JPH0315395A - 単クローン性抗体及びこれを用いるモノオキシゲネース・チトクロームｐ―４５０関連タンパク質の測定法 - Google Patents
単クローン性抗体及びこれを用いるモノオキシゲネース・チトクロームｐ―４５０関連タンパク質の測定法Info
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- JPH0315395A JPH0315395A JP1151408A JP15140889A JPH0315395A JP H0315395 A JPH0315395 A JP H0315395A JP 1151408 A JP1151408 A JP 1151408A JP 15140889 A JP15140889 A JP 15140889A JP H0315395 A JPH0315395 A JP H0315395A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は単クローン性抗体に関し、更に詳細にはヒトモ
ノオキシゲネースの一っであるチトクロームＰ−４５０
（Ｃｙｔ．Ｐ−４５０）および関連タンパク質に対する
単クローン性抗体に関する。また本発明は、かかる単ク
ローン性抗体を産生ずるハイブリドーマ、単クローン性
抗体を用いた免疫学的測定法・免疫組織化学的検索法お
よび薬剤ミサイル、さらに癌性変化に伴い認められる本
単クローン性抗体対応抗原に関する。
ノオキシゲネースの一っであるチトクロームＰ−４５０
（Ｃｙｔ．Ｐ−４５０）および関連タンパク質に対する
単クローン性抗体に関する。また本発明は、かかる単ク
ローン性抗体を産生ずるハイブリドーマ、単クローン性
抗体を用いた免疫学的測定法・免疫組織化学的検索法お
よび薬剤ミサイル、さらに癌性変化に伴い認められる本
単クローン性抗体対応抗原に関する。
［従来の技術およびその問題点コ
従来実験動物におけるモノオキシゲネースの解析は種々
行われており特にＣｙｔ．Ｐ−４５０においてはその詳
細な変動の解析がなされてきた。しかしながら、ヒト生
体中のモノオキシゲネースは実験動物由来の材料を用い
たモデルによる解析が主流であり、充分な検討はなされ
ておらず、解析に有用なヒト特異的な材料は未だ得られ
ていなかった。一方、近年ヒト臓器中および体液中（血
液、ｔｉｉｆｆｌ、尿など）のタンパク質に対する単ク
ローン性抗体を用いた臨床検査診断が盛んに実施されて
おり、癌になると増加することが知られている物質であ
る癌胎児性抗原（Ｃ Ｅ Ａ）、α−７ェトブロテンな
どに対する抗体を用いて同様なことが行われているが、
その癌性変化との関連性は不充分であり、初期発生癌の
検出には問題を残している。
行われており特にＣｙｔ．Ｐ−４５０においてはその詳
細な変動の解析がなされてきた。しかしながら、ヒト生
体中のモノオキシゲネースは実験動物由来の材料を用い
たモデルによる解析が主流であり、充分な検討はなされ
ておらず、解析に有用なヒト特異的な材料は未だ得られ
ていなかった。一方、近年ヒト臓器中および体液中（血
液、ｔｉｉｆｆｌ、尿など）のタンパク質に対する単ク
ローン性抗体を用いた臨床検査診断が盛んに実施されて
おり、癌になると増加することが知られている物質であ
る癌胎児性抗原（Ｃ Ｅ Ａ）、α−７ェトブロテンな
どに対する抗体を用いて同様なことが行われているが、
その癌性変化との関連性は不充分であり、初期発生癌の
検出には問題を残している。
［問題を解決するための手段］
本発明者らは、ヒト特異的なモノオキシゲネース解析材
料を開発すべく、種々検討を行った結果、精製ヒトＣｒ
ｔ．Ｐ−４５０を免疫源として抗とトＣｙｔ．Ｐ−４５
０単クローン性抗体を作製し、種々検討を行った結果、
ヒト生体内成分と特異的な反応性を有する単クローン性
抗体を得た。かかる単クローン性抗体のクラスとしては
ＩｇＧが好ましくζ中でも、ＩｇＧ，の抗体は特異的に
優れかつ抗体価が高いことから実用上有利である。本抗
体を用いた免疫学的検索法はヒトモノオキシゲネースの
解析に特に有用である。
料を開発すべく、種々検討を行った結果、精製ヒトＣｒ
ｔ．Ｐ−４５０を免疫源として抗とトＣｙｔ．Ｐ−４５
０単クローン性抗体を作製し、種々検討を行った結果、
ヒト生体内成分と特異的な反応性を有する単クローン性
抗体を得た。かかる単クローン性抗体のクラスとしては
ＩｇＧが好ましくζ中でも、ＩｇＧ，の抗体は特異的に
優れかつ抗体価が高いことから実用上有利である。本抗
体を用いた免疫学的検索法はヒトモノオキシゲネースの
解析に特に有用である。
本発明のモノオキシゲネースを認識し得る単クローン性
抗体の製造法の例として次のごと＜Ｃｙｔ．Ｐ−４５０
を認識する単クローン性抗体を調製する方法があげられ
る。
抗体の製造法の例として次のごと＜Ｃｙｔ．Ｐ−４５０
を認識する単クローン性抗体を調製する方法があげられ
る。
すなわち、まず、Ｃｙｔ．Ｐ−４５０の単離であるが、
ヒト検体臓器もしくはＣｙｔ．Ｐ−４５０の存在が認め
られる種々培養細胞株をホモジネートの後、界面活性剤
を用いて可溶化後、オクチルアミノセファロース４Ｂ，
ハイドロキシアパタイト、ＬＨ−２０，ＤＥＡＥ−セル
ロース、ＤＥＡＥセファロース、ＣＭ−セルロース、Ｃ
Ｍ〜セファロースや各種ゲルろ過用担体を用いたクロマ
トグラフィーにより、もしくはＨＰＬＣ％ＦＰＬＣ等の
システムによる各種イオン交換カラム、ゲルろ過用カラ
ムを用いてＣｙｔ．Ｐ−４５０を精製することができる
。また、動物由来の抗体との交差反応性を利用した、イ
ムノアフィニティカラムにより精製も可能である。また
、ｃＤＮＡの発現産物の精製によっても獲得可能であり
免疫源は混在物の存在を妨げない。
ヒト検体臓器もしくはＣｙｔ．Ｐ−４５０の存在が認め
られる種々培養細胞株をホモジネートの後、界面活性剤
を用いて可溶化後、オクチルアミノセファロース４Ｂ，
ハイドロキシアパタイト、ＬＨ−２０，ＤＥＡＥ−セル
ロース、ＤＥＡＥセファロース、ＣＭ−セルロース、Ｃ
Ｍ〜セファロースや各種ゲルろ過用担体を用いたクロマ
トグラフィーにより、もしくはＨＰＬＣ％ＦＰＬＣ等の
システムによる各種イオン交換カラム、ゲルろ過用カラ
ムを用いてＣｙｔ．Ｐ−４５０を精製することができる
。また、動物由来の抗体との交差反応性を利用した、イ
ムノアフィニティカラムにより精製も可能である。また
、ｃＤＮＡの発現産物の精製によっても獲得可能であり
免疫源は混在物の存在を妨げない。
得られたＣｙｔ．Ｐ−４５０で免疫する動物としては、
ラット、マウス等が挙げられ、特にマウスが実用上有利
に用いられる。得られた免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞
（ミエローマ）との融合によりハイブリドーマを得るが
、融合においては、公知のポリエチレングリコールを用
いる方法、センダイウイルスにより融合する方法、電気
パルスによる方法のいずれを用いてもよい。得られたハ
イブリドーマの培養上清は、免疫源である精製ｃ ｙｔ
．Ｐ−４５０を用いたＥＬＩＳＡ，およびＩ ｍ＠ｕｎ
ｏｂｌｏｔによりその反応性を検討し、陽性ハイブリド
ーマより、限界希釈法により単クローン性抗体を作製す
る。尚、このようにハイブリドーマを経由して単クロー
ン性抗体を製造する際の、脾細胞とミエローマ細胞は、
同一種の動物からのものが好ましく、特にマウス脾細胞
とマウス由来ミエローマ細胞が実用上に好適である。得
られた単クローン性抗体産生ハイブリドーマは、凍結し
て保存することができ、またこれを適当な方法で大量に
培養することができる。抗体は培養上清から得ることが
でき、また、かかるハイブリドーマを動物に移植して腫
瘍化し、その腹水や血清から目的とする単クローン性抗
体を得ることができる。本発明の単クローン性抗体の精
製は塩析およびアフィニティカラムやＤＥＡＥカラムを
用いて行われる。
ラット、マウス等が挙げられ、特にマウスが実用上有利
に用いられる。得られた免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞
（ミエローマ）との融合によりハイブリドーマを得るが
、融合においては、公知のポリエチレングリコールを用
いる方法、センダイウイルスにより融合する方法、電気
パルスによる方法のいずれを用いてもよい。得られたハ
イブリドーマの培養上清は、免疫源である精製ｃ ｙｔ
．Ｐ−４５０を用いたＥＬＩＳＡ，およびＩ ｍ＠ｕｎ
ｏｂｌｏｔによりその反応性を検討し、陽性ハイブリド
ーマより、限界希釈法により単クローン性抗体を作製す
る。尚、このようにハイブリドーマを経由して単クロー
ン性抗体を製造する際の、脾細胞とミエローマ細胞は、
同一種の動物からのものが好ましく、特にマウス脾細胞
とマウス由来ミエローマ細胞が実用上に好適である。得
られた単クローン性抗体産生ハイブリドーマは、凍結し
て保存することができ、またこれを適当な方法で大量に
培養することができる。抗体は培養上清から得ることが
でき、また、かかるハイブリドーマを動物に移植して腫
瘍化し、その腹水や血清から目的とする単クローン性抗
体を得ることができる。本発明の単クローン性抗体の精
製は塩析およびアフィニティカラムやＤＥＡＥカラムを
用いて行われる。
本研究者らは、かかるモノオキシゲネースを認識し得る
単クローン性抗体について、ｌ．ヒト以外の実験動物の
生体成分と反応性を有しないまたは検出限界以下である
こと、２，ヒト正常肝細胞の細胞質と高い反応性を有し
癌の病変部位とは反応しないこと、３．担癌ヒト生体成
分に本抗体と選択的に反応するタンパク質が存在するこ
と等を見いだした。
単クローン性抗体について、ｌ．ヒト以外の実験動物の
生体成分と反応性を有しないまたは検出限界以下である
こと、２，ヒト正常肝細胞の細胞質と高い反応性を有し
癌の病変部位とは反応しないこと、３．担癌ヒト生体成
分に本抗体と選択的に反応するタンパク質が存在するこ
と等を見いだした。
すなわち本発明は、抗体を用いた免疫学的方法により生
体内成分を測定する方法においてモノオキシゲネースお
よびその関連タンパク質を認識し得る単クローン性抗体
を用いることを特徴とするもので、本単クローン性抗体
の上述した性質を利用した臨床応用を目的としたもので
ある。
体内成分を測定する方法においてモノオキシゲネースお
よびその関連タンパク質を認識し得る単クローン性抗体
を用いることを特徴とするもので、本単クローン性抗体
の上述した性質を利用した臨床応用を目的としたもので
ある。
本発明の測定法においては、直接法、サンドウィチ法等
が用いられるが、生体試料もしくは単クローン性抗体を
担体に固定化しておくのが望ましく、固定化の方法は公
知の方法を採用でき、担体としては固相の、例えば、ポ
リスチレン、ポリエチレン、ポリアクリレート、テフロ
ン、ポリアセテート、ポリアセタール、ラテックス等を
用いた、ボール、ビーズ、ギア、マイクロプレート等が
好ましく使用される。
が用いられるが、生体試料もしくは単クローン性抗体を
担体に固定化しておくのが望ましく、固定化の方法は公
知の方法を採用でき、担体としては固相の、例えば、ポ
リスチレン、ポリエチレン、ポリアクリレート、テフロ
ン、ポリアセテート、ポリアセタール、ラテックス等を
用いた、ボール、ビーズ、ギア、マイクロプレート等が
好ましく使用される。
また、単クローン性抗体の標識化の方法や手段、それの
検出方法や手段はなんら限定されるものではなく、公知
の方法や手段、例えば、放射性物質または酵素もしくは
蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブド
ウ球菌タンパクＡとの２次反応により測定することがで
きる。標識剤としては、ホースラディシコパーオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ等の酵素、”’ｒ，’Ｈ等の放射性物質、フルオ
レセインイソチアネート等の蛍光物質が通常使用される
が、その標識剤の活性が測定可能であれば、その他のも
のであってもよい。標識剤が酵素の場合には、その活性
測定には発色基質が用いられる。基質としては、例えば
、ホースラディシュパーオキシダーゼの基質として２，
２゜アジノジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸
］アンモニウム酸（ＡＢＴＳ）−Ｈ，Ｏ，、５−アミノ
サリチル酸−Ｈ，Ｏ，、０−フェニレンジアミン一〇，
Ｏ，、４−アミ／アンチピリンーＨ，Ｏ，などが、β−
Ｄ一ガラクトシダーゼの基質として、フルオレセインー
ジー（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ｏ−ニトロフェ
ノもルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを挙げること
ができる。測定のためには、これらの試薬以外にも溶解
剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が使用される。
検出方法や手段はなんら限定されるものではなく、公知
の方法や手段、例えば、放射性物質または酵素もしくは
蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブド
ウ球菌タンパクＡとの２次反応により測定することがで
きる。標識剤としては、ホースラディシコパーオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ等の酵素、”’ｒ，’Ｈ等の放射性物質、フルオ
レセインイソチアネート等の蛍光物質が通常使用される
が、その標識剤の活性が測定可能であれば、その他のも
のであってもよい。標識剤が酵素の場合には、その活性
測定には発色基質が用いられる。基質としては、例えば
、ホースラディシュパーオキシダーゼの基質として２，
２゜アジノジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸
］アンモニウム酸（ＡＢＴＳ）−Ｈ，Ｏ，、５−アミノ
サリチル酸−Ｈ，Ｏ，、０−フェニレンジアミン一〇，
Ｏ，、４−アミ／アンチピリンーＨ，Ｏ，などが、β−
Ｄ一ガラクトシダーゼの基質として、フルオレセインー
ジー（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ｏ−ニトロフェ
ノもルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを挙げること
ができる。測定のためには、これらの試薬以外にも溶解
剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が使用される。
本発明の免疫測定法の実施態様として、ヒト生検肝中の
モノオキシゲネースの測定法を例示する。
モノオキシゲネースの測定法を例示する。
すなわち、９６ウエルマイクロプレートもしくはラテッ
クスビーズに、単クローン性抗体（ａ）を５μ９／ウエ
ルで添加した後４℃で、１２〜２４時間放置する。
クスビーズに、単クローン性抗体（ａ）を５μ９／ウエ
ルで添加した後４℃で、１２〜２４時間放置する。
次に各ウエルにｌ％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）をｌＯＯμＱづつ添加することにより、抗体
その他のタンパク質の非特異的吸着を防止する。次に試
料（ヒト生検肝ホモジネート）を各ウエルに５０μｅ添
加し、よく撹拌した後に、３７℃で３０分間放置する。
（ＰＢＳ）をｌＯＯμＱづつ添加することにより、抗体
その他のタンパク質の非特異的吸着を防止する。次に試
料（ヒト生検肝ホモジネート）を各ウエルに５０μｅ添
加し、よく撹拌した後に、３７℃で３０分間放置する。
反応混合物をＰＢＳでよく洗浄した後に、モ／オキシゲ
ネースに対する（ａ）と認識部位を異にする単クローン
性抗体のビオチン標識体（１μ９／μｅ）を各ウエルに
５０μｇ添加する。単クローン性抗体のピオチン標識は
公知の方法を用いた。よく撹拌した後に、３７゜Ｃで３
０分間放置する。反応混合物をＰＢＳでよく洗浄した後
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジ
ンの５０００倍希釈液を各ウエルに５０μＱづつ添加す
る。よく撹拌した後に、３７゜Ｃで３０分間放置する。
ネースに対する（ａ）と認識部位を異にする単クローン
性抗体のビオチン標識体（１μ９／μｅ）を各ウエルに
５０μｇ添加する。単クローン性抗体のピオチン標識は
公知の方法を用いた。よく撹拌した後に、３７゜Ｃで３
０分間放置する。反応混合物をＰＢＳでよく洗浄した後
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジ
ンの５０００倍希釈液を各ウエルに５０μＱづつ添加す
る。よく撹拌した後に、３７゜Ｃで３０分間放置する。
反応混合物をＰＢＳでよく洗浄し、水分を切った後に基
質溶液（オルトフェニレンジ７ ミ：ｙ（Ｏ Ｐ Ｄ）
ｌ ｘｙ／ｔ（１， ｐＨ ４ ．５酢酸緩衝液）を
ｌＯＯμＱづつ加え３７℃で５分間反応させる。各ウエ
ルの４９２ｎｍにおける吸光度をＥＩＡリーダーで測定
することにより試料中に存在するＴＨＰ量の定量を行う
。
質溶液（オルトフェニレンジ７ ミ：ｙ（Ｏ Ｐ Ｄ）
ｌ ｘｙ／ｔ（１， ｐＨ ４ ．５酢酸緩衝液）を
ｌＯＯμＱづつ加え３７℃で５分間反応させる。各ウエ
ルの４９２ｎｍにおける吸光度をＥＩＡリーダーで測定
することにより試料中に存在するＴＨＰ量の定量を行う
。
本発明には、単クローン性抗体を用いた生体戊分中のモ
ノオキシゲネースおよび関連タンパク質のＩ ｓｕａｕ
ｎｏｂｌｏｔ法による検出法も含むものである。
ノオキシゲネースおよび関連タンパク質のＩ ｓｕａｕ
ｎｏｂｌｏｔ法による検出法も含むものである。
Ｉ ｍｍｕｎｏｂｌｏｔは公知の方法で行い、手法、材
料になんら限定を受けるものではない。本発明の検索法
は具体的には、生体成分中のモノオキシゲネースをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースをはじめ
とする公知の膜に電気的、もしくは毛細現象を利用−し
て転写し、以下単クローン性抗体を用いた公知の免疫化
学的検索方法により、膜上のモノオキシゲネースを検出
せしめ、癌性変化の可能性の有無、癌の進行度の判定、
また薬物投与量の判定に用いるものである。
料になんら限定を受けるものではない。本発明の検索法
は具体的には、生体成分中のモノオキシゲネースをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースをはじめ
とする公知の膜に電気的、もしくは毛細現象を利用−し
て転写し、以下単クローン性抗体を用いた公知の免疫化
学的検索方法により、膜上のモノオキシゲネースを検出
せしめ、癌性変化の可能性の有無、癌の進行度の判定、
また薬物投与量の判定に用いるものである。
さらに本発明には、組織中のモノオキシゲネースおよび
関連タンパク質の存在を免疫組織化学的に検索する方法
において、モノオキシゲネースを認識し得る単クローン
性抗体を免疫反応により組織の一部に結合せしめること
を特徴とする検索方法も含まれる。かかる免疫組織化学
的検索方法における組織とは、動物、特に実用上好適に
はヒトの細胞または組織切片を意味する。
関連タンパク質の存在を免疫組織化学的に検索する方法
において、モノオキシゲネースを認識し得る単クローン
性抗体を免疫反応により組織の一部に結合せしめること
を特徴とする検索方法も含まれる。かかる免疫組織化学
的検索方法における組織とは、動物、特に実用上好適に
はヒトの細胞または組織切片を意味する。
本発明の検索法は、さらに具体的には、組織にモノオキ
シゲネースを認識し得る単クローン性抗体を作用させて
免疫反応を生じさせ、組織中のモノオキシゲネースの存
在部位にその単クローン性抗体を結合せしめることを特
徴としている。例えばかかる単クローン性抗体を認識す
るビオチン化抗体で処理し、さらに酵素標識アピジンを
作用させる等の方法によって組織におけるモノオキシゲ
ネース存在部位を染色等で標識化せしめて組織の正常度
の検索、進行癌の存在部位の検索を可能にするものであ
る。かかる免疫組織化学的検索方法は公知の方法で行い
、手法、材料になんら限定を受けるものではない。
シゲネースを認識し得る単クローン性抗体を作用させて
免疫反応を生じさせ、組織中のモノオキシゲネースの存
在部位にその単クローン性抗体を結合せしめることを特
徴としている。例えばかかる単クローン性抗体を認識す
るビオチン化抗体で処理し、さらに酵素標識アピジンを
作用させる等の方法によって組織におけるモノオキシゲ
ネース存在部位を染色等で標識化せしめて組織の正常度
の検索、進行癌の存在部位の検索を可能にするものであ
る。かかる免疫組織化学的検索方法は公知の方法で行い
、手法、材料になんら限定を受けるものではない。
さらに、本発明には、モノオキシゲネースを認識し得る
単クローン性抗体を抗癌剤または制ガン剤のヰヤリャー
として用いたことを特徴とする薬剤ミサイルも含まれる
。
単クローン性抗体を抗癌剤または制ガン剤のヰヤリャー
として用いたことを特徴とする薬剤ミサイルも含まれる
。
かかる抗癌剤や制ガン剤には、クロラムブチル、ＡＣＮ
Ｕ，ＣＣＮＵ， シスプラチン、ＭＴＸ，５ＦＵ，Ｆ
ＵＤＲ，ＡＲＡ−Ｃ，ビンブラスチン、ピンクリスチン
、ＭＭＣ，アドリアマイシン、ダウノマイシン等が用い
られるが、いずれも本発明の単クローン性抗体をキャリ
ャーとして用いることができるものであればよく、これ
らに限定されるものではない。
Ｕ，ＣＣＮＵ， シスプラチン、ＭＴＸ，５ＦＵ，Ｆ
ＵＤＲ，ＡＲＡ−Ｃ，ビンブラスチン、ピンクリスチン
、ＭＭＣ，アドリアマイシン、ダウノマイシン等が用い
られるが、いずれも本発明の単クローン性抗体をキャリ
ャーとして用いることができるものであればよく、これ
らに限定されるものではない。
また本発明の単クローン性抗体をキャリャーとして用い
る形態としては如何なるものであってもよく、例えば放
射性アイソトープの牛ヤリャーとして用いた治療法も含
まれる。かかる放射性アイソトープには２１２Ｂｉ、２
１１Ａｔ，１３１１，９０Ｙ等が用いられる。
る形態としては如何なるものであってもよく、例えば放
射性アイソトープの牛ヤリャーとして用いた治療法も含
まれる。かかる放射性アイソトープには２１２Ｂｉ、２
１１Ａｔ，１３１１，９０Ｙ等が用いられる。
かかる本発明の薬剤ミサイルによれば、抗癌剤や制ガン
剤を患部に有効に施すことが可能であり、高い治療効果
が得られかつ副作用を低下させることができる。
剤を患部に有効に施すことが可能であり、高い治療効果
が得られかつ副作用を低下させることができる。
また本発明には、放射性物質、常磁性体物質、蛍光物質
等の標識となり得るもので標識化された、単クローン性
抗体を認識し得るイメージング診断用単クローン性抗体
も含まれる。
等の標識となり得るもので標識化された、単クローン性
抗体を認識し得るイメージング診断用単クローン性抗体
も含まれる。
ここで言う放射性物質としては、例えば１！！■、Ｉｌ
ｌ ｌ ｎ， ｓｓ＋″Ｔｃ等が挙げられ、常磁性体物
質としては例えばガドリニウム（Ｇｄ）等が挙げられる
。
ｌ ｌ ｎ， ｓｓ＋″Ｔｃ等が挙げられ、常磁性体物
質としては例えばガドリニウム（Ｇｄ）等が挙げられる
。
これらはいずれも、本発明の単クローン性抗体を標識化
したものを動物、特に好適にはヒトの体内に注入し、体
内におけるモノオキシゲネースの存在部位に到達せしめ
て、その部位を標識化して、放射線や超音波診断でのイ
メージング診断用に用いることができるものであれば、
いかなるものであってもよい。
したものを動物、特に好適にはヒトの体内に注入し、体
内におけるモノオキシゲネースの存在部位に到達せしめ
て、その部位を標識化して、放射線や超音波診断でのイ
メージング診断用に用いることができるものであれば、
いかなるものであってもよい。
かかる本発明のイメージング診断用の単クローン性抗体
によれば、体内のモノオキシゲネースの局在およびその
変動を伴う進行癌等の疾患の部位の判定等が極めて容易
に診断することが可能である。
によれば、体内のモノオキシゲネースの局在およびその
変動を伴う進行癌等の疾患の部位の判定等が極めて容易
に診断することが可能である。
［実施例］
次に実施例を挙げ、本研究を説明するが、本発明は本実
施例に限定されるものではない。
施例に限定されるものではない。
実施例ｌ
（１）免疫源の調製
ヒト亡検体肝をホモジネートの後常法に従いミクロソー
ム画分を調製し、０．８％コール酸を含むリン酸緩衝液
にて可溶化する。可溶化画分は、ホモジネートの後、オ
クチルアミノセファロース４Ｂ，ハイドロキシアパタイ
ト、ＬＨ−２０を用い、ＯＤ４ １７を用いて検討し、
ｃｙｔ．ｐ−４５０活性の認められる画分を濃縮し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上単一バンドにて得られる。得られたｃ
ｙｔ．Ｐ−４５０はＰＢＳにて透析し、免疫源として使
用した。
ム画分を調製し、０．８％コール酸を含むリン酸緩衝液
にて可溶化する。可溶化画分は、ホモジネートの後、オ
クチルアミノセファロース４Ｂ，ハイドロキシアパタイ
ト、ＬＨ−２０を用い、ＯＤ４ １７を用いて検討し、
ｃｙｔ．ｐ−４５０活性の認められる画分を濃縮し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上単一バンドにて得られる。得られたｃ
ｙｔ．Ｐ−４５０はＰＢＳにて透析し、免疫源として使
用した。
（２）単クローン性抗体の作製
１． （１）で得たＣｙｔ．Ｐ−４５０を、フロイント
の完全アジュバント（Ｆ ｒｅｕｎｄ’ｓ ＣｏＢ１ｅ
ｔａ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と等量混合し、エマルジョン
とした後、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下内に一匹あたり３
０μ？投与した。２回目以降は滅菌生理食塩水０．２ｍ
（１にＣｙｔ，Ｐ−４５０ ３０μ９を溶解し、１０
日間隔で３回静脈内投与した。最終免疫は同溶液、同液
量で粗ＴＨＰ５０μ９を静脈内投与した。
の完全アジュバント（Ｆ ｒｅｕｎｄ’ｓ ＣｏＢ１ｅ
ｔａ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と等量混合し、エマルジョン
とした後、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下内に一匹あたり３
０μ？投与した。２回目以降は滅菌生理食塩水０．２ｍ
（１にＣｙｔ，Ｐ−４５０ ３０μ９を溶解し、１０
日間隔で３回静脈内投与した。最終免疫は同溶液、同液
量で粗ＴＨＰ５０μ９を静脈内投与した。
２．最終免疫の３日後に過免疫マウスから摘出した脾細
胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞株ＳＰ２／
０−Ａｇｌ４をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０
００を用いて融合した。細胞は９６ウエルプレートに１
００μｆｆ／ウエルづつ加え、２４時間後に培地の半量
を／％ット（ＨＡＴ）培地に交換し２日おきに培地交換
した。７〜１０日後にハット耐性のハイブリドーマの成
長が見られてくる。この時期に培地をＨＴに変え、約１
０日間培養し・た後にハイブリドーマ生育培地に変えた
。
胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞株ＳＰ２／
０−Ａｇｌ４をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０
００を用いて融合した。細胞は９６ウエルプレートに１
００μｆｆ／ウエルづつ加え、２４時間後に培地の半量
を／％ット（ＨＡＴ）培地に交換し２日おきに培地交換
した。７〜１０日後にハット耐性のハイブリドーマの成
長が見られてくる。この時期に培地をＨＴに変え、約１
０日間培養し・た後にハイブリドーマ生育培地に変えた
。
３．抗体産生細胞のスクリーニングは免疫に用いたＣｙ
ｔ．Ｐ−４５０を抗原として用いエライザ（ＥＬＩＳＡ
）法により行うことにより、抗原と強く反応するハイブ
リドーマを選択でき、ざらにＣｙｔ．Ｐ−４５０を試料
として用いウエスタンプロット法を行った結果、Ｃｙｔ
．Ｐ−４５０に最も強く反応するハイプリドーマを選択
できた。ここで選択された細胞株を限界希釈法によりク
ローン化し単クローン性抗体産生ハイブリドーマを樹立
した。なおＴＨＰの測定には、ハイブリドーマをプリス
タン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウスに移植してｌＯ〜１５
日目に腹水を採取し、５０％飽和硫安塩析法により精製
した単クローン性抗体を用いた。
ｔ．Ｐ−４５０を抗原として用いエライザ（ＥＬＩＳＡ
）法により行うことにより、抗原と強く反応するハイブ
リドーマを選択でき、ざらにＣｙｔ．Ｐ−４５０を試料
として用いウエスタンプロット法を行った結果、Ｃｙｔ
．Ｐ−４５０に最も強く反応するハイプリドーマを選択
できた。ここで選択された細胞株を限界希釈法によりク
ローン化し単クローン性抗体産生ハイブリドーマを樹立
した。なおＴＨＰの測定には、ハイブリドーマをプリス
タン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウスに移植してｌＯ〜１５
日目に腹水を採取し、５０％飽和硫安塩析法により精製
した単クローン性抗体を用いた。
（３）単クローン性抗体の性質
Ｃｙｔ．Ｐ−４５０に対する単クローン性抗体のクラス
（サブクラス）はＩ ｇＧ ．であった。抗体価は５０
００倍（マウス腹水から精製した抗体を２段階希釈し、
それぞれと精製ＴＨＰを反応させるエライザ（Ｅ Ｌ
Ｉ Ｓ Ａ）を行った時、最も高い吸光度の持続する希
釈倍率を抗体価とした）であった。
（サブクラス）はＩ ｇＧ ．であった。抗体価は５０
００倍（マウス腹水から精製した抗体を２段階希釈し、
それぞれと精製ＴＨＰを反応させるエライザ（Ｅ Ｌ
Ｉ Ｓ Ａ）を行った時、最も高い吸光度の持続する希
釈倍率を抗体価とした）であった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、モノオキシゲネースに対する単クローン性抗体。 ２、モノオキシゲネースがチトクロームＰ−４５０であ
る請求項１の単クローン性抗体。３、チトクロームＰ−
４５０が特にヒト型チトクロームＰ−４５０である請求
項１の単クローン性抗体。 ４、ヒト型チトクロームＰ−４５０が生体試料中のもの
である請求項１の単クローン性抗体。 ５、モノオキシゲネースを免疫源として用いて得られた
脾細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリ
ドーマが産生する、請求項１の単クローン性抗体。 ６、該脾細胞がマウス脾細胞であり、該ミエローマ細胞
がマウス由来ミエローマ細胞である請求項５の単クロー
ン性抗体。 ７、抗体のクラスがＩｇＧである請求項１の単クローン
性抗体。 ８、抗体のクラスがＩｇＧ＿１である請求項１の単クロ
ーン性抗体。 ９、放射性物質、常磁性物質、蛍光物質の群から選ばれ
る少なくとも一種で標識化された請求項１のイメージン
グ診断用の単クローン性抗体。 １０、モノオキシゲネースを免疫源として用いて得られ
た、モノオキシゲネースを認識し得る抗体の産生能を有
する脾細胞と、ミエローマ細胞とを融合して得られるハ
イブリドーマ。 １１、免疫学的方法による被検体中のモノオキシゲネー
スおよび関連タンパク質を測定する方法において、モノ
オキシゲネースを認識し得る単クローン性抗体を用いる
ことを特徴とする測定法。 １２、免疫学的方法により被検体中のモノオキシゲネー
スを測定するための試薬キットであって、モノオキシゲ
ネースを認識し得る単クローン性抗体の標識体を用いる
ことを特徴とする試薬キット。 １３、組織中におけるモノオキシゲネースおよび関連タ
ンパク質の存在を免疫組織化学的に検索する方法におい
て、モノオキシゲネースおよび関連タンパク質を認識し
得る単クローン性抗体を免疫反応により組織の一部に結
合せしめることを特徴とする検索法。 １４、モノオキシゲネースおよび関連タンパク質を認識
し得る単クローン性抗体を生体内代謝能のモデュレータ
ーとして、また直接作用を目的とした、生体内投与法。 １５、モノオキシゲネースおよび関連タンパク質を認識
し得る単クローン性抗体のヒト生体成分との選択的な反
応性を利用した、免疫学的方法によるヒト生体成分の検
出法。 １６、モノオキシゲネースおよび関連タンパク質を認識
し得る単クローン性抗体のヒト正常組織との選択的な反
応性を利用した、免疫学的方法によるヒト生体成分の検
出法。 １７、モノオキシゲネースおよび関連タンパク質を認識
し得る単クローン性抗体と反応性を有する、担癌および
癌性変化に伴いヒト生体中に認められる関連タンパク質
。 １８、モノオキシゲネースおよび関連タンパク質を認識
し得る単クローン性抗体と請求項１７に記載の関連タン
パク質との反応を利用する、担癌、癌性変化の診断およ
び癌性変化の難易度の検討による予防措置を目的とした
、免疫学的検索法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1151408A JPH0315395A (ja) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | 単クローン性抗体及びこれを用いるモノオキシゲネース・チトクロームｐ―４５０関連タンパク質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1151408A JPH0315395A (ja) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | 単クローン性抗体及びこれを用いるモノオキシゲネース・チトクロームｐ―４５０関連タンパク質の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0315395A true JPH0315395A (ja) | 1991-01-23 |
Family
ID=15517946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1151408A Pending JPH0315395A (ja) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | 単クローン性抗体及びこれを用いるモノオキシゲネース・チトクロームｐ―４５０関連タンパク質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0315395A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5132301A (en) * | 1983-05-02 | 1992-07-21 | Merck & Co., Inc. | Substituted cephalosporin sulfones as anti-inflammatory and anti-degenerative agents |
| JPH0635920A (ja) * | 1992-07-14 | 1994-02-10 | Nippon Steel Corp | スケジューリング装置 |
-
1989
- 1989-06-13 JP JP1151408A patent/JPH0315395A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5132301A (en) * | 1983-05-02 | 1992-07-21 | Merck & Co., Inc. | Substituted cephalosporin sulfones as anti-inflammatory and anti-degenerative agents |
| JPH0635920A (ja) * | 1992-07-14 | 1994-02-10 | Nippon Steel Corp | スケジューリング装置 |
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