JPH04503600A

JPH04503600A - 抗インターロイキン―１α及び―１βのモノクローナル抗体、その製法、ならびに前記抗体類の、インターロイキン―１α及び―１βの検出と治療への応用

Info

Publication number: JPH04503600A
Application number: JP2501071A
Authority: JP
Inventors: フローベール　イブリーヌ; グラッシ　ジャック
Original assignee: コミサリア　ア　レネールジー　アトミーク
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1992-07-02
Also published as: CA2004935A1; ES2038571T1; DE399024T1; FR2640146B1; WO1990006371A1; EP0399024A1; FR2640146A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗インターロイキン−１α及び−ｌβのモノクローナル抗体、その製法、ならびに前記抗体類の、インターロイキン−１α及び−１βの検出と治療への応用この発明は、抗インターロイキン、特に抗インターロイキン−１αの及び−１β のモノクローナル抗体、その製法、抗インターロイキン−１α及び−１βのモノクローナル抗体／アセチルコリンエステラーゼ抱合体、前記抗体及び／又は抱合体を用いてインターロイキン−１α及び−１βの検出と定量を行う酵素免疫測定試験法（ＥＩＡ）、ならびにｎＱ記抗体及び／又は抱合体の各種の他の応用、特に治療応用に関する。

リンホカインは、リンパ球とこれを感作する特異的抗体との相互作用で生ずる強い薬剤であり、多くの種類の細胞の機能を修飾、誘発又は抑制でき、炎症反応中、ならびに骨吸収、線維形成および化学走性の現象で必須の役割をする。加えて、このものは、造血のコントロールや免疫応答の調節に関与する。リンホカインは、１９７６球によつて産生されるが、そのなかのインターロイキン−１のようなあるものは、非白血球細胞によつて産生できることが知られている。

インターロイキン−１（ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＥ、　Ｊｅａｎ−Ｆｒａｎｃｑｉｓ　ＢＡＣＨ。

ｘｍ章、４２５〜４２Ｇ頁、第３［１９８６年診照）　Ｉ！、関連抗原ヲ組織へ提示する生物学的シグナルを構成するメゾイエイタ−であり、単球Ｔリンパ球協同作用を特徴づけるものである。Ｉ　Ｌ−１活性はＰ　ＨＡ　（Ｉ　ｕ９／１ｌｌ）の存在下Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＹウス胸線細胞の増殖テスト（ＬＰＳ−耐性）で測定するのが古典的なものである。Ｉ　Ｌ−１が存在しない場合、ＰＨＡで刺激された脚線細胞はＧｏ／Ｇｌフェーズでブロックされる。しかインターロイキン− ２が添加されると分断され、これはＩ　Ｌ−１の主作用がインターロイキン−２合成を誘発することであることを示唆している。

ヒ）　Ｉ　Ｌ−１は推定分子量が１８’ＫＤａで＋５ＫＤａの主な不純物を有する糖タンパク質である。さらに、ＩＬ−１の生理活性を示す分子量が２　ＫＤ８と４Ｄａの２つのペプチドの画分が正常尿より分離されている。

Ｔ　Ｉ、−１は、Ｔリンパ球を除いて、単核細胞、大食細胞、ケラチノサイト、アストｖ１サイト、メラノサイト、メサンギアル細胞やＢ−リンパ芽球のような多種類の細胞から産生されるとみられる。

Ｉ　Ｌ−１の生物効果は、ＩＬ−２合成の誘発に限られていない。

Ｔ　Ｌ−１は、Ｂ細胞の活性化に関与し、線維非細胞とジノビオキサイド（５ｉｎｏｖｉｏｃｙｔｏ）の増殖を刺激し、温度調節中枢に作用して体温を上昇させ、肝細胞による炎症タンパク質の産生を誘発する。２７０アミノ酸プレカーサーをコードするｌ　Ｌ−１遺伝子が最近クローン化された。この遺伝子を含有するプラスミドは、Ｉ　Ｌ−１活性を有する＋５６のアミノ酸からなるカルボキン末端ペプチドの産生を誘発する。上記の引用文献では、ＩＩ縁槽構造有する一群の分子についての仮説がｔｉ供されているけれトモタｌ’　すＬｌａ　（ＤＩＮＡＲＥＬＬＯ，Ｊ、　ＣＬＩＮ、ＩＭＭＵＮＯＬ、　（１９８５）、　５゜２８５〜２９７頁）と、オッペンハイム等（ＯＰＰＥＮＨＩＭ　ｅＬ　ａｌ、　ＩＭＭＬＩＮＯＬ。

ＴＯＤＡＹ（１９８Ｂ）　、　９．４５〜４６頁）は、Ｉ　Ｌ−１が炎症反応と免疫応答に関与する単核細胞由来の大きな群の生理活性タンパク質であることを発表した。ヒトＩＬ−１の２つの別個の種が同定された。すなわちＩＬ−１ａをＩＬ−１β（ＭＡＲＣＨｅｔ　ａｌ、、　ＮＡＴｔｌＲＥ（１９８５）、■、６４１〜６４７頁）で、これらの２つの種は、同−分子量、類似の生理効果および標的細胞に同一のレセプターを有地中及び生理液体中のＩ　Ｌ−１の存在は、主に、マウス脚線細胞の共同刺激テストやマウス胸線腫細胞系ＥＬ４試験のようなバイオアッセイを用いて上述のように測定されている。しかし、Ｉ　Ｌ−１のリンパ球−活性化特性を利用するこれらの方法は制限があって、ＩＬ−１αとＩＬ −１βの区別ができず、ＩＬ−２、レクチンおよび成長因子のような他の活性物質が存在するとバイオアッセイが阻害される。

フエルアら［ＦＥＲＲＵＡ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＩ、、　ＭＥＴＨ，（＋９１１８）。

１１４、４１〜４８頁］は、組換え体Ｉ　Ｌ−１の存在とハイブリドーマ技術の発達により、数チームの研究者ら［ＧＡＦＦＮＥＹ　ｅＬ　ａｌ、、　１９８７：　ＫＡＳＡＨＡＲＡ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９’８７　：　ＫＥＮＮＥＹ　ｅｔ、、　１９ｇ７　；　ＫＯＩＣＨＩＲＯｅＬａｌ’、、１９８７）が、殆どの生理テストの検出限界に比しうる検出限界でＩＬ−１αのとＩＬ−１βを検出する、アイソトープを使用しないサンドウィッチ免疫アッセイを開発し、次いでＩＬ −１αとＩＬ−１βの検出法を磯供することができることを指摘している。この方法では、１ピコモル以下のレベルでＩＬ−１αと１１゜−１βの検出ができる２つの別々の比色サンドウィッチ酵素免疫アッセイを使用している。しかし、そこで使用された抗体は、ウサギ又はヒツジのポリクローナル抗体である。

しかし、モノクローナル抗体の性質、特に、その大きな特異性と感受性を、■し刊αと！し一１βを別々に測定するのに利用しうるのが好ましいのは明らかである。

山中ら［ＴＡＮＡＫＡ　ｅｔ　ａｔ、　ＥＵＲ，Ｊ、　ＩＭＭＵＭＯＬ、　（１９７８）、　１７．１５２７〜１５３０頁コは、生体外で末梢血液単核細胞から作られたＩＬ−１αとＩ　Ｌ−１βを、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を使用するサンドウィッチ酵素免疫アッセイにより測定することを提案した。

すなわち、ウサギの抗ヒト１１．、−１αモノクローナルＩｇＧ１又は抗ヒトＩし一１β　ＩｇＧ１でコートしたポリスチレンビーズを、組喚え体ヒト１１．− １α、組換え体ヒトＩｔ、−１β又は単核細胞の培養上澄液とともにインキュベートし、次いで洗浄後に、抗ヒト１し一１α　Ｆａｂ“／ペルオキシダーゼ抱合体又はアフィニティ精製を行った抗ヒト１シ＝ｌβＦｉｂ’　／ペルオキシダーゼとインキュベートする。なお、使用した第２の抗体は、ウサギ抗ＩＬ−Ｌα又は抗ＩＬ−１βポリクローナル抗体である。

抗ＩＬ−１α抗体及び／又は抗ＩＬ−１β抗体は他の特許出願にも記載されている。

大塚鯛薬のヨーロッパ特許出願第２６７゜６１１号には、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗１し−１βモノクローナル抗体が記載され、これらの抗体のアフィニティ恒数は３．６Ｘ　１０″＠Ｍ／Ｑのオーダーである。

イムネクス（ｌｌｌｌＭＵＮＥＸ）　（Ｄ　ヨー　（７ツバ特許出願第２４５，０５２号には、ことに、（ａ）ＩＬ川を含有しているとみられる生体液のサンプルと、ＩＴ、−１に特徴的な第１抗原部位に特異的な第１抗体との反応と（ｂ）第１抗体とＩ　Ｌ−１との反応を検出することからなる！し−１の関与する炎症の検出法が記載されている。このイムネクスの特許出願に特に記載された抗体は、ＩＬ−１αと特異的に反応するモノクローナル抗体（１５Ａ４と命名したモノクローナル抗体）と、ＩＬ−１βと特異的に反応するモノクローナル抗体（７Ｂ４と命名されたモノクローナル抗体）である。

しかし、この出願に記載の抗体は、１ノナグラム／Ｒ（ｌ以下のインターロイキン濃度は測定できない。

ヨーロッパ特許第２２０，０６３号（大日本）は、その１部に、Ｉ　Ｔ、−１に対する抗体が記載され、この抗体は特に競合法又は免疫測定法に用いられている。このアッセイでは、この抗体を用いて、感度は、競合法で０．１βｇ／ｍＱのオーダーおよび免疫測定法ではＯ，ｌｎｇ／ｘ１２のオーダーに過ぎない。

一般的に言って、□先行技術の抗体類は、非常に敏感なＩＬ−１アツセイ（１ピコグラムのオーダー）に適用するのに十分な親和性をもってない。

本噸出噸人のフランス特許第８３７１３，３８９号では、酵素免疫アッセイを行うため、抗体、抗原又はハプテンがアセチルコリンエステラーゼと共有結合している抱合体を提案し、この新しい抱合体によって、その酵素の性質によって、１ナノグラムのオーダーのごとく少量の酵素免疫アッセイを行うことが可能に４３６〜４５０頁］は、アセデルコリンエステラーゼでラベルした抗原からなる上記特許による抱合体を、メンブレンコンプレックスであるフォトシステムＩ（ＰＳＩ）の末梢タンパク質に対するモノクローナル抗体のスクリーニングに応用することを記載している。著者はこの方法を輪台免疫アッセイでテストし、異なる生物学的抽出物中のＰＳｌポリペプチドを非常に正確に定量することを可能にしている。この免疫酵素試験法は、Ｐｓｌを構成する、２つの群のポリペプチドである異なるポリペプチドを認識できる一連のモノクローナル抗体をスクリーニングする試験法であり、次の３つのステップからなる。

−ハイブリドーマの培養上澄液中に存在する抗ＰＳＩモノクローナル抗体が固相に結合し、ＰＳｌの対応するビオデニール化抗原を間接固定化するニーこのビオデニール化抗原がアビジンと強く結合し、アビジン自体はビオチンで標識をつけたＡＣｈＥと結合するニー結合したＡＣｈＥの活性をエルマン比色測定法で測定する。この著者らは、＾Ｃｈｉシステムがモノクローナル抗体の検出限界を著しく改良することを示した。このスクリーニング法は、競合法で、異なるＰＳＩポリペプチドの定攪測定に十分に適用される。

従って、この発明は、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの検出と定量を行う高度に特異的で鋭敏な酵素免疫アッセイを可能とすのに適当な手段を提供することを目的とし、その上この手段は、治療上の応用及び生体内診断への応用も可能である。

この発明の課題は、哺乳動物、特にげっし動物のより詳しくはマウスを、ＩＬ− １αもしくはＩＬ−１βで免疫化することによって得られる、ＩＬ−１αとＩＬ −１βに特異的モノクローナル抗体であり、必要に応じて、天然もしくは組換え体の菖し一１αまたは天然もしくは組換え体のＩＬ−１βを特異的に認識し、かつ実際に、これら２つの１１．、−１間に交差反応を示さないモノクローナル抗体であって：５ｘＩＯ−＋ｏより小さい解離定数を有し、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βの異なる領域を認識するいくつかの群で構成され、いくつかの群の抗体は、他の群のすべての抗体と適合して結合することができ、すなわち、抗！Ｌ− １α抗体が、インターａイキン−１αの３つの異なる領−域を認識する３つの群（Ａ、ＢおよびＣ）で構成され、１つの群の全抗体が他の２つの群の全抗体と適合して結合できるが同じ群の他の抗体とは適合しない：抗ｔｔ、−ｉβ抗体が、４つの群（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）で構成され、その内のはじめの２群（ＡとＢ）が抗ＩＬ−１α抗体と類似の挙動をし、その内の０群の抗体がはじめの２群の各々の１つだけの抗体と適合し、その内の第４群（Ｄ）の抗体がはじめの３群のどの抗体とも非適合性で、組換え体の未変性ＩＬ−１βと結合せず、これらの抗体は、修飾されたインターロイキン１βを認識しかつＩＬ −１β／ＡＣｈＥｔ！ｌ！１合体と反応し：ならびに前記抗ＩＬ−１α抗体と抗ＩＬ−１β抗体がｉｔ、−ｉαもしくは菖Ｌ−１β／アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）　抱合体を認識する：ことを特徴とするモノクローナル抗体である。

これらの抗体は、事実上、２つのＩ　Ｌ−１の間の交差反応（＜　０．０１％）を示さない。

この発明による、インターロイキン−１αとインターロイキン−１βに特異的なモノクローナル抗体は、特にげっし動物のような哺乳類、さらに詳しくはマウスから得られ、マウスがインターロイキン−１αもしくは一１βを適切に注射することによって免疫化され、免疫化された哺乳動物のＩ？職細胞を、適切な方法で、同じ種の哺乳動物の骨髄種細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養し、必要に応じて、抗インターロイキン−１αもしくは抗インターロイキンｌβの抗体が検出された上澄み液中のハイブリドーマをサブクローン化して、対応するインターロイキンによって、抗Ｉし一１αもしくは抗ＩＬ−１βのモノクローナル抗体を分泌する細胞系が得られる。

上記哺乳類を免疫化するのに用いるインターロイキン−１αまたは一１ｂは、精製された天然のインターロイキンまたは組換え体インターロイキンであってもよい。

発明の抗ＩＬ−１αと抗１１．−１βのモノクローナル抗体を得るのに用いられるハイブリドーマは、パスツール・アンスティチェ（ＰＡＳＴＥＵＲｌｌｌ５ＴＩＴＵＴ［：）　（、−所属す４ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ　ＩＩＡＴＩＯＩＩＡＬＥ　ＤＥ　ＣｔｌＬＴｔｌＲＥｓ　ＤＥ　ＭＩＣＲＯＯＲＯＡＩＩｔＳＭＥＳ　（ＣＮＣＩＩ）　ニ１９８８年１２月８日に寄託したものである。寄託されたハイブリドーマは、次の番号１８２３、ｌ−８２４、ｌ−８２５、ｌ−８２６、菖 −８２７、Ｉ　−８２８および１、−８２９で表示されている。

またこの発明の課題は、アセチルコリンエステラーゼと、抗１１、−１αもしくはＩｔ、−１βのモノクローナル抗体もしくはこれらの抗体の断片物にＦａｂ’ 断片との抱合体である。

さらに、この発明の課題は、この発明の抗インターロイキン−１αもしくは一１ βのモノクローナル抗体のＦａｂ’断片の製造方法である。この方法によれば、前記モノクローナル抗体を、酸性培地中ペプシンで処理しＦ（ａｂ’）を断片を得て、これを分子ふるいクロマグラフィーで単離し、次にこれらのＰ（ａｂ’）を断片を、特にβ−メルカプトエチルアミン（β−ＭＥＡ）のような適切な還元剤で制御された還元反応に付してＦａｂ’断片を得、これを分子ふるいクロマグラフィーのカラムを通過させて精製する。

またこの発明の課題は、ＡＣｈＥと、抗１１．−１αもしくは抗！Ｌ−１βのモノクローナル抗体との抱合体、お上びＡＣｈＥと、前記モノクローナル抗体の断片、特にＦａｂ’断片との抱合体の製造方法であり、上記抗体もしくはその断片の１つに組み込んだかもしくは天然に存在する少なくとも１つのチオール基を、ＡＣｈＥに組み込まれた少な（とも１つのマレイミド基に、特にトスクシンイミジル４−（トマレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード（ＳＭＣＣ）のようなトスクシンイミドエステルのごとき適切なカップリング剤で、結合させることを特徴とする製造方法である。

さらにこの発明の課題は、細胞培養物の上澄液と生物学的流体中のＩＬ−１αと！し一１βを検出する鏡台免疫酵素試験法で、この方法は、第１抗体として使用されるこの発明の抗ＩＬ−１αもしくは抗！Ｌ−１βのモノクローナル抗体と、第２抗体として用いられる、適切な固体支持体に保持されたＩｇＧとを、トレーサーの役割をするＩＬ−１／ＡＣｈＥ抱合体と接触させ、インターロイキン−１ αもしくは一１βに続いて＾ＣｈＥ活性を適切な手段で見えるようにすることを特徴とする方法である。

またこの発明の主題は、適切な支持体に保持されたこの発明の抗ＩＬ−１αおよび／または抗！し一１βのモノクローナル抗体（ｎ＋Ａｂ）を、ＩＬ−１ａもしくはＴＬ−１βおよび＋ｓＡｂ／＾ＣｈＥ抱合体に接触させ、続いてＡＣｈＥの活性をいずれかの適切な手段によって目視可能にすることを特徴とする、細胞培養物の上澄液及び生物学的流体中のＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを検出する高度に特異的で鋭敏な酵素免疫試験法である。

これらの酵素免疫試験法の態様によれば、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１β、拘＾ｂ／＾ＣｈＥ抱合体と同時に、抗体に添加され、２つのモノクローナル抗体はＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βと同時に反応する。

これらの酵素免疫試験法の他の態様によれば、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βかまず導入され、その抗体と反応し、次いで翔＾ｂ／＾ＣｈＥ抱合体が続いて導入され、＾ＣｈＥ活性を適切手段で目視可能とする。

適切な支持体は、特に微小滴定用プレート、もしくは前記抗体が結合できる粒子の形態の支持体である。

さらに、この発明の課題は、ウサギ抗（マウス）　ＩｇＧからなる抗体でコートされた一連の微小滴定用プレート；適切な投与量の抗！Ｌ−１αモノクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体が入っている少なくとも１っＩＬ−１αとＡＣｈＥの抱合体の入った少なくともひとつのびんおよび／またはＩＬ−１βとＡＣｈＥの抱合体の入った少なくともひとつのびん；ＡＣｈＥを目視可能にする物質の適切な量もしくは適切な投与量！Ｌ−１αおよび／またはＩＬ−１βの適切な量もしくは投与量：からなることを特徴とするこの発明の鏡台免疫酵素試験を行うためのキットである。

−またこの発明の課題は、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体および／または抗体ＩＬ−１βモノクローナル抗体でコートされた一連の微小滴定用プレート：ＡＣｈＥと抗ＩＬ−１αおよび／または抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の抱合体の入った少なくとも１つのびん：＾ＣｈＥを目視可能にするための基質の適切な量もしくは投与量適切な潰もしくは投与量のＩＬ−１αおよび／または１シ＝ｌβとからなることを特徴とするこの発明の酵素免疫試験法を実施するためのキットである。

この発明の課題は、さらに、活性成分として、この発明の抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体および／または抗Ｉし一１β抗体および／またはその断片の単独、もしくは池の物質との、抱合体もしくは雑種形成体もしくは結合体で構成されて、いるかまたはこれらを含有することを特徴とする治療用の試薬である。

この発明によれば、前記の抗ＩＬ’−１αと抗！し一１βのモノクローナル抗体の特に有利な治療用途はその１し一１阻害活性である。

またこの発明の課題は、抗体および／またはへブタンおよび／または他の抗体もしくは抗体断片と組合せ、および／または安定なもしくは放射能の標識で標識をつけた、抗ＩＬ−１α抗体および／または抗ＩＬ−１β抗体またはそれらの断片からなることを特徴とする生体内診断に用いることができる診断薬である。

この発明には、上記の態様とは別の態様が含まれるが、これは以下の説明で明らかになるであろう。

この発明はこの発明の実施例を参照し、グラフで示す添付図面（第１図〜７図）を参照して以下に述べる説明によってより容易に理解されるであろう。

第１図：異なる２対のモノクローナル抗体の比較をＣた場合の、ＩＬ−１αのイムノアッセイの標準曲線に対する血清の非特異的効果。

第２図：酵素反応に帰因する、ＩＬ−１βと時間についての校正曲線の変化（目視化段階）。

第３図：酵素反応に帰因する、ＩＬ−１βと時間に関する試験における“誤差プロフィル°の変化（目視化段階）。

第４図；ヒトの単核細胞、リンパ球および好中球のＬＰＳで刺激されなかったもの（口、−）およびＩＰＳで刺激されたもの（◆、◇）の遠心水ひ法で精製して得た上澄み液中の特異的なＥ１＾で行ったＩＬ−１α（口、◆）およびＩＬ−１ β（■、◇）の生体外放出。

第５図：培養上澄み液または血漿の°スーパロース　１２”（ＳＵＰＥＲＯ３Ｅ　１２）分子ふるいクロマトグラフィーによるｒＬ−１αの免疫反応性の分布。

第６図：ＩＬ−１αの競合検定法を用いる従来技術のキットの検出限界。

第７図：１Ｌ−１βの免疫放射能検定法を用いる従来技術のキットの検出限界。

しかし、これらの実施例と図面はこの発明の課題を例示するだけであり、この発明を限定するものではないことは明らかに理解されるべきにである。

実施例１：　この発明の試験の実施：試薬（モノクローナル抗体と抱合体）の調製および試薬選択のためのパラメータ【、アセチルコリンエステラーゼの精製と制御電気うなぎ［エレクトロホラス・エレクトリクス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓ　ｅｌｅｃＬｒｉｃｕｓ）　］から得たアセチルコリンエステーセ（ＡＣｈＥ）を誦＾５ＳＯＵＬ　Ｉ　ＥとＢＯＮが報告した方法［Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｅｓ、　（１９７６）、６８．５３１−５３９頁］によるアフイニテイ　り口マトグラフイ−で精製した。テトラマー形の酵素またはＧ４形をインターロイキン類と抗体類に標識をつけるのに用いた。＾ＣｈＥ活性は、ＥＬＬＭＡＮらの比色法［ＢＩＯＣＩＩＥＭ、　ＰＨＡＲＭ、　（１９６１）、７．８８＝９５頁］を用いて測定した。！エルマン単位は、１１１２の媒体とＬｃｓの光路長で２５℃で１分間に１　００の吸光度の増加をもたらす酵素の量として定義される。

この単位は約８ｎｇの酵素および７．３２酵素単位に相当する（なおｌ酵素単位は、２５℃で１分間に１　ｕｌｌｏｌのアセチルコリンを加水分解する酵素の量に相当する）。ＡＣｈＥの濃度は、部位当り４．４Ｘ　ｌｏ’ｍｏｌ／ｈの触媒定数と触媒サブユニットに対して８０ＫＤａの分子量を用いて酵素で測定した。

これらの値から酵素の１．８アットモル（１０１モル）の検出限界を６４形に対して計算することができる（すなわち、２０μｅのエルマン媒体中、０．５ｃｍの光路長で１時間で０．０１０Ｄの吸光度の増加をもたらすＡＣｈＥの量）。

２、免疫化とハイプリドーマの産生法抗インターロイキン−１αと抗インターロイキン−１βの抗体は、　−下記の免疫化法を用いて、Ｂｉｏｚｚｉ　Ｈ４ｇｈ　Ｒｅ５ｐｏｎｄｅｒ（ＨＲ）系マウスに産生させた。ゼロ０目に、１５μ９の組換え体インターロイキン−１αまたは一１βをフロイント完全アンジ二バント中に乳化させて、上記マウスの足の裏の厚肉に注射した。このマウスを、高体温のような副作用を避けるためにアスピリン（０，ｌｕ／ｄａｙ）で治療した。第１ブースター注射（足の裏の厚肉）を２１日０に行い、１週間後採血した。マウス抗インターロイキン抗体の、対応する血清中の存在を、該抗体の、インターロイキン−１／ＡＣｈＥ抱合体と結合する性能を試験することによってモニターした。これらの試験は、次にハイブリドーマ培養物の上澄液をスクリーニングするのに用いるのと同じ方法を利用して、第２のｌｆｔ　（ｖつＸ）　ＩｇＧ抗体でコートした微小滴定用プレートで実施した。各インターロイキン−１について、酵素免疫検定法で最高滴定量を示すマウスを、モノクローナル抗体の製造用に選択した。この段階において、１／１．０００〜ｌ　／１０．０００の滴定量が観察された。選択したマウスに静脈内ブースター注射（７μ２のインターロイキン）を後記融合を行う２〜３日前に行った。前記のＧＲＡＳＳＥらの報告に記載されているように、対応するマウスの評職細胞をＮＳＩマウス骨髄種細胞と融合させた。

３、インターロイキン類のＡＣｈＥによる標識づけインターロイキン−１αとインターロイキン−１βとを、ウシ酸性成長因子（ａＰＧＦ）とラブドプロラクチンの標識化について知られている技術を用い、ヘテロ２官能性試薬すなわち、トスクシンイミジル４−（トマレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルメボキシラート（ＳＭＣＣ）によって、ＡＣｈＥと共有結合させた。

この方法は、チオール基（予めインターロイキン類に導入されている）と、５ｖｃｃとの反応で酵素に組み込まれたマレイミド基との反応で構成されている。インターロイキンの第１級アミノ基とトスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートＣ５ＡＴＡ）とをアルカリ性媒体中で反応させることによってインターロイキンをチオール化した。

一チオール基のインターロイキンへの組み込み：２、’ｌｕ／峠の５ＡＴＡを含有する無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液のｌＯμＱを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ８）　２００μＱ中に溶解したインターロイキン−１αもしくは葺βの１００μ９に添加する。この混合物を３０分間２５℃で反応させ、次いでヒドロキシルアミンの１Ｍ溶液（ｐｉ（７）２００μＱを添加する。さらに３０分間２５℃で反応させた後、過剰の試薬（５ＡＴＡとヒドロキシルアミン）を、５ｘｌＯ−”Ｍ　ＥＤＴＡを含有するｌＯ−ＩＭリン酸曖衡液（ｐＨ６）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１５Ｘ１ｃｍ＋）の分子ふるいクロマトグラフィで除去する。クロマトグラフィの前後において、溶離液は、溶解酸素を除き、チオール基の起こりうる酸化を避けるために、連続窒素流下に保持する。

チオール化されたインターロイキンを含有する両分を合わせる。２８０ｎｓでの吸光係数がＩ？−’Ｌｅｅ−’で分子量が１７．Ｇｏｏであると仮定して紫外分光測定法で、インターロイキンの濃度を測定した。そのチオール基含量は、０．５ｍＭ　３．５゜−ジチオビス（ニトロ安息呑酸）（ＤＴＭＢ）と反応させた後、比色法（４１２ｎｍ）で測定した。これらの測定によって、インターロイキン分子当り、はぼ１つのチオール基が組込まれていることが分かった。

一マレイミド基のＡＣｈＥへの組込みと、チオール化されたインターロイキンとの結合：マレイミド基をＳＭＣＣとの反応によってＡＣｈＥ　（Ｇ　４形）に導入したが、得られた＾ＣｈＥ−８ＭＣＣ製剤は、直ちに使用しない場合、−８０℃に凍結して貯蔵され、その反応性は少なくとも数週間失わない。チオール化されたインターロイキンとＡＣｈＥ−８ＭＥＣ（Ｇ４形）製剤とは、分子ふるいクロマトグラフィで単離して直ちにまたは解凍してできるだけ速かにこの両者を混合することによって両者を結合させた。この段階では（ＳＨ−インターロイキン／Ｇ　４ −ＳＭＣＣ）分子比５０：１を用いた。３０℃で３時間反応させた後、未反応のインターロイキンを、０．５ＭバイオゲルＡ（Ｂｉｏｇｅｌ　Ａ）のカラム（９０Ｘ１．５ｃ■）を用いるクロマトグラフィで除去する。得られた抱合体は一２０℃で凍結状部で貯蔵する。

酵素活性の喪失は上記結合の全工程中全く観察されなかりた。

璽年間のこれらの貯蔵条件下で、抱合体の免疫学的特性もしくは酵素特性の有意な変化は全く起こらなかった。

４、モノクローナル抗　のＡＣｈＥによる標識づけモノクローナル抗体（＊Ａｂ）を、従来技術に記載の方法により、カプリル酸と硫酸アンモニウムとで沈澱させることにより腹水から精製した。得られた製剤の純度は、変性条件および還元条件下でポリエクリルアミドゲル電気泳動法によって試験した。

２種の標識化法を、精製ｓＡｂをＡＣｈＥに連結するのに用いた。

４　ａ　）　ｇ＋Ａｂのビオチンによる標識化ビオチンの活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＩＢＦ、フランス）を抗体の第一球アミノ基と反応させることにより上記のようにして、ビオチンを曽＾ｂに共有結合させた。

上記の活性化エステルは無水ジメチルホルムアミドに溶解し、標識付けする抗体のアルカリ性溶液に添加した。　５ｍｇ／ｍＱのビオチンエステルを含有するＤＭＦによる溶液４０μｅを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８゜５）の２ｚＱに溶解した１１１１９の抗体に添加した。室温で３０分間経過後、２ｚＱのＥＩＡ緩衝液（後で定義する）を添加した。得られた製剤を、さらに精製することなく、各種の−Ａｂの“結合不適性”を測定するために用いた。この製剤は凍結状態にて−２０”Ｃで貯蔵した。

４　ｂ　）　Ｆａｂ’ａｂ’ＡＣｈＥによる共有標識化他の酵素で抗体断片に標識をつけるｌ５ＨＩＫＡＩＡらが発表した方法（Ｊ、　ＩＭＭＵＮＯＡｓｓＡＹ、４＠、２０９−３２７頁、１９８３年）に由来する方法を用いることによって、＋ｎＡｂのＦａｂ’ａｂ’ＳＭＣＣによってＡＣｈＥに共有結合させた。用いたこの方法の原理は、結合反応　′に関与するチオール基が対応するＦ（ａｂ’ ）ｓ断片の還元によって得られたＦａｂ’ａｂ’天然に存在することを除いて、先に述べたインターロイキンに標識を付けるのに用いた方法に非常に類似している。

・Ｆ（ａｂ’）を断片の製造Ｆ（ａｂ’）ｙ断片を、ｍＡｂの、酸性培地（酢酸緩衝液、ｐＨ４，３）中でのペプシンによる処理によって得た。５ｘｌＯ−’Ｍ　ＥＤＴ＾を含有する０、１Ｍリン酸綬衝液（ｐ）（６）で平衡化された０、５＋＊バイオゲルＡ　（Ｂｉｏｇｅｌ　Ａ　）のカラム（３０Ｘ　１．５ｃｍ）による分子ふるいクロマトグラフィで、上記の粗製ペプシン処理製剤からＦ（ａｂ’）１断片を単離した。Ｆ（ａｂ’）を画分の純度を、非還元性変性条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動法でチェックした。

これらの測定は全タンパク質含量の８０％以上がＦ（ａｂ’）ｙ断片で構成されていることを示した。

・Ｆａｂ’ａｂ’製造Ｆ（ａｂ’）＊断片を、Ｏ，１Ｍ　β−メルカプトエチルアミン（βＭＥＡ）の存在下３７℃にて１時間還元した。チオール化インターロイキンについて先に述べた、セファデックスＧ２５のカラム（３０ｘ　１．５ｃ＋ｅ）の分子ふるいクロマトグラフィで、過剰のβ−ＭＥＡを除去した。Ｆａｂ’ａｂ’濃度を、２８０ｎｍおける吸光係数がｔ、４ａｇ−’、　Ｌｃａ＋−’、分子量が４６．ＯＯＯテあるとして紫外線分光法で測定した。Ｆａｂ’　制剤のチオール基含量は、チオール化インターロイキンの場合と同様に、ＤＴＮＢと反応させて測定した。

使用したｍＡｂによって、Ｆａｂ’分子当分子−４のＳｌ＋基の値が得られた。

・マレイミド基のＡＣｈＥへの組込みとＦａｂ’ａｂ’のカップリングＳＭＣＣと反応させ次いで精製することによってマレイミド基をＡＣｈＥ　（Ｇ　４形）に導入した。酵素とＦａｂ’ａｂ’のカップリングを、＾ＣｈＥ−３ＭＣＣ製剤（この製剤を分子ふるいクロマトグラフィで単離するか解凍した後直ちに）と、過剰のＦａｂ’ａｂ’を混合することによって実施した。５ｏのモル比をこの段階ではａ常用Ｌ”ル（ｔナワチＦａｂ’＋７）チオール基／Ｇ　４−ＳＭＣＣ）。３０℃で３時間反応後、０．５ｍ　Ｂｉｏｇｅｌ＾のカラムを用いる分子ふるいクロマトグラフィでＧ　４　／　Ｆａｂ’ａｂ’を単離した。抱合体が単一の均一なピークの形態で溶離された。対応する両分を集め、−２０℃で凍結状態にて貯蔵した。結合の全工程中で酵素活性の有意な損失は見られなかった。抱合体の安定性は優れていることが証明された。その理由は抱合体が一２０’ Ｃの凍結状態もしくは凍結乾燥状態、らしくは４℃の液体状部で、その酵素特性もしくは免疫学的特性を失うことなく、貯蔵することができたからである。

５、培養物の上澄液のスクリーニングハイブリドーマ培養物の上澄み液中の抗インターロイキンー１抗体の存在を前述の免疫酵素試験と類似の方法を用いて検出した。この培養上澄み液を、第２抗（マウス）　）ｇＧ抗体とインターロイキン−１／ＡＣｈＥ抱合体とでコートされた微小滴定用プレート中で培養した。この段階中、上澄み液中に存在する抗インターロイキン−１ｍＡｂは、ＩＬ−１／ＡＣｈＥ抱合体と固相に同時に結合するので、＾ＣｈＥ活性のプレートへの間接的な固定化をもたらす。さらに、固相にＡＣｈＥが存在していることは、基質を添加し、比色法で測定することによって（洗浄した後）可視化することができた。第２の同相抗体の製法と特性値は公知であり、９６ウエルの微小滴定用プレートに存在する各上澄み液５０μＱを第２抗体でコートされた同じ大きさの微小滴定用プレートに、滅菌条件下で移転させた。ＥＩＡＩＩ衝液に溶解したインターロイキン−１／ＡＣｈＥ抱合体（１工ルマン単位ＩＲＱ）の５０μＣを添加し、得られた混合物を一夜＋４℃で反応させた。この第１反応期を終わった後、プレートを注意深く洗浄し、各ウェルに２００μｇのエルマン試薬を添加した。この段階で、固相に結合した＾ＣｈＥ活性を有するウェルは、濃い黄色に発色し、対応する上澄み液に抗Ｉ　Ｌ−１抗体が存在することを示した。各ウェルの４１４ｎｍでの吸光度は、自動プレートリーダー（Ｔ　ＩＴＥＲＴＥＫ、フィンランド）を用いて、３０分間もしくは１時間後に測定した。このスクリーニング法は、１ナノグラムのオーダーのｍＡｂの量が容易に検出できるならば、ハイブリドーマを非常に迅速かつ有効に選択することができる。そして、２．０００個の上澄み液のスクリーニングを行うのに１人の測定者のせいぜい４時間の作業を必要とするだけである。

６、各対のｍＡｂの結合適合性の測定２つの異なるｍＡｂのインターロイキン−１の１分子に対する結合適合性を、一方のｍＡｂを固相に固定化し、他方のｍＡｂをビオチン分子で標識をつける免疫試験法で測定した。これらの試験を次のように実施した。

希釈はすべてＥ１＾緩衝液で行い、次に組換え体インターロイキン−１αもしくは組換え体インターロイキン−１βを１００ｎｆ／ｉ＋ｅ含有する溶液１００μ ｇを、一方の輸＾ｂでコートされた微小滴定用プレートのウェルに添加した。撹拌しながら室温で１時間反応させた後、他方のビオチンで標識をつけたｍＡｂをｌθμ９／ｍＱ含有する溶液１００μｇを添加した。さらに撹拌しながら室温で３時間反応させた後、プレートを注意深く洗浄した。づきに固相上のビオチンで標識を付けた抗体の存在を、アビジンとビオチニル化＾ＣｈＥの混合物を添加することによって目視可能にした。ＡＣｈＥの面相に対する非特異的結合を、インターロイキン−ｌの代わりに１００μＱの緩衝液を用いた対照実験で評価した。

固相に固定化した■＾ｂと、ビオチンで標識をつけたｍＡｂとが同時に結合した場合には、エルマン試薬を添加すると濃い黄色に発色した。

？、ＩＬ−１αとＩＬ−２βを検出する免疫酵素検定法インターロイキン−１α と一１βについての２種のＥＩＡを開発した。

培養物の上澄み液もしくは腹水由来のモノクローナル抗体を、第一に、トレーサーとしてｊＬ−１／＾ＣｈＥ抱合体を用いる競合免疫検定法で試験した。第２段階では、固相をコートするかまたはＡＣｈＥで標識をつけた、抗インターロイキン＋ｍＡｂを同時に使用する免疫検定法を行った。この免疫検定法に使用した試薬はすべて、上記のＥ１＾緩衝液で希釈した。この緩衝液の組成は、０゜４Ｍ　）ｆａｃｔ、１０−”Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＢＳＡおよび０．０１％のアジ化ナトリウムを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）である。

上記の免疫検定法で述べた濃度はすべて、他の試薬を混合する前の°最初の体積 ”　（競合検定法については５０μＱ、免疫検定法については１００μＱ）中の試薬の濃度を意味する。

−Ｉｔ、−１／ＡＣｈＥ抱合体を用いる競合免疫検定法。

第１抗体としての商＾ｂと、トレーサとしてのＩ　Ｌ−１／＾ＣｈＥ抱　、合体を用いる通常の競合免疫検定法を、ヘプテンもしくは抗原に関する文献に記載しであるのと同様にして実施した。これらの検定は、ウサギ抗−（マウス）ＩｇＧからなる第２抗体でコートした９６ウ工ル微小滴定用プレートで実施した。この第２の固相抗体は、特異的な免疫反応工程中、トレーサーの結合画分と遊離画分との分離を行う。全反応体積は１５０μＱであったが、各成分（トレーサー、ｍＡｂおよび組換え体ＩＬ−１）を５０μｅの体積で添加した。ＩＬ−１／＾ＣｈＥの抱合体は１工ルマン単位／ＭＱのの濃度で使用した。鴎＾１）の作業希釈度は培養物の上澄み液もしくは腹水由来の抗体希釈曲線を作業することによって予め決定した。この試験法の感度は、ＩＬ−１の投与量によって特徴づけられ、競合体が存在しない時に観察される結合が５０％減少するか（Ｂ　／　Ｂ　ｏ　＝　５０　）、または競合体が存在しない時に観察される結合が統計的に有意に減少する［すなわちＢｏ−３ｆｉ準偏差（９９％信頼限界）］。

一５Ａｂ／＾ＣｈＥ抱合体を用いる免疫検定法。

免疫検定法を、モノクローナル抗体の１つでコートした９６ウエルの微小滴定用プレートで実施した。このコーティングを前記の第２の固相抗体について記載したのと正確に同じにして実施した。要約すると、微小滴定用プレートのウェルを、５×１０−１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４］、：溶解しり１０ｕ９／　１１２（７）　ｍＡｂを含有する溶液２００μＱで満たした。−夜室温で反応させた後、Ｏ，ＯＳ％のツイーン２０を含有する１０１リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）で、プレートを慎重に洗浄した。次に、少なくとも４時間室温で３００μｅのＥ１＾緩衝液を各ウェルに加えることによって、固相を飽和させた。得られたプレートは使用するまでこの飽和緩衝液中に４℃で保管した。このような条件下で貯蔵した時、少なくとも４ケ月間は、その結合特性に変化は認められなかった。免　 ′疫検定は２つの異なる方法を用いて実施した。

第１プロトコル（“同時プロトコル”と命名されている）は１００μＱのインターロイキン−１溶液（組換え体の標準もしくは試料の形態で導入されている）を、！００μＱの一＾ｂ／＾ＣｈＥ抱合体（通常鳳０エルマン単位ＩＲＱの濃度）とともに微小滴定プレートのウェルに添加することからなるプロトコルである。

この方法では、２つの抗体（固相抗体とＡＣｈＥで標識をつけた抗体）はインターロイキン−１と同時に反応する。試験試料の性質によつて、標準の組換え体インターロイキン−１は、対応する希釈剤、すなわち、培地、血漿もしくは血清に溶解させる。使用される希釈剤はすべて、できるだけインターロイキン−１αもしくは、−１βを欠いていなければならない。このことは、血漿もしくは血清について、免疫試験によって有意な量の１１．−１αもしくは■Ｌ−１βが検出されない個々の液体を選択することによって可能である。ＥＩＡをこれらの媒体中で実施するときは、マウス免疫グロブリン（エールリッヒの腹水液に１／２０の希釈率で導入）が用いられ、免疫反応中に添加して、これらの液中に存在するヒト抗−マウス抗体を中和する。非特異的結合性は、１００μＱの緩衝液もしくは適切な希釈剤を組換え体インターロイキン−１の代わりに加えた別のウェルで評価した。次に、各種の時間、いくつかの温度で、撹拌らしくは撹拌せずに、反応させた。この免疫反応段階のおわってから、プレートを、リン酸緩衝液／ツイーンを用いて慎重に洗浄した。固相に結合されたＡＣｈＥ活性を、２０ｈｉ２のエルマン試薬と添加することによって測定した。

第２プロトコル（′逐次プロトコル”と命名されている）は、インターロイキン −１とｍＡｂ／ＡＣｈＥ抱合体とを別個に反応させることからなるプロトコルである。第１の培養期間中、ＥＩＡ緩衝液もしくは他の適切な希釈剤（培地、血漿など）に溶解されたインターロイキン−１（標準もしくは試料の形態で導入される）の２００μＱを、固相と反応させる。この第１培養が終わってから、プレートを洗浄し、Ｅ！＾緩衝液に溶解したｍＡｂ／＾ＣｈＥ抱合体（通常１０工ルマン単位／Ｉｆｆの濃度）の２０ｈ１２を添加する。第２反応期の後、プレートを再び洗浄し、前述のようにして、＾ＣｈＥ活性を目視可能にする。

標準曲線の“誤差プロフィル°を、すべての測定を（非特異性結合性と標準の測定）８回行うことによって作成した。各投与量について、精度を変動係数（ＣＶ％）によって表し投与量の対数関数として曲線の形態にした。

免疫検定法の感度は、“最小検出可能濃度”　（ＭＰＣ）で特性が評価され、この濃度は標準の組換え体！し−１が存在しない場合に観測される結合性を統計的に有意に増加させるＩＬ−１の濃度に相当する。ＭＤＣは、非特異的結合性＋３ ×標準偏差（９９％の信頼限界）に相当するＩ　Ｌ−１の投与量として計算された。

８、ＦＰＬＣ試験生物学的媒体（培養物上澄み液、血漿）中で免疫検定することによって検出される免疫反応性物質は、ＦＰ、ＬＣ装置と、　Ｅｌ八へ衝液で平衡化されたスーパロース１２カラムとを用いる分子ふるいクロマトグラフィーによって試料を分画することによって特性を決定した。基準の組換え体Ｉ　Ｌ−１と試料を、５００ μＱの容積および２４ｍ１２／ｈｒの流速で注入し、０．８ｍＱづつの画分を集めた。クロマトグラフィーが完了した際、各画分の１００μｅについて前記のようなＩＬ−１αおよび／又は！し一１β試験を実施して試験した。

一溶離された細胞上澄液単核白血球（リンパ球と単球）と、末梢血液のポリモルホヌクレアー（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）白血球（好中球）を、Ｆ　ＩＣ０ＬＬＰＡＱＵＥ（ＰＨＡＲＭＡＣＩ＾ＦＩＮＥ　Ｃ）ＩＥＭＩＣＡＬＳ）を用いて遠心分離することによって得、次いで遠心分離向流溶離法に付して、純粋なリンパ球、単球および好中球を得ることができた。この後、単核細胞もしくはポリモルホヌクレアー細胞を、ベックマン（ＪＥ−６）溶離ローターの分離室に、８または２０ｘＱ／分の流速で、それぞれ２．５０Ｏｒｐｍの一定ローター速度で注入した。溶離緩衝液は、０．２５％のＢＳ八とＺｍＭＥＤＴ＾を補充したダルベツコの飽和ＰＢＳ溶液で構成されていた。プレートは、溶離してから１時間３０分後に注入の流速で洗浄した。単核白ぼ■球の分画を以下のように実施した。純粋なリンパ球は、流速を８肩Ｑ　／　ｍ　ｉ　ｎから２０ｘｆ）／ｎ＋ｉｎに増大することによって得た。５０ｍ＋！の媒体を各段階で集めて、遠心分離を行った（３５０　ｘ　ｇ、ｌ０ｍ１ｎ）、次に細胞のペレットを等張溶液中で一回洗浄し、最後に培地（Ｌ−グルタミン、７５％のウソ胎児血清およびペンストレップ（ｐｅｎｓ　Ｌ　ｒｅｐ）を含有するＲＰＭｌ　１６４０）に懸濁さＵた。純粋なリンパ球の画分（単球＜０，５％）もしくは豊富化単球両分（リンパ球＜２０％）を集めて、１０×ＩＯ＠もしくはｌＸｌ０＠細胞／ｊｌＱにそれぞれ調節した。流速を２０１１１２／ｓｉｎから２５　ｘＱ／ｕｌｎへと０．２５ｔ１２／ｓｉｎづつ上昇させ、ＳａＱづつの画分を集めることによって、好中球は、単球による汚染がなくなった。次に、ローターを停止させて、純粋な好中球を単一画分に集めた。この好中球の両分を等張溶液で一回洗浄し、最後に２０Ｘ　１０＠細胞／峠で培地中に再懸濁させた。培養を、１２ｘ　７２ｍｍのプロピレン培養管内で３７ ℃にて５％ｃｏ、含宵の加湿大気中で実施した。示差白血球カウントを次の方法によって行った。

（１）鋭角光と直角光の分散特性値を用いる流動細胞計測法（２）エステラーゼとライトの染料による非特異的染色法（３）フルオレセインと抱合したモノクローナル抗体を用いる免疫蛍光法、および（４）血小板による汚染についての移相差顕微鏡を用いる分析法である。

細胞生存度は、各実験について、トリバンプルー排除試験法−を用いて通常どおりに行ったが９５％より大きかった。細胞を、５μｖ／ｘＱのリボ多糖（ＬＰＳ）の非存在下および存在下の両方で培養したが、この細胞培養は０．１μＱのインドメタシンの存在下で実施した。異なる時間間隔で、培地を遠心分離しく６００Ｘ９゜１１０分、４℃）、直ちに一２０℃に凍結し、選択したＥ１＾を用いて！し一１αとＩＬ−１βを測定するまでそのまま保管した。

実施例２：抗１１．、−１モノクローナル抗体の特性決定と、免疫検定法の実施各インターロイキンについて、その血清が免疫酵素検定法で最高の滴定値を示したマウスを、選択して融合に用いた。対応４°る胛臓細胞を、前記のようにしてＮＳＩ骨髄腫細胞と融合させた。融合してから１咽間後、約５００のウェルが、両方のインターロイキンに対して、η発に増殖するハイブリドーマをもっていた。マウス抗インター【ｌイキン抗体の存在が、それらの、対応するＩ　Ｌ　−１／ＡＣｈＥ抱合体と結合４゛る能力を試験することによって、培養物上澄み液の全部に確認された。−次スクリーニングにおいて、９０と１１６の強い陽性の培養物上澄み液が■１、−．１αとＩＬ−１βそれｅれについて検出された。希釈を制限することによって対応するハイブリドーマをサブクローン化し、抗体を分泌する細胞系を得たが、この細胞系は安定で各培養物にとって独特なもので７５ −た。最後に３６と１１の細胞系を、ＴＬ−１αと１シー１βそ１しぞれについてい安定化した。クローンが誘導されるインター（ｌイキンによってαもしくは βの文字の前の数字で、全クローノを特徴づけた。クローンを腹水１１膿として培養し、カプリン酸と硫酸アンモニウムで沈殿させることによってモノクローナル抗体を腹水から精製した。オフテルロニーの二重拡散法によ−・て、イソタイプ（１ｓｏＬｙｐｅ）を腹水から測定した。全ｍＡｂが１（軽鎖を有ずろＩｇＧであったが、サブクラＩＩ表：抗ＩＬ−１αでツク【１−ナル抗体に）いての結合適合性試験の結果標識をつけたＭＡＩ３結合適合性試験を、実施例１に記載してようにして実施した。

黒丸印は、固相に固定化された一＾ｂと漂識をつけた一＾ｂとが同時に結合することが観察された対を示す。表示を明確にするため、同じ定義を有する一＾ｂを３ツのカテゴリー（八〜Ｃ）にグループ分けした。

菖ｇＧ、である餉＾ｂ璽００（Δグループ）と、５Ａｂ５０と１７６（１３グループ）とを除いて、全輪＾ｂがザブクラスＩｇＧ１のｓＡｂである。

第１１表：抗ＩＬ−１βモノクＣ１−ナル抗体についての結合適合性試験の結果標識をつけた鯖＾Ｂ結合適合性試験を、“実施例１に記載したように実施した。黒丸印は、固相に固定化されたーＡｈと標識をつけた謁＾ｂとが同時に結合するのが観察された対を示す。表示を明確にするため、同じタイプの結合性を示すｍＡｂを４つのカテゴリー（八〜Ｄ）にグループ分けした。齢１）の１ｇＧサブクラスは最後の欄に示しである。

培養物の上澄み液と嗅水の両方を、トレーサーとしてＩＩ、−Ｉ／＾ＣｈＥ抱合体を使用・１°ろ輪金免疫酵素検定法で使用した。はとんどの場合（り（１−ン β２Ｇとβ５４を除り）、標準曲線は、基準生成物として、組換え体の口、−１ αとＩＬ−１βを用いて作成することができた。Ｂ／＋３０＝５０％と定義すること、これらの検定法の感度は、４〜１００ｎｆ／ｍｌ！である。最高の場合、Ｉｎｆ／１１２の最小検定可能濃度を計算ずろことができた。金賞＾ｂは、これらが対応するインター（Ｚイキンに対し非常に特異的であることを示した。というのは、ｌし一１αとＩＬ−１β間には交差反応性−が全く存在しないかごくわずかに弱く存在することが測定できたからである。１し一１αに対するこれらの競合検定法の中のいくつかの特徴と、ヒツジもしくはウサギのポリクローナル抗体で得られた結果を、案内として下記第■表に示す。

第■表：ボリクロー＋ル抗体らしくはモノクローナル抗体およびＩＬ−１α／＾ＣｈＥ抱合体を用いろ、１１．−１αの輪金免疫酵素検定法の主な特徴傘１１／Ｒｏ　：　５０％とは、競合式゛が存在しない場合に観察されるトレーサーの結合を５０％減少させろ投与哨に相当する。

この発明のｍ要なＬｌ的の１−）は、１１．−１αと１シーｌβの両者の２つの部１カの免疫検定法を開発オろことである。つまり各インターロイキンと同時に結合できるｍＡｂの対がどれなのかを決定することが適切である。結合の相補性のこれらの試験は、−Ａｂの一方を固相に固定化し、叱方のｍＡｂをビオヂン分子で標識を付けて実施した。この段階ではビオチンによる標識付けが選択された。その理由は、それが、多数のｍＡｂ（４０を越える）を数分間で標識を付ける二とができろ好ましい簡単な方法だからである。さらに、アビジンと、ビオチンで標識をつけたＡＣｈ）：の混合物を次に使うと、固相に固定化されたビオチニル化抗体の鋭敏な検出を行うことができる。

前記の第１表と０表は、ＩＴ、−１αと菖し一１βそれぞれについてのこれらの相捕試験の結果を示す。富１、−奮αの場合、■し一１α分子の３つの異なる領域に生じるエピトープを認識する３群の−＾ｂがあることが分かる。これらの群は、八、ＢおよびＣｎと呼ばれるが、ぞれぞそ■１０．２５およびｌのモノクローナル成体をもっている。Ｉ　ｉｔのｍＡｂはすべて、他の２ｎの全ｍＡｂと適合しうる結合性を示すが、興＾ｂはそれ自体らしくは同じ群のｍＡｂと同時に結合することはない。１１．−１βの場合、情況はそれほど明らかでない。実際に４つの異なる群が観察される。最初の２ｆｆｌ（Ａお上びＢと呼ばれ、それぞれ４と３のｍＡｂを有する）については、ＩＬ−１αについて観察されたのと類似の論理的挙動（第［１ａ蒙ＩＷＤｈ（ｌ［Ｊれ４゜Ｆ３Ｆｌｉ（Ｃ）Ｃ！、へ群とＢ群のｍＡｂ（それぞれβ２８とβ３８）とだけ適合する２つのｍＡｂを含んでいろ。最後に、Ｉ）Ｉｔｌは、他のどの固相−Ａｂも固定化できない２つの請＾ｂを含んでいろ、、′ａ合した結合性を示しうるｍＡｂの幻をすべて決定した後に、鋭敏で特異的な信頼性のある免疫検定法を開発する観点から最適の性質を示す対を、各インター口イキンに対して選択４°グ１問題がある。この選択は、共有−＾ｂ／＾ＣｈＥ抱合体（およびビ１千）でｔｆｉ識されたｍＡｂではない）を用いて実施すべきであるうその理由は、これらの抱合体によってインターロイキンをより鋭敏に検出できるからである。ＩＬ−１βの場合は、２９Ｐｐ、の１り脂性しかないので、この選択は容易に実施できる。そして９−２の対応する口＾ｈ／＾ＣｈＥ抱合体を製造することを選択するように提案された。しかしこれは、ｆＬ−１αの場合には困難なことが分かった。というのは５７０種の可能性が存在することが確認されにノ！けでなく３６の一＾ｂ／＾ｃｈＥ抱合体を製造ずろことはかなりの作業であるからである。この理由のため、使用される方法は変更された。すなわち、第１段階では数種の＋ａＡｈ／＾ＣｈＦ、泡合体を製造し、次に関連する固相全体に対して試験した。対応オろ結果をη慮して、最高の結果（ずなわら所定投与爪のインター【１イキンに対する一＾ｂ／＾ＣｈＥ抱合体の最大の結合性）を得たｍＡｂに一識を付け、対応する固定化されたー＾１）を用いて、それらとの３入駒を続けた。したがって抗体α５．α２９．αｌ　１１０　、α１／ｌ７（Ａ群）、α１７６、α３９（ＢＩ′ＩＴ）およびα＋　ｏ　＋　（ｃｌｔＴ）を、連続的にＩ識付けして試験した。

この方法によって、各１１．−１をより鋭敏に決定できる少数の対を示すことができろようになった。、ｌ［、−１αについて、最高の結果は、αＩ　（ｌ　Ｉ　＜固１１らしくはトレーサーとして）、まｔ二はΔ訂のトレーサーと１３群の固ｔｌｌをＩｌｌいることによって１ｖ＃られた６　Ｔ＋、−１βの場合、固１１としてのβ７９と、トレーサーとしてのβ７０／＾ＣｈＥとでＩｌｌ　！＋ｃされる対は、他のすべての対より著しく優れていることが分ｉｒｚった。最適の対の最終的な選択は、シグナルの強度だけでなく、池のｆシタ−ロイキン類もしくは順縁物質との交差反応性がないこと、非特異的結合性のレベル、および生物学的媒体（ｌＩＩＬ蓋らしくは血清）によってもたらされる非特異的効果を含む池の基準ら考゛慮して実施した。特異性の基準は、必須のものではない。というのは試験された対のすべてが、他のインターロイキン（＋ＬｉαらしくはｒＬ− １βおよび！Ｌ−２）と非常に弱い交差反応性を示すからである。しかし弱い非特異的結合性を示す対を選択することが重要である。

その理由はこの結合性が試験の感１ｆに重大な影響を与えるからである。同嫌に、これらの媒体中で行われる測定の有効性を強化するために、生物学的媒体による非特異的効果を最小にすることが必要である。最終的に以下の対を選択した。

ずなわら固相上のα１８５−）＋１．、Ｉαに対するα２９−＾ＣｈＥ、および固相、上のβ７９＋ＩＬ−１βに対するβ７０／＾ＣｈＥである。ＩＬ−１βの場合、特に、この対は非常に弱い非特異的な結合性を有することを特徴とする特１／４的効果にはごく少ししか感度を示さないから、上記の選択が行われた。後者の特徴は、第１図に示してあり、第８表には、・１℃で一夜培捜した同時法の場合の、■＋、−１αとＩＩ、−１βを検出４°ろ試験の１ミな特徴が要約されている。

この２つの検定法は非常に鋭敏のようである。なゆぜならば、４βｇ／ｌｌＱより小さい最小検出可能濃度を、酵素測定のために３０分間を用いて、各ｒンクー［Ｉイキンについて計算できたからである。酵素反応（ＩＩＩ視化膜化段階長く続く場合、感度の増大が認められた。このような場合、２βｇ／＊Ｃより低い最小検出可能濃度を得ることができろ（上記第■表参ｊ、Ｉｔ　”）。

（以下余白）酵素測定に起因する、校正曲線の時間による変化をｗｔｚ図に示す。

この感度増加は、第４図に示°４゛ように、校正曲線の下部の測定精度の増大によってらたらされ１時間のよる°誤差のプロフィル”を変化させる。最、１の結果（感度について）は、＋４℃での一夜の免疫反応を用いて得られた。しかし優れた校正曲線は、＋４℃での（３〜５時間）の短い反応時間を用いて得られた。

すべての場合に、ｌ　Ｏｐｑ／＊Ｉ２より小さい最小検出呵能濃度が認められた。室温もしく！ｊ３７℃で検定を実施することは、これらの結果に全く影響がない。

実施例３；培地内での１１．−１αとＩＬ−１βの測定―ｌ激された培地のｊ：ｒｎみ液中の２つのインターロイキンの測定を校正曲線を用いてＪ≦施した。、培地中に１０％のウシ胎児血清が存在すると、校正曲線の傾斜に不利な影響を与えることなく非特異的結合性が著しく減少することに留金ずべきである。

これらの試験法によ・て、これらの検定法で培養物の上澄み液中の目１１様の免疫反応性物質の有〃Ｊな検出ができ、その免疫反応性の出現が細ｌ１匁の刺激に関ｉ！！ケることか判明した。代表的な例を第４図に示・１“が、この図は、５ｕ９／Ｉ（！のリボ多糖で刺激された、溶離されノニヒト白ｌ１ｌＬ球（単球、リンパ球もしくは好中球）の上澄み液中の目、−１αとＩＩ、−１βの濃度の時間による変動を示す。

実施した測定の有効性を確認４°るために、同じ試料を、口。

−１αと口、−１βの両方で刺激された梓＠＃、芽細胞によるＰ　Ｇ　Ｆ！　＊の放出を測定することに基づいたバイオアッセイを用いて試験した。対応する校正曲線を第５図に示す。得られた結果は、第６図に示すが、これらの結果は、免疫測定法を定性的に確認し、その結果免疫検定法の特異性を証明している。

培養物の上澄みｅｉ（らしくは細胞内細胞抽出物）中に検出される物質と、校正曲線を確立するのに使用された組換え体ＩＬ−１の性質が同一であることは、３　Ｆｌｌ、の制御された形式の実験で確認されている。第１の実験は、培地中の試料を希釈する実験であるが、校正曲線に平ｉ′ｒな希釈曲線を与えた。この結果を以下の第７表に示すが１種々の希釈魔で実施したＩシー１αと１１７−１β に関する２つの１＋′４なる試験の結果を示４°。類似の結果が、試験した試料全部について得られた。

第ｖ表−校正曲線と試ｔ１を希釈しｌ二ときの曲線との間の類似性の例証試料へとＢを第７表に示４゛ように希釈し、ＥｌＡ法でＩＬ−１αと１１．−１ βを検出する試験をした。希釈曲線とその校正曲線の両方は、培地（ｒｔｒ’Ｍ＋　１１０％のウシ胎児血清）中で作製した。校正曲線と試料を希釈したときの曲線との類似性を明らかに示すために、生データに希釈率を乗じて、上記表に示した。

試料Δ：　’ｒ　Ｎ　Ｆαで刺激された培養物中の肺胞マクロファージの上澄み液。

試料Ｂ：培養物中の肺胞マクロフイージの細胞内抽出物。

またこれらの試験結果は回収試験によって確認されているが、試料に導入された既知弔の組換え体ＩＬ−１を効果的に測定することができることを示している。

培地中で実施した試験を通じて回収率のレベルは８６％〜９３％であった。

第３の試験は、分子ふるいり（ｌマドグラフィーによる分画後の培養物上澄み液の分）ＩＦからなる試験である。この分析は、免疫反応性物質が、すでに述べたように、単一の均一なピークの形で溶離されることを示し、そのピークは、組換え体インターロイキンで観察されたピークと正確に一致する。このこと８よ第７図に示すが、この図は、２．二＋αを検出する試験とＩｔ、−１βを検出する試験との両方で、刺激された肺胞マクロファージの、ヒ澄み液について得ら！また異なるりＣ１７トグラフイのプロブイルを示している。類似ｊ刀こ結果が、他の培養物上澄み液もしくは細胞内抽出物について観察された。全体として見ると、こｉｔらのデータはすべて、これも２つの試験法によって、これらの媒体中のインターロイキン−１を有効に定量測定できることを明確に示している。

実施例４：血漿および１１１１清中のＩＬ−１αとＩＬ−１βの測定これらの特異的なＥ１＾を用いて、健康な提供者もしくはリウマチ様障害にかかっている患者の血漿もしくは血清中のＩＬ−１αとＩＬ−１βの１度を測定する試験を行った。これらの測定は、上記のように、」二足の流体中に存在４−るどのヒト抗（マウス）＋１（Ｇ抗体をも中和するために、マウスの１にＧの存在下で行った。

この注意は非常に必要である。というのは池の実験によって、マウスＩｇＧなしで行った測定は、特にリウマチ様障害にかかっている患者の体液中の１１．−１の濃度がかなり過大に評価されるに至る場合があることが分かったからである。

健康なボランティヤーの血漿らしくは血清について行った試験によって、検出可能な重のＩＬ−１ａもしくはＩＩ、−１βを含有していない流体を選択できることが分かった。これらの集めた血漿もしくは血清は、適切な校正曲線を確立するための希釈剤として用いることがで、きる。このような曲線を確立すると、これらの流体中のＩＩ、−１の４％１文の測定と、明らかに健康な涛供者と患者の両者内の５　ｐｑ／　ｔ１２〜数１＋ｇ／ｙｔＱのインターロイキンの濃度の測定を行うことができるようになった。その免疫反応性物質は、組喚え体１１，１に対応する分子量よりもはるかに高い分子！Ｒ（＞５００．Ｇｏｏ）で溶離されるから、第６図に示す結果は、血漿で得られた代ノ４的なブ［７フイルを与えるが、十分なものではないけれども、それにもかかわらず、ＩＩ、−１を測定するこの試験法は、＋ｆｌ漿と＋Ｉｕ　ｒｎの検定に適切なものである。

実施例５：ＩＬ−１の生物学的活性（中和活性）に対する、この発明の１九体によってすえられる阻害活性１１、−１の生物学的活性に対する、この発明の抗１１．−１モノクローナル抗体によって与えられろ阻害活性を２シリーズの試験法を用いて示した。

１、ＩＬ−２のレセプターの誘発の阻害性の試験この試験法は、ＫＡＹ［’；ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１３３＠、３号＋３３９− １３４５！、　１９Ｒ４くしに詳しく記載されている。

−原理：ＪｕｒｋａＬ細胞、例えば（ヒトＴリンパ腫由来の細胞系）は、フィトヘマグルチニン（１）ＩＩΔ）の存在下、１１．−１αもしくは１し一１βで刺激されると、１し−２を分泌する。いくつかの抗ＩＬ−１αもしくは抗ＩＬ−１βの抗体はＩＩ、−１の効果を阻害することができる。というのは、これらの抗体がレセプターへの結合に関連する部位を認識１°ろか、または１し一１抗体の複合体が形成して生物学的工程を阻害するからである。

−実験法：この発明の抗＋１．−１αもしくは抗菖し一１βの抗体を、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−！β（１０ｎ９／ｍｌりの存在下、４℃で１８時間培養した。対照の試験を、ＩＬ−１αらくは■し一１β（１０ｎ９／真０を、抗体のないこと以外同じ条件下で培養することによつて行う。

次にＪｕｒｋ＊Ｌ細胞（５ＸＩＯ’細胞／ｘｉりを、ｒ’　１（Ａ　（０，８ｕ９／ＲＱ’）の存在下、上記の各種製剤で、３７℃で２４時間５％ＣＯ２雰囲気下で刺激する。この実験条件下で、刺激の時点での「シー１の濃度はＩＢ／ｍＱである。細胞培養物の上澄み液中の！シー２の濃度は、ＳＰＩで開発された免疫検定法を用いて測定され、その原理は、Ｉ　Ｌ−１について開発された原理と同一である。

得られた結果は、２つの対照に対する阻害百分率として示す。

一方はＩし−１なしで（Ｐ　１１へのみ）で実施し１００％の阻害性を示す。他方の抗体なしで行い０％の阻害性を示す。

（以下余白）一試験結果富２．１＋、−１の、細胞レセプター、特にｒｓｍ胞に対する結合性の阻害性の試験法。

この種の試験法は、特に下記の文献に記載されている。

−ＬｏｗｅｎＬｈａｌら、Ｊ、１シｘ１）、關ＩＥ０．１６４Ｑ、　１０６０頁、１９８６年および一３ｅｃｋｉｎｇｅｒら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎ＋Ｉ　ｏｒ　ｌ＋＊＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３９巻、１５４６−１５４９頁、１９８７年一原理：１１、−１αは、膜レセプターを通じて細胞に作用し、ＩＬ−１αは膜レセプターに特異的に結合する　＋ｔｓｌで標識を付けた！！、−１αの結合性を試験・竜゛ろことができろ。そのモノクｒ１−ナル抗体が複合体に含まれているＩＬ− １α分子の部分を認識するならば、このモノクロ−→・ル抗体はＩＩ、−１αがレセプターと結合するのを阻害することができる。レセプターへの結合を阻害することによって、これらの抗体は生物学的効果を阻害する。

−実験のプロトコル： ”’Ｉｔ？［ｍをつけたＩＩ、−１を、２Ｇ０ｎ９／　１１２の濃度の抗体とともに、４℃で１時間培養しｔ為反応が完了したとき、得られた混合物を＋４℃で８時間、Ｅ！、４細胞（マウス脚線腫細胞系）に接触させた。

次に細胞を適切なｌｌ術剤で洗浄し、結合した放射能を固体シンチレーシロンカウンク−（１，ＫＢ　ｍｕｌｔｉｇｒｉｓｍａ）で測定する。

結果は、ＩＩＪで標識を付けたＩＩ、−１αが抗体ととしに培養されていない対照（１００％）結合に対オろ一ロ宵百分率で表しである。

−試験結果寓実施例６：この発明のモノクロ−ナル抗体の感度の証明；従来の記述の抗体を用いる試駆との比較検定。

上記の実施例２は、二の発明の試験法の最適反応において、最小検出可能濃度が２　ｐ９／　ＲＱより低いことを示している（特に第■表参照）。

１、比較検定：目、＋１７の検定について＾ｍｅｒｓｈａｍ試験法との比較。

実施例１で述べたように、その試験法の感１文は、競合者が存在しないときに観察さ！１ろ、結合性を統計的に有意に減少させる１し−１の投与夙（＋（ｏ　）で示した［すなわちＢｏ−３ｅ１準偏差（９９％信頼眼界）１．。

検定は、Ａｌｌ１ｅｒｓｈＡ−社が定義する条件下で実施した（放射線免疫検定法、１′ｉで標識をっけた冒し一１α）。第８図に示す曲線が得られたが、この図において横軸は１１．−１αの濃度（ｐ９／胃０で縦軸はＢ　／　ｒｓ　ｏ　（％）であり、この図は検出限界が８０ｐｙ−／胃りのオーダーであることを示している。したがって、これは、−１−記のこの発明の試験法の感：ｙよりも苫しく低い感度である。

２、免疫検定法：　ＭＥＩＨＩ：ＮＩＸ試験との比較検定を、旺ＤＧ）：ＩＩＩＸ　（免疫放射線検定法、’ＩｆＪで標識をつけた抗１シー１β抗体）に現定されている条件下で実施した。第９図に示す曲線が得られ、その横軸は１シーｌβ の濃度（ｐｖ／　ｍＱ　）で縦軸は結合した放射能（ｃｐｓ）である。この図は検出限界が１５　ｐ９７ＭＱのオーダーであることを示す。実施例１に示すように、免疫試験法の感度は、非特異的結合ト３標準偏差（信頼限界９９％）に相当する目、−１の投与型として計算する。これは、上記のように、２ｐ９／”Ｑのオーダーのこの発明の試験法の感度よりも著しく低い感度に相当する。

これらの２つの試験法は、この発明のモノクローナル抗体（１離定敗が５ｘ１ｇ −＋ａより小さい）によって、予想外のことであるが、これらの抗体が用いられる検定試験法の感度を増大させることができることを明確に示している。

上記のことから明らかなように、この発明は、より詳細に述べた、この発明の実施聾１１と、これを実施し応用する方法に眼定するものではなく、二の発明には、この発明の範囲もしくは限度から逸脱せずに当■名ならば考えられるオペての変わが含まれろ。

藝　牽　妬蓼　保　髄時間（ｈｏｕｒｓ）博国際調査報告一一一一一一−１−ＰＣＴ／ＦＲ８９１００６３４国際調査報告ＦＲＢ９００６３４ＳＡ　３３３０１ −１１−□１心ｌ陀８９１００６３４

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類の特にげつ歯動物さらに詳しくはマウスを、ＩＬ−１αもしくはｌＬ −１βで免疫化することによって得られ、必要に応じて、天然もしくは組換え体のＩＬ−１αまたは天然もしくは組換え体のＩＬ−４βを特異的に認識し、２つのＩＬ−１間には事実上交差反応を示さない、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに対して特異的なモノクローナル抗体であって；５×１０−１０より小さい解離定数を有し、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βの異なる領域を認識する数群で構成され、これらの群のうち数群の抗体は、他の群の全抗体と適合して結合することができ、すなわち抗ＩＬ−１α抗体は、インクーロイキン−１αの３つの異なる領域を認識する３群（Ａ，ＢおよびＣ）からなり、１群の全抗体は他の２群の全抗体と適合して結合することができるが同じ群の他の抗体は非適合性であり、抗ＩＬ−１β抗体は、４群で構成され、その中最初の２群（ＡとＢ）は抗ＩＬ− １α抗体と類似の挙動を示し、Ｃ群の抗体は最初の各２群の１つの抗体とだけ適合性で、第４群（Ｄ）の抗体は、最初の３群のいずれの抗体とも非適合性でかつ組換え体の未変性ＩＬ−１βと結合せず、これらの抗体は修飾されたインターロイキン−１βを認識しかつＩＬ−１β／ＡＣｈＥ抱合体と反応し；および前記抗ＩＬ−１αと抗ＩＬ−１βの抗体が、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１β／アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）抱合体を認識する；ことを特徴とするモノクローナル抗体。
２．アセチルコリンエステラーゼと、抗ＩＬ−１αもしくは抗ＩＬ−１βのモノクローナル抗体またはこれらの抗体の断片特にＦａｂ′断片との抱合体。
３．請求項１の抗インターロイキン１αもしくは抗インター口イキン−１β　モノクローナル抗体のＦａｂ′断片の製造方法であっ上記モノクローナル抗体を、酸性媒体中ペプシンで処理してＦ（ａｂ′）２断片を得、これら分子ふるいクロマトグラフィーで単離し、これらのＦ（ａｂ′）２断片を、特にβ−メルカプトエチルアミン（βＭＥＡ）のような適切な還元剤による制御された還元工程に付してＦａｂ′断片を得、この断片を分子ふるいクロマトグラフィーのカラムを通過させることにより精製することを特徴とするＦａｂ′断片の製造方法。
４．ＡＣｈＥと全抗ＩＬ−１αもしくは抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体との抱合体、およびＡＣｈＥと、抗ＩＬ′−１αもしくは抗ＩＬ−ｌβモノクローナル抗体、特に請求の範囲２のＦａｂ′断片との抱合体の製造方法であって；上記断片の１つに組込まれたかもしくは天然に存在している少なくとも１つのチオール基が、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような適切なカップリング剤によって、ＡＣｈＥに組込まれた少なくとも１つのマレイミド基と連結することを特徴とする抱合体の製造方法。
５．細胞培養上澄み液と生物的液体中のＩＬ−１αとＩＬ−１βを検出する競合免疫酵素試験法であって；第１抗体として用いられる適切な抗ＩＬ−１αもしくは抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、および第２抗体として用いられ、適切な支持体に保持される１８Ｇを、トレーサーの役割をするＩＬ−１／ＡＣｈＥ抱合体およびインターロイキン−１αもしくはインターロイキン−１βと接触させ、その後ＡＣｈＥの活性がいずれか適切な手段によって目視可能にされることを特徴とする試験方法。
６．細胞培養物の上澄み液と生物学曲流体中のＩＬ−１αとＩＬ−１βを検出する高度に特異的で税敏な酵素免疫試験方法であって；適切な１支持体によって保持される抗ＩＬ−１αおよび／または抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を、ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βとｍＡｂ／ＡＣｈＥ抱合体と接触させ、その後、ＡＣｈＥ活性を適切な手段によって目視可能にすることを特徴とする試験方法。
７．ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βを、ｍＡｂ／ＡＣｈＢ抱合体と同時に、抗体に添加して、その２つのモノクローナル抗体が同時にＩＬ−１αもしくはＩＬ− １βと反応することを特徴とする請求の範囲６項記製の方法。
８．ＩＬ−１αもしくはｌＬ−１βをまず導入して、支持体に接合された抗体と反応させ、次にｍＡｂ／ＡＣｈＥ抱合体を導入して、ＡＣｈＥ活性を適切な手段によって目視可能とすることを特徴とする請求の範囲第６項記載の試験方法。
９．ウサギ抗（マウス）１ｇＧで構成されている抗体でコートされた一連の微小滴定用プレート；抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の適切な投与量が入っている少なくとも１つのびん；ＩＬ−１αとＡＣｈＥの抱合体の入っている少なくとも１つのびん、および／またはＩＬ−１βとＡＣｈＥの抱合体の入っている少なくとも１つのびん；ＡＣｈＥを目視可能にする基質の適切な量もしくは投与量；適切な量もしくは投与量のＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−Ｉβ；からなることを特徴とする請求の範囲５項記載の競合免疫酵素試験法を実施するためのキット。
１０．抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体でコートされた一連の微小滴定用プレート；ＡＣｈＥと抗ＩＬ−１αおよび／または抗ＩＬ−１βのモノクローナル抗体との泡合体の入った少なくとも１つのびん；ＡＣｈＥを目視可能にする基質の適切な量もしくは投与量；適切な量もしくは投与量のＩＬ−１αおよび／またはＩＬ− １βからなることを特徴とする請求の範囲６〜８のいずれか１つに記載の免疫試験法を実施するためのキット。
１１．活性成分として、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体および／またはＩＬ− １β抗体および／またはそれらの断片を単独または、他の物置と抱合もしくは雑種形成もしくは結合して、含有するかもしくはこれらで構成されていることを特徴とする治療用途を有する薬剤。
１２．抗原および／またはハプテンおよび／または他の抗体または抗体の断片を組合わせ、および／または安定なもしくは放射能の標識で標識をつけた、抗ＩＬ −１α抗体および／または抗ＩＬ−１β抗体もしくはその断片からなることを特徴とする、生体内診断に用いることができる診断剤。
１３．パスツール　アンスティチュに属するコレクション　ナショナール　ド　キュルチュール　ド　ミクローオルガニスムス（ＣＮＣＭ）に１９８８年１２月８日付で寄託され、このコレクションにおいてＩ−８２３、Ｉ−８２４、Ｉ−８２５、Ｉ−８２６、Ｉ−８２７、Ｉ−８２８およびＩ−８２９の番号で表示されている、請求の範囲１または２項に記載の抗ＩＬ−１αと抗ＩＬ−１βのモノクローナル抗体を製造するのに用いられるハイブリドーマ。