JPS62143700A - 対合セグメント抑制または競合による核酸アツセイ法 - Google Patents
対合セグメント抑制または競合による核酸アツセイ法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的試ネ１の核酸中の標的ヌクレオチド配
列（ＤＮＡｉだはＲＮＡ）の定性的または定量的測定法
に関する。
列（ＤＮＡｉだはＲＮＡ）の定性的または定量的測定法
に関する。
先行技術による核酸アッセイ法は（１）固定化ｔ〜だ試
料のアッセイ法、（２１２７ｆｆ＋の異なる標的ヌクレ
オチド配列に対するプローブを用いるサンドインチ型ア
ッセイ法、および（３）標的ヌクレオチド配列への標識
プローブの溶液内ノ・イブリッド形成を用いるアッセイ
法に分類できる。たとえば米国特許出願第６０７，８８
５号明細書（ダイアモンドら、１９８４年５月７日出願
、出願中、同−出、願人）に記載される第４の形態であ
る連鎖置換法は本発明に対しては公表された先行技術で
はない。
料のアッセイ法、（２１２７ｆｆ＋の異なる標的ヌクレ
オチド配列に対するプローブを用いるサンドインチ型ア
ッセイ法、および（３）標的ヌクレオチド配列への標識
プローブの溶液内ノ・イブリッド形成を用いるアッセイ
法に分類できる。たとえば米国特許出願第６０７，８８
５号明細書（ダイアモンドら、１９８４年５月７日出願
、出願中、同−出、願人）に記載される第４の形態であ
る連鎖置換法は本発明に対しては公表された先行技術で
はない。
第３の型の先行技術による核酸アッセイ法、すなわち溶
液内ハイブリッド形成法はコーネの国際特許出願公開８
４７０２７２１号（１９８４年７月１９日）に過剰の標
識プローブを用いるものとして特色づけられている。従
ってここでは反応混合物は標的ヌクレオチド配列に結合
した若干の標識プローブ（被分析体／標識ポリヌクレオ
チド複合体、またはＡ％Ｚｌ’）および若干の遊離標識
プローブ（Ｌ′）を含有する。コーネはこれらを特にヒ
ドロキシアパタイト（１−ＩＡ）によりＡｎＬ ’を固
定化することによシ分離する方を好んでいる。その３９
頁に彼は代替法、す々わち（ｉｉ，Ｓ’、酵素法（Ｌ’
を消化し、ＡｎＬ ’と容易に識別できる断片にする）
、（２）サイズ分離法、および（３）゛各種の試料固定
化法″について述べている。これらの方法（恐ら＜Ｓ＋
法を除く）によれば検出すべき標識は分離マトリックス
上にある。これに対し米国特許用１顆第６０７．８８５
号の連鎖置換アッセイ法の場合、置換された検出すべき
ポリヌクレオチドは溶液中にあるので（分離後）、流動
系内でよシ容易に取扱うことができ、−または溶液中で
種々の後続処理を施すことができる。Ｓ１酵素法ではこ
の制限は克服され々い。無傷のＡｎＬ’をＬ′の断片と
区別して最終的に分離するためには、時間のかかる消化
工程ののちＡｓＬ’を通常は固定化し寿ければ々ら（Ｂ
） ないからである。
液内ハイブリッド形成法はコーネの国際特許出願公開８
４７０２７２１号（１９８４年７月１９日）に過剰の標
識プローブを用いるものとして特色づけられている。従
ってここでは反応混合物は標的ヌクレオチド配列に結合
した若干の標識プローブ（被分析体／標識ポリヌクレオ
チド複合体、またはＡ％Ｚｌ’）および若干の遊離標識
プローブ（Ｌ′）を含有する。コーネはこれらを特にヒ
ドロキシアパタイト（１−ＩＡ）によりＡｎＬ ’を固
定化することによシ分離する方を好んでいる。その３９
頁に彼は代替法、す々わち（ｉｉ，Ｓ’、酵素法（Ｌ’
を消化し、ＡｎＬ ’と容易に識別できる断片にする）
、（２）サイズ分離法、および（３）゛各種の試料固定
化法″について述べている。これらの方法（恐ら＜Ｓ＋
法を除く）によれば検出すべき標識は分離マトリックス
上にある。これに対し米国特許用１顆第６０７．８８５
号の連鎖置換アッセイ法の場合、置換された検出すべき
ポリヌクレオチドは溶液中にあるので（分離後）、流動
系内でよシ容易に取扱うことができ、−または溶液中で
種々の後続処理を施すことができる。Ｓ１酵素法ではこ
の制限は克服され々い。無傷のＡｎＬ’をＬ′の断片と
区別して最終的に分離するためには、時間のかかる消化
工程ののちＡｓＬ’を通常は固定化し寿ければ々ら（Ｂ
） ないからである。
固定化試料型のアッセイ法はアール・ビー・ワレシスら
のヌクレイツク・アシツヅ・リサーチ、９巻、／１６４
．８７９−８９４頁（１９８１年）に報告されている。
のヌクレイツク・アシツヅ・リサーチ、９巻、／１６４
．８７９−８９４頁（１９８１年）に報告されている。
ワレシスはきわめて短いプローブ（ヌクレオチド１７個
以下）を用い、彼はこれを一般に１００：１のモル比で
固定化試料に施ｌ−ている。その８８７〜８８頁に記載
された実験においては（図３）、３２Ｆ−標識１４ｍｅ
ｒ２種をそれぞれ約１００ ： １のモル比で２．６ｋ
ｂの断片にハイブリッド形成させる。その際一方の標識
１４ｍｅｒ（ＲβＧ １．４ Ａ−）は固定化試料型の
１４−ヌクレオチド配列に児全に′１ケ合し、他方の標
識］、 ＝１ｍｅｒ（ＥβＧ１４７？）はヌク１／オチ
ド１４１固の１２番目（試料配列のＧの反対側、８８５
頁の図２を参照されたい）に不整合を形成する（Ｃの代
わりにＴ）。不整合の効果を証明し、これによりこの提
案された固定化試料アッセイ法の選択性を証明するため
に、本発明劣らは用いられているＰ３２−ＲβＧ１４Ａ
について７倍過剰量の゛無標識競合体″（ＲβＧ １４
ＡまだはＲβＧ １．４ Ｂ ）の存在下または不在
下で゛競合実験゛を行った。゛無標識競合体パが被分析
体であることは示唆されておらず、゛無標識競合体“が
過剰に用いられたにすぎない。
以下）を用い、彼はこれを一般に１００：１のモル比で
固定化試料に施ｌ−ている。その８８７〜８８頁に記載
された実験においては（図３）、３２Ｆ−標識１４ｍｅ
ｒ２種をそれぞれ約１００ ： １のモル比で２．６ｋ
ｂの断片にハイブリッド形成させる。その際一方の標識
１４ｍｅｒ（ＲβＧ １．４ Ａ−）は固定化試料型の
１４−ヌクレオチド配列に児全に′１ケ合し、他方の標
識］、 ＝１ｍｅｒ（ＥβＧ１４７？）はヌク１／オチ
ド１４１固の１２番目（試料配列のＧの反対側、８８５
頁の図２を参照されたい）に不整合を形成する（Ｃの代
わりにＴ）。不整合の効果を証明し、これによりこの提
案された固定化試料アッセイ法の選択性を証明するため
に、本発明劣らは用いられているＰ３２−ＲβＧ１４Ａ
について７倍過剰量の゛無標識競合体″（ＲβＧ １４
ＡまだはＲβＧ １．４ Ｂ ）の存在下または不在
下で゛競合実験゛を行った。゛無標識競合体パが被分析
体であることは示唆されておらず、゛無標識競合体“が
過剰に用いられたにすぎない。
さらに固定化試料に対し標識１．４ ｍｅｒ ＲβＧ１
．４Ａは１００：１のモル比で施され、無標識１４ ｍ
ｅｒＲβＧ１４Ｂ（ここできわめて関心がある例で）は
７００ ： ］のモル比で施された。
．４Ａは１００：１のモル比で施され、無標識１４ ｍ
ｅｒＲβＧ１４Ｂ（ここできわめて関心がある例で）は
７００ ： ］のモル比で施された。
本発明は第１の形態においては、
（（Ｚｌ 溶液中で、試料および（１）標的ヌクレオ
チド配列に塩基対結合１〜つる標識付き第１プローブポ
リヌクレオチドおよび（ｉｉ）第１プローブポリヌクレ
オチドの、標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領
域において第１プローブポリヌクレオチドＶＣ＞択的に
塩基対結合しうる固定化可能なまたは固定化された第２
プローブポリヌクレオチドを、第１プローブポリヌクレ
オチドが標的ヌクレオチド配列に結合しかつ第２プロー
ブポリヌクレオチドに結合しうる条件下で接触させ、 （ｂＩ 第２プローブポリヌクレオチドを、固定化可
能な場合にはこれに結合した標識付き第１プローブポリ
ヌクレオチドと共に固定化し、そして（ｃ） 固定化
さ）ｔた寸たは固定化可ｎＢな第２プローブポリヌクレ
オチドと共に固定化されていない標識付きポリヌクレオ
チドを、試料中の標的ヌクレオチド配列の量の尺度とし
て検出する工程からなる、生物学的試＊：１の核酸中の
あらかじめ定められた標的ヌクレオチド配列の存在を検
出するための方法を提供する。
チド配列に塩基対結合１〜つる標識付き第１プローブポ
リヌクレオチドおよび（ｉｉ）第１プローブポリヌクレ
オチドの、標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領
域において第１プローブポリヌクレオチドＶＣ＞択的に
塩基対結合しうる固定化可能なまたは固定化された第２
プローブポリヌクレオチドを、第１プローブポリヌクレ
オチドが標的ヌクレオチド配列に結合しかつ第２プロー
ブポリヌクレオチドに結合しうる条件下で接触させ、 （ｂＩ 第２プローブポリヌクレオチドを、固定化可
能な場合にはこれに結合した標識付き第１プローブポリ
ヌクレオチドと共に固定化し、そして（ｃ） 固定化
さ）ｔた寸たは固定化可ｎＢな第２プローブポリヌクレ
オチドと共に固定化されていない標識付きポリヌクレオ
チドを、試料中の標的ヌクレオチド配列の量の尺度とし
て検出する工程からなる、生物学的試＊：１の核酸中の
あらかじめ定められた標的ヌクレオチド配列の存在を検
出するための方法を提供する。
本発明は第２の形態においては、
（ａ）溶液中で、試料および（１）標的ヌクレオチド配
列に塩基対結合しうる固定化可能なまだは固定化された
第１プローブポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）第１プロ
ーブポリヌクレオチドの、標的ヌクレオチド配列に塩基
対結合しうる領域において第１プローブポリヌクレオチ
ドに選択的に塩基対結合しうる標識付き第２プローブポ
リヌクレオチドを、第１プローブポリヌクレオチドが標
的ヌクレオチド配列に結合しかつ第２プローブポリヌク
レオチドに結合しうる条件下で接触させ、 （ｂ＋ 第１プローブポリヌクレオチドを、固定化可
能な場合にはこれに結合しまた標識付き第２プローブポ
リヌクレオチドと共に固定化し、そして（ｃｌ 溶液
中に残存する標識付きポリヌクレオチドを、試料中の標
的ヌクレオチド配列の量の尺度として検出する 工程からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定め
られた標的ヌクレオチド配列の存在を検出するための方
法を提供する。
列に塩基対結合しうる固定化可能なまだは固定化された
第１プローブポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）第１プロ
ーブポリヌクレオチドの、標的ヌクレオチド配列に塩基
対結合しうる領域において第１プローブポリヌクレオチ
ドに選択的に塩基対結合しうる標識付き第２プローブポ
リヌクレオチドを、第１プローブポリヌクレオチドが標
的ヌクレオチド配列に結合しかつ第２プローブポリヌク
レオチドに結合しうる条件下で接触させ、 （ｂ＋ 第１プローブポリヌクレオチドを、固定化可
能な場合にはこれに結合しまた標識付き第２プローブポ
リヌクレオチドと共に固定化し、そして（ｃｌ 溶液
中に残存する標識付きポリヌクレオチドを、試料中の標
的ヌクレオチド配列の量の尺度として検出する 工程からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定め
られた標的ヌクレオチド配列の存在を検出するための方
法を提供する。
第１および第２の形態の双方において、まず試料を第１
プローブポリヌクレオチドと接触または反応させ、次い
でこの生成物混合物を第２プローブポリヌクレオチドと
接触または反応させることが好ましい。さらに第１プロ
ーブポリヌクレオチドと第２プローブポリヌクレオチド
の間の潜在的対合領域が、第１プローブポリヌクレオチ
ドと標的ヌクレオチド配列の間の対合領域の部分集合（
大きさが等しいかまたはより小さい）であることが好丑
しい。
プローブポリヌクレオチドと接触または反応させ、次い
でこの生成物混合物を第２プローブポリヌクレオチドと
接触または反応させることが好ましい。さらに第１プロ
ーブポリヌクレオチドと第２プローブポリヌクレオチド
の間の潜在的対合領域が、第１プローブポリヌクレオチ
ドと標的ヌクレオチド配列の間の対合領域の部分集合（
大きさが等しいかまたはより小さい）であることが好丑
しい。
本発明はさらにそれぞれ第１および第２の方法のために
調整された２種のキットを提供する。各キットは生物学
的試料の核酸中のあらかじめ定められた標的ヌクレオチ
ド配列の存在を検出するためのものである。第１キツト
は、 （ａ）標的ヌクレオチド配列に選択的に結合しうる第１
ポリヌクレオチド領域を含む標識付き第１プローブポリ
ヌクレオチド、 （ｂ）第１ポリヌクレオチド領域の少なくとも一部に選
択的に結合しうる第２ポリヌクレオチド領域をもつ固定
化可能な第２プローブポリヌクレオチド、および （ｃｌ 固定化可能な第２プローブポリヌクレオチド
をこれに結合１〜だ標識付き第１プローブポリヌクレオ
チドと共に固定化するための固定化手段からなる。
調整された２種のキットを提供する。各キットは生物学
的試料の核酸中のあらかじめ定められた標的ヌクレオチ
ド配列の存在を検出するためのものである。第１キツト
は、 （ａ）標的ヌクレオチド配列に選択的に結合しうる第１
ポリヌクレオチド領域を含む標識付き第１プローブポリ
ヌクレオチド、 （ｂ）第１ポリヌクレオチド領域の少なくとも一部に選
択的に結合しうる第２ポリヌクレオチド領域をもつ固定
化可能な第２プローブポリヌクレオチド、および （ｃｌ 固定化可能な第２プローブポリヌクレオチド
をこれに結合１〜だ標識付き第１プローブポリヌクレオ
チドと共に固定化するための固定化手段からなる。
第２キツトは、
（ａ）標的ヌクレオチド配列に選択的に結合しうる第１
ポリヌクレオチド領域をもつ固定化可能な第１プローブ
ポリヌクレオチド、 （ｂ） 第１ポリヌクレオチド領域の少なくとも−部
に選択的に結合しうる第２ポリヌクレオチド領域をもつ
標識付き第２プローブポリヌクレオチド（固定化可能な
第１プローブポリヌクレオチドと標識付き第２プローブ
ポリヌクレオチドは実質的に等モル量存在する）、およ
び （ｃｌ 固定化可能な第１プローブポリヌクレオチド
をこれに結合した標識付き第２ブローン゛ボリヌクレチ
ドと共に固定化するための固定化手段からなる。
ポリヌクレオチド領域をもつ固定化可能な第１プローブ
ポリヌクレオチド、 （ｂ） 第１ポリヌクレオチド領域の少なくとも−部
に選択的に結合しうる第２ポリヌクレオチド領域をもつ
標識付き第２プローブポリヌクレオチド（固定化可能な
第１プローブポリヌクレオチドと標識付き第２プローブ
ポリヌクレオチドは実質的に等モル量存在する）、およ
び （ｃｌ 固定化可能な第１プローブポリヌクレオチド
をこれに結合した標識付き第２ブローン゛ボリヌクレチ
ドと共に固定化するための固定化手段からなる。
本発明の方法およびキットには２種の試薬ポリヌクレオ
チド、すなわち標識付きプローブポリヌクレオチドおよ
び固定化可能な（または固定化された）プローブポリヌ
クレオチドを用いる。一般にこれら２種の試薬ポリヌク
レオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。いずれも使用中
に少なくとも対合領域においては一本鎖で々ければなら
ない。
チド、すなわち標識付きプローブポリヌクレオチドおよ
び固定化可能な（または固定化された）プローブポリヌ
クレオチドを用いる。一般にこれら２種の試薬ポリヌク
レオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。いずれも使用中
に少なくとも対合領域においては一本鎖で々ければなら
ない。
いずれも対合領域外に大型、小型のポリヌクレオチドを
含むか、または含まなくてもよい。対合領域の長さはヌ
クレオチド約１５個の小さなものからヌクレオチド約２
００個の大きなもの丑でであつてもよく、約２０〜１５
００個が好１しく、約２５〜１０００個がより好ましい
。２種の試薬ポリヌクレオチドの極性および対合セグメ
ントの寸−法間の好ましい関係について以下に述べろ。
含むか、または含まなくてもよい。対合領域の長さはヌ
クレオチド約１５個の小さなものからヌクレオチド約２
００個の大きなもの丑でであつてもよく、約２０〜１５
００個が好１しく、約２５〜１０００個がより好ましい
。２種の試薬ポリヌクレオチドの極性および対合セグメ
ントの寸−法間の好ましい関係について以下に述べろ。
標識ポリヌクレオチドは対合セグメントのほかに検出可
能なタグ（ｔｃＬｇ）を含む。米国／ｊ９訂出願第６０
７，８８５号明細冑に記載されたタグ、たとえば放射性
核種、螢光性タグ、−（Ｙ素系タグ、比色定量用タグの
いずれも使用できる。さらに米国特許出願第７２９，５
０２号および第７２９，５０３号明細書（バリーら）に
記載されるように、タグは（特に他の試薬および試料が
ＤＮＡである場合）消化可能々ポリリボヌクレオチドセ
グメント、好ましくは３′−末端ポリリボヌクレオチド
セグメント、たとえば３′−ポリ（ｒＡ）であってもよ
い。いずれの場合も、接触工程および（多くの場合）固
定化工程の後に、特定のタグまたは標識に関して適宜検
出工程を実施する。
能なタグ（ｔｃＬｇ）を含む。米国／ｊ９訂出願第６０
７，８８５号明細冑に記載されたタグ、たとえば放射性
核種、螢光性タグ、−（Ｙ素系タグ、比色定量用タグの
いずれも使用できる。さらに米国特許出願第７２９，５
０２号および第７２９，５０３号明細書（バリーら）に
記載されるように、タグは（特に他の試薬および試料が
ＤＮＡである場合）消化可能々ポリリボヌクレオチドセ
グメント、好ましくは３′−末端ポリリボヌクレオチド
セグメント、たとえば３′−ポリ（ｒＡ）であってもよ
い。いずれの場合も、接触工程および（多くの場合）固
定化工程の後に、特定のタグまたは標識に関して適宜検
出工程を実施する。
しかしさらに、標識ポリヌクレオチド（第１法において
は被分析体結合ハイブリッドとして）をたとえば放射性
核種に関するフィルム計数法まだはシンチレーション計
数法により検出する前に、濃縮または分別などの介在工
程を行ってもよい。
は被分析体結合ハイブリッドとして）をたとえば放射性
核種に関するフィルム計数法まだはシンチレーション計
数法により検出する前に、濃縮または分別などの介在工
程を行ってもよい。
過剰の標識プローブＤＮＡを除去することは、定量的検
出法（すなわち標的ヌクレオチド配列の存否寸だは量）
および定性的方法（たとえばゲル電気泳動）の双方に有
用である。本発明は複雑々ＤＮＡ試料において制限酵素
地図を作成する際、および制限酵素開裂法もしくは変性
濃度勾配ゲル電気泳動法によりＤＮＡ配列差を検出する
際に使用できる（実施例７および８に示す）。
出法（すなわち標的ヌクレオチド配列の存否寸だは量）
および定性的方法（たとえばゲル電気泳動）の双方に有
用である。本発明は複雑々ＤＮＡ試料において制限酵素
地図を作成する際、および制限酵素開裂法もしくは変性
濃度勾配ゲル電気泳動法によりＤＮＡ配列差を検出する
際に使用できる（実施例７および８に示す）。
検出は酵素系タグに刻する試薬と共に常法によシインキ
ユベー トすることを伴う場合もある。消化可能なポリ
リボヌクレオチドセグメントタグについては、検出は消
化および消化生成物の検出、たとえばポリヌクレオチド
ホスホリラーゼによる消化、ピルビン酸キナーゼ（およ
びホスホエノールピルビン酸）を用いるリン酸化、およ
びルシフェラーゼ（およびルシフェリン）を用いる光学
的読取りを含むであろう。米国特許出願第７２９．５０
２号および第７２９，５０３月を参照されたい。
ユベー トすることを伴う場合もある。消化可能なポリ
リボヌクレオチドセグメントタグについては、検出は消
化および消化生成物の検出、たとえばポリヌクレオチド
ホスホリラーゼによる消化、ピルビン酸キナーゼ（およ
びホスホエノールピルビン酸）を用いるリン酸化、およ
びルシフェラーゼ（およびルシフェリン）を用いる光学
的読取りを含むであろう。米国特許出願第７２９．５０
２号および第７２９，５０３月を参照されたい。
固定化可能なプローブポリヌクレオチドを用いる場合、
これはオリゴ（ｄＧ）セルロースとの接触により固定化
されたポリ（ｄｃ）なとの末端ホモポリヌクレオチドセ
グメントを含んでいてもよい。
これはオリゴ（ｄＧ）セルロースとの接触により固定化
されたポリ（ｄｃ）なとの末端ホモポリヌクレオチドセ
グメントを含んでいてもよい。
置換アッセイ法における同様なプローブ固定化について
は米国特許出願第７２９，５０１号明細書（ウンガーら
）を参照されたい。好ましくは親和性部分、たとえばビ
オチンが固定化プローブポリヌクレオチドに懸垂してい
る（たとえば末端デオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼ（ＴｄＴ）を用いてビオチニル−（ｄＵ）により
３′−延長することによってここに供給される；ワード
らの欧州特許出願第６３，８７９号（１９８２年）参照
）。
は米国特許出願第７２９，５０１号明細書（ウンガーら
）を参照されたい。好ましくは親和性部分、たとえばビ
オチンが固定化プローブポリヌクレオチドに懸垂してい
る（たとえば末端デオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼ（ＴｄＴ）を用いてビオチニル−（ｄＵ）により
３′−延長することによってここに供給される；ワード
らの欧州特許出願第６３，８７９号（１９８２年）参照
）。
親和性部分は固定化可能なプローブの対合領域外のいず
れかに位置してもよい。
れかに位置してもよい。
次いで固定化工程は反応混合物を親和性部分に対する固
定化親和試薬（たとえばアビジン、ストレプトアビジン
または抗ビオチン抗体）と接触さく１′７） せ、ビオチニル化された固定化可能々プローブポリヌク
レオチドおよびそれらのハイブリッドを固定化すること
を伴う。他の同様な親和性部分には糖部分が含まれ、こ
れを固相でレクチンと接触させる。固定化可能々プロー
ブポリヌクレオチドは標識付きプローブポリヌクレオチ
ドまだは試料ポリヌクレオチドよりも実質的に大きな釦
であってもよく（前処理後に）、これにより固定化可能
なプローブポリヌクレオチドおよびそのノ・イブリッド
を寸法に基づいて分離しく実施例６および７のアクリル
アミドゲル）、固定化されなかった鎖をさらにゲル内へ
移行させることもできる。
定化親和試薬（たとえばアビジン、ストレプトアビジン
または抗ビオチン抗体）と接触さく１′７） せ、ビオチニル化された固定化可能々プローブポリヌク
レオチドおよびそれらのハイブリッドを固定化すること
を伴う。他の同様な親和性部分には糖部分が含まれ、こ
れを固相でレクチンと接触させる。固定化可能々プロー
ブポリヌクレオチドは標識付きプローブポリヌクレオチ
ドまだは試料ポリヌクレオチドよりも実質的に大きな釦
であってもよく（前処理後に）、これにより固定化可能
なプローブポリヌクレオチドおよびそのノ・イブリッド
を寸法に基づいて分離しく実施例６および７のアクリル
アミドゲル）、固定化されなかった鎖をさらにゲル内へ
移行させることもできる。
同相上で親和試薬によシ固定する場合、種々の形状の固
相、たとえばビーズ、カラム、吸収剤マトリックス、充
填材、および生物学的もしくは化学的親和試薬も適して
いる。
相、たとえばビーズ、カラム、吸収剤マトリックス、充
填材、および生物学的もしくは化学的親和試薬も適して
いる。
場合によっては、２種の試薬ポリヌクレオチドの割合（
ＬもしくはＬ′のモル数およびＩもしくはＩ′のモル数
）および予想される標的ヌクレオチド配列の水準（ＴＮ
’；のモル数）が以下に論じる理由から重要である。第
１の方法（およびキット）については、標識付き第１プ
ローブポリヌクレオチドは好ましくは測定を意図する標
的ヌクレオチド配列の最高予想水準と等しいかまたは過
剰な水準で存在する。この種の第１の方法およびキット
においては、固定化可能なまたは固定化された第２のプ
ローブポリヌクレオチドは好ましくは第１の標識付きプ
ローブポリヌクレオチドの水準と等しいかまたはよシ高
い水準で存在することが好ましい。第１の方法における
好ましいモル比は次式のとおりである。
ＬもしくはＬ′のモル数およびＩもしくはＩ′のモル数
）および予想される標的ヌクレオチド配列の水準（ＴＮ
’；のモル数）が以下に論じる理由から重要である。第
１の方法（およびキット）については、標識付き第１プ
ローブポリヌクレオチドは好ましくは測定を意図する標
的ヌクレオチド配列の最高予想水準と等しいかまたは過
剰な水準で存在する。この種の第１の方法およびキット
においては、固定化可能なまたは固定化された第２のプ
ローブポリヌクレオチドは好ましくは第１の標識付きプ
ローブポリヌクレオチドの水準と等しいかまたはよシ高
い水準で存在することが好ましい。第１の方法における
好ましいモル比は次式のとおりである。
第１分数は好寸しくけ少なくとも１０、より好ましくは
少なくとも５０、一般に１００〜１０００またはそれ以
上である。
少なくとも５０、一般に１００〜１０００またはそれ以
上である。
この第１分数が大きくなるのに伴ってＡｎとＬ′の間の
ハイブリッド形成率が高捷る（これは少量の被分析体を
速やかに分析したい場合に特に重要である）。しかし第
１比がこのように高まると、Ｌに比例するバックグラウ
ンド源もＮ１３ するであろう（すなわちＬ試薬中の不
純物から生じるもの、またはＬ鎖のタグの開裂により生
じるもの）。従って個々のアッセイについて行われるタ
グ、まだはＬ鎖の精製水準の選択はこの係数により影響
され、および／またはこのバックグラウンド源を許容で
きる水準にまで低下させるためには第１比は（用いられ
るＬ′釦を予想されるＡｎ量と比較して）最大ハイブリ
ッド形成率を与える第１比以下に選ばれるであろう。
ハイブリッド形成率が高捷る（これは少量の被分析体を
速やかに分析したい場合に特に重要である）。しかし第
１比がこのように高まると、Ｌに比例するバックグラウ
ンド源もＮ１３ するであろう（すなわちＬ試薬中の不
純物から生じるもの、またはＬ鎖のタグの開裂により生
じるもの）。従って個々のアッセイについて行われるタ
グ、まだはＬ鎖の精製水準の選択はこの係数により影響
され、および／またはこのバックグラウンド源を許容で
きる水準にまで低下させるためには第１比は（用いられ
るＬ′釦を予想されるＡｎ量と比較して）最大ハイブリ
ッド形成率を与える第１比以下に選ばれるであろう。
第２分数は好ましくは少なくとも２、一般に５〜１０ま
たはそれ以」−である。
たはそれ以」−である。
第２の方法について比率
Ｉ′のモル数
りのモル数
は普通はほぼ１である（すなわち約０９〜１．１）。
この場合、Ｉ′のモル数およびＬのモル数のうち小さい
方までの水準の被分析体Ｃ’ＴＮＳのモル数）を検出し
、識別することができる（より高い量は識別できないで
あろつ）；好捷しくは（後記のように力学的配慮および
許容できる時間的拘束に応じて）Ｉ′のモル数およびＬ
のモル数はそれぞれ、予想される’Ｉ’ＮＳのモル数の
約１〜２０（好ましくは２〜１０）倍に選ばれるであろ
う。
方までの水準の被分析体Ｃ’ＴＮＳのモル数）を検出し
、識別することができる（より高い量は識別できないで
あろつ）；好捷しくは（後記のように力学的配慮および
許容できる時間的拘束に応じて）Ｉ′のモル数およびＬ
のモル数はそれぞれ、予想される’Ｉ’ＮＳのモル数の
約１〜２０（好ましくは２〜１０）倍に選ばれるであろ
う。
これらの量は普通はＴＮＳのモル数（最大予想水準）よ
シもそれぞれ太きいが、５〜１００倍程度にすぎない。
シもそれぞれ太きいが、５〜１００倍程度にすぎない。
Ｉ′のモル数くＬのモル数
の条件は除外はされないが、ＬマイナスＩ′遊離第２ポ
リヌクレオチドによるバックグラウンド信号が生じる点
で望ましくない。ＬマイナスＩ′は予想ＴＮＳ水準に比
べて小さく、従ってＴＮＳセグメントがバックグラウン
ドよシも高く検出される未結合り鎖の添加水準にまで達
することが好ましい。
リヌクレオチドによるバックグラウンド信号が生じる点
で望ましくない。ＬマイナスＩ′は予想ＴＮＳ水準に比
べて小さく、従ってＴＮＳセグメントがバックグラウン
ドよシも高く検出される未結合り鎖の添加水準にまで達
することが好ましい。
Ｉ′のモル数〉Ｌのモル数
は、このような場合第１Ｉ′マイナスＬ標的ヌクレオチ
ド配列が未結合Ｌ＠の変化を生じないであろうという点
でいっそう望ましくない。標的ヌクレオチド配列はきわ
めて低い水準（たとえばピコモル量、フェムトモル量、
またはアトモル量）で存在する場合が多い（従って検出
が求められる）ので、この後者の条件はしばしば許容で
きない。
ド配列が未結合Ｌ＠の変化を生じないであろうという点
でいっそう望ましくない。標的ヌクレオチド配列はきわ
めて低い水準（たとえばピコモル量、フェムトモル量、
またはアトモル量）で存在する場合が多い（従って検出
が求められる）ので、この後者の条件はしばしば許容で
きない。
等モル量のＬおよびＩ′を第２法（従って第２キツト）
に保証するための一方法は、Ｌｆ標的ヌクレオチド配列
と競合する標識付き第２プローブポリヌクレオチド）を
Ｉ’ （標的ヌクレオチド配列に相補的な固定化可能
な第１プローブポリヌクレオチド）との１＝１試薬ノ・
イブリッドとして供給することである。使用前にこの試
薬ノ・イブリッドを変性しくすなわち熱により）；次い
でこの変性した試薬を有意量のＬおよびＩ′が再ノ・イ
ブリッド形成する前に試料と接触させる。この種の試薬
ハイブリッドは（あらかじめ）別個に調製されたＬ鎖と
Ｉ′鎖をハイブリッド形成させることにより、あるいは
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤｓＡ−ＲＮＡ二本鎖の適宜な末
端を誘導体化することによシ製造できる。適宜な末端に
対する選択性（たとえはタグの化学的結合、あるいはＴ
ｄＴ およびビオチニル−ｄＵ−ＥたばｒＡ′ｆｆ：用
いる延伸に対する）は、米国特許出願第７２９．５０４
号明細書（フリッチおよびコリンズ）にその明細書の図
１Ｆ、ＩＧｇよびＩＨに関連して記載されたものと同様
な様式で順次、制限エンドヌクレアーゼ開裂および付着
により達成できる。
に保証するための一方法は、Ｌｆ標的ヌクレオチド配列
と競合する標識付き第２プローブポリヌクレオチド）を
Ｉ’ （標的ヌクレオチド配列に相補的な固定化可能
な第１プローブポリヌクレオチド）との１＝１試薬ノ・
イブリッドとして供給することである。使用前にこの試
薬ノ・イブリッドを変性しくすなわち熱により）；次い
でこの変性した試薬を有意量のＬおよびＩ′が再ノ・イ
ブリッド形成する前に試料と接触させる。この種の試薬
ハイブリッドは（あらかじめ）別個に調製されたＬ鎖と
Ｉ′鎖をハイブリッド形成させることにより、あるいは
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤｓＡ−ＲＮＡ二本鎖の適宜な末
端を誘導体化することによシ製造できる。適宜な末端に
対する選択性（たとえはタグの化学的結合、あるいはＴ
ｄＴ およびビオチニル−ｄＵ−ＥたばｒＡ′ｆｆ：用
いる延伸に対する）は、米国特許出願第７２９．５０４
号明細書（フリッチおよびコリンズ）にその明細書の図
１Ｆ、ＩＧｇよびＩＨに関連して記載されたものと同様
な様式で順次、制限エンドヌクレアーゼ開裂および付着
により達成できる。
固定化プローブポリヌクレオチドを用いる場合、これは
既知の方法により、あるいは好ましくは米国特許出願第
６０７．８８５号および特に同第７２９．７００号明細
書（ブラウンら）に記載き扛た化学的方法または化学的
方法／リゲーションにより固相に付着させることができ
る。
既知の方法により、あるいは好ましくは米国特許出願第
６０７．８８５号および特に同第７２９．７００号明細
書（ブラウンら）に記載き扛た化学的方法または化学的
方法／リゲーションにより固相に付着させることができ
る。
いずれの接触工程についてもハイブリッド形成速度は常
法により、たとえばポリ（エチレングリコール）、硫酸
デキストラン、ｒｅｃＡ蛋白質および他の既知の各種ノ
・イブリッド形成速度促進剤を用いることにより高める
ことができる。
法により、たとえばポリ（エチレングリコール）、硫酸
デキストラン、ｒｅｃＡ蛋白質および他の既知の各種ノ
・イブリッド形成速度促進剤を用いることにより高める
ことができる。
前記および後記のように各工程、特に被分析体鎖（標的
ヌクレオチド配列を含むかまたは宮まない試料核酸）を
伴うハイブリッド形成〔接触〕工程に関する最小許容時
間は種々の因子に基つくものであり、これには（ｉｉ予
想被分析体水準、（２）塩濃度Ｂよび温度比（前記参照
）、選ばれた実施態様（後記の第３図および第４図に関
する考察を参照されたい）、ならびに用いられる促進剤
が含１れる。一般に、固定化された一本鎖を用いるもの
と比べて全体的に溶液中で行われるハイブリッド形成に
関しては１０〜１． ＯＯ０倍高い初速が期待できる。
ヌクレオチド配列を含むかまたは宮まない試料核酸）を
伴うハイブリッド形成〔接触〕工程に関する最小許容時
間は種々の因子に基つくものであり、これには（ｉｉ予
想被分析体水準、（２）塩濃度Ｂよび温度比（前記参照
）、選ばれた実施態様（後記の第３図および第４図に関
する考察を参照されたい）、ならびに用いられる促進剤
が含１れる。一般に、固定化された一本鎖を用いるもの
と比べて全体的に溶液中で行われるハイブリッド形成に
関しては１０〜１． ＯＯ０倍高い初速が期待できる。
この種の一般原則を留意して、目的の感度を達成するた
めに各工程に許容される期間はルーチン実験により判定
できる。ざらに本発明の容積実施態様の選択は他の因子
（たとえば要求される感度、使いやすさ、特定の極性を
もつ標識鎖育たは固定化可能な鎖の入手しやすさつと対
比して時間的な拘束または優位性に基づいて行うことが
できる。これらの改質剤を用いた、！たは用いないハイ
ブリッド形成に適した塩条件および温度を採用しうる。
めに各工程に許容される期間はルーチン実験により判定
できる。ざらに本発明の容積実施態様の選択は他の因子
（たとえば要求される感度、使いやすさ、特定の極性を
もつ標識鎖育たは固定化可能な鎖の入手しやすさつと対
比して時間的な拘束または優位性に基づいて行うことが
できる。これらの改質剤を用いた、！たは用いないハイ
ブリッド形成に適した塩条件および温度を採用しうる。
絶対濃度（ＴＨＥ、 Ｌ’ｊ６よびＩの相対割合と区
別して）は決定的ではないが、荷に第２法についてはよ
り高濃度の反応混合物が一般に好ましい。試料を調製し
て（たとえば変性）その核酸を入手できる一本鎖状で（
多くの場合開裂したもの）得るための方法は一般に採用
されるものである。
別して）は決定的ではないが、荷に第２法についてはよ
り高濃度の反応混合物が一般に好ましい。試料を調製し
て（たとえば変性）その核酸を入手できる一本鎖状で（
多くの場合開裂したもの）得るための方法は一般に採用
されるものである。
上記米国特許出願明細１： （Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ ）ｋそ
れぞれ前記に適した材料の記述に関してここに引用する
。
れぞれ前記に適した材料の記述に関してここに引用する
。
ティックス
７２９．５０１ １９８５．５．２ ウンガーら
アライド７２α５０３ １９８５．５．２ バリー
ら アライド７２ａ５０４ ’１９８５．５．
２ フリツチュら ジエネテイックス７２９．７０
０ １９８５．５．２ ブラウンら ジエネテイ
ックスまたここに米国特許出願第６４５．２０２号明細
書（ダイアモンドら、１９８４年４月２９日出願、アラ
イド社に譲渡）をイムノアッセイ法および核酸アッセイ
法に関する気相を伴う酵累胱取に関する記載の記述につ
いて参考として引用する。
アライド７２α５０３ １９８５．５．２ バリー
ら アライド７２ａ５０４ ’１９８５．５．
２ フリツチュら ジエネテイックス７２９．７０
０ １９８５．５．２ ブラウンら ジエネテイ
ックスまたここに米国特許出願第６４５．２０２号明細
書（ダイアモンドら、１９８４年４月２９日出願、アラ
イド社に譲渡）をイムノアッセイ法および核酸アッセイ
法に関する気相を伴う酵累胱取に関する記載の記述につ
いて参考として引用する。
第１〜４図は本発明の４徨の形態、すなわち抑制様式（
第１．２３よび４図）もしくは競合様式（第３図）を用
いるもの、固定化可能がポリヌクレオチド試薬（プロー
ブ）（第１．３および４図）もしくは固定化でれたポリ
ヌクレオチド試薬（プローブ）（第２図）を用いるもの
、および被分析体の標的ヌクレオチド配列（ＴＮＳ）に
相補的な標識付きプローブヌクレオチド（第１および２
図）もしくはこれと競合するもの（第３８よび４図）を
用いるものを示す。第１〜４図には適切な対合セグメン
トのみを示す。３本の連鎖、すなわち仮分析体（Ａｎ）
、標識ポリヌクレオチド（相補的な場合はＬ′、競合的
な場合はＬ）、固定化可能なポリヌクレオチド（競合的
な場合はＩ、相補的な場合はｒ１）のいずれにも、対合
領域の輪郭を描く異種の自己列は存在しないと思われる
。後述するように、このような異質の領域は有害ではな
い。対合領域の艮でを第５図と関連して後述する。
第１．２３よび４図）もしくは競合様式（第３図）を用
いるもの、固定化可能がポリヌクレオチド試薬（プロー
ブ）（第１．３および４図）もしくは固定化でれたポリ
ヌクレオチド試薬（プローブ）（第２図）を用いるもの
、および被分析体の標的ヌクレオチド配列（ＴＮＳ）に
相補的な標識付きプローブヌクレオチド（第１および２
図）もしくはこれと競合するもの（第３８よび４図）を
用いるものを示す。第１〜４図には適切な対合セグメン
トのみを示す。３本の連鎖、すなわち仮分析体（Ａｎ）
、標識ポリヌクレオチド（相補的な場合はＬ′、競合的
な場合はＬ）、固定化可能なポリヌクレオチド（競合的
な場合はＩ、相補的な場合はｒ１）のいずれにも、対合
領域の輪郭を描く異種の自己列は存在しないと思われる
。後述するように、このような異質の領域は有害ではな
い。対合領域の艮でを第５図と関連して後述する。
第２図において、固足化ポリヌクレオチドｆｌｄと表示
する。これは被分析体鎖と競合的だからである。固定化
可能なセグメントはビオチニル化ｄＵテイル（第１図に
おいてＥＢＢ、 第４図においてＢＢ）により、！、
たポリ（ｄＣ）テイル（第３図においてｃｃｃｃｃ）に
より表わされ、これらは次いでそれぞれアビジンもしく
はストレプトアビジンカラム（第１および４図ＶＣおい
てＡυ）寸たはポリ（ｄＧ）セルロースカラム（第３図
においてＧＧＧ）により捕捉される。アッセイ終了時に
標識ポリヌクレオチドＬまたはＬ′上のタグＴがアッセ
イされる。第１および２図においてはＡｎＬ’ （［分
析体と相補的標識鋲との非固定化複合体〕として、ある
いは第３および４図においてはＬ（一本領として、また
にアッセイに関係のない鎖（たとえばＡｎ’）との二本
鎖として。
する。これは被分析体鎖と競合的だからである。固定化
可能なセグメントはビオチニル化ｄＵテイル（第１図に
おいてＥＢＢ、 第４図においてＢＢ）により、！、
たポリ（ｄＣ）テイル（第３図においてｃｃｃｃｃ）に
より表わされ、これらは次いでそれぞれアビジンもしく
はストレプトアビジンカラム（第１および４図ＶＣおい
てＡυ）寸たはポリ（ｄＧ）セルロースカラム（第３図
においてＧＧＧ）により捕捉される。アッセイ終了時に
標識ポリヌクレオチドＬまたはＬ′上のタグＴがアッセ
イされる。第１および２図においてはＡｎＬ’ （［分
析体と相補的標識鋲との非固定化複合体〕として、ある
いは第３および４図においてはＬ（一本領として、また
にアッセイに関係のない鎖（たとえばＡｎ’）との二本
鎖として。
第１〜４図それぞれに示したそれぞれの型の鎖の相対数
（たとえば第１図において５本のＬ′鎖および２本のＡ
ｎ鎖）は好ましい実施態様に関する特定の比率を示すた
めのものではなく、いずれの連鎖が過剰モルであること
が好葦しいが（第３および４図のＬ鎖およびＩ′鎖の場
合）、いずれの連鎖がほぼ等モル重存在するかを示すた
めのものである。
（たとえば第１図において５本のＬ′鎖および２本のＡ
ｎ鎖）は好ましい実施態様に関する特定の比率を示すた
めのものではなく、いずれの連鎖が過剰モルであること
が好葦しいが（第３および４図のＬ鎖およびＩ′鎖の場
合）、いずれの連鎖がほぼ等モル重存在するかを示すた
めのものである。
第１図においてはすべての、または本質的にすべての破
分析体鎖Ａｎが、これに対し相補的であり過剰量に供給
された標識鎖Ｌ′の一部にハイブリッド形成する。たと
えば図示されたように５本の標識鎖Ｌ′に対し２本の被
分析体鎖Ａｎがある場合、２本のＡｎＬ’複合体が形成
きれ、３本のＬ′鎖が残るはずである。次いで過剰の固
定化可能な鎖を添加することにより（Ｌ′上の部位に対
しＡｎと競合する６本のビオチニル化連鎖Ｉとして示さ
れている）第１工程で一本鎖の１１残きれていた標識鎖
Ｌ′はすべてＩＬ’ 複合体を形成するであろう。
分析体鎖Ａｎが、これに対し相補的であり過剰量に供給
された標識鎖Ｌ′の一部にハイブリッド形成する。たと
えば図示されたように５本の標識鎖Ｌ′に対し２本の被
分析体鎖Ａｎがある場合、２本のＡｎＬ’複合体が形成
きれ、３本のＬ′鎖が残るはずである。次いで過剰の固
定化可能な鎖を添加することにより（Ｌ′上の部位に対
しＡｎと競合する６本のビオチニル化連鎖Ｉとして示さ
れている）第１工程で一本鎖の１１残きれていた標識鎖
Ｌ′はすべてＩＬ’ 複合体を形成するであろう。
固定化可能な連鎖Ｉはここでアビジンまたはストレプト
アビジンカラム（Ａτ）により捕捉葦たは固定化される
。ＩＥよびＩＬ’の双方が捕捉される。
アビジンカラム（Ａτ）により捕捉葦たは固定化される
。ＩＥよびＩＬ’の双方が捕捉される。
ＡｎＬ’のみがカラムを通過する。ここで溶出液を直ち
に、寸たは芙施例６に示したように後処理したのち、タ
グＴについてアッセイすることにより、試料中のＡｎ鎖
（すなわち標的ヌクレオチド配列をもつもの）の蛍に対
し関数関係にある（一般に直線関係および正比例関係に
ある）値が？Ｇられる。
に、寸たは芙施例６に示したように後処理したのち、タ
グＴについてアッセイすることにより、試料中のＡｎ鎖
（すなわち標的ヌクレオチド配列をもつもの）の蛍に対
し関数関係にある（一般に直線関係および正比例関係に
ある）値が？Ｇられる。
第１図に示した各要素の組合わせは一般に幾つかの理由
できわめて好寸しい配列である。第１にこれは最高感度
を与える。これは、量および条件が適切であるならばＡ
ｎ鎖の不在により溶出液中のタグＴのバンクグラウンド
値がきわめて低くなり；少量のＡｎ鎖により、この水準
がわずかではあるが測定できる程度に変化するからであ
る。わずかな変化を検出するのは多数の場合よりも少数
の場合の方が容易であることは認められるであろう。第
２にＬ′の正確な量はＡｎの予想水準よりも高いことが
好ブしいからである。しかしＬ′の量がＡｎＯ量よりも
低いとしても、最大水準のＡｎＬ’が認められ、存在す
るＡｎ鎖についての少なくとも最大の値を測定しうる。
できわめて好寸しい配列である。第１にこれは最高感度
を与える。これは、量および条件が適切であるならばＡ
ｎ鎖の不在により溶出液中のタグＴのバンクグラウンド
値がきわめて低くなり；少量のＡｎ鎖により、この水準
がわずかではあるが測定できる程度に変化するからであ
る。わずかな変化を検出するのは多数の場合よりも少数
の場合の方が容易であることは認められるであろう。第
２にＬ′の正確な量はＡｎの予想水準よりも高いことが
好ブしいからである。しかしＬ′の量がＡｎＯ量よりも
低いとしても、最大水準のＡｎＬ’が認められ、存在す
るＡｎ鎖についての少なくとも最大の値を測定しうる。
プらに第１図に示した抑制様式の場合、Ａｎ’（ＴＨＥ
に相補的な配列をもつ試料鎖、試料が単に変性された二
本鎖ＤＮＡである場合に存在するであろう〕の任在は再
現性のあるわずかな影響を与えるにすぎない。たとえば
２本のＡｎ’鎖および２本のＡｎ鎖が試料中に各５個の
Ｌ′鎖に対して存在した場合、再ハイブリッド形成がＡ
ｎ／Ｌ’ ハイブリッド形成と競合して２本以下のＡｎ
Ｌ’鎖が形成されるであろう。すなわちＡｎとＡｎ’の
間の相同長さの増大などの二次的因子を無視すると、そ
れぞれ最初の５本のＬ′鎖につき２Ｘに／’）−％Ａｎ
Ｌ’鎖が予想されるであろう。
に相補的な配列をもつ試料鎖、試料が単に変性された二
本鎖ＤＮＡである場合に存在するであろう〕の任在は再
現性のあるわずかな影響を与えるにすぎない。たとえば
２本のＡｎ’鎖および２本のＡｎ鎖が試料中に各５個の
Ｌ′鎖に対して存在した場合、再ハイブリッド形成がＡ
ｎ／Ｌ’ ハイブリッド形成と競合して２本以下のＡｎ
Ｌ’鎖が形成されるであろう。すなわちＡｎとＡｎ’の
間の相同長さの増大などの二次的因子を無視すると、そ
れぞれ最初の５本のＬ′鎖につき２Ｘに／’）−％Ａｎ
Ｌ’鎖が予想されるであろう。
第２図は第１図に示したと同じ抑制アッセイ法の第２工
程を表わす。ただしこの場合、固定化可能な鎖Ｉではな
く、Ａｎと競合する固定化ポリヌクレオチドＩｄを用い
る。この場合は合計わずか２工程で、Ａ、ｎＬ’複合体
の形のみの検出可能なタグＴをもつ溶出液が得られる。
程を表わす。ただしこの場合、固定化可能な鎖Ｉではな
く、Ａｎと競合する固定化ポリヌクレオチドＩｄを用い
る。この場合は合計わずか２工程で、Ａ、ｎＬ’複合体
の形のみの検出可能なタグＴをもつ溶出液が得られる。
ＡｎＬ’の濃度は試料中により多量のＡｎが存在するの
に伴って直線的に高する。
に伴って直線的に高する。
第２図のアッセイ法は１工程少ないという利点をもつが
、固定化された鎖に対して完全てありがつ選択的なハイ
ブリッド形成および結合を得ることが、第１図で用いた
固定化可能な鎖の場合はど容易でないことが多い。溶液
中の鎖と固相上のものとのハイブリッド形成の速度は（
全体的に溶液中のハイブリッド形成と比較して）より緩
慢である（約１０倍、また溶液中に促進剤が含１れると
１００〜１０００倍）。従って、第２図のアッセイ法は
若干の速度および感度の損失を与えるが、感度に対する
要求が低い場合、および／筐たは効率の高い固定化ポリ
ヌクレオチド鎖１ｄが得られる場合はその使いやすさの
ため好捷れるであろう。
、固定化された鎖に対して完全てありがつ選択的なハイ
ブリッド形成および結合を得ることが、第１図で用いた
固定化可能な鎖の場合はど容易でないことが多い。溶液
中の鎖と固相上のものとのハイブリッド形成の速度は（
全体的に溶液中のハイブリッド形成と比較して）より緩
慢である（約１０倍、また溶液中に促進剤が含１れると
１００〜１０００倍）。従って、第２図のアッセイ法は
若干の速度および感度の損失を与えるが、感度に対する
要求が低い場合、および／筐たは効率の高い固定化ポリ
ヌクレオチド鎖１ｄが得られる場合はその使いやすさの
ため好捷れるであろう。
第３図は既知量の標識ポリヌクレオチドＬおよび未知量
の被分析体Ａｎとの間で起こる、既知量の固定化可能な
鎖ｒ’ｃｒ、−ｓよびＡｎの双方に対し相補的）に対す
る競合アッセイ法を示す。図示されたように３本の仮分
析体鎖ＡｎＣ標的ヌクレオチド配列をもつ）対６本の標
識競合鎖し′対６本の固定化可能な鎖１′が力えられる
と（ハイブリッド形成に対しタグＴによる二次的影響が
ないと仮定して）、４本のＬＪＪ合体および２木のＡｎ
ｌ’複合体が得られ、１本のＡｎｆ；Ａおよび２本のＬ
鎖がハイブリッド形成せずに残されるであろう。そこで
Ｉ′鎖、Ｌｌ’鎖およびＡ、 ｎ Ｉ ’鎖をすべて固
定化することにより、“ハイブリッド形成していない”
標識鋲り上にのみタグをもつ溶出液が得られる。最初に
より多量のＡｎ鎖が存在するほど（既知量または再現性
のある量のＬ鎖およびＩ′鎖に対して）、より少量のＬ
鎖が溶出液中に見出される。従って、６本の１′鎖およ
び６本のＬ鎖が存在したと仮定すると、下記の用量応答
曲線が得られるであろう。
の被分析体Ａｎとの間で起こる、既知量の固定化可能な
鎖ｒ’ｃｒ、−ｓよびＡｎの双方に対し相補的）に対す
る競合アッセイ法を示す。図示されたように３本の仮分
析体鎖ＡｎＣ標的ヌクレオチド配列をもつ）対６本の標
識競合鎖し′対６本の固定化可能な鎖１′が力えられる
と（ハイブリッド形成に対しタグＴによる二次的影響が
ないと仮定して）、４本のＬＪＪ合体および２木のＡｎ
ｌ’複合体が得られ、１本のＡｎｆ；Ａおよび２本のＬ
鎖がハイブリッド形成せずに残されるであろう。そこで
Ｉ′鎖、Ｌｌ’鎖およびＡ、 ｎ Ｉ ’鎖をすべて固
定化することにより、“ハイブリッド形成していない”
標識鋲り上にのみタグをもつ溶出液が得られる。最初に
より多量のＡｎ鎖が存在するほど（既知量または再現性
のある量のＬ鎖およびＩ′鎖に対して）、より少量のＬ
鎖が溶出液中に見出される。従って、６本の１′鎖およ
び６本のＬ鎖が存在したと仮定すると、下記の用量応答
曲線が得られるであろう。
この種の競合様式は広範な予想ＩＪｔのＡｎの検出を可
能にするが、核酸のアッセイについては本発明のこの形
態はしばしば感度が不適当である。でらにＬの量対Ｉ′
の量を正確に制御する可行目性がしばしば制限される。
能にするが、核酸のアッセイについては本発明のこの形
態はしばしば感度が不適当である。でらにＬの量対Ｉ′
の量を正確に制御する可行目性がしばしば制限される。
従ってこの形態のアッセイを行う場合、既知の量のＡｎ
、ＶＣついて対照実験を行い、これにより試料の分析と
同時に用量応答曲線を確豆することが望ましいであろう
。
、ＶＣついて対照実験を行い、これにより試料の分析と
同時に用量応答曲線を確豆することが望ましいであろう
。
第４図は第３図の実施態様の場合と同じ試薬（すなわち
、被分析体と競合する標識鋲り、ならびにＡｎおよびＬ
それぞれに相補的な固定化可能な鎖Ｉ′）を表わすが、
この場合ば３工程の抑制法である。存在するＡｎ鎖が多
いほど多量のＡｎｌ’複合体が生成し、第２工程でＬが
添加された際にこの標識鋲りと結合する一木鎖状のＩ′
鎖はより少量残される。次いでＡｎｌ’およびＬｌ’ｇ
合体を固定化することにより、溶出液中に残されたタグ
ばＬ鎖のみとなるはずである。６本のＬ鎖および６本の
Ｉ′鎖について予想される用量一応答曲線は下記のと８
りとなる。
、被分析体と競合する標識鋲り、ならびにＡｎおよびＬ
それぞれに相補的な固定化可能な鎖Ｉ′）を表わすが、
この場合ば３工程の抑制法である。存在するＡｎ鎖が多
いほど多量のＡｎｌ’複合体が生成し、第２工程でＬが
添加された際にこの標識鋲りと結合する一木鎖状のＩ′
鎖はより少量残される。次いでＡｎｌ’およびＬｌ’ｇ
合体を固定化することにより、溶出液中に残されたタグ
ばＬ鎖のみとなるはずである。６本のＬ鎖および６本の
Ｉ′鎖について予想される用量一応答曲線は下記のと８
りとなる。
Ａｎ鎖 溶出液中のＬ＠
７＋６
従ってこのアッセイ法は第１図の第１の実施態様と同じ
潜在感度を与えるが、Ｌｇ′ｊ６よびＩ′鎖の量を制御
する必要性が若干大きい。
潜在感度を与えるが、Ｌｇ′ｊ６よびＩ′鎖の量を制御
する必要性が若干大きい。
１０６個の被分析体分子ｉｔへ囲における効果を調べる
と、第３図８よび第４図の糸は最適な塩および温度の条
件下でも、寸だ促進剤を用いても、鎖ＡｎおよびＩ′の
ハイブリッド形成全十分に終結させるために１０〜３０
分以上の期間を必要とするであろう。従ってこの場合、
このハイブリッド形成を一夜行わせ、後続の工程を翌朝
行ってもよい。
と、第３図８よび第４図の糸は最適な塩および温度の条
件下でも、寸だ促進剤を用いても、鎖ＡｎおよびＩ′の
ハイブリッド形成全十分に終結させるために１０〜３０
分以上の期間を必要とするであろう。従ってこの場合、
このハイブリッド形成を一夜行わせ、後続の工程を翌朝
行ってもよい。
第３′ｊ６よび４図の形態のいずれも、十分な活性およ
び選択性が得られるならば、置屋化可能な鎖（Ｉ′〕の
代わりに固定化テ扛たｖＪ（Ｉｄ’）ｋ用いて行うこと
もできる。さらに第１図で用いた試楽鎖（Ｌ′およびＩ
）ｌたは第２図で用いたもの（Ｌ′およびＩ）を用いて
、試料全Ｌ′に対して相補的でありかつＩと競合する被
分析体鎖Ａｎについて同時に分析することもできる（こ
のアッセイ法もより広い使用範囲をもつが、感度は低い
）。
び選択性が得られるならば、置屋化可能な鎖（Ｉ′〕の
代わりに固定化テ扛たｖＪ（Ｉｄ’）ｋ用いて行うこと
もできる。さらに第１図で用いた試楽鎖（Ｌ′およびＩ
）ｌたは第２図で用いたもの（Ｌ′およびＩ）を用いて
、試料全Ｌ′に対して相補的でありかつＩと競合する被
分析体鎖Ａｎについて同時に分析することもできる（こ
のアッセイ法もより広い使用範囲をもつが、感度は低い
）。
第５図は６本の被分析体鎖Ａｎ （ＡＤＺ、〜Ａｎ６）
、１本の相補的標識鎖Ｌ′、および２本の競合的な固定
化可能な鎖ハおよびＩ２ 全位相幾何学的に示す。
、１本の相補的標識鎖Ｌ′、および２本の競合的な固定
化可能な鎖ハおよびＩ２ 全位相幾何学的に示す。
これらについて、第１図の場合と同様な抑制アッセイに
用いるために以下に述べる。その際予想されるすべての
Ａｎ鎖の量よりも過剰のＬ′を用い、かつＬ′鎖よりも
過剰のＩ知を用いる。
用いるために以下に述べる。その際予想されるすべての
Ａｎ鎖の量よりも過剰のＬ′を用い、かつＬ′鎖よりも
過剰のＩ知を用いる。
伎分析体鎖Ａｎ、〜Ａｎ、、はすべて配列ＴＮＳ全体を
含む。仮分析体鎖Ａｎ、は配列ＴＮＳの一部ＴＮＳｂの
みを含む。標識鎖Ｌ′はＴＨＥすべてに刈（７相桶的な
対合セグメントＰＳ′ 全含む。従って過剰の標識鎖
Ｌ′はＴＮＳ／Ｐ、Ｓ”二本鎖セグメント＝ｉ含むハイ
ブリッド’ｌＡｎ、１〜Ａ、ｎ５ と共に形成するであ
ろう。Ａｎ６はＴＮＳ ｂ領域においてＬ′とハイブリ
ッドを形成し、その際ＰＳ′ の相補的部分ＰＳｂ′
に結合しているが、ＰＨ１の他の部分ＰＳａ′は一本鎖
の形である。
含む。仮分析体鎖Ａｎ、は配列ＴＮＳの一部ＴＮＳｂの
みを含む。標識鎖Ｌ′はＴＨＥすべてに刈（７相桶的な
対合セグメントＰＳ′ 全含む。従って過剰の標識鎖
Ｌ′はＴＮＳ／Ｐ、Ｓ”二本鎖セグメント＝ｉ含むハイ
ブリッド’ｌＡｎ、１〜Ａ、ｎ５ と共に形成するであ
ろう。Ａｎ６はＴＮＳ ｂ領域においてＬ′とハイブリ
ッドを形成し、その際ＰＳ′ の相補的部分ＰＳｂ′
に結合しているが、ＰＨ１の他の部分ＰＳａ′は一本鎖
の形である。
ここで、ＰＨ１に対し相補的な対合セグメントｐｓを宮
む１１ を添加すると、過剰の（完全に一季鎖状の）
Ｌ′鎖はすべてＩ、ＶＣ紹合するであろう（次いで固定
化されるであろう）。核合体Ａｎ６Ｌ’は置換反応され
、ハ がＬ′のｐｓａ’に結合し、次いでＡｎ６はポリ
ヌクレオチド分枝移行によりＰＳｂ’から直換さ扛る（
シー・グリーン３よびＣ，ヂベッッ、ヌクレイツク・ア
シッヅ・リサーチ、９巻、４８．１．９０５−１８頁（
１９８１年）および米国特許出願第６０７，８８５号明
細書に記載）。従って試薬鎖Ｌ′および７１ ｋ用いる
アッセイ法はＡｎ、〜Ａ、ｎ５を表わす値を与えるが（
一般に）Ａｎ６を示さない（ＡｎｏをＰＳ ｂ’に結合
した状態に維持し、１１ をｐｓａ’に結合させない）
・イブリッド形成条件を第２工程について選ばない限り
）。
む１１ を添加すると、過剰の（完全に一季鎖状の）
Ｌ′鎖はすべてＩ、ＶＣ紹合するであろう（次いで固定
化されるであろう）。核合体Ａｎ６Ｌ’は置換反応され
、ハ がＬ′のｐｓａ’に結合し、次いでＡｎ６はポリ
ヌクレオチド分枝移行によりＰＳｂ’から直換さ扛る（
シー・グリーン３よびＣ，ヂベッッ、ヌクレイツク・ア
シッヅ・リサーチ、９巻、４８．１．９０５−１８頁（
１９８１年）および米国特許出願第６０７，８８５号明
細書に記載）。従って試薬鎖Ｌ′および７１ ｋ用いる
アッセイ法はＡｎ、〜Ａ、ｎ５を表わす値を与えるが（
一般に）Ａｎ６を示さない（ＡｎｏをＰＳ ｂ’に結合
した状態に維持し、１１ をｐｓａ’に結合させない）
・イブリッド形成条件を第２工程について選ばない限り
）。
しかし標識鎖Ｌ′の対合セグメントＰＳのＰｓｂ’部分
に対してのみ各Ａｎ鎖と競合する固定化可能な鎖Ｉ２
を用いると、Ａｎ、〜Ａｎ、を表わす値が得られるで
あろう。
に対してのみ各Ａｎ鎖と競合する固定化可能な鎖Ｉ２
を用いると、Ａｎ、〜Ａｎ、を表わす値が得られるで
あろう。
目的とする配列が釦Ｌ′のセグメントＰＳ’ に対し
て相補的である場合、固定化ｏＪ能な鎖１１ の配列に
対して相補的でない隣接配列Ａ ５１１６よびＡｓ２を
Ｌ′のＰＨ１の両側に選ぶことがきわめて好ましい。こ
れらの条件はＩ、ＶＣついて（図示されるように）鎖１
１ の５′末端をＰＳの５′末端とすることにより、か
つ鎖Ｌ′の配列ＡＳ２に対し異質の隣接配列ＡＳ３をｐ
ｓの隣りに設けることにより満たされる。
て相補的である場合、固定化ｏＪ能な鎖１１ の配列に
対して相補的でない隣接配列Ａ ５１１６よびＡｓ２を
Ｌ′のＰＨ１の両側に選ぶことがきわめて好ましい。こ
れらの条件はＩ、ＶＣついて（図示されるように）鎖１
１ の５′末端をＰＳの５′末端とすることにより、か
つ鎖Ｌ′の配列ＡＳ２に対し異質の隣接配列ＡＳ３をｐ
ｓの隣りに設けることにより満たされる。
第５図から一般化すると、標識付き第１ポリヌクレオチ
ドが％足のセグメント中の標的ヌクレオチド配列に相補
的である場合、固定化可能な才たは固定化された第２ポ
リヌクレオチドは特定のセグメントの部分集合（すなわ
ちこのセグメントと等しいか、またはこれよりも小さく
これに含まれる）である配列において標識ポリヌクレオ
チドに対し相補的でなければならない。 ′しかし
鎖Ｌ′、ＡｎおよびＩを同時に競合反応させる場合（順
次反応させ、Ｉを最後に添加するのではなく）、Ｉの対
合セグメントは標的ヌクレオチド（χ列の大きさよりも
小をいことが好寸しい（同じではなく）。従って、第５
図の鎖Ｌ′およびＩ２ を用いて競合型アッセイ法にお
いてＡｎ、〜Ａｎ、を検出する場合、目的とするＡｎＬ
’ハイブリッドは２種の機構により生成する可能性があ
る。
ドが％足のセグメント中の標的ヌクレオチド配列に相補
的である場合、固定化可能な才たは固定化された第２ポ
リヌクレオチドは特定のセグメントの部分集合（すなわ
ちこのセグメントと等しいか、またはこれよりも小さく
これに含まれる）である配列において標識ポリヌクレオ
チドに対し相補的でなければならない。 ′しかし
鎖Ｌ′、ＡｎおよびＩを同時に競合反応させる場合（順
次反応させ、Ｉを最後に添加するのではなく）、Ｉの対
合セグメントは標的ヌクレオチド（χ列の大きさよりも
小をいことが好寸しい（同じではなく）。従って、第５
図の鎖Ｌ′およびＩ２ を用いて競合型アッセイ法にお
いてＡｎ、〜Ａｎ、を検出する場合、目的とするＡｎＬ
’ハイブリッドは２種の機構により生成する可能性があ
る。
第１に遊離Ａｎ鎖が遊離Ｌ′鎖とハイブリッド形成して
ＡｎＬ’ハイブリッド（これは安定であろう）を形成す
る可能性がある。第２に、多数のＩＬ’ハイブリッドが
形成されたのち、遊離Ａｎ鎖がＩＬ’・ ハイブリッド
に接触する可能性がある。Ａｎ鎖は鎖Ｌ′のＰＳａ、′
領域（この領域＆’！ＩＬ’ハイブリッド中で一本鎖で
ある〕に結合し、次いでＩ２ 鎖を領域ＰＳ ｂ’から
直換してＡｎＬ’ハイブリッドが形成さ詐る可能性があ
る。このような競合様式に固定化可能な鎖ハ を用いる
ことは、この第２の機構が起こり得なくなり、従って有
意の感度が失われるので好１しぐない。
ＡｎＬ’ハイブリッド（これは安定であろう）を形成す
る可能性がある。第２に、多数のＩＬ’ハイブリッドが
形成されたのち、遊離Ａｎ鎖がＩＬ’・ ハイブリッド
に接触する可能性がある。Ａｎ鎖は鎖Ｌ′のＰＳａ、′
領域（この領域＆’！ＩＬ’ハイブリッド中で一本鎖で
ある〕に結合し、次いでＩ２ 鎖を領域ＰＳ ｂ’から
直換してＡｎＬ’ハイブリッドが形成さ詐る可能性があ
る。このような競合様式に固定化可能な鎖ハ を用いる
ことは、この第２の機構が起こり得なくなり、従って有
意の感度が失われるので好１しぐない。
同様な理由から、固定化されたまたは固定化可能な第１
ポリヌクレオチドの各セグメントに対して仮分析体鎖と
競合する標識付き第２ポリヌクレオチドを用いる芙施態
様（第３図Ｓよび第４図の場合）が優位となるであろう
。Ｌ／Ｉ’またはＬ／Ｉｄ’の相補領域はＡｎ／Ｉ’ま
たはＡｎ／Ｉｔｌ’相補領域の部分果合とすべきである
。
ポリヌクレオチドの各セグメントに対して仮分析体鎖と
競合する標識付き第２ポリヌクレオチドを用いる芙施態
様（第３図Ｓよび第４図の場合）が優位となるであろう
。Ｌ／Ｉ’またはＬ／Ｉｄ’の相補領域はＡｎ／Ｉ’ま
たはＡｎ／Ｉｔｌ’相補領域の部分果合とすべきである
。
各図は単一の標的ヌクレオチド配列を構出するための実
施態様を示すが、２種以上のあらがじめボめられた標的
ヌクレオチド配列を同時に１莢出するために不発明の方
法およびキット金用いることもできる。たとえば第１図
の弐ケ用いると、試料全数種の異なる標識付きプローブ
ポリヌクレオチドＬ′と接触させる。これらはそれぞれ
標別横田できるタグをもち、それぞｆあらがしめボめら
れた標的ヌクンオチド配列に対し相補的な結合′Ｉｉ口
域をもつ。次いで反応混合物を対応する数量よりも過剰
の固定化可能なポリヌクレオチドＩと接触させる。これ
らはそれぞれビオチン部分をもち、かつそれぞれ標識プ
ローブポリヌクレオ芋ドＬ′のうち１種の結合領域に対
し相補的な結合領域をもつ。
施態様を示すが、２種以上のあらがじめボめられた標的
ヌクレオチド配列を同時に１莢出するために不発明の方
法およびキット金用いることもできる。たとえば第１図
の弐ケ用いると、試料全数種の異なる標識付きプローブ
ポリヌクレオチドＬ′と接触させる。これらはそれぞれ
標別横田できるタグをもち、それぞｆあらがしめボめら
れた標的ヌクンオチド配列に対し相補的な結合′Ｉｉ口
域をもつ。次いで反応混合物を対応する数量よりも過剰
の固定化可能なポリヌクレオチドＩと接触させる。これ
らはそれぞれビオチン部分をもち、かつそれぞれ標識プ
ローブポリヌクレオ芋ドＬ′のうち１種の結合領域に対
し相補的な結合領域をもつ。
反応混合物を固定化アビモノ衝たはストレプトアビジン
カラムに通してＩＬ’ハイブリッド（および遊離Ｉ鎖）
を捕捉したのち、溶出液を各種の識別可能なタグ、たと
えば識別０Ｔｆｆ目な螢光タグ、識別しうる別個の反応
を触媒する酵素、シンチレーション計数により解像しう
る異種の放射性同位体、ｆ、たは異なる型のタグの組合
わせにつきアッセイする。
カラムに通してＩＬ’ハイブリッド（および遊離Ｉ鎖）
を捕捉したのち、溶出液を各種の識別可能なタグ、たと
えば識別０Ｔｆｆ目な螢光タグ、識別しうる別個の反応
を触媒する酵素、シンチレーション計数により解像しう
る異種の放射性同位体、ｆ、たは異なる型のタグの組合
わせにつきアッセイする。
実 施 例 １：競合アッセイ法
塩基２７個のオリゴマー５’−ＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＧ
ＴＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣ（ここでは２７ ｍ
ｅｒと呼ぶ）を末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
エラーゼ（ＩＢＩより）によりその３′末端においてビ
オチン−１１−ｄＵＴＰ（ＢＥＬより）で延長した。８
６％の分子に少なくとも２個のビオチニル化ヌクレオチ
ドのテイルが形成された。この生成物の精製は行わなか
った。このオリゴマーの相補体５’−ＧＡＴＣＡＴＧＧ
ＣＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧ（以下抗−２
７ｍｅｒと呼ぶ）をその５′末端においてｒ”Ｐ−ＡＴ
Ｐで比放射能２．５ ｘ １０７ｃｐｍ／ｐｆｌとなる
ように標識した。これらの配列の等モル量をハイブリッ
ド形成させたところすべての標識２７ ｍａｒが二本鎖
Ｄ Ｎ Ａ ＶＣ取込１れた（データは示されていない
〕。一連の反応において一定量の標識抗−２７ｍｅｒ
（０，２ｐｍｏ１） （ｊｐ識プローブ）を種々の量の
無標識抗−２ｒ７ｍａｒ（９分析体）と混合し、ハイブ
リッド形成させた（５００．３０分８．３７７＋、＆）
リス、ｐＨ８，１，０，８３ｒｎＭ−ＥＤＴＡｌｌ ６
６ ｍｕ−ＮａＣｔ 中、総容積１２ ｐｔ）。その際
約０．２ｒ ｐｍｏＬのビオチニル化２７ ｍａｒ（固
定化可能なポリヌクレオチド）を同時に存在させた。各
ハイブリッド形成反応混合物の半量を１５％ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動した（３５０Ｖ、２時間）。
ＴＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣ（ここでは２７ ｍ
ｅｒと呼ぶ）を末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
エラーゼ（ＩＢＩより）によりその３′末端においてビ
オチン−１１−ｄＵＴＰ（ＢＥＬより）で延長した。８
６％の分子に少なくとも２個のビオチニル化ヌクレオチ
ドのテイルが形成された。この生成物の精製は行わなか
った。このオリゴマーの相補体５’−ＧＡＴＣＡＴＧＧ
ＣＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧ（以下抗−２
７ｍｅｒと呼ぶ）をその５′末端においてｒ”Ｐ−ＡＴ
Ｐで比放射能２．５ ｘ １０７ｃｐｍ／ｐｆｌとなる
ように標識した。これらの配列の等モル量をハイブリッ
ド形成させたところすべての標識２７ ｍａｒが二本鎖
Ｄ Ｎ Ａ ＶＣ取込１れた（データは示されていない
〕。一連の反応において一定量の標識抗−２７ｍｅｒ
（０，２ｐｍｏ１） （ｊｐ識プローブ）を種々の量の
無標識抗−２ｒ７ｍａｒ（９分析体）と混合し、ハイブ
リッド形成させた（５００．３０分８．３７７＋、＆）
リス、ｐＨ８，１，０，８３ｒｎＭ−ＥＤＴＡｌｌ ６
６ ｍｕ−ＮａＣｔ 中、総容積１２ ｐｔ）。その際
約０．２ｒ ｐｍｏＬのビオチニル化２７ ｍａｒ（固
定化可能なポリヌクレオチド）を同時に存在させた。各
ハイブリッド形成反応混合物の半量を１５％ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動した（３５０Ｖ、２時間）。
遊離抗−２７ｍ、ｅｒＳよびビオチニル化２７ ｍａｒ
とハイブリッド形成した抗−２７・ｍａｒに対応するバ
ンドをオー（・ラジオグラフィーにより位置調べし、切
り取り、セレ／コフ勝により計数した。残りの半量を少
量の２Ｘｓｓｃ、 ０．１％ＳＤＳ中に入れ、シリコ
ナイズしたピペット先端中に８０μｔのスラリー金柑い
て作成したアビジン−アガロース（シグマ）カラムに施
した。非結合標識全量じ緩衝液９００μｔで溶離した。
とハイブリッド形成した抗−２７・ｍａｒに対応するバ
ンドをオー（・ラジオグラフィーにより位置調べし、切
り取り、セレ／コフ勝により計数した。残りの半量を少
量の２Ｘｓｓｃ、 ０．１％ＳＤＳ中に入れ、シリコ
ナイズしたピペット先端中に８０μｔのスラリー金柑い
て作成したアビジン−アガロース（シグマ）カラムに施
した。非結合標識全量じ緩衝液９００μｔで溶離した。
カラム３よび俗出液それぞれの放射能の量を測定した。
後記に示す結果はアビジンカラムがゲルから得たものと
一致するデータを与え、従ってビオチニル化ＤＮＡとハ
イブリッド形成した標識抗−２７ｍｅｒの定食に採用で
きること全確認した。これらは葦た、競合する”試料”
ＤＮＡの任７：ＥＫよりカラムを通過する標識の量が増
加することを証明する。
一致するデータを与え、従ってビオチニル化ＤＮＡとハ
イブリッド形成した標識抗−２７ｍｅｒの定食に採用で
きること全確認した。これらは葦た、競合する”試料”
ＤＮＡの任７：ＥＫよりカラムを通過する標識の量が増
加することを証明する。
コールド抗−２７ｍａｒの不在下（被分析体なし）では
１３％の標識抗−２７ｍａｒ鎖がカラムを通過する点を
留意されたい。これはこの実験において得られる最大保
持率の水準であり、見掛けのビオチニル化”捕捉用″２
７ ｍ、ｅγ分子の１４％にビオチンテイルが存在しな
い場合に一致する。従って、オリゴマー１個に２個寸た
はそれ以上のビオチニル化ｄＵＴＰを付加することがこ
れをアビジン−アガロースに結合させるのに十分である
と結論てれる。
１３％の標識抗−２７ｍａｒ鎖がカラムを通過する点を
留意されたい。これはこの実験において得られる最大保
持率の水準であり、見掛けのビオチニル化”捕捉用″２
７ ｍ、ｅγ分子の１４％にビオチンテイルが存在しな
い場合に一致する。従って、オリゴマー１個に２個寸た
はそれ以上のビオチニル化ｄＵＴＰを付加することがこ
れをアビジン−アガロースに結合させるのに十分である
と結論てれる。
表 １
０．１ １９６ ５ ９９６ １８０
．２ ９９８ ２３ １８６０ ３００．
４ ２８３６ ５６ ３３３１ ５７０．８
３６３２ ７１ ４８４０ ７４１．０
４３９０ ７５ ４３２４ ７８２．０
５１２８ ８１ ５２９６ ８９＊ 下方のバ
ンドのｃｐｍ／Ｃ上方２よび下方のバンドのｃｐｍ） ＊＊ 溶出ｃｐｒｒＬ／（溶出Ｃｐｍ’：Ｆ６よびカラ
ム中のｃ ｐ ｍ ） １ 分析のために三等分する前に反応液全体に添加され
たコールド抗−２７ｍｅγのｐｍｏＬ実 施 例 ２：
抑制アツ＋イ法（第４図参照）実施例１に記載した実験
を線返し、下記の変更を含む２組の試験管を用いた。第
１の場合のようにビオチニル化２７ ｍｅｒを標識プロ
ーブおよび無標識試料（共に抗−２７ｍａｒ ）の双方
と同時に供給する代わりに、被分析体（無標識）抗−２
７ｍｅｒをビオチニル化−２７ｍｅｒと３０分間反応さ
せりのち、標識プローブ抗−２７ｍａｒを姫加し、この
時点で式らに３０分間ハイブリッド形成を続けた。
．２ ９９８ ２３ １８６０ ３００．
４ ２８３６ ５６ ３３３１ ５７０．８
３６３２ ７１ ４８４０ ７４１．０
４３９０ ７５ ４３２４ ７８２．０
５１２８ ８１ ５２９６ ８９＊ 下方のバ
ンドのｃｐｍ／Ｃ上方２よび下方のバンドのｃｐｍ） ＊＊ 溶出ｃｐｒｒＬ／（溶出Ｃｐｍ’：Ｆ６よびカラ
ム中のｃ ｐ ｍ ） １ 分析のために三等分する前に反応液全体に添加され
たコールド抗−２７ｍｅγのｐｍｏＬ実 施 例 ２：
抑制アツ＋イ法（第４図参照）実施例１に記載した実験
を線返し、下記の変更を含む２組の試験管を用いた。第
１の場合のようにビオチニル化２７ ｍｅｒを標識プロ
ーブおよび無標識試料（共に抗−２７ｍａｒ ）の双方
と同時に供給する代わりに、被分析体（無標識）抗−２
７ｍｅｒをビオチニル化−２７ｍｅｒと３０分間反応さ
せりのち、標識プローブ抗−２７ｍａｒを姫加し、この
時点で式らに３０分間ハイブリッド形成を続けた。
次いで谷試料の半分を′電気泳動処理し、切り取り、カ
ウントし、他方の半分を実施例１に記載したと同様に８
０μｔのアビジン−アガローススラリーカラムに施した
。アビジンの結果のみ全以下に示す。二工程ハイブリッ
ド形成法の感度が増大することは、たとえば等モル量の
コールド（試料）抗２７ ｍｅｒ−ｊ６よび標識（プロ
ーブ）抗−２７ｍ６ｒの存在下で証明された。その際同
時にビオチニル化２７ｍｅｒに供給する場合は標識分子
の半量がノ・イブリッド形成を行わなかったが、無標識
試料を１ずハイブリッド形成させる場合はほぼすべてが
／％イブリッド形成されなかった。
ウントし、他方の半分を実施例１に記載したと同様に８
０μｔのアビジン−アガローススラリーカラムに施した
。アビジンの結果のみ全以下に示す。二工程ハイブリッ
ド形成法の感度が増大することは、たとえば等モル量の
コールド（試料）抗２７ ｍｅｒ−ｊ６よび標識（プロ
ーブ）抗−２７ｍ６ｒの存在下で証明された。その際同
時にビオチニル化２７ｍｅｒに供給する場合は標識分子
の半量がノ・イブリッド形成を行わなかったが、無標識
試料を１ずハイブリッド形成させる場合はほぼすべてが
／％イブリッド形成されなかった。
衣 ２
０．１ ３６ ６６０．２’
５２ ９２０．４
６３ ９３０．８ ７０
９５１．０ ８６ ９
８１ 反応液全体に添加したコールド抗−２７ｍａｒの
ｐｍｏＬ 実 施 例 ３：抑制アラ士イ法（Ｑ” Ｉ ＩＡ参照
）ＤＮＡオリゴマーの構造は実施例１に記載でれたもの
であるが、標識抗−２７ｍｅｒＯ比放射能は］、、 ７
Ｘ １０７ｃｐｒｎ／μＪであった。以下に示す本実
施例に８いては一定量（０，２ｐｍｏｌ ）の抗−２７
ｍｅγ（標識プローブ）を種々の量のコールド２７ｍｅ
γ（試料または被分析体）と実施例１に記載した条件下
で３０分間ハイブリッド形成はせた。次いで、標識プロ
ーブに対する捕捉剤として作用する過剰の（０，４ｐｍ
ｏｌ ）ビオチニル化２７ ｍａｒ（ｂｉｏ−２７ｍｅ
ｒ）を添加し、３０分間ハイブリッド形成を絖けた。次
いで、得られた試料の半量をアビジン−アガロース（実
施例■参照）に施し、分離生成物をカウントした。後記
のアビジンカラムのデータは存在する試料の量が増加す
ると、カラムから排出はれる標識プローブがＭ７１０す
ることを示した。ポリアクリルアミドゲルのオートラジ
オグラフィー（データは示きれていない）により、試料
の蛍が増加するのに伴って二本鎖２７ｍｅｒと共に移行
するカウントの割合が増加し、一方ｂｉ。
５２ ９２０．４
６３ ９３０．８ ７０
９５１．０ ８６ ９
８１ 反応液全体に添加したコールド抗−２７ｍａｒの
ｐｍｏＬ 実 施 例 ３：抑制アラ士イ法（Ｑ” Ｉ ＩＡ参照
）ＤＮＡオリゴマーの構造は実施例１に記載でれたもの
であるが、標識抗−２７ｍｅｒＯ比放射能は］、、 ７
Ｘ １０７ｃｐｒｎ／μＪであった。以下に示す本実
施例に８いては一定量（０，２ｐｍｏｌ ）の抗−２７
ｍｅγ（標識プローブ）を種々の量のコールド２７ｍｅ
γ（試料または被分析体）と実施例１に記載した条件下
で３０分間ハイブリッド形成はせた。次いで、標識プロ
ーブに対する捕捉剤として作用する過剰の（０，４ｐｍ
ｏｌ ）ビオチニル化２７ ｍａｒ（ｂｉｏ−２７ｍｅ
ｒ）を添加し、３０分間ハイブリッド形成を絖けた。次
いで、得られた試料の半量をアビジン−アガロース（実
施例■参照）に施し、分離生成物をカウントした。後記
のアビジンカラムのデータは存在する試料の量が増加す
ると、カラムから排出はれる標識プローブがＭ７１０す
ることを示した。ポリアクリルアミドゲルのオートラジ
オグラフィー（データは示きれていない）により、試料
の蛍が増加するのに伴って二本鎖２７ｍｅｒと共に移行
するカウントの割合が増加し、一方ｂｉ。
−２７ｍｅｒとの二本鎖として移行するものは減少する
ことが示された。従ってアビジンカラムから・ のプロ
ーブの排出は、試料が標識プローブにハイブリッド形成
し、その後のｂｉｏ −２７ｒｎｅｒ とのノ＼イブ
リッド形成から、壕だ後続のアビジン分離から標識プロ
ーブが隔離されることによる。
ことが示された。従ってアビジンカラムから・ のプロ
ーブの排出は、試料が標識プローブにハイブリッド形成
し、その後のｂｉｏ −２７ｒｎｅｒ とのノ＼イブ
リッド形成から、壕だ後続のアビジン分離から標識プロ
ーブが隔離されることによる。
表 ３
コールド２７ｍｅｒ アビジンカラムＱ
９８８ １６０．０１ ９８
２ １５０．０２ １７３０
２７０．０４ ２３７０ ４２０．０６
２９１．５ ５２０．１ ３
４９７ ８６０．２ ３９３４
９２実 施 例 ４：抑制アッセイ法（第１図参照
）大型の試料ＤＮＡおよび複雑な配列によりアビジンカ
ラムへのプローブの結合が抑制されることを示すために
、実施例３に記載したと同様な実験を行った。標識付き
抗−２７ｍａｒ （０，２ｐｍｏＬ、比放射能ｌ、２
ｘ １０７ｃｐｍ／ｌ’＆ ）を棟々の量の一本鎖Ｍ１
３ｍｐ８またはＭｌ、３ ｍｐ８−２０とハイブリッ
ド形成させ、次いで０．４ｐｍｏｌのビオチニル化２７
ｍｅｒＫハイブリッド形成させた。２７ｍｅｒおよび抗
−２７ｍａｒオリゴマーは３４９−３７５の位置におい
て７＞ＢＲ３２２に等しい配列のものである。Ｍｌ３
ｍｐ８は抗−２７ｒｎｅｒと相同の配列を含まない。
９８８ １６０．０１ ９８
２ １５０．０２ １７３０
２７０．０４ ２３７０ ４２０．０６
２９１．５ ５２０．１ ３
４９７ ８６０．２ ３９３４
９２実 施 例 ４：抑制アッセイ法（第１図参照
）大型の試料ＤＮＡおよび複雑な配列によりアビジンカ
ラムへのプローブの結合が抑制されることを示すために
、実施例３に記載したと同様な実験を行った。標識付き
抗−２７ｍａｒ （０，２ｐｍｏＬ、比放射能ｌ、２
ｘ １０７ｃｐｍ／ｌ’＆ ）を棟々の量の一本鎖Ｍ１
３ｍｐ８またはＭｌ、３ ｍｐ８−２０とハイブリッ
ド形成させ、次いで０．４ｐｍｏｌのビオチニル化２７
ｍｅｒＫハイブリッド形成させた。２７ｍｅｒおよび抗
−２７ｍａｒオリゴマーは３４９−３７５の位置におい
て７＞ＢＲ３２２に等しい配列のものである。Ｍｌ３
ｍｐ８は抗−２７ｒｎｅｒと相同の配列を含まない。
７１／１３ ｍｐ８−２０はｍｐ８の誘導体であり、
？Ｃ１ＬＡＦ４）ＢＥ ３２２ｆ７）］、、］、 ｋｂ
Ｐｓ ｔ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片がその十鎖が抗−２
７ｍａｒに相補的（′！！：たは２７ ｍａｒに相同）
となる向きでクローニングされたものである。次いで各
試料の半量をアビジンカラムに供給しく実施例１参照）
、得られた谷画分をカウントした。残りの半量は１５％
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動処理した（３５０
Ｖ、２時間）。Ｍ１３／抗−２７ｍｅｒ”イブリッド（
上方）Ｓよびｂｉｏ−２７ｍｅｒ ／抗−２７ｍａｒハ
イブリッド（下方〕に相当する各バンドをオートラジオ
グラフィーにより位置決めし、切取り、カウントした。
？Ｃ１ＬＡＦ４）ＢＥ ３２２ｆ７）］、、］、 ｋｂ
Ｐｓ ｔ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片がその十鎖が抗−２
７ｍａｒに相補的（′！！：たは２７ ｍａｒに相同）
となる向きでクローニングされたものである。次いで各
試料の半量をアビジンカラムに供給しく実施例１参照）
、得られた谷画分をカウントした。残りの半量は１５％
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動処理した（３５０
Ｖ、２時間）。Ｍ１３／抗−２７ｍｅｒ”イブリッド（
上方）Ｓよびｂｉｏ−２７ｍｅｒ ／抗−２７ｍａｒハ
イブリッド（下方〕に相当する各バンドをオートラジオ
グラフィーにより位置決めし、切取り、カウントした。
以下に示す結果は、相同配列を含む一本ｆａＭ１３ＤＮ
ＡはアビジンカラムからプローブＤＮＡを排出ツセるに
つきオリゴマーＤＮＡと同様な効力をもつが、複雑な非
相同ＤＮＡは効力をもたないことを表わす。
ＡはアビジンカラムからプローブＤＮＡを排出ツセるに
つきオリゴマーＤＮＡと同様な効力をもつが、複雑な非
相同ＤＮＡは効力をもたないことを表わす。
表 ４
ｐ８−２０
０ １１０ ５ ８１５ １．６０
、Ｉ ｌ９０９ ５］ ２５８８ ４０
０．２ ３８１３ ！Ｊ Ｏ３６５１９４０，
４４７８５９１５０８０９］ ０．８ ３７７９ ９］ ５５１６ ９１
１．０ ４５０５ ９３ ／１２５８ ９
３２．０ ２９８５ ９３ ３８２７ ９３
３．０ ４３１９ ９４ ３９８５ ９５ｎ
ｐ８ ＯＮ、Ｄ、 ７３６ １６３、ＯＮ、
Ｄ、 １０７０ １６！ 量ばＯ，Ｄ、
測定に基づく推定であるが、（前記ＤＮＡすべてと同様
）、−不順ＤＮＡ製品は他の核酸系汚染物質を含■する
ことが知られている。
、Ｉ ｌ９０９ ５］ ２５８８ ４０
０．２ ３８１３ ！Ｊ Ｏ３６５１９４０，
４４７８５９１５０８０９］ ０．８ ３７７９ ９］ ５５１６ ９１
１．０ ４５０５ ９３ ／１２５８ ９
３２．０ ２９８５ ９３ ３８２７ ９３
３．０ ４３１９ ９４ ３９８５ ９５ｎ
ｐ８ ＯＮ、Ｄ、 ７３６ １６３、ＯＮ、
Ｄ、 １０７０ １６！ 量ばＯ，Ｄ、
測定に基づく推定であるが、（前記ＤＮＡすべてと同様
）、−不順ＤＮＡ製品は他の核酸系汚染物質を含■する
ことが知られている。
この量を反応全体に添加し、そのうち半量がアビジンカ
ラムに、他の半量はポリアクリルアミドゲルに供給され
た。
ラムに、他の半量はポリアクリルアミドゲルに供給され
た。
２ 上方のバンドのｃｐｍ／（上方および下方のバンド
のｃｐｍ） ３ 溶出ｃｐｍ／Ｃ溶出ｃｐｍ、およびカラム中のｃｐ
ｍ） Ｎ、Ｄ、：識別不能 実 施 例 ５：抑制アッセイ法における感度抗−２７
ｍｅｒ ｆ ５’末端において１３２Ｐ−ＡＴＰで比放
射能２．２ Ｘ Ｉ Ｏ８ｃｐｍ／ｐｌとなる葦で標識
した。この抗−２７ｍｅτ ０．ＩｐｍｏＬを種々の量
の”試料”２７ ｍａｒとハイブリッド形成させた（５
０℃、３０分、１０ ｍＭ ）リス、ｐＨ８，１，１
ｍＭ・ＥＤＴＡ、 ２００ｍＭ−ＮａＣ１甲、１ｏμ
ｔ）。得られた溶液のうち１μｔ（全体の１０分の１）
を次いで同じ条件下でビオチニル化２７ｍａｒ（約０、
０３ ｐｍｏｌ ）とハイブリッド形成させ、得られた
試料５μｔ（全体の２分の１）を前記谷側に記載したと
同様にアビジンカラムに供給した。このビオチンテイル
付き２７ｍａｒ％製品は約２０％の無テイル分子を含ん
でいた。下記の結果は０．５フ工ムトモル程度の少量の
試料をこの系で明瞭に検出しうろことを示す。ティルな
しの”捕捉”用分子によるバンクグラウンドが除かれて
いないこの場合ですら、プローブの％０の濃度で存在す
る試料が検出された。
のｃｐｍ） ３ 溶出ｃｐｍ／Ｃ溶出ｃｐｍ、およびカラム中のｃｐ
ｍ） Ｎ、Ｄ、：識別不能 実 施 例 ５：抑制アッセイ法における感度抗−２７
ｍｅｒ ｆ ５’末端において１３２Ｐ−ＡＴＰで比放
射能２．２ Ｘ Ｉ Ｏ８ｃｐｍ／ｐｌとなる葦で標識
した。この抗−２７ｍｅτ ０．ＩｐｍｏＬを種々の量
の”試料”２７ ｍａｒとハイブリッド形成させた（５
０℃、３０分、１０ ｍＭ ）リス、ｐＨ８，１，１
ｍＭ・ＥＤＴＡ、 ２００ｍＭ−ＮａＣ１甲、１ｏμ
ｔ）。得られた溶液のうち１μｔ（全体の１０分の１）
を次いで同じ条件下でビオチニル化２７ｍａｒ（約０、
０３ ｐｍｏｌ ）とハイブリッド形成させ、得られた
試料５μｔ（全体の２分の１）を前記谷側に記載したと
同様にアビジンカラムに供給した。このビオチンテイル
付き２７ｍａｒ％製品は約２０％の無テイル分子を含ん
でいた。下記の結果は０．５フ工ムトモル程度の少量の
試料をこの系で明瞭に検出しうろことを示す。ティルな
しの”捕捉”用分子によるバンクグラウンドが除かれて
いないこの場合ですら、プローブの％０の濃度で存在す
る試料が検出された。
表 ５
０ １、 ＯＯＯ２２
０，０００２５１２６６２５
０，０００５１４６３４４
０，００１２７４４５９
０，００２２４５４，７４
０，００５＊” ３６６４ ８８０．０１
４６５４ ９５１ カラムに添加した
量（もとの×。）中に存在するコールド２７ ｍｅｒの
ｐｍｏＬｏこれは抗−２７ｍｅｒプローブプローブ試薬
５ ｐｍｏｔを含有していた。
４６５４ ９５１ カラムに添加した
量（もとの×。）中に存在するコールド２７ ｍｅｒの
ｐｍｏＬｏこれは抗−２７ｍｅｒプローブプローブ試薬
５ ｐｍｏｔを含有していた。
２ 溶出ｃｐｍ／溶出Ｑｐｍ およびカラム甲のｐｍ
＊＊ 等モル重の標識プローブ：被分析体実施例６εよ
び７゜ これら２種の実験ＶＣ′ｊ６いてはヒ）ＤＮＡにおける
特異的ＤＮＡ配列を検出した。過剰の放射性標識付き一
本鎖ＤＮＡプローブ分子を寸ず溶液中でゲノムＤＮＡ断
片にハイブリッド形成さぜた。十分なハイブリッド形成
期間後に、過剰の一本領Ｍ１３制型ＤＮＡ （プローブ
ＤＮＡに相補的である）を反応液に添加した。被分析体
１）ＨＡにハイブリッド形成していないプローブ分子は
その際Ｍ１３鋳型ＤＮＡにハイブリッド形成した。標識
プローブ−Ｍ１３鋳型鋳型体からの標識ブローブー破分
析体複合体の分離は、アクリルアミドゲル上での電気泳
動により行われた。７１／１３鋳型−プローブ複合体は
ゲルの上部に質重り、一方プローブー級分析体複合体は
ゲルの内部に育で十分に電気泳動でれた。最適条件下で
は、構出可能な過剰のプローブＤＮＡはＭ１３鋳型ＤＮ
Ａへのハイブリッド形成により除かれた。これらの条件
下では、過剰のプローブ試薬を標識付き被分析体複合体
から完全に分離するために単純なゲル電気泳動で十分で
ある。
び７゜ これら２種の実験ＶＣ′ｊ６いてはヒ）ＤＮＡにおける
特異的ＤＮＡ配列を検出した。過剰の放射性標識付き一
本鎖ＤＮＡプローブ分子を寸ず溶液中でゲノムＤＮＡ断
片にハイブリッド形成さぜた。十分なハイブリッド形成
期間後に、過剰の一本領Ｍ１３制型ＤＮＡ （プローブ
ＤＮＡに相補的である）を反応液に添加した。被分析体
１）ＨＡにハイブリッド形成していないプローブ分子は
その際Ｍ１３鋳型ＤＮＡにハイブリッド形成した。標識
プローブ−Ｍ１３鋳型鋳型体からの標識ブローブー破分
析体複合体の分離は、アクリルアミドゲル上での電気泳
動により行われた。７１／１３鋳型−プローブ複合体は
ゲルの上部に質重り、一方プローブー級分析体複合体は
ゲルの内部に育で十分に電気泳動でれた。最適条件下で
は、構出可能な過剰のプローブＤＮＡはＭ１３鋳型ＤＮ
Ａへのハイブリッド形成により除かれた。これらの条件
下では、過剰のプローブ試薬を標識付き被分析体複合体
から完全に分離するために単純なゲル電気泳動で十分で
ある。
実 施 例 ６：ヒ）ＤＮＡ中のファクター■遺伝子か
らの６００塩基対Ｘｂα ■−Ｐｓｔ ■制限断片の検
出 女性供血者から分離したヒｌ−ＤＮＡ ５０７１ｇをＸ
ｂａ ＩおよびＰｓｆ、ＶＩＣより完全に消化した。消
化後にＤＮＡをフェノール′８にびクロロホルムで抽出
し、エタノールで沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭトリス、ｐ
Ｈ８，０、Ｉ ｍＷ−ＥＤＴＡ ）５０ Ｉｌｌに再懸
濁した。
らの６００塩基対Ｘｂα ■−Ｐｓｔ ■制限断片の検
出 女性供血者から分離したヒｌ−ＤＮＡ ５０７１ｇをＸ
ｂａ ＩおよびＰｓｆ、ＶＩＣより完全に消化した。消
化後にＤＮＡをフェノール′８にびクロロホルムで抽出
し、エタノールで沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭトリス、ｐ
Ｈ８，０、Ｉ ｍＷ−ＥＤＴＡ ）５０ Ｉｌｌに再懸
濁した。
ヒトファクター■遺伝子の一部を含むＡｆ１３クローン
は、６００塩基対Ｘｂａ−Ｉ Ｐｓｔ Ｉ断片をイ
ントロン１３からＭ１３ヘタダーｍｐ１０ヘサブクロー
ニングすることにより作成された。このクローンはｍｐ
ｌｏ 、Ｆ８ＸｂＰｓｔ２．６と命名された（ジエイ・
ジェイ・ラーンら、（１９８４年）ネイチャー３１２：
３４２−３４７およびジエイ・ギツチェルら（１９８４
年）ネイチャー３１２：３２６−３３０をファクター■
■遺伝子のマツプおよびクローニングに関して参照テ扛
だい）。
は、６００塩基対Ｘｂａ−Ｉ Ｐｓｔ Ｉ断片をイ
ントロン１３からＭ１３ヘタダーｍｐ１０ヘサブクロー
ニングすることにより作成された。このクローンはｍｐ
ｌｏ 、Ｆ８ＸｂＰｓｔ２．６と命名された（ジエイ・
ジェイ・ラーンら、（１９８４年）ネイチャー３１２：
３４２−３４７およびジエイ・ギツチェルら（１９８４
年）ネイチャー３１２：３２６−３３０をファクター■
■遺伝子のマツプおよびクローニングに関して参照テ扛
だい）。
３２Ｐ標識付き一本鎖ＤＮＡプローブはこのＭ］、３鋳
型からプライマー延長により合成された。ｍｐｌｏ 、
Ｆ８ＸｂＰｓｔ６．２鋳型ＤＮＡ ０．５１１９１．
ＤＮＡ配列プライマー（ＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣ）１０ピコモル、１０ＸＤＮＡ合成用緩衝液
（１００ｍＭ−ＭｇＣｌ２．１００ｍＭトリス、 ｐＨ
８，０、５００ｍＭ−Ｎａｃ１）Ｌ５／１１，０．１５
Ｍ−ＤＴＴ Ｏ，５ｐｉ。
型からプライマー延長により合成された。ｍｐｌｏ 、
Ｆ８ＸｂＰｓｔ６．２鋳型ＤＮＡ ０．５１１９１．
ＤＮＡ配列プライマー（ＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣ）１０ピコモル、１０ＸＤＮＡ合成用緩衝液
（１００ｍＭ−ＭｇＣｌ２．１００ｍＭトリス、 ｐＨ
８，０、５００ｍＭ−Ｎａｃ１）Ｌ５／１１，０．１５
Ｍ−ＤＴＴ Ｏ，５ｐｉ。
３よび水５μｔをエツベンドルフ試験管中で混和し、煮
沸し、水浴中で３０分間放冷した。３２Ｐ−ｄＡＴＰ
（１０μＣｉ／μＬ；３０００Ｃｉ／ミリモル）４ｐｔ
、ミックス＋ ６ （０，２ｍＭ−ｃｌｃＴＰ、ｃｌＧ
ＴＰ。
沸し、水浴中で３０分間放冷した。３２Ｐ−ｄＡＴＰ
（１０μＣｉ／μＬ；３０００Ｃｉ／ミリモル）４ｐｔ
、ミックス＋ ６ （０，２ｍＭ−ｃｌｃＴＰ、ｃｌＧ
ＴＰ。
ｄＴＴＰ、Ｏ１］、−ｍＭ ｔｉＡＴＰ、ｌＸＤＮＡ
合成用緩衝液中）１μｍＳおよびＤＮＡポリメラーゼタ
レナウ（Ｋｌｅｎｏｖ）断片（ＥＲＬから約４単位）Ｉ
ｐｌを添加し、反応液を室温で３０分間インキュベート
した。次いで２回目のクレナウ断片ポリメラーゼ１μＬ
ｆ：添加し、反応液をさらに３０分間インキユヘートし
た。次いで試ｆ’ｌを１００ｍＷ−ＮａＣＬ、１０ｍＭ
”Ｐリス−１１ＣＩ−ｐＨ８，０，１０ｍＭ・ｕｇｃｔ
２．１００ｐＪ／ｍｅ ＢＳＡ、１６よび１ｒｎ、Ｍ
・ＤＤＴに調整し、Ｘｂａ Ｔで６０分間消化した。
合成用緩衝液中）１μｍＳおよびＤＮＡポリメラーゼタ
レナウ（Ｋｌｅｎｏｖ）断片（ＥＲＬから約４単位）Ｉ
ｐｌを添加し、反応液を室温で３０分間インキュベート
した。次いで２回目のクレナウ断片ポリメラーゼ１μＬ
ｆ：添加し、反応液をさらに３０分間インキユヘートし
た。次いで試ｆ’ｌを１００ｍＷ−ＮａＣＬ、１０ｍＭ
”Ｐリス−１１ＣＩ−ｐＨ８，０，１０ｍＭ・ｕｇｃｔ
２．１００ｐＪ／ｍｅ ＢＳＡ、１６よび１ｒｎ、Ｍ
・ＤＤＴに調整し、Ｘｂａ Ｔで６０分間消化した。
試料を０． Ｉ Ｎ−Ｎａ０ＩＩに調整し、これを６５
℃に１０分間加熱することによりＤＮＡ ｆ変性した。
℃に１０分間加熱することによりＤＮＡ ｆ変性した。
次いで一重鎖プローブをアルカリ性アガロースゲル（３
０ｍＭ−ＮａＯＨ，２，５ｍＭ−Ｎａ２ＥＤＴＡ中の２
％アガロース）中での電気泳動により精製し、プローブ
をＮＡ４．５膜（シュライヘル・アンド・シュル）Ｖ？
−よりゲルから溶離した。
０ｍＭ−ＮａＯＨ，２，５ｍＭ−Ｎａ２ＥＤＴＡ中の２
％アガロース）中での電気泳動により精製し、プローブ
をＮＡ４．５膜（シュライヘル・アンド・シュル）Ｖ？
−よりゲルから溶離した。
Ｘｂａ Ｉ−Ｐｓｉ ｌ消化ヒトＤＮＡを一本領複製
ヒ）ＤＮＡ配列に関して３５倍過剰のプローブＤＮＡに
ハイブリッド形成させた。ＤＮＡ５０μｙおよび１７，
０００セレンコフｃｐｍのプローブを合わせて３分間煮
沸し、６５℃で総容積１００μｔの０．３Ｍ−ＮａＣ１
および０．１７１／−）リスＨｃＬ１ｐＨ８，０中で一
夜ノ・イブリッド形成でせた。
ヒ）ＤＮＡ配列に関して３５倍過剰のプローブＤＮＡに
ハイブリッド形成させた。ＤＮＡ５０μｙおよび１７，
０００セレンコフｃｐｍのプローブを合わせて３分間煮
沸し、６５℃で総容積１００μｔの０．３Ｍ−ＮａＣ１
および０．１７１／−）リスＨｃＬ１ｐＨ８，０中で一
夜ノ・イブリッド形成でせた。
次いで試料を２０μｔずつの５アリコートに分割し、０
．１．０，２０．３０″！、たは６０ ｎｆＪのｍｐｌ
ｏ、Ｆ８ＸｂＰｓｔ６ ２ｉ１ｊ型ＤＮＡ （固定化可
能なプローブポリヌクレオチド、第１図の■に相当）を
各試験管に添加し、試料を６５℃テ１０分間インキュベ
ートした。次いで試料を尿素およびホルムアミドの濃度
勾配を含む６イ％アクリルアミドゲル上を走行感せ（ニ
ス・ジー・フィッシャーオヨヒエル・ニス・レルマン、
フロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス（ニー−ニス・ニー）、ＳＯ巻、１５
７９−１５８３頁（１９８３年）全ゲル系の記述に関し
て参照されたい）、ブローブー被分析複合体をＭｌＢｉ
型−プローブ複合体から分離した。仄いてゲルを乾燥さ
せ、オートラジオグラフィー処理し、走査した。各ピー
クを切取り、秤量した。結果を表６に提示する。このゲ
ルＶＣ′ｊ６いてプローブ−伎分析体複合体はゲル内へ
約５．５膜移行した鋭いピークを形成し、一方ハイブリ
ッド形成していないプローブはゲル内へ約６．３ ＣＩ
ｎ移行する。プローブ−Ｍ１３１Ｊ）４聖夜合体はゲル
の頂部に留まる。ハイブリッド形成後にＭｘ３６Ａ型Ｄ
ＮＡを添加しない場合、ノ・イブリッド形成していない
プローブのバックグラウンドがブローブー伎分析体バン
ドを一部穏し、ゲル走査において２本のバンドを区別で
きない。ＭＩ３鋳型（Ｉ）の添加量が増加するのに伴っ
て、ノ・イブリッド形成していないプローブからのバッ
クグラウンドが減少し、６０ｎｙの添加によって、被分
析体ＤＮＡにノ・イブリッド形成していない標識プロー
ブ分子の約９９％がＭ１３鋳型により（表６参照）ＩＬ
／として捕捉される。Ｍ１３鋳型の添加量が増加するの
に伴って、標識プローブ−被分析体（Ａｎ、Ｌ’）から
の信号が減少するのが認められる。これはプローブの合
成に用いたＭ１３鋳型がＭＩ３捕捉鎖にハイブリッド形
成することによる。次ぎの実施例で証明されるように、
これはＭ１３プライマーの使用を避けることにより除か
れる。
．１．０，２０．３０″！、たは６０ ｎｆＪのｍｐｌ
ｏ、Ｆ８ＸｂＰｓｔ６ ２ｉ１ｊ型ＤＮＡ （固定化可
能なプローブポリヌクレオチド、第１図の■に相当）を
各試験管に添加し、試料を６５℃テ１０分間インキュベ
ートした。次いで試料を尿素およびホルムアミドの濃度
勾配を含む６イ％アクリルアミドゲル上を走行感せ（ニ
ス・ジー・フィッシャーオヨヒエル・ニス・レルマン、
フロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス（ニー−ニス・ニー）、ＳＯ巻、１５
７９−１５８３頁（１９８３年）全ゲル系の記述に関し
て参照されたい）、ブローブー被分析複合体をＭｌＢｉ
型−プローブ複合体から分離した。仄いてゲルを乾燥さ
せ、オートラジオグラフィー処理し、走査した。各ピー
クを切取り、秤量した。結果を表６に提示する。このゲ
ルＶＣ′ｊ６いてプローブ−伎分析体複合体はゲル内へ
約５．５膜移行した鋭いピークを形成し、一方ハイブリ
ッド形成していないプローブはゲル内へ約６．３ ＣＩ
ｎ移行する。プローブ−Ｍ１３１Ｊ）４聖夜合体はゲル
の頂部に留まる。ハイブリッド形成後にＭｘ３６Ａ型Ｄ
ＮＡを添加しない場合、ノ・イブリッド形成していない
プローブのバックグラウンドがブローブー伎分析体バン
ドを一部穏し、ゲル走査において２本のバンドを区別で
きない。ＭＩ３鋳型（Ｉ）の添加量が増加するのに伴っ
て、ノ・イブリッド形成していないプローブからのバッ
クグラウンドが減少し、６０ｎｙの添加によって、被分
析体ＤＮＡにノ・イブリッド形成していない標識プロー
ブ分子の約９９％がＭ１３鋳型により（表６参照）ＩＬ
／として捕捉される。Ｍ１３鋳型の添加量が増加するの
に伴って、標識プローブ−被分析体（Ａｎ、Ｌ’）から
の信号が減少するのが認められる。これはプローブの合
成に用いたＭ１３鋳型がＭＩ３捕捉鎖にハイブリッド形
成することによる。次ぎの実施例で証明されるように、
これはＭ１３プライマーの使用を避けることにより除か
れる。
表 ６
ピークの紙■
０ ゲル走査で識別不能 ２．０＊１０
ｎｊＪ １３．０ ５８．０
６７．３２０ ｎ！ ９，８
５６．６ ８２．７３０ ｎ＆
７，９ ２１．２ １１６．
６４０ ｔＪ ３．０ １．５
１２３．３表 ７（下記実施例７参照） ０ ５．４ ８．１ １４５３”
２１８＊１Ｏｎｙ５．９ ７．５
８．６ ５３３２５ｎｆｊ ４．５
３．６ １，０ ５６．０５０ｎｌｊ
４．３ ４．２ Ｎ、Ｄ、 ５
６．４７５ｎｇ５．５ ３．５ Ｎ−
Ｄ、６０’、４１００ｉ、９ ６．２
３．Ｉ Ｎ、Ｄ、 ６３ｇ（５日） Ｎ、Ｄ、−ゲル走査で検出できない。
ｎｊＪ １３．０ ５８．０
６７．３２０ ｎ！ ９，８
５６．６ ８２．７３０ ｎ＆
７，９ ２１．２ １１６．
６４０ ｔＪ ３．０ １．５
１２３．３表 ７（下記実施例７参照） ０ ５．４ ８．１ １４５３”
２１８＊１Ｏｎｙ５．９ ７．５
８．６ ５３３２５ｎｆｊ ４．５
３．６ １，０ ５６．０５０ｎｌｊ
４．３ ４．２ Ｎ、Ｄ、 ５
６．４７５ｎｇ５．５ ３．５ Ｎ−
Ｄ、６０’、４１００ｉ、９ ６．２
３．Ｉ Ｎ、Ｄ、 ６３ｇ（５日） Ｎ、Ｄ、−ゲル走査で検出できない。
＊ニゲル頂部のプローブＤＮＡの非特異的粘着によるバ
ックグラウンド（ｉＴ号 ＊＊：フィルムが捕捉された標識プローブにより過剰露
光されるため他のレーンの捕捉された標識プローブより
も値が高いと思われる。捕捉てれていない標識プローブ
がゲル内へ著しく尾？ひき、この値に実質的に関与して
いる。
ックグラウンド（ｉＴ号 ＊＊：フィルムが捕捉された標識プローブにより過剰露
光されるため他のレーンの捕捉された標識プローブより
も値が高いと思われる。捕捉てれていない標識プローブ
がゲル内へ著しく尾？ひき、この値に実質的に関与して
いる。
Ｊ 施 例 ７：ヒ）ＤＮＡ中のファクター■遺伝子
からの２種の被分析体断片の検出 ヒト女性胎盤ＤＮＡ ２００μ：ｊｆ Ｅａｍ ＨＩ
′ｊ６よびＥｃｏ ＲＩで完全に消化し、フェノール
Ｓよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿さぞ、
２００μｔのＴＥに再懸濁した。
からの２種の被分析体断片の検出 ヒト女性胎盤ＤＮＡ ２００μ：ｊｆ Ｅａｍ ＨＩ
′ｊ６よびＥｃｏ ＲＩで完全に消化し、フェノール
Ｓよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿さぞ、
２００μｔのＴＥに再懸濁した。
ファクター■遺伝子のイントロ／１４から］。、Ｉｋｂ
のＲａｍ ＩＩ（−Ｅｃｏ Ｒ１断片を７１／１３ベク
ターｙｒＬｐＨ中へサブクローンしてクローン？？＋、
ｐｌｌ、Ｆ８４．１を作成した。この鋳型ＤＮＡ力）
ら実施例６と同様にして放射性標識プローブを合成した
。ただしフ０ライマー延１甲後にＤＮＡをＢａｒｎＩＩ
■で消化した。一本領プローブを実施例６と同様にゲ
ル棺製した。
のＲａｍ ＩＩ（−Ｅｃｏ Ｒ１断片を７１／１３ベク
ターｙｒＬｐＨ中へサブクローンしてクローン？？＋、
ｐｌｌ、Ｆ８４．１を作成した。この鋳型ＤＮＡ力）
ら実施例６と同様にして放射性標識プローブを合成した
。ただしフ０ライマー延１甲後にＤＮＡをＢａｒｎＩＩ
■で消化した。一本領プローブを実施例６と同様にゲ
ル棺製した。
ＥａｍＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩ消化ヒトＤＮＡ ８０１１
ＦＪを煮沸Ｖこより変性させ、２８，０００セレンコフ
ｃｐｍの標識プローブ（一本領複製ＤＮＡに対し約２０
倍過剰の標識プローブ）と、最終容積２００ｐｔの０．
３Ａ／−ＮａＣ１ｂよび０．ＩＭ−）リスｌ−ＩＣｔ
。
ＦＪを煮沸Ｖこより変性させ、２８，０００セレンコフ
ｃｐｍの標識プローブ（一本領複製ＤＮＡに対し約２０
倍過剰の標識プローブ）と、最終容積２００ｐｔの０．
３Ａ／−ＮａＣ１ｂよび０．ＩＭ−）リスｌ−ＩＣｔ
。
ｐＨ８，０中で約１６時間ハイブリッド形成させた。
次いで１７５μｔのハイブリッドを０１５Ｍ・Ｎ ａ
ＣＬに希釈し、１０ ｍＭ−Ｍ ｇ Ｃｉ２、ｉｏｏμ
ｙ／ｗ ＢＳＡ、６ｒｎＭ−ＢＭＥ１最終容４１５０
μｔに調整し、Ｘｈｏ Ｉで４時間消化した。この酵
素はハイブリッドの中央で１回切断し、６４０塩基対Ｅ
ａｍ ＨＩ −Ｘｈ、ｏ Ｉ断片、５よび４９５塩基
対Ｅｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ Ｔ断片（Ｍ１３ブライマー
によるプローブ合成に基つ〈２２塩基の一本領プローブ
が突出）を産生じた。消化後にＤＮＡをエタノールで沈
殿でぞ、ＴＥに再懸濁し、最終容積１７５Ｉｌｌ、 ０
．３ Ｍ −ＮｔｙＣＬおよび０．１Ａ／−１−リスＨ
ＣＬ。
ＣＬに希釈し、１０ ｍＭ−Ｍ ｇ Ｃｉ２、ｉｏｏμ
ｙ／ｗ ＢＳＡ、６ｒｎＭ−ＢＭＥ１最終容４１５０
μｔに調整し、Ｘｈｏ Ｉで４時間消化した。この酵
素はハイブリッドの中央で１回切断し、６４０塩基対Ｅ
ａｍ ＨＩ −Ｘｈ、ｏ Ｉ断片、５よび４９５塩基
対Ｅｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ Ｔ断片（Ｍ１３ブライマー
によるプローブ合成に基つ〈２２塩基の一本領プローブ
が突出）を産生じた。消化後にＤＮＡをエタノールで沈
殿でぞ、ＴＥに再懸濁し、最終容積１７５Ｉｌｌ、 ０
．３ Ｍ −ＮｔｙＣＬおよび０．１Ａ／−１−リスＨ
ＣＬ。
ｐＨ８，ＣＪＶＣ調督した。仄いて試料を２５μｔずっ
の７アリコートに分割した。これらのうち６アリコート
をこの実験に用いた。０．１０．２５．５０．７５また
は１００ ｎｆｌのｍ、ｐＨ，Ｆ８４１鋳型ＤＮＡを各
アリコートに添加し、これらの試料を６５℃で１０分間
インキュベートし、次いで氷上に乗せて反応を停止させ
た。
の７アリコートに分割した。これらのうち６アリコート
をこの実験に用いた。０．１０．２５．５０．７５また
は１００ ｎｆｌのｍ、ｐＨ，Ｆ８４１鋳型ＤＮＡを各
アリコートに添加し、これらの試料を６５℃で１０分間
インキュベートし、次いで氷上に乗せて反応を停止させ
た。
被分析体−標識プローブ複合体（Ａ ｎ Ｌ’ ）をＡ
／１３鋳型−標識プローブ複合体から電気泳動により分
離し、ゲルをオートラジオグラフィー処理し、実施例６
の記載と同様に走査した。この実験において、４９５塩
基対Ｅｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ断片（２２塩基一本領突
出を含む）はゲル内へ約６．６ ｃｍ泳動し、６４０塩
基対Ｂａｍ ＨＩ −Ｘｈｏ Ｉ ハイブリッドはゲ
ル内へ約７．２ＣＩＩＬ泳動じた。ハイブリッド形成し
ていない標識プローブＬ′は約１．３ ｃｍに泳動し、
標識プローブはこの下方にゲル内へ若干用をひき、一方
Ｍ］、３鋳型−プローブ複合体はゲルの頂部に留１つだ
。ゲル走査により得たデータの要約を表７に示す。ここ
に示されるように、ハイブリッド形成していない一木＠
ＤＮＡプローブは５０ＦＪ以上のＭ１３鋳型を添加した
レーンでは検出されなかった。７１／１３の添加後にＥ
ｃｏＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ−”イブリッドからの信号に約
２５倍の低下が認められたが、Ｅａｍ、ＨＩ−Ｘｈｏ
Ｉ 断片にはこのような信号の低下は認められなかっ
た。
／１３鋳型−標識プローブ複合体から電気泳動により分
離し、ゲルをオートラジオグラフィー処理し、実施例６
の記載と同様に走査した。この実験において、４９５塩
基対Ｅｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ断片（２２塩基一本領突
出を含む）はゲル内へ約６．６ ｃｍ泳動し、６４０塩
基対Ｂａｍ ＨＩ −Ｘｈｏ Ｉ ハイブリッドはゲ
ル内へ約７．２ＣＩＩＬ泳動じた。ハイブリッド形成し
ていない標識プローブＬ′は約１．３ ｃｍに泳動し、
標識プローブはこの下方にゲル内へ若干用をひき、一方
Ｍ］、３鋳型−プローブ複合体はゲルの頂部に留１つだ
。ゲル走査により得たデータの要約を表７に示す。ここ
に示されるように、ハイブリッド形成していない一木＠
ＤＮＡプローブは５０ＦＪ以上のＭ１３鋳型を添加した
レーンでは検出されなかった。７１／１３の添加後にＥ
ｃｏＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ−”イブリッドからの信号に約
２５倍の低下が認められたが、Ｅａｍ、ＨＩ−Ｘｈｏ
Ｉ 断片にはこのような信号の低下は認められなかっ
た。
これは、ＭＩ３プライマー配列が放射性プローブ（Ｌ′
）に付着していない場合は大過剰のＭ１３鋳型ＤＮＡ
［Ｉｌを添加して、被分析体−標識プローブハイブリッ
ド（ＡｎＬ’）からの信号低下なしに、ノ・イブリッド
形成していないプローブＤＮＡを完全に除去しうろこと
を証明する。
）に付着していない場合は大過剰のＭ１３鋳型ＤＮＡ
［Ｉｌを添加して、被分析体−標識プローブハイブリッ
ド（ＡｎＬ’）からの信号低下なしに、ノ・イブリッド
形成していないプローブＤＮＡを完全に除去しうろこと
を証明する。
第１〜を図は本発明の各種の形態、すなわち抑制様式（
第１．２および４図）もしくは競合様式（第３図）を用
いるもの、固定化可能なポリヌクレオチド試薬（プロー
ブ、Ｉ 、 Ｉ’） （第１．３および４図）もしくは
固定化されたポリヌクレオチド試薬（Ｉｄ）（プローブ
、Ｉｄ）（第２図）を用いるもの、および被分析体（Ａ
ｎ）の標的ヌクレオチド配列（Ｔ＃、Ｓ’）に相補的な
標識付きブローブボリヌクレオチド（Ｚ、’） （第１
および２図）もしくはこれと競合するもの（Ｌ）（第３
および４図）を用いるものを示す。
第１．２および４図）もしくは競合様式（第３図）を用
いるもの、固定化可能なポリヌクレオチド試薬（プロー
ブ、Ｉ 、 Ｉ’） （第１．３および４図）もしくは
固定化されたポリヌクレオチド試薬（Ｉｄ）（プローブ
、Ｉｄ）（第２図）を用いるもの、および被分析体（Ａ
ｎ）の標的ヌクレオチド配列（Ｔ＃、Ｓ’）に相補的な
標識付きブローブボリヌクレオチド（Ｚ、’） （第１
および２図）もしくはこれと競合するもの（Ｌ）（第３
および４図）を用いるものを示す。
Claims (10)
- （１）（ａ）溶液中で、試料および（ｉ）標的ヌクレオ
チド配列に塩基対結合しうる標識付き第１プローブポリ
ヌクレオチドおよび（ｉｉ）第１プローブポリヌクレオ
チドの、標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領域
において第１プローブポリヌクレオチドに選択的に塩基
対結合しうる固定化可能なまたは固定化された第２プロ
ーブポリヌクレオチドを、第１プローブポリヌクレオチ
ドが標的ヌクレオチド配列に結合しかつ第２プローブポ
リヌクレオチドに結合しうる条件下で接触させ、 （ｂ）第２プローブポリヌクレオチドを、固定化可能な
場合にはこれに結合した標識付き第１プローブポリヌク
レオチドと共に固定化し、そして（ｃ）固定化されたま
たは固定化可能な第２プローブポリヌクレオチドと共に
固定化されていない標識付きポリヌクレオチドを、試料
中の標的ヌクレオチド配列の量の尺度として検出する 工程からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定め
られた標的ヌクレオチド配列の存在を検出するための方
法。 - （２）第１プローブポリヌクレオチドにまず試料を接触
させ、次いでハイブリッド形成期間後に、反応混合物に
第２プローブポリヌクレオチドを接触させ、その際第２
プローブポリヌクレオチドは固定化可能であり、かつ第
２プローブポリヌクレオチドの、第１プローブポリヌク
レオチドに塩基対結合しうる領域の外側に独特のヌクレ
オチド配列を含有し、固定化工程（ｂ）が反応混合物を
この独特のヌクレオチド配列に対し実質的に相補的であ
るヌクレオチド配列をもつ固定化された第３ポリヌクレ
オチドと接触させることよりなる、特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - （３）第２プローブポリヌクレオチドが固定化可能であ
りかつ親和性部分をもち、固定化工程（ｂ）が反応混合
物をこの親和性部分に対する親和性試薬と接触させるこ
とよりなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （４）試料がＤＮＡであり、標識付き第１プローブポリ
ヌクレオチドがアデノシンリン酸類を含むリボヌクレオ
シドリン酸類に消化されうるポリリボヌクレオチドセグ
メントを含有し、 検出工程（ｃ）が （ｃ１）溶液中に残存する標識付き第１ポリヌクレオチ
ドのポリリボヌクレオチドセグメントを消化し、そして （ｃ２）消化工程（ｃ１）で生成したアデノシンリン酸
類を検出する ことよりなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （５）（ａ）標的ヌクレオチド配列に選択的に結合しう
る第１ポリヌクレオチド領域をもつ標識付き第１プロー
ブポリヌクレオチド、 （ｂ）第１ポリヌクレオチド領域の少なくとも一部に選
択的に結合しうる第２ポリヌクレオチド領域をもつ固定
化可能な第２プローブポリヌクレオチド、および （ｃ）固定化可能な第２プローブポリヌクレオチドをこ
れに結合した標識付き第１プローブポリヌクレオチドと
共に固定化するための固定化手段からなる、生物学的試
料の核酸中のあらかじめ定められた標的ヌクレオチド配
列の存在を検出するためのキット。 - （６）（ａ）溶液中で、試料および（ｉ）標的ヌクレオ
チド配列に塩基対結合しうる固定化可能なまたは固定化
された第１プローブポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）第
１プローブポリヌクレチドの、標的ヌクレオチド配列に
塩基対結合しうる領域において第１プローブポリヌクレ
オチドに選択的に塩基対結合しうる標識付き第２プロー
ブポリヌクレオチドを、第１プローブポリヌクレオチド
が標的ヌクレオチド配列に結合しかつ第２プローブポリ
ヌクレオチドに結合しうる条件下で接触させ、 （ｂ）第１プローブポリヌクレオチドを、固定化可能な
場合にはこれに結合した標識付き第２プローブポリヌク
レオチドと共に固定化し、そして（ｃ）固定化されたま
たは固定化可能な第１プローブポリヌクレオチドと共に
固定化されていない標識付きポリヌクレオチドを、試料
中の標的ヌクレオチド配列の量の尺度として検出する 工程からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定め
られた標的ヌクレオチド配列の存在を検出するための方
法。 - （７）（ａ）標的ヌクレオチド配列に選択的に結合しう
る第１ポリヌクレオチド領域をもつ固定化可能な第１プ
ローブポリヌクレオチド、 （ｂ）第１ポリヌクレオチド領域の少なくとも一部に選
択的に結合しうる第２ポリヌクレオチド領域をもつ標識
付き第２プローブポリヌクレオチド（固定化可能な第１
プローブポリヌクレオチドと標識付き第２プローブポリ
ヌクレオチドは実質的に等モル量存在する）および （ｃ）固定化可能な第１プローブポリヌクレオチドをこ
れに結合した標識付き第２プローブポリヌクレオチドと
共に固定化するための固定化手段からなる、生物学的試
料の核酸中のあらかじめ定められた標的ヌクレオチド配
列の存在を検出するためのキット。 - （８）さらに （ｄ）固定化手段によって固定化可能な第１プローブポ
リヌクレオチドと共に固定化されていない標識付き第２
プローブポリヌクレオチドを検出するための検出手段 を含む、特許請求の範囲第７項に記載のキット。 - （９）固定化可能な第１プローブポリヌクレオチドおよ
び標識付き第２プローブポリヌクレオチドを、各第２ポ
リヌクレオチド領域が第１ポリヌクレオチド領域に結合
した試薬ハイブリッドとして保有する、特許請求の範囲
第７項に記載のキット。 - （１０）接触工程（ａ）および固定化工程（ｂ）の後で
あって、ただし検出工程（ｃ）の前に、固定化されてい
ない標識付き第１プローブポリヌクレオチドに、標識付
き第１プローブポリヌクレオチドど標的ヌクレオチド配
列を含有する種々の試料核酸とのハイブリッド類を識別
するのに十分なクロマトグラフィー分離が施される、特
許請求の範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79067185A | 1985-10-23 | 1985-10-23 | |
| US790671 | 1985-10-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62143700A true JPS62143700A (ja) | 1987-06-26 |
Family
ID=25151416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61252798A Pending JPS62143700A (ja) | 1985-10-23 | 1986-10-23 | 対合セグメント抑制または競合による核酸アツセイ法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0219842A1 (ja) |
| JP (1) | JPS62143700A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3851810T2 (de) * | 1987-07-31 | 1995-02-09 | Gen Probe Inc | Polynukleotidentest unter Benutzung von Oligonukleotiden zur Eliminierung von unerwünschten Kreuzreaktionen. |
| NL8801147A (nl) * | 1988-05-02 | 1989-12-01 | Tno | Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie, en daarvoor geschikte kit. |
| CA2026573A1 (en) * | 1989-02-03 | 1990-08-04 | John B. Findlay | Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid |
| US5445933A (en) * | 1992-09-15 | 1995-08-29 | Boehringer Mannheim Corporation | Strand displacement assay and complex useful therefor |
| WO1997018329A1 (en) * | 1995-11-14 | 1997-05-22 | Ragland William L | Efficient method of detecting an infectious agent in blood |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3486488T2 (de) * | 1983-01-10 | 2003-04-03 | Gen-Probe Inc., San Diego | Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| JPS6091999A (ja) * | 1983-10-25 | 1985-05-23 | Fujirebio Inc | ポリヌクレオチドの測定方法 |
| CA1254114A (en) * | 1984-05-07 | 1989-05-16 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing recombination protein and diagnostic kit |
| US4629689A (en) * | 1984-08-29 | 1986-12-16 | Allied Corporation | Binding assay with amplified read-out and gas-phase detection |
-
1986
- 1986-10-20 EP EP86114509A patent/EP0219842A1/en not_active Withdrawn
- 1986-10-23 JP JP61252798A patent/JPS62143700A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0219842A1 (en) | 1987-04-29 |
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