｎ１２−１６．６
３．１９、Ｎ１２−１６．６３．４９．１９．６９など
（Ｔｅｘｔ　　ｆｏｒ　　３ｎｄ　　Ｓｙｍｏｓｉｕｍ
　　ｏｎ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ　　Ｐｒｏｊｅｃｔ　　ｏｆ　　Ｂａｓ
ｉｃ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ｆｏｒ　　Ｆ　ｕｔ
ｕｒｅ　　Ｉ　ｎｄｕｓＬｒｉｅｓ，　　１　５　５、
１　９　８　５）、１　１　２　　２　２　．　２　５
　（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＢ．ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎ，１２９：２６、１９８５）；ＨＢ　　Ｉ　Ｉ　Ｉ−
４３．１（同上）など。付着性（　ａｄｈｅｒｅｎｔ）
細胞は、例えば、次のものを包含する：ＦＬ　　ＡＴＣ
Ｃ　　ＣＣＬ　　６２　（ＡｍｎｉｏｎＳＨｕｍａｎ，
　ＨｅＬａ　　ＭａｒｋｅｒＳ）、（　Ｐ　ｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｓ　ｏｃｉｅｔｙ　　
ｆｏｒＥ　ｘｐｅｒｉｍｅｎＬａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　
ｉｏｌｏｇｙ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　９４　：　５２
３、１９５７）；ＨｅＬａ　　ＡＴＣＣ　　ＣＣ　Ｌ　
　２　（　Ｅ　ｐｉｔｈｅｌｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｙ
ｎａ％ｃｅｒｖｉｘ，ヒト）　　（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，　　ｌ　２　：　２　６　４、　１９
５２）　　；ＷＩＳＨ　　　ＡＴＣＣ　　　ＣＣＬ　　
　２５　　（Ａｍｎｉｏｎ％Ｈ　ｕｍａｎ，　　Ｈ　ｅ
Ｌ　ａ　　Ｍａｒｋｅｒｓ）（Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ　　Ｃｅｌｌ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２　３　　：
　　ｌ　　４、　１９６１）；ＣＨＯ−Ｋ　Ｉ　　　Ａ
ＴＣＣ　　　ＣＣＬ　　　６　　１　　（Ｏｖａｒｙ，
Ｃｈｉｎｅｅｓｅ　　ｈａｍｓｔｅｒ、Ｃ　ｒｉｃｅＬ
ｕｌｕｓ　　ｇｒｉｓｅｕｓ）（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，１０８：９４５、１９５８）　；ＮＣＴＣ
クローン９２９ＡＴＣＣ　　ＣＣＬ　　ｌ（結合組織、
マウス）、菌株Ｌのクローン（　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　
Ｃ　ａｎｃｅｒｌ　ｎｓｔｉｔｕｔｅ　（米国）、９：
２２９、ｌ　９　４　８）など。
さらに、特許請求の範囲の化合物の有効性は化学的部分
の組み合わせにあるように思われる。例えば、変性プレ
ポリマーは、ポリオール、イソシアネートおよび発現さ
れた第２官能基、例えば、スルフヒドリル、アミノまた
はスルホン酸基を包含する。好ましくは、これらの部分
から生ずるプレポリマーは、イソシアネート、例えば、
インホロンジイソシアネートで末端キャッピングされた
７５％のエチレンオキシドに基づくポリオールであり、
そしてＮＣＯは前述の官能基を含有する変性化合物と反
応されている。
しかしながら、表Ｖｌおよび下表Ｖｌｌの実験Ｂおよび
Ｃが実証するように、前述の部分の組み合わせがポリエ
ーテルグリコールおよび／または変性化合物の個々の存
在と反対に存在するとき、初めて細胞増殖の活性が示さ
れる。さらに、ポリオール部分のみを欠く変性プレポリ
マーは誘導体により産生されるのと同一のレベルで細胞
の増殖を増強しない。これらの結果は表ＶＩＡ中の結果
の追加の組により支持され、ここで異なるポリオールお
よび変性された誘導体が試験されている。
抗体の産生の増加は、また、単一の戊分の結果であるよ
うに思われない。表Ｖｌｌの実験Ａに示すように、培地
へのポリオール単独の添加は、細胞基準で抗体の産生を
顕著に増加せず、ならびに有意の細胞の増殖を示さなか
った。
細胞増殖エンハンサー化合物の利点の要約ここに記載す
る変性されたプレポリマーおよびポリマーの性質は、独
特であり、そして従来の細胞増殖エンハンサー／抗体産
生刺激因子および一般のポリマー系を越えた有意の利点
を提供する。
第１に、１つの実施態様において、特許請求の範囲の細
胞増殖エンハンサーはゲルの形態を取る。
前に述べたように、本発明のプレポリマーおよび変性プ
レポリマーは大量の水でゲル化する能力を有する。前述
したように、プレポリマーのＮＣＯ基の約３０％までの
みを変性すると、変性グレポリマーは実質的に重合する
容量を有する。生ずるヒドロゲルの一般の性質は、もと
のプレポリマーに基づくが、また、変性化合物により影
響を受けるであろう。こうして、細胞増殖エンハンサー
をゲルの形態にすることが便利であるとき、特許請求の
範囲の発明はこの要求を満足する柔軟性を有する。
第２に、シスタミンの実施態様は抗体産生刺激因子に容
易に適合することができる細胞増殖エンハンサーを提供
する。詳しくは、シスタミンで変性されたプレポリマー
またはポリマーのバッチの供給の半分を細胞増殖エンハ
ンサーとして使用することかできる；次いで、他方の半
分上のシスタミンのジサル７アイド結合を還元して抗体
の産生を刺激することができる。実施例ｘｘｖ　ｔおよ
び表ＩＩに示すように、シスタミンを使用してプレポリ
マーを変性し、次いで還元して−ＳＨ基を露出し、変性
プレポリマーは抗体の産生を４〜５倍／細胞に増加する
。全体的に、９倍の増加は、抗体産生細胞の量の２倍の
増加と組み合わせるとき、得られる。抗体の産生は、ま
た、スルホン酸を発現する誘導体により示される。参照
、実施例ＸＸＸＩＶにおけるタウリン変性プレポリマー
この方法における制限された数のプレポリマーのイソシ
アネート基を多官能性化合物で変性すると、官能性また
は反応性の基の導入が可能となると同時に、氷または架
橋剤との反応による連鎖延長および重合の行う能力をプ
レポリマーは維持する。こうして、変性されたが、なお
生物適合性のポリマーを形成することができる。
第３に、細胞増殖エンハンサーを、また、使用して、細
胞を種々の低い細胞密度、例えば、１〜ｌ０００細胞／
　ｍ　Ｑで開始される、細胞培養方法のための培地を補
充することができる。細胞のクローニングは、特許請求
の範囲のエンハンサーを使用することができる、これら
の方法のちょうど１つの例である。
以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施
例は本発明を限定しない。次の略号を本発明の説明にお
いて使用した。
゜Ｃ　　　セ氏０ ｃｍ　　　センチメートル ＤＭＥＭ　　ダルベツコ変性イーグル培地ＤＩ　　　脱
イオン化 ｇｍまたはｇ　　　グラム Ｈｇ　　　水銀 Ｍ　　　モル ｍ２　　平方メートル ｍ　ｅ　ｑ　　ミリ当量 ｍｇ　　　ミリグラム ｍｉｎ分 ｍＱ　　　ミリリットル ｍｍ　　　ミリメートル ｍｍｏｌｅｓ　　ミリモル μｇｍまたはμｇ　マイクログラム μｍ　　マイクロメートル μＭ　　マイクロモル ＭＷ　　　分子量 Ｎ　　　ノルマル ＮＣＯ　　イソシアネート ｎｇｍ　　ナノグラム ＰＢＳ　　リン酸塩緩衝液 ｐｐｍ　　部／ｌ００万 ％　　　パーセント ＳＥ　　　標準誤差 ＴＭ　　　商標 ■　　　体積 ｗｔ　　　秤量 ポリオールに基づくプレポリマーの調製実施例■ （プレポリマーＡの調製） 本発明のプレポリマーの調製に使用したプロピレンオキ
シド、Ｐｌｕｒａｃｏｌ　　Ｖ７＠（ＢＡＳＦ）、ｏｅ
（７５％）およびプロピレンオキシド（２５％）の７０
００ＭＷのトリオールコポリマーを脱イオン化し、そし
て乾燥した。この脱イオン化後、１６８７．４６ｇのＰ
　ｌｕｒａｃｏｌＶ　７を１６５．０ｇのイソホロンジ
イソシアネート（ＩＤＰＩ）および０．９３ｇのＳ　ａ
ｎｔｏｎｏｘ　　Ｒ　＠　（　Ｍ　ｏｎｓａｎｔｏ　　
Ｃ　ｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃ　ｏ．）と混合し、そして乾
燥窒素下に７０００に加熱した。イソシアネートのレベ
ルをジブチルアミンの添加により決定し、そして標準の
酸で逆滴定した。イソシアネートの濃度が０．４７ｍｅ
ｇ／ｇ　（０．３９ｍｅ　ｑ／ｇ＝理論値）に到達する
まで１５日を要した。生ずるプレポリマープレポリマー
Ａと表示する、は室温において液状であった。
実施例ＩＩ （プレポリマーＢの１４１Ｋ） ３００．０ｇの脱イオン化および乾燥したＴＰＥ　Ｇ　
Ｉ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　＠（Ｕｎｉｏｎ　　Ｃａｒｂｉｄ
　　Ｃｏｒｐ．）を２２．０ｇのＩＤＰＩおよび０．１
　６　ｇのＳ　ａｎｔｏｎｏｘ　　Ｒと混合して、プレ
ポリマーを形成した。
ＴＰＥＧ１００００は１００％の水和ポリマーのエチレ
ンオキシドから調製したＩＯ．０００ＭＷのトリオール
であった。この混合物を乾燥窒素下にに実施例■におけ
るように７０℃に加熱し、イソシアネート値を０．３６
ｍｅｑ／ｇ（理論値＝０．２８ｍｅｑ／ｇ）に到達させ
た。このプレポリマー、プレポリマーＢと表示する、は
、室温に冷却すると、固体を形成した。
実施例ＩＩＩ （プレポリマーＣの調製） ５０．０ｇ　（０．０　１２５当量のヒドロキシル）の
ポリエチレングリコール（８０００ＭＷ）（Ｓｉｇｍａ
　　Ｃ　ｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃ　ｏ．）を１００ｃｃ（
７８−２ｇ）のアセトニトリル中に溶解して、プレポリ
マーを調製した。これに、３．０６ｇ　（０．０２７５
当量のイソシアネート）および０．３ｇのＳ　ａｎｔｏ
ｎｏｘ　　Ｒを添加した。この溶液を、乾燥窒素下に乾
燥した酸洗浄したフラスコ中で１４日間７０゜Ｃに加熱
した。イソシアネートのレベルは第１４日に０．ｌＯｍ
ｅｑ／ｇ（理論値−０．１１ｍｅｑ／ｇ）に低下した。
形成したプレポリマーをブレポリマ−Ｃと表示し、モし
てアセトニトリル中の２５％の溶液として貯蔵した。
実施例ｉｖ （プレポリマーＤの調製） まず５０．０ｇ　（０．０２６３当量のヒドロキシノレ
）のポリエチレングリコーノレモノメチノレエーテル（
ＭＷ　ｌ　９　０　０　）　（　Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，　Ｉ　ｎｃ．）を１００ｍｆ２　　（７９．２ｇ
）のアセトニトリル中に溶解して、プレポリマーを調製
した。この溶液に、６．４３ｇ　（０．０５７８当量の
イソシアネート）のイソホロンジイソシアネートおよび
０．０３ｇのＳ　ａｎｔｏｎｏｘ　　Ｒを添加した。こ
の溶液を乾燥窒素下に乾燥した酸洗浄したフラスコ中で
８日間７０°Ｃに加熱し、このときイソシアネート含量
はＯ．１５ｍｅｑ／ｇ（理論値−０．２３ｍｅ　ｑ／ｇ
）であった。このプレポリマー、プレポリマーＤと表示
する、をアセトニトリル中の％として貯蔵しｌこ　。
実施例Ｖ （プレポリマーＥの調製） ｌＩ２のポリエチレンびん内で、８４８．８ｇの脱イオ
ン化および乾燥したポリオールＢＡＳＦ　１１２３　（
ＢＡＳＦ）を９１．６ｇのイソホロンジイソシアネート
と、室温において機械的に攪拌しながら３０分間混合し
て、プレポリマーを調製した。乾燥窒素をこの混合物の
上にパージし、そしてこのびんをねじ付きキャップで密
閉し、そして電気炉内に８５゜Ｃにおいて入れた。１１
日後、反応を停止した。生成物は０．４３ｍｅｑ／ｇの
イソシアネート値および２５゜Ｃにおける６２．００Ｑ
ｃｐｓの粘度を有した。このプレポリマーをプレポリマ
ーＥ（低温）と表示した。プレポリマーを同一の方法で
調製するが、ただしそれを電気炉内で１２５℃において
２日間インキュベーションした。このプレポリマー、プ
レポリマーＥ（高温）と表示した。
実施例Ｖｌ （プレポリマーＦの調製） 分子量５５０の七ノーメトキシポ・り（エチレングリコ
ール）（１６０ｇＳ０．２９１モル）をインホロンジイ
ソシアネート（６９．０ｇ，０．３　１０モル）と、ポ
リエチレンびん内で混合し、そして乾燥窒素でパージし
た。試料を炉内に入れ、そして温度を７０’Ｃ！に２０
時間維持しＩ；。その時、試料を取り出し、そしてイソ
シアネートのレベルは１．３２ｍｅｑ／ｇと決定された
。この生成物をプレポリマーＦと表示した。
実施例Ｖｌｌ （プレポリマーＧの調製） ８４％のエチレンオキシドおよび１６％のプロピレンオ
キシドからなり、分子量２２０のポリエーテルジオール
（タケダ）を得た。このジオール（８００ｇ，０．３６
モル）をＩＤＰＩ　（１６３．４ｇ，０．７４モル）と
混合し、そしてポリエチレンびん中に乾燥窒素下に入れ
た。試料を７０’０にＩＯ日間加熱し、その時イソシア
ネートのレベルは０．７５ｍｅｑ／ｇであることが分か
った。
反応をこの時点で停止し、モして生成物を乾燥窒素下に
攪拌した。生或物をプレポリマーＧと表示しｔ二。
実施例Ｖｌｌｌ （プレポリマーＨの調製） ８２％のエチレンオキシドおよび１８％のプロピレンオ
キシドからなり、分子量３６００のポリエーテルトリオ
ール（８００ｇ，０．２２モル）（アサヒガラス）を、
イソホロンジイソシアネート（１４９．１ｇ，０．６７
モル）と乾燥窒素下に混合し、そしてポリエチレンびん
内に入れた。試料を７０℃に１２時間加熱し、この時イ
ンシアネ−トのレベルは０．７２ｍｅｑ／ｇに到達した
。
試料をプレポリマーＨと表示し、そして乾燥窒素下に４
°Ｃにおいて貯蔵した。
プレポリマーの変性 実施例ｔＸ （プレポリマーＡのアミノエタンスルホン酸の変性） １２６．０ｍｇのアミノエタンスルホン酸（タウリン）
をｌｏ．Ｏｍ１２の０．０５モルのリン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）中に溶解して、溶液を調製した。４．７２ｍ
１２のタウリンの溶液をｌ．１８ｇのプレポリマーＡに
添加し、次いでよく混合した。
この比はプレポリマーのＮＣＯ基のｌモル当たり１モル
のタウリンのアミノ基に等しかった。この可溶性の変性
されたプレポリマーを室温において一夜攪拌し、次いで
透析して過剰のタウリンを除去した。変性プレポリマー
は、ゲル形成の性質を示すよりはむしろ、水中に溶解し
た。変性プレポリマーは大きさ排除クロマトグラ７イー
により特性決定した。
実施例Ｘ （プレポリマーＥのアミノエタンスルホン酸の変性） ２−グロバノール：リン酸塩緩衝液（０．０５モル）（
ｐＨ７．０）の１：１の溶液の２００．０ｍＱに、１．
２７ｇのアミノエタンスルホン酸（タウリン）を添加し
た。この混合物を室温において攪拌して、タウリンを溶
解した。連続的に攪拌しながら、５．０ｇのプレポリマ
ーＥ（低温）（５．ＯｍＱの２−プロパノール中に溶解
した）をタウリンの溶液に添加した。このプレポリマー
のＮＣＯ基より２倍過剰のタウリンのアミノ基であると
計算される。滴々添加を１５分間続け、そして反応を一
夜室温において続けた。溶媒を反応混合物から回転蒸発
器で真空下に除去した。乾燥した残留物は２　０　．０
　ｍＱの水中に完全に溶解した。
実施例ＸＩ （特性決定：プレポリマーＥのチロシンの変性）０．１
ｍｆｆの重炭酸ナトリウムを含有するｌ００．Ｏｍ１２
の水中に１．６３ｇのＬ−チロシンを溶解し、そしてｐ
Ｈｌｌ−１２に調節することによって、溶液を調製した
。５．０ｇの量のプレポリマ−Ｅ（低１１）をｌｏ．Ｏ
ｍ＜１の２−プロパノール中に溶解し、そしてチロシン
の溶液を攪拌しなから滴々添加した。これはプレポリマ
ーのＮＣＯ基より５．５倍過剰のチロシンであると計算
される。
過剰のチロシンを水に対する透析により除去した．透析
した組或物をセファデックス（　Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−２５のゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した
。チロシン変性したプレポリマーを排除した体積で溶離
し、ここでマーカープルーデキストランを溶離した。遊
離のチロシンの標準は、その溶離体積の２回で溶離した
。透析した組或物は、この透析により反応しないチロシ
ンを含有しないように思われた。生ずる化合物は、他の
変性プレポリマーを特性決定する標準として働いた。
実施例Ｘｌｌ （プレポリマーＥのシスタミンの変性）（低温） ３７．１ｍｇのシスタミ，ンニ塩酸塩を１５．０ｍｆｆ
の５０．０ミリモルのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）
中に溶解して、溶液を調製した。この溶液を１．０ｇの
プレポリマーＥ（低温）に添加し、そしてプレポリマー
Ｅ（低温）が溶解すると思われるまで攪拌した。ゲルの
形成は室温においてほぼ■２時間で起こった。過剰のシ
スタミンを２０．０ｍＱのＰＢＳをゲルに添加しそして
３１’Ｃにおいて１時間インキユベーションして洗浄除
去した。
ＰＢＳを注ぎ出し、そして洗浄手順を２回反復しｔこ　
。
このゲルに、ＰＢＳ中の２００．０ミリモルの５　．０
　ｍＱを添加して、シスタミンのジサルファイド結合を
還元して、変性化合物の第２官能基を活性化した。２４
時間後、ゲルは部分的に溶解し、そして追加の２．０ｍ
ｄの０．１モルのメルカプトエタノール溶液を２　．０
　ｍＱのゲル／溶液と混合してゲルを完全に溶解した。
次いで、この溶液を濾過滅菌した。
実施例ＸＩＩＩ （プレポリマーＡのシスタミンの変性）７４．２ｍｇの
シスタミンニ塩酸塩を３０．０ｍ１２の５０．０ミリモ
ルの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中に溶解して、溶
液を調製した。これは、プレポリマーのＮＣＯ基のほぼ
すべての変性について、シスタミンのアミノ基より１．
０６倍の過剰のプレポリマーのＮＣＯ基であると計算さ
れる。
２ｇのプレポリマーＡをこの溶液中に溶解し、次いでこ
れをガラス板中に注いで、ほぼ１２時間でゲル化して薄
い層を生成した。
シスタミンのジサルファイド結合を還元し、そしてゲル
を溶解し、３０．０ｍｆｆの５５ミリモルのメルカプト
エタノールを添加した。次いで、生成物を濾過滅菌した
。
実施例ＸＩＶ （プレポリマーＢのシスタミンの変性）１．３ｇのシス
タミンニ塩酸塩を１５０．０ｍαの５０ミリモルの重炭
酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中に溶解して、溶液を調製
した。この溶液に、ｌＯ．ＯｇのプレポリマーＢ（アセ
トニトリル中の５０％（　ｗ　／　ｗ　）溶液として）
を攪拌しながら添加した。攪拌しながら４時間後、メル
カプトエタノールを添加してシスタミンのジサル７アイ
ド結合を還元した。蒸留水に対して透析後、生或物を濾
過滅菌した。
実施例ＸＶ （プレポリマーＥ１低温、のシスタミンの変性）２５．
０ｍｆｆのＰＢＳ中に４０．０ミリモルのシスタミンニ
塩酸塩および５５．０ミリモルの２一メルカプトエタノ
ールを含有する溶液を調製し、これによりシスタミンの
内部のジサルファイド結合を還元した。この溶液に、０
．５ｇのプレポリマーＥ（低温）を攪拌しながら嫡々添
加した。この溶液を室温において一夜攪拌した。過剰の
シスタミンを水に対する透析により除去した。この実施
例において、プレポリマーの変性をシステアミンのチオ
レート基を経て、第２官能基としてアミノ基を残した。
結果はＮＭＲにより確証された。
実施例ＸＶＡ （プレポリマーＥ１高温、のシスタミンの変性）過剰の
シスタミンを添加して、プレポリマーＥ（高温）上のす
べてのイソシアネートを末端キャッピングした。シスタ
ミン、１　．　５　ｇ　（　Ａ　ｌｄｒｉｃｈ，ロット
Ｎｏ．０２１０１６ｃｊ）を１５０ｍ１２の５０ミリモ
ルの重炭酸ナトリウムｐ　Ｈ　８　．５中に溶解した。
この溶液をｌＯｇのプレポリマーＥ（高温）に添加し、
そして攪拌した。ゲルは形成せず、したがって４倍過剰
のシスタミンがすべてのイソシアネート基をキャッピン
グし、こうして架橋を防止したと推定した。攪拌しなが
ら、０．６ｍ１２のメルカプトエタノールをシスタミン
／プレポリマーの溶液に添加して、シスタミンをシステ
アミンに還元した。脱イオン水中で透析後、ＰＢＳ中の
５５ミリモルのメルカブトエタノール溶液を添加し、そ
してこの混合物を攪拌した。生成物ヲ０　．２ミクロン
のフィルターで濾過滅菌した。
実施例ＸＶＩ （プレポリマーＦのシスタミンの変性）分子量５５０の
モノメトキシポリ（エチレングリコール）を、１００ｍ
＜２のインプロパノール中に５０ｐＱのＩ　ＤＰ　Ｉ　
（Ｖｅｄａ−Ｃｈｅｍｉａ　　ＡＧ）を溶解して調製し
た溶液と混合し、次いで１０７ｍｇのシスタミンを含有
するホウ酸塩の１００ｍｕと混合した。これを攪拌し、
次いでヒューム７−ド中に一夜室温において入れた。次
いで、この溶液を４２５部のＰＢＳ（ｖ／ｖ）で希釈し
、そして０．２ミクロンのフィルターで滅菌した。
実施例ＸＶＩＩ （プレポリマー〇のシスタミンの変性）プレポリマーＧ
　（２．５０ｇ，１．８８ｍｅｑのＮＣＯ）を２　．５
　ｍＱの２−プロパノール中に溶解した。シスタミンニ
塩酸塩（４．２２ｇ，１８．７ミリモル）を５０．０ｍ
１２の０．０５モルのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
中に溶解し、そしてｐＨをＩＮ　　ＮａＯＨで７．０に
再調節した。プレポリマー溶液を攪拌しながらシスタミ
ン溶液に滴々添加した。室温において２４時間攪拌し、
生成物を蒸留水に対して２４時間透析して、反応しない
シスタミンを包含する、低分子量の物質を除去した。
実施例ＸＶＩＩＩ （プレポリマーＨのシスタミンの変性）プレポリマーＨ
　（２．５０ｇ，１．７９ｍｅｑのＮＣＯ）を２　．５
　ｍＱの２−プロパノール中に溶解した。シスタミンニ
塩酸塩（４．０２ｇ，１７．９ミリモル）を５０．０ｍ
（２の０．０５モルのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
中に溶解し、そしてｐＨをＩＮ　　ＮａＯＨで７．０に
再調節した。プレポリマー溶液を攪拌しながらシスタミ
ン溶液に滴々添加した。室温において２４時間攪拌した
。
次いで、生或物を蒸留水に対して２４時間透析して、反
応しないシスタミンを包含する低分子量の物質を除去し
た。
実施例ＸＩＸ （ＨＹＰＯＬ［Ｆ］ヒドロゲルのシスタミンの変性）Ｈ
ＹＰＯＬ■ヒドロゲルのポリウレタンのプレポリマー（
２．５　２　ｇ，２．０　２ｍｅ　ｑのＮＣＯ．Ｇ　ｒ
ａｃｅ　　Ｓ　ｐｅｃｉａｌｉｔｙ　　Ｃ　．、Ｗ．　
Ｒ．　Ｇｒａｃｅ　　＆Ｃ．一Ｃｏｎｎ．）を２　．５
　ｍＱの２−グロバノール中に溶解した。シスタミン二
塩酸塩（４．５４ｇ，２０．０ミリモル）を５　０　．
０　ｍＱの０．０５モルのリン酸ナトリウム（ｐＨ７−
０）中に溶解し、そしてｐ｝ｌをＩＮ　　ＮａＯＨで７
．０に再ｍ節した。プレポリマー溶液を攪拌しながらシ
スタミン溶液に満々添加した。室温において２４時間攪
拌し、この時生成物を蒸留水に対して２４時間透析して
、反応しないシスタミンを包含する低分子量の物質を除
去した。
実施例ＸＸ （ＨＹＰＯＬ＠Ｘ６１００のシスタミンの変性）ＨＹＰ
ＯＬ＠Ｘ６　１００、実験用の親水性ウレタンのプレポ
リマー（５０．０ｇ１９３ｍｅｑのＮＣＯ，　Ｇｒａｃ
ｅ　　Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ　　Ｃ．、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａ
ｃｅ　　＆　　Ｃ　．　−　Ｃ　ｏｎｎ．）を、５０ミ
リモルの重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中のシスタミ
ンニ塩酸塩（１　０．５ｇ，４　６．４ミリモル）の溶
液添加した。この溶液を一夜室温において攪拌した。
実施例ＸＸＩ （プレポリマーＡのシスタミンの変性）５５ｍｇの溶液
Ｘを３ｇのプレポリマーＡと５０ｍｇのボリブロビレン
の遠心管（　Ｃ　ｏｒｎｉｇ）中で混合し、モして５ｍ
Ｑのアリコートを９つのｌＯｃｍの培養平板（Ｆａｌｃ
ｏｎｌ　Ｏ　２　９、ロット５１９１２０２）の各々中
に配置した。生ずるヒドロゲルを一夜形威させた。溶液
Ｘの組威は、次のとおりであった： ４０ｍＱのホウ酸塩緩衝液（５０ミリモル、ｐＨ８．５
） ６４２μαのシスタミン原液（５６３ｍｇのシスタミン
ＨＣＩ／５ｍ１２のホウ酸塩緩衝液）４　．５　ｍＱの
ＩＯＸＰＢｓ　（ＧＩＢＣＯ　　３１０−４０８０１ロ
ットｌｌＮ２２５６）ヒドロゲノレは各ゲノレを２０ｍ
（２のＰＢＳと４日間ほぼ室温（２２℃）においてイン
キユベーションして完全水和した。次いで、過剰のＰＢ
Ｓを除去し、そしてヒドロゲルを２０ｍ１２　　（ｅａ
）の２−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含有するＰＢ
Ｓ溶液で還元した。ゲルを室温において４日間インキユ
ベーションし、次いで生ずる溶液を５０ｍＱの遠心管に
室温における貯蔵のために移した。
ゲルをＰＢＳ中の６３μモルの２−メルカプトエタノー
ルで調製し、そして０．２ミクロンの真空濾過により滅
菌した。
実施例ＸＸＩＩ （プレポリマーＡのシスタミンの変性）このゲルを実施
例ＸＸＩに従い調製したが、ただしヒドロゲルを形成し
、水和し、そしてリン酸塩または塩化ナトリウムを含有
しない水溶液中で還元した。
詳しくは、５５ｍＱのシスタミン／ホウ酸塩溶液（２−
８６ｍ（１の新しく調製した０．５モルのホウ酸塩緩衝
液中のシスタミンを９　．７　ｍＱのホウ酸塩緩衝液ｐ
Ｈ８．５に添加した）を、５０ｍ（１の遠心器内のプレ
ポリマーＡの３ｇと混合し、次いで５ｍＱのアリコート
をｌＯｃｍのバクテリアの培養平板に移した。７時間後
、２０ｍＱの水を各平板に添加し、そして平板をインキ
ュベーター中に３７℃において一夜入れた。過剰の水を
廃棄し、そして１０ｍ（２の７．７ミリーモルの２−メ
ルカプトエタノールを各平板に添加した。平板を３７℃
において一夜配置し、そして生ずる溶解したケルを５０
ｍ＜１の管に移し、次いで０．２ミクロンの真空濾過を
した。
実施例ＸＸＩＩＩ （プレポリマーＤのシスタミンの変性）誘導体の溶液を
調製し、ここで実施例Ｘｖ■により調製した誘導体のＩ
ｇを２ｍαの２２．２ｍｇのシスタミンを含有するホウ
酸塩緩衝液と混合した。溶液を攪拌しそして一夜放置後
、生ずる誘導体溶液を２５部のＰＢＳ（ｖ／ｖ）で希釈
し、そして濾過滅菌した。
実施例ＸＸ［Ｖ （プレポリマーＡのシスタミンの変性）第一アミノ基を
含有する水溶性化合物、例えば、シスタミン（ｌ　ｌ．
２９ｍｇ／ｍＱ，Ｓｉｇｍａ）は、５０ｍＱのリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解した。次いで、実施例Ｉ
からのプレポリマーＡの原液を、等しい重量のプレポリ
マーと乾燥アセトニトリルとの混合により調製した。次
いで、４ｍＱの上のシスタミン溶液をプレポリマーＡの
原液に添加した。
上の反応戊分は反応した溶液中で誘導化ポリマーを形成
し、ここでプレポリマーＡのイソシアネート基の１００
％が問題の化合物のアミン基により尿素結合を形成して
いると仮定される。混合後、ポリマ一一誘導体を室温に
おいて一夜硬化した。
次いで、誘導化したプレポリマーのアリコート（プレポ
リマーＡの量に基づいて０．１９ｇ）を１０ｍ（２のＰ
ＢＳで希釈しｔ；。
次いで、ポリマーの誘導体のこの希釈溶液のアリコート
（５ｍ＜２）を０。ｌｍＱの２一メノレカプトエタノー
ル（ＧＩＢＧＯ）の５５ミリモルの溶液で還元した。次
いで、これらの調製物を０．２ミクロンの濾過により滅
菌した。
実施例ｘｘＶ （プレポリマーＡのタウリンの変性） 誘導体を実施例ＸＸＩＶに従い調製したが、ただし２−
アミノエタンスノレホン酸、６．２４ｍｇ／ｍＱ　１　
Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を第一アミノ化合物として使用してプ
レポリマーを誘導化した。タウリンはイソシア不−ト基
の５０％と反応して尿素結合を形成すると考えられる。
（シスタミン変性プレポリマーＡの効果）ＨＦＮ７．ｌ
ハイブリドーマ細胞（ＣＲＬ　　１６０６不ズミ　ハイ
ブリドーマ系統、ＡＴＣＣ）を用いるアッセイによって
、７イブ口ネクチンと結合する免疫グロブリン（ＩｇＧ
）が産生され、産生されたＩｇＧの量はＥＬ　Ｉ　ＳＡ
又はＨＰＳＥＣにより定量することができる。この系統
の細胞は、１部のＤＭＥと１部のＦ−１２培地（ＧＩＢ
Ｃ○）を混合することにより調製された、血清を含まな
い培地中で６ケ月以上連続的に培養された。
この混合物は３７゜ＣでｐＨ７．２を有し、３ｍＭの炭
酸水素ナトリウムを用いて製造され、更に２５ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ　（シグマ）、５μｇ／Ｉ＋ＩＱインスリン（
シグマ）、ｌμｇ／ｗｒＱの鉄飽和トランスフェリン（
マイルス）、２０μＭのエタノールアミン（シグマ）、
３０ｎＭのＳｅ　（Ｎａｕｓｅａ．として）（シグマ）
及び５０ｐｇ／ｍＱの牛血清アルブミン（マイルス）が
追加されている。
１ｍＱ当たり２０，０００個の対数増殖期のＨＦＮ７．
１ハイブリドーマ細胞を含むこの培地の原液を調製し、
５ｍＱのアリコートを数個のＴ−２５組織培養フラスコ
（コーニング）の各々の中に入れた。この四重複（ｑｕ
ａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）分析において、二種の異なる
容積の生理的食塩水（ｌ　ＯＸダルベツコのＰＢＳ，Ｇ
ＩＢＣＯから製造された）又は実施例ＸＸＩからの誘導
体をこれらの反復実験フラスコに添加した。フラスコを
密封し、四日間３７゜Ｃのインキュベーター中に置いた
。次いで得られる細胞濃度をコールター・カウンター（
ＣｏｕＨｅｒＣｏｕｎｔｅｒ）　（　Ｔ　Ｍ型）粒子計
数器（コールター社）で測定し、培養された細胞により
産生された抗体の量はＥＬＩＳＡにより測定された。
前に言及し、且つ第■表に示すように、誘導体調製物は
細胞数で二倍の増加を、及び細胞当たりの抗体産生速度
で４−５倍の増加を誘発した。これは総体的抗体産生で
９倍の増加をもたらしており、例えば対照速度が４．５
倍で抗体産生細胞数が２倍となっている。
第　　■ 表 試料 誘導体　初期細胞数 Ｃｍｇ／Ｑ　）　　平均±ＳＥ ＩｇＧ（μｇ）／ １０’ 細胞 Ｑ．ｌ＋ｎＱ　　食塩水　８　　　　　１０．６±０．
９５　　　　２２．３０．’ｋｍＱ　　ＸＸ　Ｉ　　Ｏ
．０３５　２　１．０±１．９６　　１０２．３０．２
５＋＋＋Ｑ食塩水　０　　　　　９．７±０．３５　　
　　３８．２０．２５ｍＣＸＸＩ　　Ｏ．０８６　２２
．３±２．０１　　　９９．０実施例　ＸＸ■ （増殖に及ぼす初期細胞密度の効果と細胞増殖エンハン
サーに対する応答） この実施例においては、｝｛ＦＮ７．ｌ細胞を再度実施
例ＸＸ■に記載された培地を含むフラスコ（Ｔ−２５）
中に入れた。この場合には、細胞密度は第■表に指示さ
れたように変化させた。実施例ＸＸＩにおいて製造した
誘導体（　０　．　ｌ　ｍｆｆ）を実験フラスコに添加
したが、それ以上何も対照フクスコには添加しなかった
。次いでフラスコを密栓し、四日間インキュベーター（
３７℃）中に置いた。次いで細胞濃度をコールター・カ
ウンター（ＴＭ型）粒子計数器で測定した。
第■表に示すように、培養基が誘導体の非存在下に、低
い初期細胞密度で平板培養された時には殆ど又は全く細
胞の増殖が観察されない。誘導体は又対照培養基におい
て著しい増殖が観察された、細胞密度を高くして平板培
養された培養基中においても増殖を増進した。
第　　　ｍ　　　表 ｌ一当たりの細胞数　　　　細胞数の増加試　料　　初
期　　終期　　倍率 対照　　１２９０ 実施例ＸＸＩ　　　１２９０ 対照　　５７４０ 実施例ＸＸＩ　　　５７４０ 対照　１１８００ 実施例ＸＸＩ　　１１８００ 対照　２１７２０ 実施例ＸＸＩ　　２１７２０ １３７５　　　　　　１．１ ５８８０　　　　　　４．６ ５２１０　　　　　　０．９ ３９８６０　　　　　　６．９ ２３１５５　　　　　　２．０ １５７１５５　　　　　１３．２ １５２３４５　　　　　　７．０ ４３６０７０　　　　　２０．１ 実施例　ＸＸ■ （誘導体の投与量応答分析） １ｍ１２当たり１８，０００個の対数増殖期のＨＦＮ７
．１ハイブリドーマ細胞を含む実施例ＸＸＶＩに記載さ
れた培地原液を調製し、５ｍαのアリコートを数個のＴ
−２５組織培養フラスコ（コー二冫グ）の各々中に入れ
た。この四重複分析において、第■表に示すように、生
理的食塩水又は種々の量の実施例ＸＸＩからの誘導体を
これらの反復実験フラスコの幾つかに添加した。フラス
コを密栓し、四日間３７゜Ｃのインキュベーター中に置
いた。次いで得られた細胞濃度をコールター・カウンタ
ー（ＴＭ型）粒子計数器で測定した。誘導体の最終的な
量及び実験培地中の最終細胞密度も第■表に示されてい
る。
第 ■表 試　　料 誘導体の量　　誘導体　　　（細胞／ｍα）（μＱ）　
　（μｇ／＋ＩＩＱ）（平均＋ＳＥ）対照 食塩水　１００ 食塩水　２５０ 実施例ＸＸＩ　　　　ｔｏ　　　　　４実施例ＸＸＩ　
　　　５０　　　　１８実施例ＸＸＩ　　　　７５　　
　　２７実施例ＸＸＩ　　　１００　　　　３５実施例
ＸＸＩ　　　２５０　　　　８６１．９±０．２Ｘ　１
　０’ １．９±０．２ＸＩＯ’ １．７±０．ＩＸＩＯ″ ２．７±Ｏ．ｌＸｌＯ’ ２．９±Ｏ．ｌＸｌＯ’ ３．２ｆＯ．ｌＸＩＯ’ ３．８ｆ０．４ＸＩＯ’ ３．９±０．３ｘ　ｌ　Ｏ’ 実施例　ＸＸ［ （誘導体の存在及び非存在における２−メルカプトエタ
ノールの増殖効果） メルカプトエタノールは或種の培養された啼乳類の細胞
の増殖を促進することが知られており、或培養培地の処
方中に含まれている（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ　（ＴＭ）培地
、Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ中に５５μＭ）。
従って本実施例は従来から既知の細胞増殖エンハンサー
と本発明によるエンハンサーとの比較である。本実施例
においてはｌｍ１２当たり２２．０００個のＨＦＮ７．
１ハイブリドーマ細胞を含む実施例ＸＸＶＩに記載され
た培地５＋＋＋ｆｆを四個のＴ−２５組織培養フラスコ
の各々に入れた。次いで四個のフラスコに下記のように
添加した。
フラスコ＃ｌ：対照 フラスコ＃２：０．５ｍ＜１の５　７　０　ｐＭ２−メ
ルカプトエタノール フラスコ＃３：０．ｌｍｄの実施例ＸＸＩからの誘導体 フラスコ＃４：フラスコ＃２のようにメルカプトエタノ
ール及びＯ　．　ｌ　ｒａＱの実施例ＸＸＩ。
次いでフラスコを堅く密栓し、インキュベーター（３７
℃）中に入れた。四日の増殖後、細胞数をコールター・
カウンター（ＴＭ型）粒子計数器で測定し、下記の第Ｖ
表に記録してある。
第　　Ｖ 表 誘導体化した　　２−メルカプト フラスコ　プレポリマー　　エタノール番号　　（μｇ
／ＩＩＱ）　　　　　（μＭ）４日目の 細胞数／Ｉｌ＋１２ ＃１　　　　−−−　　　　　　一−−　　　　１．５
ｘｌＯ’＃２　　　　−一−　　　　　　５７　　　　
１．７ｘｌｏ’＃３　　　　　３５　　　　　−一−　
　　　４．５ＸＩＯ’＃４　　　　　３５　　　　　　
　５７　　　　４．４ｘｌＯ’指摘したように、誘導体
プレポリマーは顕著な増殖刺激を誘発し、メルカプトエ
タノールは単独添加又は誘導体と組み合わせての添加で
は殆ど又は全く効果が観察されなかった。従って誘導体
の効果は調製物中に２−メルカプトエタノールの存在に
よるものではない。
実施例　ＸＸＸ （誘導体中の各或分の増殖効果） 下記の実験はプレポリマーの戊分の一つ及びポリマー誘
導体が増殖の強化の要因となっている可能性を探求する
。
ｌｍ１２当たり１５．０００個（７）ＨＦＮ７．１ハイ
：ｌ／リドーマ細胞を含む実施例ＸＸ■に記載された培
地５ｍｆｆを、多数のＴ−２５組織培養フラスコの各々
に添加した。試験した各試料の適当な容積が四重複して
フラスコに添加された。試験試料は二つの対照、エチレ
ンオキシド基剤ポリオール（プルラコール　ｖ７）、シ
スタミン、ポリオール誘導体及び実施例ＸＸＩ及び実施
例ｘｘｎにより製造される特許請求の範囲内の誘導体を
欠いている、実施例ＸＶＩにより製造されｔ；化合物を
包含していた。フラスコを堅く密栓し、四日間インキュ
ベーター（３７℃）中に入れた。最終細胞数はコールタ
ー・カウンター（ＴＭ型）粒子計数器で測定され、細胞
数は対照細胞数の％として括弧［］内に示されている。
結果は第■表に示されている。実施例ＸＶＡにおいて製
造された誘導体及び異なるポリオール、例えばＢＡＳＦ
ｌ１２３を含む培地からの追補的な試験結果は第ＶＩＡ
表に包含されている。実験■及び■における実施例Ｄを
参照のこと。
第　　　ＶＩＡ　　　表 （細胞増殖に及ぼすポリオールの効果）実験ＸＶＡにお
ける誘導体 実施例　ＸＸＸＩ 第■表の実験Ａにおいて、１ｇのプルラコールＶ７　（
ＢＡＳＦ　　ワイアンドット社）及びｌｇのＴＰＥＧ　
　１００００（ユニオン・カーバイド）を各々９ｇのハ
ングの緩衝生理的食塩水（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）と混合して
各１０％の原液を製造した。本溶液及びハングの緩衝生
理的食塩水（０．０５又は０．５ｍ１２）を、ｋｒｍＱ
当たり２０．０００（７）ＣＬＲ１６０６細胞の実施例
ＸＸＶＩに記載された培地５講Ｑを含むＴ−２５フラス
コに添加した。実験Ｂにおいては、プルラコール　ｖ７
から製造された誘導体が又試験された。五日後、最終細
胞数はコールター・カウンター（ＴＭ型）粒子計数器を
用いて測定された。結果は第■表に報告されている。
実施例　ｘｘｘｕ 第７表の実験Ｃにおいては、ポリオールＢＡＳＦｌ１２
３及びこのポリオールから製造された誘導体、例えばプ
レポリマーＥ１高温度、が実施例ｘｘｘｒのように細胞
の増殖強化について試験された。この添加の結果は第■
表に記録されている。
第　　■ 表 実験 試料 ポリオール 戊分の濃度 （即／ＩＩ（２） 細胞　増殖 （対照の％） Ａ 対照（ＨＢＳ） プルラルコールＶ７ プルラルコールＶ７ ＴＰＥＧ　　１００００ ＴＰＥＧ　　１００００ Ｂ 対照（ＨＢＳ） プルラルコールＶ７ 実施例　Ｘｘ■ ０ ０．２ ０．０４ １００ ９１ １８７ Ｃ 対照（ＨＢＳ）　　　　　　Ｏ ＢＡＳＦ　　１１２３　　　　　０．０７実施例　ＸＶ
Ａ　　　　　　Ｏ．０５ １００ ７７ １３６ 実施例　ｘｘｘｍ （シスタミン変性プレポリマーＤ及びＧの効果）この実
施例においては一価のプレポリマーＤ（１分子当たりｌ
イソシアネート基）及び二価のプレポリマーＧ（１分子
当たり２イソシアネート基）を用い、それらをシスタミ
ンで変性することによって増殖強化誘導体を製造するた
めに用いた；実施例ＸＸ■及びＸ■を参照のこと。
ｌＩＩＩＱ当たり１５，０００個のＨＦＮ７．１ハイプ
リドーマ細胞を含む実施例ＸＸＶＩに記載された培地５
ｍ１２を多数のＴ−２５組織培養フラスコの各々に添加
した。１００μＱの食塩水及び誘導体を適当なフラスコ
に添加した。誘導体の原液は約１３ｒｔｒｇ／ｍＱのポ
リオール（誘導体調製物中に共有結合した付加物として
存在）を含んでいた。フラスコを密栓し、四日間インキ
ュベーター（３７゜Ｃ）に入れた。最終細胞数をコール
ター・カウンター（ＴＭ型）粒子計数器を用いて測定し
た。これは四重複分析であり、増殖の四日後に観測され
た相対細胞密度（食塩対照に関して）は表にまとめられ
、第■表に報告されている。
第　　■ 表 試料 食塩水 変性プレポリマーＤ（実施例ＸＸＩ［Ｉ）変性プレポリ
マーＧ（実施例Ｘ■） 相対的細胞密度 １．００ ｌ．５５±０．１６ ｌ．５８±０．２４ これらの調製物は（これらの濃度で存在する時）両者共
細胞の増殖を刺激する。
他の硫黄含有第一アミンを用いて製造された誘導生 実施例　ＸＸＸｒＶ （シスチン変性プレポリマーＡ及びタウリン変性プレポ
リマーＡによる抗体産生） 下記の事例は硫黄が他の酸化状態で存在している他の硫
黄含有第一アミンを用いて細胞増殖強化誘導体が製造で
きることを示している。更に、これらの調製物はヒドロ
ゲルが生成しない条件下で製造された。又誘導体の生成
の際に毒性物質は生成しないことが示されており、従っ
てこれらの物質は水利工程の際ヒドロゲルから洗浄され
たことを示している。結果は下記の第１表のＡ及びＢの
欄に表示されている。
この場合ＨＦＮ７．１ハイブリドーマ細胞（Ａの欄では
２９，０００細胞／ｍＱ及びＢの欄では３２．０００細
胞／ｒｔｒＱ，　５ｍＱ／　Ｔ　　２　５フラスコ）は
グレース・スペシャルティ・ケミカル社、Ｗ．Ｒ．グレ
ース社、コネチカットのアミンコ部門から市販されてい
るＷＲＣ　　９３５”培地中で培養された。外に特に指
示しない限り第Ｘ表の試料ｌに指示されたＷＲＣ　　９
３５培地が下記の実施例に使用された。
下記の第■表のＡの欄では、各０．２５ｍ１２の誘導体
調製物、例えばＸＸＩＶ及びＸＸＶ，及び指示された対
照溶液が重複してフラスコに添加された。
Ｂの欄では実施例ＸＸｖで製造された誘導体が三種の異
なる濃度で試験された。濃度は細胞の増殖及び抗体の産
生の両者に及ぼす濃度の効果を比較するために変化させ
た。試験濃度は括弧内に示されており、Ａの欄で試験さ
れた量の％として表現されている。次いでフラスコを密
栓し、五日間（Ａ）又は三日間（Ｂ）のいずれかの間（
３７゜Ｃ）インキュベーター中に置かれる。最終細胞数
はコールター・カウンター（ＴＭ型）粒子計数器を用い
て測定され、抗体濃度はＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定され
た。第■表において、細胞の増殖は細胞密度の相対的増
加（最終細胞数／接種細胞数）として表現され、抗体の
産生は比較の目的のために細胞を基準として正規化され
ている。
試　　料 第　　■ 表 抗体産生 初期細胞数／　（μ９／１０’細胞） 最終細胞数　　　（平均±ＳＥ） Ａ）５日間増殖 対照、添加物無し 対照、食塩水 対照、食塩水十ＭＥ 対照、平均 実施例ＸＸＩＶ 実施例ＸＸＶ Ｂ）３日間増殖 対照、添加物無し 実施例ＸＸＶ（１．２％） 実施例Ｘ）ｌ（１２．４％） 実ｍ例Ｘ　Ｘ　Ｖ（ｌ　ｌ　７．６％）１６．Ｏ １６．６ １６．２ １６．３ １９．４ ｌ８．０ ６．８ ７．７ ｌＯ．１ １１．３ ２０、５±１．８ ２１．６±２．８ １８．８±０．２ ２０．２±２．０ ３８．８ ２７．８±１．４ ２３．４±２．８ ２８．４±０．２ ３７．０±１．７ ２７．８ ＭＥ＝メルカブトエタノーノレ 実施例　ｘｘｘｖ （システアミン変性プレポリマーＥ１ 果） 高温度の効 ＨＦＮ７．ｌネズミ　ハイブリドーマ細胞を第Ｘ表の試
料ｌに指示された蛋白質補添剤を含むＷＲＣ　　９３５
＠培地中に１　ｍＱ当たり２０，０００細胞毎にローラ
ー壜中に接種した。第Ｘ表に指示されたような追加蛋白
質又はシステアミン誘導プレポリマーを添加し、培養液
をｌ分間当たり１．５回転させて３７゜Ｃでインキユベ
ートした。抗−ヒトフィブロネクチン抗体の濃度が連続
バッチ培養の４日目及び５日目に測定されｔこ。
試 １ ２ ３ 料 第 Ｘ 表 培地の内容 補添剤として市販の インスリン５μｇ／ｍＱ トランスフエリン５μｇ／ｍＱ アルブミン５０μｇ／ｍＱを含む ＷＲＣ　　９３５培地 ２倍の蛋白質（インスリンｌＯμｇ／ｍＱ；トランスフ
エリンｌ　Ｏ　ｐｇ／ｍＱ　；アルブミンｌ００μｇ／
ｒｎＱ’）を加えたＷＲＣ　　９３５培地 実施例ＸＶＡで製造された誘導体 ２０／７９を加えたＷＲＣ９３５培地 ＩｇＧ Ｃｍｇ／Ｑ　） ４日　　５日 ２７ ８０ ４０ １０５ ４８ １０８ ４ 上記の試料２のように２倍の蛋白質 及び実施例ｘｖＡで製造された誘導体 ２０μ２を加えたＷＲＣ　　９３５培地５３ １４９ 実施例　ＸＸＸＶＩ （シスタミン変性プレポリマーＢ及びプレポリマーＥ、
高温度の効果） 実施例ＸＩＶ（プレポリマーＢからの誘導体）及びＸＶ
（プレポリマーＥ１高温度からの誘導体）に従って製造
された誘導体を夫々７５１Ｒｇ／Ｑ及び５０ｍｙ／Ｑで
ＷＲＣ　　９３５＠培地に添加した。
下記の第■表を参照のこと。
第　　　ｍ　　　表 （細胞増殖に及ぼすポリマー誘導体の効果）細胞数（Ｘ
ＩＯつ 日数　対照Ｘ 培地に実施例ｘｎを ５２ｍｇ／Ｑ添加 培地に実施例ＸＶを ６７ｍｙ／Ｑ添加 第　　　■　　　表 初期細胞数　　最終細胞数　　　ＩｇＧ添加剤　　　（
ＸＩＯつ　　（ｘｌＯ’）（μｇ／１０’細胞）無し　
　　　　　　　　　２ （ＷＲＣ　　９３５培地） 実施例　ＸＶＡ （５　０ｒａｇ／Ｑ　） 実施例　Ｘ■ （７５１１９／Ｑ） ２ ２ ５２ １００ １００ ７９ １０７ ９８ 日数　対照Ｘ 培地に実施例ＸＸ■を １０ｍｇ／ｉ２添加 培地に実施例ＸＶＡを ５０ｖｐ；ｔ／Ｑ添加 本培地−ＷＲＣ　　９２５培地に第Ｘ表の試料ｌに指示
された蛋白質補添剤を加えたもの 補足的変性プレポリマー （プレポリマーＥ１高温度の２．２′−ジチオジエタン
酸変性） １７０．０ｍｇの２，２゛−ジチオジエタン酸を２０．
ＯｒＲＱのアセトニトリルに溶かして溶液を調製した。
この溶液を４．４ｇのプレポリマーＥ１高温度に添加し
、プレポリマーが溶解したように見えるまで攪拌した。
これはプレポリマーのＮＣＯ基に対し１．０モル当量の
カルボン酸基であると算定される。一週間後の試料のカ
ーボン１３−ＮＭＲスペクトルによれば、ＮＣＯ基の５
−ｔｏ％だけがカルボン酸基と反応したことを示した。
この時点で総てのカルボキシル基をイオン化するために
当量のＮ−メチルイミダゾールを添加した。約２４時間
以内に室温でゲルの生戒が起こった。ゲルを２０．０ｍ
（２のアセトニトリルと共に４時間振盪し、余分の２．
２′−ジチオジエタン酸及びＮ−メチルイミダゾールを
洗い流した。
ゲルを洗浄するためにアセトニトリルに溶かした２００
ｍＭの２一メノレカブトエタノーノレ溶液２０．０ｍＱ
を添加し、変性されたプレポリマーの遊離の官能基とし
て−ＳＨを発現するために、２，２″−ジチオジエタン
酸のジスルフィド結合を還元した。１２時間後、ゲルは
完全に溶解した。化合物を５５ｍＭの２−メルカプトエ
タノールに対して透析し、使用前に滅菌濾過した。
実施例　ＸＸＸ■ （プレポリマーＥ１高温度の３．３′−ジチオジプロピ
オン酸変性） ２００■の３，３″−ジチオジプロビオン酸を５ｍＱの
アセトニトリルに懸濁し、１６０ｍ９のＮ−メチルイミ
ダゾールを滴下して加えることにより溶液を製造した。
この溶液をアセトニトリル中のブレホリマーＥ（高温度
）溶液（１８１１１１２のアセトニトリル中に４．４ｇ
のプレポリマーＥ）に添加し、溶液を３０分間振盪した
。これはプレポリマーのＮＣＯ基に対し１．０モル当量
のカルポン酸基であると算定される。約２４時間後に室
温でゲルの生或が起こった。ゲルを２０．０＋ｍ（２の
アセトニトリルと共に４時間振盪して、余分の３．３′
−ジチオジプロビオン酸及びＮ−メチルイミダゾールを
洗い流した。
ゲルを洗浄するためにアセトニトリルに溶かした２００
ｍＭの２一メルカプトエタノール溶液２０．ＯｍＱを添
加し、３．３′−ジチオジブロピオン酸のジスルフィド
結合を還元した。１２時間後、ゲルは完全に溶解した。
化合物を５５ｍＭの２−メルカプトエタノールに対して
透析し、使用前に滅菌濾過した。
実施例　ｘｘｘａ （プレポリマーＥ１高温度の酸化されたグルタチオン変
性） プレポリマー上の総てのイソシアネートが末端キャッピ
ングされることを確実にするために、５倍の過剰のグル
タチオンのーＳ−Ｓ−グルタチオン（酸化型）をプレポ
リマーＥ，低温度に添加した。特にグルタチオン（酸化
型）、１０．０ｇ　（分子量６５６．６）をｐ　Ｈ　９
　．０の２５ｍＭの炭酸水素ナトリウム２３４−に溶解
した。この溶液に、１５．６９のアセトニトリルに溶か
したｌ’．５６９のプレポリマーＥ（低温度）を徐々に
添加し、混合物を攪拌した。溶液を水に対し透析し、過
剰の反応剤を除去した。
実施例　ＸＬ （プレポリマーＥ１低温度の還元型グルタチオン変性） 上記の実施例ＸＸＸＩＩにおける誘導体を過剰の２一メ
ルカブトエタノールに添加し、グルタチオンのジスフル
ド結合を還元した。得られる誘導体を５５ｍＭのメルカ
プトエタノールに対して透析し、使用前に滅菌濾過した
。
実施例　ＸＬＩ （フレホリマーＥ１低温度のシスチン変性）プレポリマ
ー上の総てのイソシアネートが末端キャッピングされて
いることを確実にするために、５倍の過剰なシスチンを
グレポリマーＥに添加しｔ；。シスチン、１４．６８を
ｐＨ９．０の２５ｍＭの炭酸水素ナトリウム、３００ｍ
ｆｆに溶解した。この溶液に２０９のアセトニトリルに
溶かした２０９のプレポリマーＥ（低温度）を徐々に添
加した．溶液を水に対して透析し、過剰の反応剤を除去
しｔこ　。
実施例　ＸＬＩ［ （プレポリマーＥ１低温度の還元型シスチン変性）上記
の実施例ＸＬＩにおける誘導体を過剰の２一メルカブト
エタノールに添加し、シスチンのジス７イド結合をシス
テインに還元した。得られる誘導体を５５ｍＭのメルカ
プトエタノールに対して透析し、使用前に滅菌濾過した
。
第　　　ｘｍ　　　　表 （細胞増殖に及ぼす変性プレポリマーの添加の効果）細
胞数（×ｌＯつ ０日　３日　４日 ５日 ＸＷＲＣ　９３５＠培地中の ＨＦＮ７．１細胞 ２　　ＷＲＣ９３５培地に　　　　　０．２　　３．１
　　７．６　　１　１．４実施例ＸＸｘ■の変性プレポ
リマー （チオエタン酸により変性されＩ； プレポリマーＥ１高温）を５０ｍｇ／（２添加３　　Ｗ
ＲＣ９３５培地に　　　　　０．２　　３．７　　８．
７　　１２．４実施例ｘＸＸ■の変性プレポリマー （チオエタン酸により変性された プレポリマーＥ１高温）を５０１１ｇ／１２添加４　＃
ｌの対照　　　　　　　　　０．２１．９４．５　　　
９．８５　　ＷＲＣ９３５培地に　　　　　０．２　　
３．０　　７．１　　１５．０実施例ＸＶＡの変性プレ
ポリマー （シスタミンにより変性されたプレポリマーＥ１高温、
の還元生成物）を５０ｍｇ／Ｑ添加５　　ＷＲＣ９３５
培地に　　　　　０．２　　２．２　６．０　　１３．
９実施例ＸＬの変性プレポリマー （グルタチオンにより変性されたプレポリマーＥ１低温
、の還元生或物）を５０１１１９／（２添加７　　ＷＲ
Ｃ９３５培地に　　　　　０．２　　３．０　９．７　
　１６．２実施例ＸＬＩＩの変性プレポリマー （シスチンにより変性されたプレポリマーＥ１高温、の
還元生或物）を５０１１９／Ｑ添加本発明の原理、好適
な具体化及び操作の方法は前述の明細書に記載されてい
る。しかしそれらは限定ではなく例証と見做されるもの
であるから、ここで保護されることを意図している発明
は、開示された特定の形態に限定されるものと解釈すべ
きではない。本発明の精神から逸脱することなく当業者
には変化及び変更を加えることが可能である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ヒドロキシル基の少なくともあるものがポリイソシ
    アネートでキャッピングされている、オキシエチレンに
    基づくジオールまたはポリオール単位からなる変性親水
    性ポリマーであって、前記ポリイソシアネートのイソシ
    アネートはイソシアネート（ＮＣＯ）反応性官能基で変
    性されており、そして前記変性ポリマーは前記ポリマー
    が効果的に哺乳動物の細胞の増殖を増強しおよび／また
    は抗体の産生を刺激する程度に遊離官能基を発現するこ
    とを特徴とする変性親水性ポリマー。 ２、前記ＮＣＯ反応性官能基は、スルフヒドリル、アミ
    ノおよびカルボキシルから成る群の１員である、上記第
    １項記載の変性ポリマー。 ３、前記遊離官能基は、アミノ、スルフヒドリルおよび
    スルホン酸から成る群の１員である、上記第１項記載の
    変性ポリマー。 ４、前記ＮＣＯ反応性官能基はチオレートアニオンを形
    成する条件下にあるスルフヒドリルであり、そして前記
    ポリマーは少なくとも１つのチオウレタン結合を含有し
    、そして前記変性ポリマーの前記遊離官能基はアミノで
    ある、上記第１項記載の変性ポリマー。 ５、前記ＮＣＯ反応性官能基はアミノであり、そして前
    記変性ポリマーは少なくとも１つの尿素結合を含有する
    、上記第１項記載の変性ポリマー。 ６、前記ポリマーはジサルファイド結合を含有し、そし
    て前記遊離官能基はアミノである、上記第５項記載の変
    性ポリマー。 ７、前記遊離官能基はスルフヒドリルであり、そして前
    記変性ポリマーは抗体の産生を刺激する、上記第１項記
    載の変性ポリマー。 ８、前記ＮＣＯ反応性官能基はカルボキシルであり、そ
    して前記変性ポリマーは少なくとも１つのエステル結合
    を含有し、そして前記遊離官能基はスルフヒドリルであ
    る、上記第１項記載の変性ポリマー。 ９、前記ＮＣＯ反応性官能基はアミノであり、そして前
    記遊離官能基はスルホン酸であり、上記第１項記載の変
    性ポリマー。 １０、前記遊離官能基はスルホン酸であり、そして前記
    変性ポリマーは抗体の産生を刺激する、上記第１項記載
    の変性ポリマー。 １１、溶解性親水性生物適合性ヒドロゲルからなる細胞
    増殖エンハンサーおよび抗体産生の刺激因子に対する前
    駆体であって、前記ヒドロゲルはジサルファイド結合を
    含有する変性ポリマーからなり、前記ポリマーはオキシ
    エチレンに基づくジオールまたはポリオールから誘導さ
    れ、ここでヒドロキシル基の少なくともあるのはポリイ
    ソシアネートでキャッピングされており、そして前記ポ
    リイソシアネートのイソシアネートはイソシアネート（
    ＮＣＯ）反応性官能基により変性されていることを特徴
    とする細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生の刺激因子
    に対する前駆体。 １２、前記ポリマーのイソシアネート基の５０％までは
    ＮＣＯ反応性官能基により変性されている、上記第１１
    項記載の細胞増殖エンハンサーおよび前駆体。 １３、前記ポリマーのイソシアネート基の約２０〜約３
    ０％は前記ＮＣＯ反応性官能基により変性されている、
    上記第１２項記載の細胞増殖エンハンサーおよび前駆体
    。 １４、前記ポリイソシアネートは脂肪族および脂環族の
    ポリイソシアネートから成る群の１員である、上記第１
    １項記載の細胞増殖エンハンサーおよび前駆体。 １５、前記ポリイソシアネートはイソホロンジイソシア
    ネートである、上記第１４項記載の細胞増殖エンハンサ
    ーおよび前駆体。 １６、前記ＮＣＯ反応性官能基はアミノであり、そして
    前記ヒドロゲルは少なくとも１つの尿素結合を含有する
    、上記第１１項記載の細胞増殖エンハンサーおよび前駆
    体。 １７、前記変性ポリマーは遊離アミノを発現する、上記
    第１１項記載の細胞増殖エンハンサーおよび前駆体。 １８、前記ＮＣＯ反応性官能基はカルボキシルであり、
    そして前記ヒドロゲルは少なくとも１つのエステル結合
    を含有する、上記第１１項記載の細胞増殖エンハンサー
    および前駆体。 １９、変性親水性プレポリマーからなる細胞増殖エンハ
    ンサーおよび／または抗体産生の刺激因子であって、前
    記プレポリマーは、ヒドロキシル基の少なくともあるも
    のがポリイソシアネートでキャッピングされている、オ
    キシエチレンに基づく１官能性のアルコール、ジオール
    またはポリオールであり、前記ポリイソシアネートのイ
    ソシアネートは、前記ポリマーが前記イソシアネートに
    より重合しない程度に、イソシアネート（ＮＣＯ）反応
    性官能基により変性されており、そして変性ポリマーは
    遊離官能基を発現することを特徴とする細胞増殖エンハ
    ンサーおよび／または抗体産生の刺激因子。 ２０、前記イソシアネートの少なくとも５０％は前記Ｎ
    ＣＯ反応性官能基により変性されている、上記第１９項
    記載の細胞増殖エンハンサー。 ２１、前記イソシアネートの実質的にすべては前記ＮＣ
    Ｏ反応性官能基により変性されている、上記第１９項記
    載の細胞増殖エンハンサー。 ２２、前記イソシアネートの１００％は前記ＮＣＯ反応
    性官能基により変性されている、上記第１９項記載の細
    胞増殖エンハンサー。 ２３、前記ＮＣＯ反応性官能基は、アミノ、スルフヒド
    リルおよびカルボキシルから成る群の１員である、上記
    第１９項記載の細胞増殖エンハンサー。 ２４、前記遊離官能基は、アミノ、スルフヒドリルおよ
    びスルホン酸から成る群の１員である、上記第１９項記
    載の細胞増殖エンハンサー。 ２５、前記ＮＣＯ反応性官能基および遊離官能基はアミ
    ノであり、そして前記変性プレポリマーはジサルファイ
    ド結合を含有する、上記第１９項記載の細胞増殖エンハ
    ンサー。 ２６、前記ＮＣＯ反応性官能基はアミノであり、そして
    前記遊離官能基はスルフヒドリルであり、前記細胞増殖
    エンハンサーは抗体の産生を刺激する、上記第１９項記
    載の細胞増殖エンハンサー。 ２７、前記ＮＣＯ反応性官能基はチオレートアニオンを
    形成する条件下にあるスルフヒドリルであり、そしてそ
    して前記プレポリマーは少なくとも１つのチオウレタン
    結合を含有し、そして前記遊離官能基はアミノである、
    上記第１９項記載の細胞増殖エンハンサー。２８、前記
    ＮＣＯ反応性官能基はカルボキシルであり、そして前記
    プレポリマーは少なくとも１つのエステル結合を含有し
    、そして前記遊離官能基はスルフヒドリルである、上記
    第１９項記載の細胞増殖エンハンサー。 ２９、前記ＮＣＯ反応性官能基はアミノであり、そして
    前記遊離官能基はスルホン酸であり、ここで細胞増殖エ
    ンハンサーは抗体の産生を刺激する、上記第１９項記載
    の細胞増殖エンハンサー。 ３０、変性プレポリマーを水と約１：１〜約１：２０の
    プレポリマー対水の比で反応させることからなり、前記
    変性プレポリマーは、 （ａ）ジオールまたはポリオールをポリイソシアネート
    と約１．８〜約２．２のイソシアネート対ヒドロキシル
    比で反応させ、こうして前記ジオールまたはポリオール
    のヒドロキシル基の本質的にすべてをポリイソシアネー
    トでキャッピングして、ポリイソシアネートエンドキャ
    ップドプレポリマーを生成し、そして （ｂ）前記プレポリマーを変性化合物と反応させ、前記
    変性化合物は少なくとも１つのジサルファイド結合を含
    有しかつ少なくとも１つのイソシアネート（ＮＣＯ）反
    応性官能基を有し、ここで前記変性化合物は前記ポリイ
    ソシアネートキャップドプレポリマーのイソシアネート
    基の約３０％までを変性するために十分な量で存在し、 （ｃ）前記変性プレポリマーを水と反応させてポリ尿素
    −ウレタンポリマーゲルを形成し、そして （ｄ）前記ポリ尿素−ウレタンポリマーゲルを塩基性触
    媒またはジサルファイド還元剤で溶解し、こうして前記
    溶解生成物はスルフヒドリルを発現する、 ことによって調製される、ことを特徴とする、細胞増殖
    エンハンサーおよび抗体産生刺激因子を生成する方法。 ３１、（ｂ）における反応は水性媒質中で実施し、こう
    して刺激の変性および重合を生ずる、上記第３０項記載
    の方法。 ３２、前記変性化合物の前記ＮＣＯ反応性官能基はアミ
    ノである、上記第３０項記載の方法。 ３３、前記変性化合物はシスタミンである、上記第３２
    項記載の方法。 ３４、前記ＮＣＯ反応性官能基はカルボキシルである、
    上記第３０項記載の方法。 ３５、上記第３０〜３４項記載の方法の生成物からなる
    ことを特徴とする細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生
    刺激因子。 ３６、工程： （ａ）ポリイソシアネートキャップドオキシエチレンに
    基づく１官能性のアルコール、ジオールまたはポリオー
    ルのプレポリマー単位を、（ｂ）変性化合物、前記変性
    化合物は少なくとも２つの官能基を有し、ここで少なく
    とも１つの官能基はイソシアネート（ＮＣＯ）反応性官
    能基である、 と反応させ、こうして前記プレポリマーのイソシアネー
    ト基の少なくとも一部分をＮＣＯ反応性官能基により変
    性させることからなり、そして前記変性プレポリマーは
    遊離官能基を発現する、ことを特徴とする、細胞増殖エ
    ンハンサーおよび／または抗体産生刺激因子を生成する
    方法。 ３７、前記イソシアネート基の実質的にすべては前記Ｎ
    ＣＯ反応性官能基により変性される、上記第３６項記載
    の方法。 ３８、前記イソシアネート基の１００％は前記ＮＣＯ反
    応性官能基により変性される、上記第３６項記載の方法
    。 ３９、工程： （ａ）ポリイソシアネートキャップドオキシエチレンに
    基づく１官能性のアルコール、ジオールまたはポリオー
    ルのプレポリマー単位を変性化合物と反応させ、前記変
    性化合物は少なくとも２つの官能基を有し、ここで少な
    くとも１つの官能基はイソシアネート（ＮＣＯ）反応性
    官能基であり、こうして前記プレポリマーのイソシアネ
    ート基の少なくとも５０％はＮＣＯ反応性官能基により
    変性されており、そして （ｂ）前記変性プレポリマーを重合して可溶性ポリマー
    単位を形成し、前記ポリマー単位は遊離官能基を発現し
    、そして哺乳動物の細胞の増殖を増強する、 からなることを特徴とする、細胞増殖エンハンサーを生
    成する方法。 ４０、前記ＮＣＯ反応性官能基および遊離官能基はアミ
    ノであり、そして前記変性化合物はジサルファイド結合
    を含有する、上記第３６または３９項記載の方法。 ４１、前記ジサルファイド結合は還元剤により還元し、
    こうして前記遊離官能基はスルフヒドリルであり、そし
    て前記細胞増殖エンハンサーは抗体の産生を刺激する、
    上記第４０項記載の方法。 ４２、前記ジサルファイド結合はメルカプトエタノール
    により還元する、上記第４１項記載の方法。 ４３、前記変性化合物はシスタミンである、上記第４１
    項記載の方法。 ４４、前記変性化合物はシスチンである、上記第４１項
    記載の方法。 ４５、前記変性化合物はグルタチオンである、上記第４
    １項記載の方法。 ４６、前記ＮＣＯ反応性基はチオレートアニオンを形成
    する条件下にあるスルフヒドリルであり、そして前記遊
    離官能基はアミノである、上記第３６または３９項記載
    の方法。 ４７、前記変性化合物はシステアミンである、上記第４
    ６項記載の方法。 ４８、前記変性化合物はシステインである、上記第４６
    項記載の方法。 ４９、前記変性化合物はグルタチオン−ＳＨである、上
    記第４６項記載の方法。 ５０、前記ＮＣＯ反応性官能基はアミノであり、そして
    前記遊離官能基はスルホン酸であり、そして前記細胞増
    殖エンハンサーは抗体の産生を刺激する、上記第３６ま
    たは３９項記載の方法。 ５１、前記変性化合物はタウリンである、上記第５０項
    記載の方法。 ５２、前記ＮＣＯ反応性官能基はカルボキシルであり、
    そして前記遊離官能基はスルフヒドリルである、上記第
    ３６または３９項記載の方法。 ５３、前記変性化合物はチオエタン酸である、上記第５
    ２項記載の方法。 ５４、前記変性化合物はチオエタン酸である、上記第５
    ０項記載の方法。 ５５、上記第３６、３９、４３、４７、４８、４９およ
    び５１項記載の方法の生成物から成る群の１員からなる
    ことを特徴とする細胞増殖エンハンサー。 ５６、上記第４１、４２、５１、５２、５３および５４
    項記載の方法の生成物から成る群の１員からなることを
    特徴とする細胞増殖エンハンサーおよび抗体産生刺激因
    子。 ５７、血清を含むか、あるいは含まず、上記第１、１９
    または５５項記載の細胞増殖エンハンサーを含有するこ
    とを特徴とする細胞培地。 ５８、血清を含むか、あるいは含まず、上記第７、２６
    または５６項記載の細胞増殖エンハンサーおよび抗体産
    生刺激因子を含有することを特徴とする細胞培地。 ５９、上記第５７項記載の培地中で前記細胞を培養する
    ことを特徴とする細胞の増殖する方法。 ６０、上記第５８項記載の培地中で細胞を培養すること
    を特徴とする増殖を増強しかつ抗体の産生を刺激する方
    法。
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