JPH03151900A - 核酸の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は核酸のハイブリッド形成反応を利用した核酸の
検出方法に関する。

［従来の技術］ 試料中に検出対象としての核酸（被検出核酸）が存在す
るか否かを検出するための方法として種々の方法が知ら
れている。

例えば、固相に固定した試料に標識化プローブ核酸を反
応させ、固相上での被検出核酸・ブローブ核酸ハイブリ
ッドの形成の有無をプローブ核酸に施した標識により検
出する方法、液相中で試料とプローブ核酸を反応させ、
得られた反応混合物中への被検出核酸・プローブ核酸ハ
イブリッドの形成の有無を検出する方法がある。

前者の方法の一例では、まず試料を電気泳動で分画し、
ブロッティングすることによりニトロセルロースフィル
ターに試料の電気泳動パターンのレプリカを形成し、こ
のレプリカに放射性プローブ核酸を反応させる。その際
、試料中に被検出核酸が存在する場合には、被検出核酸
と放射性プローブ核酸との間にハイブリッドが形成され
る。

その後ハイブリダイズしなかった放射性プローブ核酸を
洗浄、除去したのち、ニトロセルロースフィルター上に
形成されたハイブリッドの放射性標識領域をオートラジ
オグラフィーなどによって検出する。

後者の方法の一例においては、溶液中で試料と放射性プ
ローブ核酸とを反応させ、試料中に被検出核酸が含まれ
ている場合に形成されるパイプリッドと未反応物とをカ
ラム処理により分離し、形成されたハイブリッド中の放
射性同位元素の標識活性を測定することで検出を行って
いる。

また、カラムにプローブ核酸を固定し、試料を流して反
応させ、その後形成されたハイブリッドを抽出したのち
１本鎖に解離し、それを集めて検出する方法もある。

［発明が解決しようとする課題］ 前述の固相に固定した試料を用いる方法では、試料を大
量に浪費したり検出操作に時間がかかるうえ、固相の調
製が複雑で多くの工程を要するという欠点がある。

また、液相で試料とプローブ核酸を反応させ、生成ハイ
ブリッドと未反応物とをカラム処理により分離する方法
においては、被検出核酸のヌクレオチド鎖が比較的短い
場合、カラム処理による分離精度が悪くなるという欠点
がある。

また、カラムに固定したプローブ核酸を用いる方法では
、カラムが特定の用途、すなわち、特定の核酸塩基配列
を検出する場合にしか用いることができず汎用性に欠け
る。また、複数の核酸塩基配列の検出を行う場合には、
それぞれの塩基配列に対応するプローブ核酸を作成し個
別のカラムに固定化を行なわなければならないという問
題がある。

本発明はハイブリダイゼーション法を利用する従来の各
種検出方法における問題点を解決するために鋭意検討し
た結果なされたものであり、特定の検出対象としての核
酸の存在を速やかにかつ簡便に検出できる方法を提供す
ることを目的とする。

【課題を解決するための手段］ 本発明の検出方法は、 被検出核酸を含む試料と、 プローブ核酸と、 固相に結合された部分と、プローブ核酸とハイブリダイ
ズする部分とを有する固定化用核酸を用い、 ａ）被検出核酸・プローブ核酸・固定化用核酸ハイブリ
ッドを形成する過程と、 ｂ）固相に結合されたハイブリッド標識を利用して被検
出核酸・プローブ核酸ハイブリッドの形成の有無を検出
する過程と 固定化用核酸を利用して得る過程と を含むことを特徴とする。

本発明は生体に由来するＤＮＡや遺伝子操作によって得
られるＤＮＡなど各種核酸の検出に利用でき、検出対象
となる被検出核酸の種類は限定されない。

プローブ核酸としては、被検出核酸及び固定化用核酸と
特異的にハイブリダイズできる塩基配列を有する核酸で
あればどのようなものでも利用できるが、合成機で手軽
に合成できる比較的短いヌクレオチド鎖長のオリゴヌク
レオチドが利用し易い。

プロニブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出核酸のヌク
レオチド鎖長の１／１０以下とするのが好ましい。

なお、本発明において、プローブ核酸と被検出核酸との
二本鎖形成部に標識を施す場合、ブローブ核酸自体に標
識化に必要な要件が要求されない。

例えば、ニックトランスレーション法や標識酵素の結合
法を用いる標識では、標識される核酸がある程度以上の
ヌクレオチド鎖長を有する必要があるが、本発明で利用
するプローブ核酸にはこのような要件は要求されない。

従って、入手（調製）し易く、かつ上述のように高感度
な検出を実現し得る短いヌクレオチド鎖長のものがプロ
ーブ核酸として利用できるようになる。

しかしながら、本発明において被検出核酸とプローブ核
酸の二本鎖形成部に標識が施される場合、プローブ核酸
の構成やヌクレオチド鎖長を、該二本鎖形成部の標識化
が容易であるように選択することが望ましい。

例えば、後述するような、被検出核酸とプローブ核酸の
二本鎖形成部の一方のヌクレオチド鎖をブライマーとし
て利用し、その末端からヌクレオチド鎖を伸展させ、そ
の伸展部分に標識物質を取り込ませる方法による標識化
方法で、プローブ核酸をブライマーとして利用する場合
、該二本鎖形成部が、プローブ核酸とハイブリダイズし
た被検出核酸のヌクレオチド鎖がブライマ一端部の伸展
の際の鋳型として機能できるような構成、すなわちプロ
ーブ核酸の末端伸展方向に被検出核酸のヌクレオチド鎖
が一本鎖の状態で存在する構成を有している必要がある
。

従って、このようなプローブ核酸をブライマーとして利
用するこの標識化方法の場合には、プローブ核酸の構成
やヌクレオチド鎖長を、形成される二本鎖形成部の構造
を考慮して決定するのが望ましい。

なお、場合によっては試料核酸をブライマーとして利用
するものであっても良い。

プローブ核酸の構成としては、例えば５′末端側に固定
化用核酸とハイブリダイズできるＢ部分を、かつ３′末
端側に被検出核酸とハイブリダイズできるＡ部分をそれ
ぞれ有し、例えば第１図に示すような各核酸の連結構造
を形成できるものを挙げることができる。

固定化用核酸としては、プローブ核酸とハイブリダイズ
できる塩基配列を有し、かっ固相と結合し得る核酸であ
ればどのようなものでも利用できるが、プローブ核酸と
同様に合成機で手軽に合成できるヌクレオチド鎖を有す
るものが利用し易い、この固定化用核酸の鎖長もプロー
ブ核酸の構成やヌクレオチド鎖長を考慮して決定するの
が望ましい。なお、プローブ核酸とハイブリダイズした
固定化用核酸に解離処理を行い固定化用核酸を再利用し
たい場合は、解離操作を考慮した構成を有する固定化用
核酸を用いるとよい。

固定化用核酸の固相への固定のための構成としては、後
述する固相に固定化されている物質と選択特異的に結合
する物質を導入した構成が利用できる０例えば、固相に
固定化されている物質としてアビジン、それに選択特異
的に結合し、かつヌクレオチド鎖に結合可能な物質とし
てビオチンがあげられるが、この両物質については選択
特異的に結合し、かつ固定化用核酸のヌクレオチド鎖、
固相に導入できるものであれば、どのようなものでも利
用可能である。

試料と、プローブ核酸及び固定化用核酸とのハイブリダ
イゼーションは、常法に従って行なうことができる。

なお、ハイブリッド形成反応の条件は、用いられるプロ
ーブ核酸、固定化用核酸の有するヌクレオチド鎖長や塩
基配列などによって異なるので、ハイブリダイゼーショ
ンにおける操作条件は所望とする目的に応じて最適条件
を適宜選択すると良い。

このハイブリッド形成反応は、−ａ的には、ホルムアミ
ド、適当な塩及びＤｅｎｈａｒｄｔ溶液を含むパイプリ
ダイゼーション溶液中で、温度をコントロールして行う
ことができる。

固定化用核酸の固定化には、固定化用核酸の有する固定
用の特定物質に選択特異的に結合する物質を各種ゲル、
ニトロセルロース等の担体に物理的あるいは化学的に結
合させ、その後選択特異的に結合する物質量に反応を生
じさせる方法が利用できる。

本発明の方法においては、試料とプローブ核酸を反応さ
せ、その結果形成されたハイブリッドに選択的に標識が
施される。

この標識化の方法としては、例えばハイブリッドの二本
鎖形成部を構成する鎖の一方をブライマーとして利用し
、その末端を伸展させて１本鎖部分を２本鎖化する際に
、その新たに合成される伸展部分に標識物質を取り込ま
せる方法等が利用できる。

本発明の方法の上記過程ａは、例えば試料とプローブ核
酸とをプローブ核酸のＡ部分と被検出核酸とでの二本鎖
形成に必要な条件下で反応させた後、得られた反応混合
物に固定化用核酸をプローブ核酸のＢ部分と固定化用核
酸とでの二本鎖形成に必要な条件で反応させることによ
り行なうことができる。

この操作により、試料中に被検出核酸が含まれている場
合には、例えば第１図に示すような被検出核酸ドブロー
ブ核酸２・固定化用核酸３ハイブリツドが形成される。

このハイブリッド形成反応には、試料とプローブ核酸及
び固定化用核酸とを同時にハイブリダイゼーション溶液
中で反応させる方法、試料とプローブ核酸とをハイブリ
ダイゼーションさせ、得られた反応混合物に固定化用核
酸なハイブリダイゼーションさせる方法、プローブ核酸
と固定化用核酸をハイブリダイゼーションさせ、得られ
た反応混合物に試料をハイブリダイゼーションさせる方
法等が利用できる。上記において、固定化用核酸は固相
に固定化されている場合もある。

すなわち、まずプローブ核酸と固定化用核酸とを反応さ
せ、次いで得られた反応混合物と試料とを反応させても
良い。

本発明は、例えば過程ａを液相中で行ない、得られた反
応混合物に該反応混合物に含まれる固定化用核酸の固相
への固定に必要な処理を行なうことにより行なうことが
できる。この際、該反応混合液に被検出核酸・プローブ
核酸・固定化用核酸ハイブリッドが形成されている場合
には、このハイブリッドも固定化用核酸を介して固相に
固定され、例えば第２図のような固定相５への固定状態
が得られる。

また、固定化用核酸の固相への固定のための処理を、二
本鎖形成のための反応の前に導入することにより行なう
こともできる。その具体的な方法としては、固相に固定
された固定化用核酸に、試料及びプローブ核酸を同時に
反応させる方法、固相に固定された固定化用核酸に、プ
ローブ核酸を反応させ次いで試料を反応させる方法、試
料とプローブ核酸を反応させ、得られた反応混合物を固
相に固定された固定化用核酸と反応させる方法、固定化
用核酸とプローブ核酸を反応させ、得られた固定化用核
酸−プローブ核酸ハイブリッドを固相に固定した後、該
ハイブリッドに試料を反応させる方法がある。

本発明の方法における上記過程すは、例えば被検出核酸
とプローブ核酸とのハイブリッドに選択的に標識を施し
、それを用いた標識に応じた方法で検出することにより
行なうことができる。

この標識化には、前述したように二本鎖形成部の一方の
鎖をブライマーとし、他の鎖を鋳型として利用して、ブ
ライマーとなる鎖の端部を伸展させる際に、新たに形成
させる伸展部に標識を取り込ませる方法が利用できる。

第２図にプローブ核酸のＡ部分を構成する３′末端部を
ブライマーとして利用する場合を示す。

具体的には、例久ば、ブライマ一端部の伸展に必要なｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどのヌクレオ
チドと標識化すべきハイブリッドとをヌクレオチド鎖形
成用の酵素の存在下で反応させ、その際に用いるヌクレ
オチドの１を鋳型に標識化ヌクレオチドを用いて、新た
に形成されるヌクレオチド鎖に標識を取り込ませる方法
等を利用できる。

この標識化ヌクレオチドとしては、一般にプローブの標
識に利用されている、例えば放射性同位元素（ＲＩ）に
より標識化されたもの、例えばビオチン、ジニトロフェ
ニルヌクレオチド誘導体等の蛍光、発光または発色を誘
発するのに必要な酵素や化合物などの非放射性標識物質
（ｎｏｎＲＩ）で標識化されたものなどが利用できる。

ヌクレオチド鎖形成用の酵素としては、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ１％ＤＮＡポリメラーゼＴのクレノー断片、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等の各種ＤＮＡのポリメラーゼ
や逆転写酵素などが利用できる。

本発明における標識化は、ハイブリッドが固定化用核酸
を介して固相に固定化された状態で行なうことができる
。標識化過程を導入する時期としては、被検出核酸とプ
ローブ核酸とがハイブリッドを形成した後に行なうのが
よい。

また、この方法によれば、ハイブリッドを形成していな
い核酸には、新たな二本鎖部分形成のためのブライマー
として機能する部分及び伸展部分形成用の鋳型となる部
分が存在しないので、上記の標識物質を取り込む二本鎖
化反応が生じない。

なお、標識化の反応終了後に、標識化されたハイブリッ
ドと、ハイブリッドに取り込まれなかった標識との分離
は、例えば以下のような方法により行なうことができる
。すなわち固定化用核酸を介して固相に固定されたプロ
ーブ核酸と試料の間にハイブリッドが形成された場合に
は、ハイブリッドも固相に固定化されている状態となる
。その状態で洗浄し、ハイブリッドに取り込まれなかっ
た標識を洗い出して除去する。

また、試料、プローブ核酸及び固定化用核酸の反応類を
前述のように種々変更した場合でも、最終的に固定化用
核酸を介したハイブリッドの固相への固定化状態を得た
後、上述と同様の洗浄処理を行なってハイブリッドに取
り込まれなかった標識を分離することができる。

ハイブリッドに取り込まれた標識の検出は、例えば第２
図に示すように固相に固定化された状態のハイブリッド
に取り込まれている標識を、該標識に応じた方法で検出
する方法、固相に固定化されたハイブリッドの固定化用
核酸とプローブ核酸との結合部を解離させ、固相から離
された被検出核酸・プローブ核酸ハイブリッドに取り込
まれている標識を該標識に応じた方法で検出方法等によ
り行なうことができる・ なお、本発明の方法においては、固相に固定されたハイ
ブリッドのプローブ核酸と固定化用核酸との結合部を解
離させて得られる固定化用核酸が結合した固相は、次の
検出反応に繰返し再利用可能である。その際、Ｂ部分を
再利用する固定化用核酸に対して共通に形成し、Ａ部分
を被検出核酸に応じて異ならせた複数種のプローブ核酸
を用いれば、固相に固定された固定化用核酸を異なる被
検出核酸の検出に繰返し再利用できる。

また、本発明の方法において、ハイブリッドに取り込ま
れた標識の量を測定することにより、被検出核酸の定量
を行なうことができる。

〔実施例１ プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部をもつ遺伝子検
出を行った。

プラスミドｐｕｃ　１９の塩基配列の一部に対応するＡ
部分と後に述べる固定化用核酸に対して相補的な塩基配
列をもつＢ部分、及びその間にＡとＢとの距離を保つ塩
基配列をもった下記の構成のオリゴヌクレオチドをＤＮ
Ａ合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、
３８１　Ａ型）により合成しプローブ核酸１とした。

５′ Ａ部分 次に固定化用核酸調製用オリゴヌクレオチドとして、下
記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成
装置で合成した。

これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部をサンプ
リングし、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によりその純度を調べた。その結果、９５％
以上の純度であったので、それ以上の精製を行なわずに
以下の反応に用いることにした。

更に、上述のようにして得た固定化用核酸調製用オリゴ
ヌクレオチドに以下の操作によりビオチンを導入して固
定化用核酸を得た。

合成オリゴヌクレオチド５０μ℃（５０μｇ）、混合試
薬液（（１，４６Ｍカコジル酸カリウム、０．］２ＭＴ
ｒｉｓ−ＯＨｐＨ６，９，３，３ｍＭＣｏＣ１ｇ、０、
３３ｍＭジチオスレイトール）１００μＪ、４．０ｍＭ
ビオチン化ＵＴＰ　（ＢＲＬ社製）４０μβ、１．０ｍ
Ｍ　　ｄＴＴＰ　　１ｕ４、Ｈ２Ｏ１００ｕｆｉおよび
ＴｄＴ　　１５ｕｎ（約９０　ｕｎｉｔ）を混合し、３
０℃で反応を行なった。１０分間経過後、０．２Ｍ　　
ＥＤＴＡ　　４μ℃を反応系に添加し、酵素反応を停止
させ、更にフェノール処理、エタノール沈殿を行い得ら
れた沈殿物を乾燥後ＨａＯ１００ＬＬＩ２に溶解した。

次に、試料としてプラスミドｐＵＣ１９、ｐ１３Ｒ３２
２及びこれらの混合物（１：１）を用意し、各試料を常
法に従いＥｃｏＲＩで消化してから得られた消化物を加
熱処理して、二本鎖ＤＮＡを一本鎖化し、各試料から得
られた３種の一本鎖ＤＮＡ混合物を個々に用いて以下の
操作を行なった。

一本鎖ＤＮＡ混合物２０μｇと、先に調製した固定化用
核酸２μｇ及びプローブ核酸２μｇを試験管に入れＩＯ
Ｘアニーリング溶液（１００ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ
　　ｐＨ８，０，６０ｍＭＭｇＣ１□、６０ｍＭ　　β
−メルカプトエタノール、５００ｍＭ　　ＮａＣ１）を
１０ｕ１２を加え、更に蒸留水を加え全体が１００μｉ
になるように調製した。得られた溶液を６５℃まで加熱
し、１０分間その温度を保った後約１時間かけてゆっく
り室温まで冷ました。この時の反応状態を模式的に示し
たのが第２図である。

次に、得られた反応液１００μｉにＩＯＸアニーリング
溶液１０ＬＬ（１，１ｍＭ　　ｄＡＴＰ、１ｍＭｄＣＴ
Ｐ及び１　ｍＭ　　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐを各１０７．ｔｎ加
えた後、ｐ”−ＴＴＰ　　１００ｕＡを添加シ、サラニ
蒸留水を加え全液量を２００μρとして標識化用の溶液
を調製した。この溶液にＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅ
ｎｏｗ断片を５単位加え水冷下で１時間反応させた。こ
の時の状態を模式的に示したのが第３図である。

反応後、この反応液を７ガロースゲルを臭化シアンで活
性化しアビジンを結合した固相と混合し、２０分間ゆっ
くり混和させた後、常温で軽く遠心し上清を廃棄した。

得られた沈殿物をＴＥ緩衝液で２度洗浄した後その放射
線の計数をシンチレーションカウンターで数度測定した
ところｐｕｃ　ｌ　９及びｐＵｃ１９とｐＢＲ３２２の
混合物を用いた場合は１０’〜’ｃｐｍの強度が計数さ
れ、ｐＢＲ３２２のみの試料におけるその値はバックグ
ランドの２倍に満たなかった。

また、上記沈殿物をＴＥ緩衝液に加え、８０℃で１０分
間加熱を行なった後すばやく遠心し上清を廃棄した後、
沈殿物をＴＥ緩衝液で洗浄して放射活性を測定した。そ
の結果、沈殿物中に放射活性は計量されず、この加熱処
理により標識を取り込んだ部分が解離されたことが確認
された。

次に、この加熱処理後に得られた沈殿物を、上述と同様
の操作に再利用したところ、良好な核酸の操作が行なえ
た。従って、該沈殿物はアビジンビオチン結合により固
定化用核酸が臭化シアン活性化アガロースに結合したも
のであり、繰返し再利用が可能であることが確認された
。

［発明の効果］ 従来、検出を行なう目的遺伝子の塩基配列に応じて核酸
断片を用意し、これを固定化プローブとして用いるため
に、固定化の処理を施す必要があった。

また、検出したい遺伝子の種類が変われば、それに従っ
て新たな核酸断片を用意し、なおかつ、これに固定化の
処理が必要となる。つまり検出する遺伝子が変わるたび
に、それに応じて固定化プローブを形成する必要がある
。

しかし本発明では固定化用プローブとその一部と相補的
配列をもつプローブ核酸を用いることによって検出した
い遺伝子核酸の種類が変ってもプローブ核酸のみを作成
すればよく、固相への固定化の処理を行なう必要が全く
ないので、迅速かつ簡便な核酸の検出を行なうことがで
きる。

また、本発明においては標識を取り込んだハイブリッド
と取り込まれなかった標識との分離が固相・液相間で精
度良く行なわれるので、精度良い検出操作が可能となる
。

更に、本発明においては、アビジン−ビオチン結合等を
利用して固相に結合させた固定化用核酸は、プローブ核
酸との解離処理を行なうことにより再利用可能である。

従って、この固相に結合された固定化用核酸を利用する
ことにより、新たな検出操作において化学的反応等を利
用した固相への核酸の結合処理を省略でき、操作が極め
て簡易化される。

【図面の簡単な説明】

第１図は被検出核酸・プローブ核酸・固定化用核酸ハイ
ブリッドの構成を示す模式図、第２図は第１図で示した
ハイブリッドな固相に固定した状態を示す模式図、第３
図は第２図で示した固定化ハイブリッド標識化の過程を
示す模式図である。 １：被検出核酸　　　　２ニブローブ核酸３：固定化用
核酸　　　４：標識 ５：固相

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）被検出核酸を含む試料と、 プローブ核酸と、 固相に結合された部分と、プローブ核酸とハイブリダイ
   ズする部分とを有する固定化用核酸を用い、 ａ）被検出核酸・プローブ核酸・固定化核酸ハイブリッ
   ドを形成する過程と、 ｂ）固相に結合されたハイブリッドを標識を利用して被
   検出核酸・プローブ核酸ハイブリッドの形成の有無を検
   出する過程と を含むことを特徴とする核酸の検出方法。 ２）被検出核酸とプローブ核酸との二本鎖形成部に選択
   的に標識を施す請求項１に記載の核酸の検出方法。 ３）被検出核酸、プローブ核酸及び固定化用核酸を同時
   に反応させる請求項１に記載の核酸の検出方法。 ４）被検出核酸とプローブ核酸を反応させ、得られた反
   応混合物に固定化用核酸を反応させる請求項１に記載の
   核酸の検出方法。 ５）プローブ核酸と固定化用核酸とを反応させ、得られ
   た反応混合物に被検出核酸を反応させる請求項１に記載
   の核酸の検出方法。 ６）被検出核酸・プローブ核酸ハイブリッドを固定化用
   核酸より解離する過程を有する請求項１記載の核酸の検
   出方法。