JPH03160985A - 新規変異株及びこれを用いる醤油の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は醤油中の重要な香気成分のｌ種である２−フェ
ニルエタノールを高生成する新規変異株及びこれを用い
る香気の優れた醤油の製造法に関する。

〔従来の技術〕

酵母によりエタノールと共に生或される高級アルコール
とそのエステルは、醤油中の重要な香気或分の一つであ
る。それら高級アルコールの中で、中心的役割をはたす
ものの一つにバラ様の香気を有する２−フエニルエタノ
ールがある。これら高級アルコールはく・酵母の発酵過
程で生成するが、その生或については、清酒酵母、ビー
ル酵母等について検討され、２−フエニルエタノールに
ついても、アミノ酸の一つであるフエニルアラニンより
生成するエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）経路とグルコ
ースよりフェニルアラニンを生合戒する経路の途中の中
間体より生成する生合或経路が知られている。

このグルコースより２−フェニルエタノールを生合成す
る経路に関し、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、焼
酎酵母などのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、該生
合戒経路の制御（生合或の抑制の原因）として、デオキ
シーＤ−アラビノーＤ−へプチュ口ソネート　ホスフェ
ート生合戒酵素（ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−Ｄ
−ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性のフェニルアラニンとチロシン
によるフィードバック阻害、コリスメート　ミュターゼ
（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ　ｍｕｔａｓｅ）活性のチロシ
ンによる同阻害、プレフェネート　デハイドラターゼ（
ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）活性
のフェニルアラニンによる同阻害、さらにはブレフエネ
ート　デハイドロゲナーゼ（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性のチロシンによる同阻害
が知られている（Ｌｉｎｇｅｎｓ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ
．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　，Ｌ　３
６３（１９６７））。

そしてこれに関連し、清酒酵母や焼酎酵母のサッカロミ
セス・セレビシエを親株とし、該親株より２倍以上ある
いは１０倍以上の２−フェニルエタノールを生戊するフ
ルオロフエニルアラニン耐性変異株を得たことが報告さ
れている（平成元年度日本醗酵工学会大会講演要旨集、
第５０頁及び５２頁、平或元年９月１０日発行）。

しかし、チゴサッ力ロミセス属酵母ではそのようなこと
は知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者は、醤油香気成分のなお一層豊富な生成を目指
し、グルコースより生合成される２−フェニルエタノー
ルを高生戒するチゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃ
ｈｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母変異株の検索を行な
った。即ち、本発明の目的は、チゴサッカロミセス属酵
母において、２−フェニルエタノールを高生成する変異
株を得ること及びこの変異酵母を用いて香気のすぐれた
醤油を製造することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、種々のチゴサッ力ロミセス属に属する酵
母を対象として、これに種々の変異処理を施すことによ
り、グルコースより２−フェニルエタノールを生合或す
る経路におけるブレフェネート　デハイドロゲナーゼを
除く前記律速酵素が阻害を受けることなく、２−フェニ
ルエタノールを多量に生或する能力を有する変異株を検
索した結果、親株であるチゴサッ力ロミセス・ルキシー
（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ
）　ＡＴＣＣ　１３３５６を変異処理することにより目
的とする２−フェニルエタノールを高生成するチゴサッ
カロミセス属に属する新規変異株を得ることに成功し、
本発明を完成した。

即ち、本発明は、チゴサッカロミセス属に属し、フルオ
ロフエニルアラニン耐性を有する新規変異株であり、ま
た本発明は、該新規変異株を醤油製造における発酵熟成
工程中に用いることを特徴とする醤油の製造法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、本発明の親株として使用する菌株としては、例え
ば、チゴサッカロミセス・ルキシーＡＴＣＣ１３３５６
などが挙げられる。そして該親株に通常の変異処理を行
なって本発明における新規変異株チゴサッカロミセスＦ
ＰＡ−　１を得ることができる。

次に、上記チゴサッカロミセスＦＰＡ−　１の菌学的性
質を示す。

（ａ）各培地における生育状態 ■　ＹＭ寒天培地でクリーム色コロニーを形威し、栄養
細胞は主径３〜７μの球形ないし卵形で出芽により増殖
する。ＹＭ液体培地では薄膜を形威しない。

■　バレイショ抽出液寒天培地で偽菌糸は形威しない。

（ｂ）子嚢胞子の形成 一般酵母用胞子形戊培地では子嚢を形威し難いが、０．
９％食塩を含むＹＭ培地で接合子型子嚢を形成する。

（ｃ）射出胞子の形成 ＹＭ寒天平面培養で射出胞子を形戊せず。

（ｄ）各生理的性質 ■　１５〜３７℃でよく生育し、最適温度は３０℃、ｐ
ｆ｛　３〜７でよく生育し、最適ｐＨは５である。

■　硝酸塩の同化性・・・・なし。

■　塩化ナトリウム耐性・・・・ｌ８％（Ｗ／Ｗ）以上
の塩化ナトリウム存在下でよく生育する。

■　ビタミン要求性・・・・ビオチン、パントテン酸。

（ｅ）同化性、発酵性の有無 同化性　発酵性 Ｄ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−ガラクトース 十　　　　　　　＋ ＋ 同化性　発酵性 麦芽糖 シ　　　ョ　　糖　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　十乳糖 ラフィノース α−メチルーＤ−グルコシド アルブチン コハク酸塩 メリビオース セロビオース トレハロース エタノール Ｄ−マンニット　　　　　　　　　千　　　十（ｆ）２
−フェニルエタノール生成量 親株チゴサッカロミセス・ルキシーＡＴＣＣ　１３３５
６と本発明における変異株チゴサッカロミセスＦＰＡ一
１　を対比し、以下の試験を行なった。

チゴサッ力ロミセス・ルキシーＡＴＣＣ　１３３５６と
チゴサッカロミセスＦＰＡ−　１　　の両株を、おのお
の下記組戊の合或培養培地で３０℃、５日間前培養した
。

（合成培養培地） ディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベース（アミノ
酸及び硫酸アンモニウムを含まない）０．２％（Ｗ／Ｖ
）、硫酸アンモニウム２０ｍＭ，グルコース５％（Ｗ／
Ｖ）、食塩５％（Ｗ／Ｖ）、ｐｉ　５．２次いで、これ
を上記組戊の合戒培養培地で、３０℃、７日間静置培養
した。その結果、培養培地中の２−フェニルエタノール
生戒量は、親株であるチゴサッカロミセス・ルキシーＡ
ＴＣＣ　１３３５６が４　ｐｐｍであるのに対し、変異
株チゴサッカロミセスＦＰＡ−　１　　は　１５０　ｐ
ｐｍであった。

（ｇ）プレフェネート　デヒドロゲナーゼ活性親株チゴ
サッ力ロミセス・ルキシーＡＴＣＣ　１３３５６と本発
明における変異株チゴサッ力ロミセスＦＰＡ１　とを比
較すると、チゴサッカロミセスＦＰＡ一１　より得られ
たプレフエネート　デヒドロゲナーゼの菌体総蛋白質量
当りの活性は、親株のチゴサッカロミセス・ルキシーＡ
ＴＣＣ　１３３５６のそれを１００％とした場合、２％
以下に減少し、親株とは大きく異なっている。

即ち、変異株チゴサッカロミセスＦＰＡ−１　　では上
記のごとくブレフエネート　デヒドロゲナーゼ活性が著
しく低下してチロシンの生合戒が減少し、そしてグルコ
ースより２−フェニルエタノールを生合戒する経路上の
酵素のチロシンによるフィードバック阻害が軽減され、
その結果として２フェニルエタノールが著量生威される
のである。

以上のチゴサッカロミセスＦＰＡ−　１　　における（
ａ）〜（ｅ）の菌学的性質は、クレガー編（Ｎ．　Ｊ．
　Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ　Ｒｉｊ）の「ザイースト
Ｊ　（ｒＴｈｅ　ＹｅａｓｔｓＡ　ｔｏｘｏｎｏｍｉｃ
　ｓｔｕｄｙＪ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　
Ｐｕｂ．）第３版により、いずれもチゴサッカロミセス
属に属する菌株の有するものと同一である。

そしてこの親株チゴサッ力ロミセス・ルキシーＡＴＣＣ
　１３３５６と変異株チゴサッ力口ミセスＦＰＡ１の両
菌株間の違いは、上記（ｆ）及び（ｇ）の他に、後者の
変異株が、前者の親株と異なって、フルオロフェニルア
ラニンを５０μｇ／ｍｌ含む培地で生育できるフルオロ
フェニルアラニン耐性菌であることである。

これらのことより、該菌株チゴサッ力口ミセスＦＰＡ−
　１　　は新菌株であると同定した。

なお、このチゴサッカロミセスＦＰＡ−　１　　は、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１１１
１５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−　１１１１５　）として寄託さ
れている。

上記変異処理としては、如何なる方法でもよい。

例えば化学的方法としてＮ−メチル−Ｎ′一二トローＮ
−ニトロソグアニジン（以下、ＭＮＮＧと略称する）、
エチルメタンスルホネート、メチルメタンスルホネート
、４−ニトロソキノン、亜硝酸、プロモウラシル等の変
異誘発剤を用いるか、物理的方法として紫外線照射、Ｘ
線照射、放射線照射処理などを行なう。

培地としては、酵母が利用し得る炭素源、窒素源、無機
塩類、その他酵母の生育に必要な成分を、適宜配合した
合成培地、天然培地が用いられる。

なお醤油の如く、高塩濃度の諸味への添加を意図する場
合には、該培地の食塩濃度を６〜１８％（Ｗ／Ｖ）程度
に調整することが望ましい。そしてフルオロフェニルア
ラニン耐性を付与するために、上記酵母培養培地にｐ−
フルオロフェニルアラニン、Ｏフルオロフェニルアラニ
ン又はｍ−フルオロフエニルアラニン、好ましくはｐ−
フルオロフェニルアラニンを５０μｇ／ｍ１程度添加す
る。

この酵母の培養は、振盪培養、通気培養、攪拌培養、静
置培養等の好気的、あるいは嫌気的培養方法のうち、適
宜な方法が採用される。培養温度は酵母菌体が生育し得
る範囲内で可能であるが通常２５〜３０℃であり、培養
時間は好気的培養の場合にはｌＯ〜５０時間、嫌気的培
養の場合には１２０〜１７０時間程度培養する。

このようにして固体培養の場合には生じたコロニーを分
離し、液体培養の場合には遠心分離、濾過等の通常の操
作方法に従い分離し、必要により洗浄して本変異株を得
る。

このようにして得られた本変異株の培養は、通常の酵母
の培養法に従えばよい。

次に本変異株を用いて醤油を製造する方法について述べ
る。

先ず、常法により、通常の蛋白質原料、炭水化物原料な
どに、例えば蒸煮、膨化、炒熱などの原料処理を施した
のち、種麹を接種して製麹し、醤油麹を得る。次いで、
常法により、該醤油麹を適宜の濃度の食塩水と共に仕込
み、これを発酵熟或させて熟成諸味を得る。そして本発
明においては、この仕込から熟戊諸味を得る迄の発酵熟
或工程期間中の適当時期に、別に培養して得た本菌株の
菌体又はその培養液を添加し、以後は通常の諸味発酵熟
成管理を行なう。このときの本菌株の菌体又はその培養
液の添加時期、添加量などは特に制限されないが、好ま
しくは通常仕込後１〜２か月、菌体量として約ｌ０６個
／ｇ程度である。

このようにして得た熟或諸味を、常法により圧搾し、規
格調整、火入などを行なって、香気の優れた火入醤油が
得られる。

また、原料の酸あるいは酵素分解液を常法により固定化
した乳酸菌、酵母などと接触させて発酵熟成させ、香味
芳醇なる発酵液を得るに際し、通常の酵母菌株の一部ま
たは全部に替えて、本変異株を使用することもできる。

〔発明の効果〕

本発明の新規変異株は、従来のチゴサッカロミセス属に
属する菌株に比し、著しく２−フエニルエタノールの生
戒能が優れたものであり、本菌株を用いて醤油製造を行
なった場合、得られた醤油は２−フェニルエタノール等
の高級アルコール戊分を著しく多量に含み、顕著に香気
の優れたものである。

〔実施例〕

以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ 親株チゴサッカロミセス・ルキシーＡＴＣＣ　１３３５
６を、窒素源としてＬ−プロリンを含む下記組成のブロ
リン培地５０ｍｌで、３０℃、５日間静置培養した。

（プロリン培地） ディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベース（アミノ
酸と硫酸アンモニウムを含まない）０．２％（Ｗ／Ｖ） Ｌ−ブロリン　　　　　　　　　　２　ｍＭＮａＣ１　
　　　　　　　　　　　　　　　５％（Ｗ／Ｖ）次いで
得た培養液を遠心分離して集菌し、これを食塩５％（Ｗ
／Ｖ）含有の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
洗浄したのち、該洗浄菌体を食塩５％（Ｗ／Ｖ）、グル
コース５％（Ｗ／Ｖ）含有の１００ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）に懸濁し、さらにＭＮＮＧを１　ｍｇ／ｍ
ｌになるように加えたのち、３０℃でｌ時間ゆっくりと
振盪しながら変異処理を行なった。続いてこれを遠心分
離して集菌し、これを上記ブロリン培地５０ｍｌで、３
０℃、ｌＯ時間静置培養したのち、さらにｐ−フルオロ
フェニルアラニンを最終濃度として５０μｇ／ｍｌ及び
寒天を２％（Ｗ／Ｖ）含有させること以外は上記ブロリ
ン培地と同様の培地に塗沫し、３０℃でｌＯ日間培養し
て、生育した多数の耐性株よりチゴサッカロミセスＦＰ
Ａ−　１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−　１１１１５　）を得た。

実施例２ 脱脂大豆１００ｋｇを蒸煮変性したものと、小麦１０５
ｋｇを炒熱割砕したものを混合し、これに種麹を接種し
、４２時間の通風製麹を行ない醤油麹を得た。

これにｌ５℃に冷却した２５％（Ｗ／Ｖ）食塩水３６０
１を加え、６００ｌ容密閉仕込タンクに仕込んだ。そノ
際、ベディオコッカス・ハロフィルス（Ｐｅｄｉｏｃｏ
−ｃｃｕｓ　ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）　ＩＡＭ１６９３
を生菌数が諸味１ｇ当りｔｘｔｏ’個となるように添加
した。添加後ときどき攪拌し、仕込後１４日目より加温
し、仕込後６０日目に、別に下記の方法により得たチゴ
サッ力口ミセスＦＰＡ−　１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−　１１
１１５　）の培養液を、生菌数が諸味１ｇ当りＩＸＩＯ
’個となるように添加した。

〔チゴサッ力口ミセスＦＰＡ−　１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−
　１１１１５）の培養液： 上記の仕込後２０日目の醤油諸味液汁を食塩１５％（Ｗ
／Ｖ）に調整したのち、無菌濾過して得た培地（ｐＨ　
５．２）に、実施例１で得たチゴサッカロミセスＦＰＡ
−　１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１１１５　）を接種し、３
０℃で４日間培養して培養液を得た。） その後さらに６か月間通常の諸味管理を行なって熟成諸
味を得た。

これを常法により圧搾した後、Ｎａ（Ｊ　１７．０％（
Ｗ／Ｖ）、Ｔ．Ｎ　１．５７％（Ｗ／Ｖ）　ニ調整し、
８０℃で４時間の火入を行ない、火入醤油（本製品）を
得た。

一方上記チゴサッ力口ミセスＦＰＡ−　１の代りに、チ
ゴサッ力ロミセス・ルキジーＡＴＣＣ　１３３５６を用
いる以外は、上記と全く同様にして火入醤油（対照製品
）を得た。

上記火入醤油の一般分析を醤油技術会編「しょうゆ基準
分析法」に従って行ない、併せて２−フェニルエタノー
ルも定量した。その結果を表１に示す。

なお、２−フェニルエタノールの定量法は、常法により
ガスクロマトグラフィーによった。

また、上記火入醤油について、２４名のパネルにより、
トライアングル法で官能検査を実施した。

その結果を表２に示す。

ｌ７ ｌ８ 表１に示されるようにアルコールが十分に生成され、い
ずれの製品にても正常な酵母発酵が行なわれた。モして
２−フェニルエタノールは、本製品にて対照製品に比べ
約２０倍に増加していることが確認された。

また表２の結果より明らかな如く、本製品は対照製品に
比べ香気に著しく優れている製品であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）チゴサッカロミセス属に属し、フルオロフェニル
   アラニン耐性を有する新規変異株。
2. （２）請求項（１）記載の新規変異株を醤油製造におけ
   る発酵熟成工程中に用いることを特徴とする醤油の製造
   法。