JPH07227278A - 成熟中枢神経細胞用の無血清培地 - Google Patents

成熟中枢神経細胞用の無血清培地

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JPH07227278A
JPH07227278A JP6044955A JP4495594A JPH07227278A JP H07227278 A JPH07227278 A JP H07227278A JP 6044955 A JP6044955 A JP 6044955A JP 4495594 A JP4495594 A JP 4495594A JP H07227278 A JPH07227278 A JP H07227278A
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nerve cells
medium
serum
central nerve
mature central
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洋 齋藤
Hiroshi Katsuki
博志 香月
Fumio Kawahara
富美男 川原
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Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 成熟中枢神経細胞の培養に有用な新規な無血
清培地を提供する。 【構成】 イーグルの最少必須培地、もしくはこれにト
ランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレ
ッシンを加えた培地にＰＤＧＦ、ビトロネクチン、ＩＬ
−１β、ＢＳＡを添加した合成培地。 【効果】 本発明の培地を用いて成熟中枢神経細胞を培
養すると良好な基質への接着、神経突起の伸展、生存維
持が達成されるとともに、これまで用いられてきたアス
トロサイト培養上清に比べ、より安定した確実な培養が
可能となるなどの効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は成熟中枢神経細胞の培養
に有用な無血清培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】老人性痴呆症や血管病変、あるいは脳損
傷による脳障害に代表される中枢神経性疾患は高齢化社
会の拡大に伴い、重大な問題となっている。従って、こ
れらの疾患に対する治療薬の開発が切望されている。神
経細胞の培養系は細胞の再生・修復過程のメカニズムの
研究やこれらの過程に作用する薬物の探索に極めて重要
な意味を持っている。
【０００３】神経細胞の培養は通常、合成培地に牛血清
などの動物の血清を添加した培地を用いて行われてい
る。成熟中枢神経細胞の培養は一層難しく、アストロサ
イトグリアの単層上（Brain Research, 598, 264-270(1
992)) か、アストロサイト培養上清（ＡＣＭ）中（Brai
n Research, 594, 215-220(1992)) でしか成功していな
い。ここで、本明細書において「成熟」とは神経細胞が
機能的に分化、成熟している状態を意味する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、実際に成熟中
枢神経細胞の培養を行う際に大きな問題となるのは血清
のロットであり、アストロサイトグリアの培養の良し悪
しによる質的変動である。血清やＡＣＭのロットによ
り、培養結果に差異が現れ、良好な血清や単層、あるい
はＡＣＭが確保できない場合は実験の継続も危うくな
る。このような変動因子に代わりうる添加物として各種
のホルモン、増殖因子などが検討されているが、未だ、
十分な効果を持つものは開発されていない。
【０００５】無血清の、常に同じ条件で培養できる安定
な培地は神経細胞の培養にとって極めて高い有用性を示
しうるものであり、ましてや成熟中枢神経細胞の培養を
可能ならしめるという高度な要求も満たすものである。
即ち、本発明は従来のような、効果の一定しない血清
や、コントロールの難しいアストロサイト単層や、未知
の因子を含有したＡＣＭを必要としない、常に安定した
神経細胞の接着、神経突起の伸展、生存維持を示す神経
細胞、特に成熟中枢神経細胞用の新規な培地を提供する
ことを目的としたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明の構成は以下の技術的手段からなるもの
である。
【０００７】(1) 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及
び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を有効成分として含有す
ることを特徴とする成熟中枢神経細胞用の無血清培地。
【０００８】(2) 上記(1) に記載の無血清培地に、更
にビトロネクチン、インターロイキン−１β（ＩＬ−１
β）の一種もしくは二種を有効成分として含有せしめた
成熟中枢神経細胞用の無血清培地。
【０００９】(3) ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、ビトロネクチ
ン、ＩＬ−１βを有効成分として含有することを特徴と
する成熟中枢神経細胞用の無血清培地。
【００１０】すなわち、本分野において基本培地として
知られるイーグル(Eagle) の最少必須培地（ＥＥＭ）や
改変イーグル培地（ＭＥＭ）等はこれに血清を添加しな
いと成熟中枢神経細胞の培養に用い得なかった。しかる
に本発明のごとく、基本培地にＰＤＧＦ及びＢＳＡを含
有せしめると、血清を添加することなく成熟中枢神経細
胞の培養が達成された。また、ＰＤＧＦ、ＢＳＡに加え
て、ビトロネクチン及びＩＬ−１βを基本培地に含有せ
しめて成熟中枢神経細胞の培養を行うとより好ましい培
養結果が得られることが判明した。
【００１１】本発明に用いる基本培地としてはＥＥＭ、
ＭＥＭ等、神経細胞に限らず、各種の細胞培養において
通常用いられる既知のものが挙げられる。
【００１２】培地に含有せしめる各成分の濃度は、ＰＤ
ＧＦ、 0.1〜10ng／ml、ＢＳＡ 0.1〜0.5 ％、ビトロネ
クチン0.01〜1.0 μｇ／ml及びＩＬ−１β 0.1〜10Ｕ／
mlが好ましい。さらにより好ましい各成分の濃度は、Ｐ
ＤＧＦ 0.5〜1.0 ng／ml、ＢＳＡ 0.1〜0.2 ％、ビトロ
ネクチン0.05〜0.5 μｇ／ml及びＩＬ−１β 0.5〜1.0
Ｕ／mlである。
【００１３】また、培養に際して添加剤としてトランス
フェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレッシン
等の一種又は二種以上を本発明の培地に加えても良い。
【００１４】
【発明の効果】本発明で得られた培地を用いて、成熟中
枢神経細胞を培養すると、血清を添加した系で認められ
るグリア細胞の増殖も少なく、グリア細胞の増殖阻害剤
を加える必要もない。特に、低密度培養のような生存維
持の難しい条件下でも、本発明による培地の効果は著し
く、神経細胞の基質への良好な接着、神経突起の伸展及
び生存維持が認められる。神経細胞の培養を行う上で、
本発明の培地は非常に有用なものであり、産業上の利便
性極めて大なるものである。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、これによって本発明が限定されるものでは
ない。
【００１６】（参考例１）イーグルの最少必須培地（日
水製薬社）にＬ−グルタミン（0.29ｇ／リットル、和光
純薬）、ピルビン酸ナトリウム（0.11ｇ／リットル、和
光純薬）、グルコース（9.0 ｇ／リットル、和光純
薬）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ／リットル、和光純
薬）、亜セレン酸ナトリウム（30nM、和光純薬）を加え
た培地（以下これをＭＥＭという）を調製した。
【００１７】（参考例２）参考例１と同様にして調製し
たＭＥＭにトランスフェリン（100 μｇ／ml、シグマ
社）、インスリン（５μｇ／ml、ベクトン・デッキンソ
ン社）、プロゲステロン（20nM、シグマ社）、プトレッ
シン（100 μＭ、シグマ社）を加えた培地（以下これを
ＭＥＭ＋ＴＩＰＳという）を調製した。
【００１８】（実施例１）参考例１と同様にして調製し
たＭＥＭをＢＳＡ（0.1 ％、シグマ社）、ＰＤＧＦ（0.
5 ng／ml、ケミコン社）、ＩＬ−１β（0.5 Ｕ／ml、ベ
ーリンガー社）、ビトロネクチン（0.5 μｇ／ml、シグ
マ社）を添加し、成熟中枢神経細胞用の培地を調製し
た。
【００１９】（実施例２）参考例２と同様にして調製し
たＭＥＭ＋ＴＩＰＳにＢＳＡ（0.1 ％、シグマ社）、Ｐ
ＤＧＦ（0.5 ng／ml、ケミコン社）、ＩＬ−１β（0.5
Ｕ／ml、ベーリンガー社）、ビトロネクチン（0.5 μｇ
／ml、シグマ社）を添加し、成熟中枢神経細胞用の培地
を調製した。
【００２０】（試験例）参考例及び実施例で調製したそ
れぞれの培地を用いて、中枢神経細胞の培養を行った。
Brain Research, 594, 215-220(1992)に従って、生後３
週齢ラットの脳から視床下部のスライスを作成しプロナ
ーゼ（0.02％、カルビオケム社）、サーモリジン（0.02
％、シグマ社）中で37℃、30分、順次、酵素処理を行っ
た。酵素液を除いた後、視床下部の視交叉上核をパンチ
アウトし、ガラスキャピラリーでピペッティングを行い
細胞分散液を得た。予め 0.1％のポリエチレンイミンで
コーティングしたプラスチックプレート（ヌンクあるい
はファルコン社）にこの細胞浮遊液を50〜150 μリット
ル／ウエルで加え、炭酸ガス（５％）インキュベーター
中、37℃、３週間培養した。顕微鏡下、細胞を経時的に
観察した。
【００２１】参考例で調製した培地を用いて培養を行っ
た場合、生存している神経細胞は認められなかった。本
発明の培地を用いるとグリア細胞の増殖が少なく、培養
開始後３〜５日目から14日目頃の長時間にわたり良好な
神経細胞の接着、神経突起の伸展及び生存維持が認めら
れた。また、これらの細胞が神経細胞であることは神経
細胞に特異的なタンパク質であるＭＡＰ２の抗体を用い
た免疫染色法によって確認した。
【００２２】図１に本発明の培地で突起を伸展した生後
３週齢ラットの視交叉上核神経細胞の位相差顕微鏡像写
真を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の培地で突起を伸展した生後３週齢のラ
ットの視交叉上核神経細胞の形態を表わす位相差顕微鏡
像写真である（写真右下のバーは 100μｍを示す）。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及び牛
    血清アルブミン（ＢＳＡ）を有効成分として含有するこ
    とを特徴とする成熟中枢神経細胞用の無血清培地。
  2. 【請求項２】 ビトロネクチン、インターロイキン−１
    β（ＩＬ−１β）の一種もしくは二種を有効成分として
    含有することを特徴とする請求項１に記載の成熟中枢神
    経細胞用の無血清培地。
  3. 【請求項３】 ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、ビトロネクチン、Ｉ
    Ｌ−１βを有効成分として含有することを特徴とする成
    熟中枢神経細胞用の無血清培地。
JP6044955A 1994-02-18 1994-02-18 成熟中枢神経細胞用の無血清培地 Pending JPH07227278A (ja)

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ES95101935T ES2111346T3 (es) 1994-02-18 1995-02-13 Medio sin suero para el cultivo de neuronas centrales postnatales.
EP95101935A EP0668348B1 (en) 1994-02-18 1995-02-13 Serum-free medium for cultivation of postnatal central neurons
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