JPH03163028A - うし流行熱抗原およびそのワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野」 この発明は、うし流行熱（またはうし１日熱ＢＥＦ）ウ
ィルス抗原およびそこから誘導されたワクチンに関する
ものである。

［従来の技術］ うし流行熱は、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）および水牛（ｗａ
ｔｅｒｂｕｆｒａｌｏｅｓ）の急性ウィルス感染症であ
る。この病気は地球上の熱帯および亜熱帯領域に広く分
布し、オーストラリア、日本、中国および南アフリカに
おいては主たる経済的に重要な問題であると認識されて
いる（セント・ジョージおよびスタンドファースト、エ
ビデマイオロジー・オブ・アーボバイランーズ（Ｅｐｉ
ｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ）
、１９８８）。原因ウィルスであるうし流行熱ウィルス
（ＢＥＦ）は、現在また１種類しか存在が知られていな
い血清型のアルボ・ラブド・ウィルスである。

幾つかの血清学的に関連のあるウィルスは健康な牛およ
び昆虫から単離されたが、それらの中゛で病気を誘発す
ることが示されたウィルスは無い。これらには、オース
トラリアからのベリマー（Ｂｅｒｒｉａ＋ａｈ）および
キンバリー（Ｋ　ｉｍｂｅｒ　ｌｅｙ）、アフリカから
のマラカル（Ｍａｌａｋａｌ）およびアノアからのブチ
ョング（Ｐｕｃｈｏｎｇ）がある［リーネ等、「オース
トラリアン・ジャーナル・オプ・エクスベリメンタル・
バイオロジー・アンド・メディカル・サイエンス」（Ａ
ｕｓｔ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．　Ｓｃ
ｉ．）、５９、３４７−３５６、＋９８１，およびガー
ド等、「オーストラリアン・ベテリナリー・ジャーナル
Ｊ（Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．　　Ｊ．）、　　６０，８９　
　、　　１　９　８　３　コ。

ＢＥＦの構造に関する以前の研究によると、このウィル
スは弾丸状形暢を示し、１本鎖ＲＮＡゲノムを含むこと
が報告されていろ［デラーボルタおよびブラウン、「ノ
ヤーナル・オブ・ジェネラル・バイＤｏノーＪＣＪ．　
Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．）、４４、９９−１１２、＋９
７９］。しかしながら、他のラブドウィルスとは異なり
、ＢＥＦは、２種のマトリックス蛋白質を含め６種の構
造蛋白質（Ｌ，Ｇ、Ｎ．ＮＳ，ＭｌおよびＭ２）を含む
ことが報告された。この発明において、ＢＥＦおよび密
接に関連したヘリマーウィルスのポリペプチトを再試験
した結果、これらのウィルスの構？ｉおよび蛋白質合成
は、狂犬病ウィルスの種類と一致するという証拠が得ら
れた。

幾つかの国では、接種の使用により動物をＢＥＦ感染か
ら防御している。マウス脳または細胞培養において生成
される生の弱毒化ワクチンは、フロインド完全または不
完全アジュバント中［テオドリディス等、「オンダース
テプート・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
ｊ（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ　Ｊ．　Ｙｅｔ．　Ｒ
ｅｓ．）、４０（３）、７７−８２、１９７３、チボリ
等、「オーストラリアン・ベテリナリー・ジャーナル」
（＾ｕｓｔ．　Ｙｅｔ，　Ｊ，）、５！、ｌ９７５、チ
ボリおよびスブレッドブロー、「オーストラリアン・ベ
テリナリー・ジャーナルｊ（Ａｕｓｔ．Ｙｅｔ．　Ｊ．
）、５４、２３２、１９７８、エラスムス、アルボバイ
ラス・リサーチ・イン・オーストラリア・プロンーディ
ングス・フ十−ス・シンポジウム−１９８６］またはサ
ボニン・アジュバントのキルＡ中しバンスロー等、「ザ
・ベテリナリー・レコードＪ（Ｔｈｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎ
ａｒｙ　Ｒｅｃｏｒｄ）、　１９８５、　ｌ１７、３７
−４３Ｆでの生の弱毒化ウィルスの多重投与を使用して
いる。実験および自然攻撃条件下で得られたデータは、
才一ストラリアで試験された弱毒化ワクチンが必ずしも
有効ではないことを示す［バンスロー等、前出、バンス
ロー、アルボバイラス・リサーチ・イン・オーストラリ
ア・プロンーディングス・フォース・シンポジウム＋９
８６、ウォルトホールおよびバンスロー、アルボバイラ
ス・リサーチ・イン・オーストラリア・ブロノーディン
グス・フォース・シンボノウム−１９８６　コ。

日本では、■用量の燐酸アルミニウムゲルに吸着させた
細胞培養適合ウィルスにより牛に接種を行う［稲葉等、
「アルヒーフ・フユール・ディー・ケザムテ・フィルス
フォルシュングＪ（Ａｒｃｈｉｖ　　Ｆｕｒ　ｄｉｅ　
ＧｅｓａｍＬｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ）、４
４、＋２１−１３２、ｌ９７４、田中、アルボバイラス
・リサーチ・イン・オーストラリア・プロンーディング
ス・フォース・シンポジウム−１９８６１。このワクチ
ンは、流行発生熱の予防に部分的に有効であると思われ
る［田中およびｆ＋ＷＩｍ、アルボバイラス・リサーチ
・イン・オーストラリア・プロシーデインダス・フォー
ス・シンポジウム１９８６］が、実験または自然攻撃に
対する個々の動物の応答に関するデータは入手できない
。ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンにより不活化
されたウィルスの２つの接種を用いることによる非生ワ
クチン開発の試みは成功しなかった［稲葉等、「アルヒ
ーフ・フスール・ディー・ゲザムテ・フィルスフォルシ
ユング」（＾ｒｃｈｉｖ　　Ｆｕｒ　ｄｉｅ　Ｇｅｓａ
ｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ）、４２、４２
−５３、ｌ９７３、デラポルタおよびスノードン、「ベ
テリナリー・マイクロバイオロジーＪ（Ｙｅｔ．　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．）、４、ｌ８３−１９５、ｌ９７９、
「ベテリナリー・マイクロバイオロジーＪ（Ｙｅｔ．　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、４、ｌ９７−２０８、１　９
　７　９］。不活化ウィルスの接種後における実験的攻
撃に対する免疫性は乏しく信頼できないものであった。

他のラブドウィルス（狂犬病ウィルスおよび水はう性口
内炎ウィルス）に関して述べると、保護免疫性は、ビリ
オン表面糖蛋白質（Ｇ）により誘導される［コックス等
、「インフェクンヨン・アンド・イミュニティ−Ｊ（ｌ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｌｌｕｎｉｔｙ）、１
９７７年６月、７５４−７５９頁、ル・フランソワ、「
ジャーナル・オブ・パイロロジーＪ（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ
．）、５１，２０８、１９８４］。

また、ビリオノ・ヌクレオカプンド（Ｎ）は、恐らくＧ
糖蛋白質と共に保護免疫性の誘導に関与すると思われる
［ディーツショールド等、「プロンーディングス・オブ
・ザ・ナンヨナル・アカデミー・オプ・サイエンシーズ
・オブ・ザ・ユー・エス・エイＪ（Ｐｒｏｃ．　　Ｎａ
ｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ）、ｉ±
、９１６５−９１６９、＋９８７ｊ０ＢＥＦワクチンに
関する他の興味深い文献としては、パンスロー等、「ベ
テリナリー・バイラル・デイノーズＪ（Ｖｅｔｅｒｉｎ
ａｒｙ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、「ゼア・シ
グニフィカンス・イン・サウス・イースト・エイジア・
アンド・ザ・ウェスタン・パシフィック（Ｔｈｅｉｒ　
Ｓｉｇｎｉｒｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　Ｓｏｕｔｈ　Ｅａｓ
ｔ　Ａｓｉａ　ａｎｄｔｈｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｐａｃ
ｉ『ｉｃ）　Ｉ　９　８　５　Ｊ％　シドニーのアーサ
ー・ウェブスクー・プティ・リミテッドにょり出版され
た「ア・テクニカル・インフオメーンヨン・ブレティン
・コンサーニング・リビング・ＢＥＦ・バクシーンＪ（
ａ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｒ＋４ｏｒｍａｔｉｏｎ　
Ｂｕ１１ｅｔｉｎ　ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ　ｌｉｖｉｎ
ｇ　ＢＥＦ　ｖａｃｃｉｎｅ）、キヤメロン等、「オン
ダーステブート・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リ
サーチＪ（ＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔＪ，　Ｙｅｔ．
　Ｒｅｓ．）、５４、１５７−１５８、１９８７、ギャ
ファ一等、「ツエントラルブラット・フユール・ベテリ
ネルメデイツインＪ（Ｚｂｌ．　Ｖｅｔ．　Ｍｅｄ．　
Ｂ．）、２６、７７３−７７８、１９７９、オイシェー
レ等、「セブンティサード・アニュアル・ミーティング
・ユーエス・アニマル・ヘルス・アソーンエイションＪ
（７３ｒｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ＵＳＡｎ
ｉｍａｌ　Ｉｌｅａｌｔｈ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）
、１９６９、スブラッドブロー、「オーストラリアン・
ベテリナリー・ノヤーナルＪ（Ａｕｓｔ．　Ｙｅｔ．　
Ｊ．）、５１、１９７５、パイ・ウェンピン等、「ハー
ピン・ベテリナリー・リサーチ・インスティテユート・
チャイニーズ・アカデミー・オブ・アグリカルチュラル
・サイエンンーズＪ（ｔｌａｒｂｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎ
ａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｌｎｓｔｉｔｕｔｅＣｈｉ
ｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ　Ｓｃ＋ｅｎｃｅＳ）、ラセルス、「オーストラ
リアン・ベテリナリー・ジャーナルＪ（Ａｕｓｔ．　Ｙ
ｅｔ．　Ｊ．）、５２、３８ｌ１５３７−５３８、１９
７６、デラボルタおよびスノードン、「才一ストラリア
ン・ベテリナリー・ジャーナルＪ（Ａｕｓｔ．　Ｙｅｔ
．　Ｊ．）、５３、１９９、スブラッドブロー、「オー
ストラリアン・ベテリナリー・ジャーナルＪ（Ａｕｓｔ
．　Ｙｅｔ．　Ｊ．）、５３、３５１−３５２、並びに
チウおよびリュ、『ザ・プロフィラキノス・才ブ・ビー
イーエフ・イン・タイワン』と題する文章、プロビンン
ヤル・リサーチ・インスティテユート・フォー・アニマ
ル・ヘルス、（台北）がある。

また、ラブドウィルスの抗原ｈ’ｆｌ造に関する総括的
検討は、ウンナー等、「イミュノケミストリー０オブ０
バイルシーズＪ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｃ
ｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ）、「ザ・ベーンス・フォー・セロ
ディアグノシス・アンド・バシーンズＪ（Ｔｈｅ　ｂａ
ｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓＩｓ　ａｎｄ
　ｖａｃｃｉｎｅｓ）、エルセヒア◆サイエンス・パブ
リッンヤーズ・バイオメディカル・ディビジョン（＋９
８５）に記載されている。また、サブユニット・ワクチ
ン・ウィルスの性質は、モライン等、「バシーンｊ（Ｖ
　ａｃｃｉｎｅ）、３（１９８５）に記載されている。

従って、上記の先行技術文献を充分に再検討した結果、
これまでＢＥＦウィルスに由来する抗原およびワクチン
の生成は、生の弱毒化ウィルスまたは不活化総体ウィル
スに関するものであったと考えられる。生の弱毒化ＢＥ
Ｆウィルスは、単独または不活化ウィルスと組み合わせ
た形で有効な防御作用を与えるが、不活化ＢＥＦウィル
スのみを含むワクチンは有効ではないことが判っている
。

防御ワクチンとして使用され得ろウィルスの非生サブユ
ニソトの同定に関する報告は未だ発表されていない。Ｂ
ＥＦウィルスのサブユニットから戊るワクチンは、安全
性、輸送安定性および費用効率の良い生産を目指す組換
えＤＮＡ技術へのアクセスに関してかなりの利点を提供
する。

［発明の構成コ 従って、この発明の対象は、適当な宿主、例えば畜生ま
たは水牛への投与後にｎＥＦの発生に関して防御作用を
示し得る、ＢＥＦウィルスのサブユニットから誘導され
た抗原および／またはワクチンの製造である。

この発明は、一態様ノこおいて、ウィルスに格染した細
胞からのＢＥＦ（ウィルス）サブユニソト抗原の単離方
法であって、 （ｉ）　　細胞培養においてＢＥＦウィルスを繁殖させ
、 （ｉｉ）　（ｉ）段階から得られた感染細胞培養物を精
製することにより、精製ウィルス抽出物を得、（ｉｉｉ
）ワクチン中で使用されるサブユニット・ウィルス抗原
を精製ウィルス抽出物から誘導する段階を含む方法を提
供する。好ましくは、サブユニット・ウィルス抗原は、
後述の原型ＢＥＰＩＢ８７７２２１として８１Ｋｄの分
子量を有する糖蛋白質表面抗原である。

（ｉ）段階について述べると、好適には＋３　Ｅ　Ｆウ
ィルスを細胞培養中で増殖させる。好ましく：よ、抗生
物質、例えばベニンリンおよグストレプトマインンを加
えることにより、細菌汚染を阻止する。

このウィルスは、３０−３８℃でＢＨＫ−２１細胞また
は他の適当なセルラインにおいて生育され、ウィルスが
細胞中で増殖した後、適当な時点で感染細胞培養上清に
おいて採取され得る。

また、適当なプロテアーゼ阻害剤を各感染試料に加える
ことにより、ウィルスの蛋白質加水分解的変性を阻止す
ることができる。セリン・プロテアーゼ阻害剤であるフ
エニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および
／または他のプロテアーゼ阻害剤が適当である。

感染細胞からのウィルスの精製［上記（ｉｉ）段階コに
関して述べると、これは、速度らしくは平衡密度勾配遠
心分離またはこれらの技術の組み合わせに基づいて実施
され得る。すなわち、平衡勾配を使用することにより、
感染性ウィルスおよび非感染性ウィルス粒子の両方を含
む密集帯（密度バンド）を得ることが可能である。速度
勾配技術は、主として大きさに基づく分離に関するもの
で、この段階を含めると、非感染性粒子から感染性粒子
が分離される。他方、平衡勾配は、粒子が同じ大きさを
有し得る場合でも、主として密度差異に基づく分離に関
するものである。感染性ウィルスおよび非感染性粒子は
両方とも適当な抗原供給源である。これらの両技術に適
した培地はしょ糖である。

好ましくは、最初の精製段階では、粗細胞抽出物を清澄
化することにより細胞屑を除去し、遠心分離後、ウィル
ス粒子が上清から単離され得る。

その後、さらに遠心分離工程を行うことにより、ウィル
ス粒子は沈澱物として得られるか、または他の手段（例
、限外ろ過、沈澱）により濃縮され得る。続いて、濃縮
ウィルス調製物を上記勾配遠心分離技術に適用すること
により、適当な抗原調製物を得ることができろ。

サブユニット・ウィルス抗原の製造または単離について
述べると、好ましくは精製ウィルス抽出物を、ＢＥＦウ
ィルスの外郎リボ蛋白質エンベローブまたは鞘の溶解に
有用な非イオン性デタージェントで処理する。適当なデ
タージェントとしては、オクチルグルコンド、トリトン
系列、ブリージ系列、ノニデブト系列および他の非イオ
ン性デターノエントがある。

上記の要領でデタージェント処理を行うと、糖蛋白質に
対応する８１０００ダルトンの分子量を有する表面抗原
がウィルスから放出され得る。この抗原は、Ｇ蛋白質と
して知られている。それらの調製物を遠心分離にかける
ことができ、その場合Ｇ蛋白質は可溶性上清に見出され
、残りのウィルス抗原は不溶性戊澱物中に含まれている
。原型ＢＥＦ昧ＢＢ７７２１の場合、これらは分子量ｌ
８　０Ｋｄ，５　２Ｋｄ，４　３Ｋｄおよび２９Ｋｄの
抗原を含み得る。分子量５２Ｋｄの抗原は核蛋白質（Ｎ
蛋白質）に対応し、分子量２９Ｋｄの抗原はマトリック
ス蛋白質（Ｍ．蛋白質）に対応する。ＮおよびＭ，蛋白
質は燐酸化されている。分子５１１８０Ｋｄの抗原はＬ
蛋白質として知られており、分子量４３Ｋｄの抗原はＭ
１蛋白質として知られている。

また、上記非イオン性デタージェントの使用により、沈
澱物にデターノエント適用後、Ｌ１Ｍ，およびＭｔ蛋白
質が単離され得る。

特に重要なのは、Ｇ蛋白質が２形態で存在するという事
実であった。グリコシル化を阻止する適当な薬剤（例え
ば、ツニカマイシン）で処理された細胞において、６７
Ｋｄおよび７１Ｋｄの分子量を有する非グリコシル化蛋
白質Ｇ前駆体が得られた。

ツニカマイシンの非存在下では、？７Ｋｄおよび７９Ｋ
ｄのグリコシル化形態が検出され、これらをさらに修飾
することに上り、８１ＫｄのビリオンＧ蛋白質、および
、さらに９０Ｋｄの細胞関連形態が生成された。

ＢＥＦウィルスの場合と同様に、密接に関連したベリマ
ー（［３　ｅｒｒｉｍａｈ）ウィルスに感染した細胞に
おいて５Ｍのウィルス蛋白質が検出された。ＢＥＦの場
合と同様、２形態の糖蛋白質がベリマー感染細胞におい
て検出された。分子ｉ４０ＫｄのベリマーＭ１蛋白質は
、対応する１３ＥＦ蛋白質よりも小さいと思われた。他
のベリマー蛋白質はＢＥＦの場合よりもサイズが小さか
った。

上記抗原および前駆体を検出するための適当な技術には
、パルス標識およびパルス・チェイスの技術があった。

パルス標識では、ウィルス増殖周期中の様々な時点で、
適当な放射性標識、例えばＬ　　［３６Ｓ］一メチオニ
ンによりウィルス感染細胞をパルスし、その直後に採取
した。

パルス・ヂエイス実験では、ウィルス増殖周期中の選ば
れた時点で、通当な放射性標識、例えばＬ−［３ＳＳ］
一メチオニンにより感染試料をパルスし、続いて非放射
性メチオニンにより「チェイス」または「フラッド（Ｈ
ｏｏｄ）Ｊさせた。試料は、「パルス」後および「チェ
イス」後に採取され得る。

上記精製段階に関して述べると、遠心分離は特に好まし
い技術ではあるが、これは本質的なことではないため、
池の適当な精製技術、例えば限外ろ遇ら採用さｆＩ得る
ものとする。

また、前述したことから、この発明はまた、適当なアジ
ュバントと組み合わせた形で上記ウィルス抗原のいずれ
か１つを含むワクチンをその・範囲内に含むものとする
。

また、この明細書で使用されているＢＥＦウィルスとい
う語は、ＢＥＦウィルスおよび後で詳細に述べるベリマ
ー・ウィルスの株および変異体を全てその範囲内に含み
得る。

この発明における使用に適したアジュバントには、キル
Ａおよび他のサボニン類、フロインド完全アジュバント
、フロインド不完全アジュバントおよび他の適当なアジ
ュバント、例えばバンスローにより記載されたもの［「
ヘテリナリー・ブレテＩンＪ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、ｌ９８７、５７巻、１ｌ号］があ
る。

［実施態様］ （方法） ウィルスの起源 うし流行熱ウィルス（ＢＢ７７２１株）は、１９６８年
にオーストラリアのチャーターズ・タワーズで感染した
牛の血液から単離された［ドハーティ等、「オーストラ
リアン・ジャーナル・オブ・サイエンスＪ（Ａｕｓｔｒ
ａｌｉａｎ　Ｊ，　Ｓｃｉ．）、３１、３６５−３６６
、１　９　６　８］。細胞培養に適用する前に、ウィル
スを実験的に子牛および乳のみマウスに通過させた。ベ
リマー・ウィルス（ＤＰＰ６３株）は、１９８１年にオ
ーストラリアのダーウィン付近で健康な雄の子牛から単
離された。ウィルスをＢＨＫ−２１細胞において直接感
染動物から通過させると、中和試験によりＢＥＦとは異
なることが示された［ガード等、「オーストラリアン・
ヘテリナリー・ジャーナルｊ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　
Ｖｅｔ．　Ｊ．）、６０、８９、＋９８３３。両ウィル
スともベロ細胞において３回プラーク・クローン化され
た。

細胞培養 ８５０ｃｕ’ローラー・フラスコまたは９６ウエル・プ
レート中１４ミリモルのＨＥＰＥＳ，ｔｏ％牛胎児血Ｆ
ｉ、１００単位／ｙＱのペニシリンおよび１００μ９７
紅のストレブトマインンを補ったＲＰＭＩｌ６４０培地
においてＢＨＫ−２１細胞を３゛７℃で培養した。

ウィルスの生長および放射性標識 ＢＨＫ−２１細胞を含む全面（生長）ローラー・フラス
コを０　．　４　ｐｒｕ／細胞の増殖割合で感染させ、
３７℃で１時間インキユベーションした。接種物を除去
し、２８ミリモルのＨＥＰＥＳ．０．１％牛血清アルブ
ミン・フラクションＶ　（Ｂ　Ｓ　Ａ）、１００単位／
抑のペニシリンおよび１００μ９／叶のストレプトマイ
ンン（１　６４　０／ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩｌ６４０
培地と置き換えた。ｔ，　　［３５ｓコ−メチオニンに
より標識したウィルスを製造するため、感染のＩＯ時間
後に培地を除去し、０，３μ９／ＩＱのアクチノマイシ
ンＤを含むメチオニン不含有１６４０／ＢＳＡ培地と置
き換えた。３７゜Ｃで２時間後、５μｃｉ／一のＬ　　
［３５Ｓ］一メチオニンを加え、感染の２０−２４時間
後に採取するまで培養物を３７℃でインキユベーション
した。

Ｄ−［６−３８］一グルコサミン標識を行うため、感染
のｌＯ時間後から０．３μ９ＩＲＱのアクチノマイシン
Ｄを含むグルコース不含有＋６４０／ＢＳＡ培地により
培養物を処理し、感染の２０−２４時間後に採取するま
で１２時間後から！００μＣｉ／ｒｔｔＱのＤ−［６−
３８］一グルコサミンを加えた。

ｊｆｆｔｐ］一オルトホスフェートで標識するため、感
染の１２時間後に０．３μ９／対のアクチノマイシンＤ
を含む燐酸不含有１　６４　０／［３ＳＡ培地で培徨物
を処理し、次いで、ｌＯμＣｉ／ｙ（ｌの［ｆｆ″Ｐ］
オルトホスフエートを含む同培地中で２時間標識し、感
染の１４時間後に採取した。採取時点で感染細胞培養肢
を０．１ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド（ＰＭＳＦ）で処理し、ウィルス精製に必要とされる
まで４℃で一時的に貯蔵した。

ウィルス精製 感染細胞培養物を３０分間５０００ｒｐｍで遠心分離に
より清澄化した（ソルバールＳＳ３４ローター）。ウィ
ルスを９０分間３　０　０　０　０　ｒｐｍで上清から
虎澱さ＋ｋ（コントロンＴＦＴ４　５ローター）、小容
虫の１２０ミリモルＮａＣｌ，１．２ミリモルＥＤＴＡ
，０．１％ＢＳＡ，１２ミリモルのトリスＩ｛ＣＩ（ｐ
ｉ４７．６）（ＮＴＥ／ＢＳＡ）に再懸濁させた。／ｔ
′澱したウィルスを、ＮＴＥ／ＢＳＡ中１５％−４５％
（ｗ／ｗ）Ｌよ糖勾配に適用し、３０分間４０００Ｏｒ
ｐｍで遠心分離した（ベックマンＳＷ１１ローター）。

２つの目に見える帯が勾配において検出された。上部の
帯は非感染性の切頭状粒子を含んだ。感染性ビリオンを
含む下部の帯を２倍容徹のＮＴＥ／ＢＳＡ中で希釈し、
１０分間７０　０　０　０　ｒｐｍで遠心分離した（ベ
ツクマンＴＬＡ　１００ローター）。ウィルス沈澱物を
小容量のＮＴＥ／Ｂ　Ｓ　Ａに再＠濁し、４　０　０　
０　０　ｒｐｍで１６時間平衡密度に遠心分離した（コ
ントロンＴＳＴ５５ローター）。ウィルス帯を２容量の
ＮＴＥ／ＢＳＡ中で希釈し、ウィルスをＩＯ分間７００
００ｒｐｍで沈澱させた（ベブクマンＴＬＡ　１　０　
０ローター）。調製物によっては、最初のレートゾーン
勾配を精製工程から省いた。

感染細胞抽出物の製造 １　ｘ　ｌ　Ｏ’ＢＨＫ−２　１細胞／ウヱルを含む９
６ウエル・マイクロタイター・プレート（ヌンク・コー
ポレーション）゜を用いて、感染細胞におけるパルス標
識およびパルスーチェイス実験を行った。２５μＱの欠
損粒子不含有ウィルスにより１０　ｐｆｕ／細胞の増殖
割合でウェルを感染させた。

３７℃で１時間吸着後、接種物を！００μＱのｌ６４０
／ＢＳＡ培地と置き換えた。パルス標識前に、メチオニ
ン不含有またはグルコース不含有ｌ６４０／ＢＳＡ培地
中３．５時間０　．　３　ｕ　９／ｙ（１（１）アクチ
ノマイシンＤで培養物を処理し、１００μＣ　ｉ／ＩＮ
＆ノＬ　−　［”Ｓ　］　−　）チオニンまたハＤ−［
６３Ｈｌ−グルコサミンを含む同培地中でパルス標識を
行った。パルス標識の３．５時間前およびその期間中、
必要時に【μ９／籾のツニカマインンを培養物に加えた
。細胞リゼイトを製造するため、細胞をＰＢＳで２回次
浄し、次いで、室温で５分間１００μＱの２％ＳＤＳ，
１％２−メルカブトエタノール、ｌＯ％グリセリン、０
．■ミリモルのＰＭＳＦ’，１０ミリモルの燐酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．８）、０．０　０　１％のプロモフェノ
ール・ブルーで処理した。次いで、リゼイトを２分間９
５℃に加熱し、電気泳動に必要とされるまで−２０°Ｃ
で貯蔵した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動 レムリ、「ネイチ＋　−　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）　Ｊ（ロ
ンドン）２２７，６８０−６８５（１　９７０）に従っ
て製造された４％スクッキング・ゲルでオーバーレイ（
被覆）した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルに
おいて電気泳動を行った。ゲルを、垂直ミニゲル（ヘー
ファ一）中で９０分間１００Ｖで移動さセ、次いで３０
分間酢酸／メタノール／水（Ｉ：７＝２に固定した）。

ゲルをクーマシー・ブリリアント・プルーＲ−２５０（
バイオ・ラド）で染色またはアンプリファイ（アマーン
ヤム）中で浸漬し、真空下６０℃で乾燥し、−７０℃で
アマーシャムβマックスまたはコダックＡＲエックス線
フイルムに暴露した。

免疫プロッティング 本質的に前記方法と同じ要領で蛋白質免疫プロツティン
グを行った［ウォーカー等、「ジャーナル・オブ・パイ
口ロジカル・メソッズＪ（Ｊ　．　Ｖ　ｉｒｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏａｓ）、１５、２０＋−ＩＩ．１９８７］。電気
プロット法により、蛋白質をポリアクリルアミド・ゲル
からニトロセルロース紙に移動させた。

ニトロセルロースを３％ゼラチンでブロックし、モノク
ローナル・マウスＩｇＧ，次いでビオチニル化ひつじ抗
マウスＩｇＧ（アマーンヤム）および１％ゼラチン中ビ
オチンーストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体（
アマーシャム）で処理した。基質４−クロローｌ−ナフ
トール（バイオ・ラド）を用いて免疫プロットを展開し
た。

漿果 ＢＥＰをｔ，−［３５Ｓ］一メチオニンで標識し、前記
と同様に、しよ塘中レートゾーンおよび平衡密度勾配遠
心分離により感染ＢＨＫ−２１細胞リゼイトから精製し
た。精製ウィルス試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写
真法により分析した。５Ｎの蛋白質（１　８　０Ｋｄ，
　８　１Ｋｄ，　５　２Ｋｄ，　４　３Ｋｄおよび２９
Ｋｄ）が精製ビリオンにおいて検出された（第ｌ図ｂ）
。また、レート・ゾーン勾配のゆっくりと沈澱している
非感染性ピークから集められた切頭状欠損干渉性粒子は
、５種のウィルス蛋白質を含んでいたが、２９Ｋｄ蛋白
質の相対比率は感染性ビリオンにおける場合よりも少な
かった（第１図Ｃ）。また、クーマンー・ブルーで染色
したＳＤＳゲルにおいて５種のビリオン蛋白質が検出さ
れた。これはまた、［３ＳＡ担体蛋白質の残基を示すも
のであった（第１図ａ）。

ＢＥＦビリオン糖蛋白質 ビリオン糖蛋白質を同定するため、ＢＥＦを［３Ｈ］一
グルコサミンで標識し、感染細胞リゼイトから精製し、
上記と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法により分
析した。［３Ｈ］一グルコサミンは、主として８１Ｋｄ
蛋白質に取り込まれた（第ｌ図ｄ）。また、４３Ｋｄ蛋
白質の領域では３つの弱い糖蛋白質帯が検出され、Ｌ　
　［３ＳＳＦ−メチオニン標識ウィルスを精査した結果
、これらの糖蛋白質帯がビリオンの小成分として存在し
ていることが確認された（第１図ｂ）。免疫プロット分
析により、８１ｋ糖蛋白質に対する３つの小さな帯の関
係を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより勾配精製ＢＥＦを
分画し、電気プロッティングによりニトロセルロース紙
に移動させ、ＢＥＦモノクローナル抗体ＤＢＳによりブ
ローブした。モノクローナル抗体は８１Ｋｄ蛋白質およ
び４３Ｋｄ領域における３つの小さな帯の両方と反応し
（第ｌ図ｅ）、前述の小さな帯が８１Ｋｄ蛋白質上に存
在するエピトープを含むことを示した。試験されたＢＥ
Ｆの全標本において小さな帯が検出され、これらは精製
中におけるプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＰおよびＥＤＴＡ
の使用により排除されなかった。

ＢＥＦビリオン燐蛋白質 ビリオン燐蛋白質を同定するため、ＢＥＦを、［３　ｔ
　ｐ　］一オルトホスフエートで標識し、感染細胞リゼ
イトから精製し、上記と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより分析した。

燐酸標識は５２Ｋｄおよび２９Ｋｄビリオン蛋白質にお
いて検出された（第２図）。５２Ｋｄ蛋白質は、小さな
燐蛋白質よりもさらに強く標識された。また、燐酸化物
質の２つの高分子量帯が検出された（Ａ％Ｂ１第２図）
。これらは、サイズの点で同定されたビリオン蛋白質と
一致せず、完全な欠損ウィルスＲＮＡを表すとは思われ
なかった。

ＢＥＦビリオンのデタージェント崩壊 ｔ，　　［３６ｓ］一メチオニン標識ＢＥＦを前記と同
様感染細胞リゼイトから精製し、室瓜で２０分間５００
ミリモルのＮａＣｌの存在および非存在下０．２％トリ
トンＸ−１００（デタージェント／蛋白質比＝　１　７
．４）により処理した。次いで、処理試料および非処理
対照を超遠心分離により清澄化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よび蛍光写真法により可溶性および不溶性フラクション
を分析した（第３図）。

０．２％トリトンＸ−　１　０　０単独で処理すると、
８１Ｋｄ蛋白質の約７５％が溶けた。他のビリオン蛋白
質は沈澱粒子と共に残った。５００ミリモルＮａＣｌの
存在下では、８１Ｋｄ蛋白質は完全に溶解した。さらに
、１　８　０Ｋｄ，４　３Ｋｄおよび２９Ｋｄ蛋白質の
大部分がビリオンから放出された。

５２Ｋｄ蛋白質は沈澱しているヌクレ才カプンド・フラ
クションと共に残存した。

ＢＥＦウィルス感染細胞において合戊された蛋可異 ＢＨＫ−２１細胞を、１０ｐｆｕ／細胞の増殖率でＢＥ
Ｆ’により模擬感染または感染させた。感染の６時問お
よび８時間後並びにその後４時間間隔で、細胞を３０分
間ｔ，　　［３５ｓ］一メチオニンにより標識し、採取
し、前記と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法によ
り分析した。まず、細胞変性作用の早期段階で感染の１
２時間後にウィルス蛋白質合吠が検出され、感染の２８
時間後までには完全になった（第４図）。細胞蛋白質合
成の阻害割合は、感染ｌ６時間後のウィルス蛋白質合成
の最大割合と一致した。ＢＥＦ感染細胞において５種の
蛋白質が誘導され、これらは１８０Ｋｄ，８ｌＫｄ，５
２Ｋｄ，４３Ｋｄおよび２９Ｋｄビリ才ン蛋白質と対応
していた。糖蛋白質は二重の帯として現れ、８１Ｋｄビ
リ才ン蛋白質よりも僅かに速くゲル中を移動した（７７
Ｋｄおよび７９Ｋｄ帯）。

ウィルス蛋白質の合成割合は、ビリオンにおけるそれら
の相対比率と類似していたが、ただし、４３Ｋｄ蛋白質
は感染細胞において比較的多量に存在していた。

ベリマー・ウィルス感染細胞において合成された蛋白質 Ｂｌ−ＩＫ−２１細胞を、１０ｐｆｕ／細胞の増殖率で
ヘリマー・ウィルスにより模擬感染または感染させー、
Ｌ−４３５５］一メチオニンでパルス標識し、感染後時
々採取し、ＢＥＦに関する記載と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
および蛍光写真広により分析した。

ヘリマー・ウィルスは、同じ増殖率の感染においてＢＥ
Ｆよりも細胞蛋白質合成阻害の点で効率的ではなかった
。感染１２時間後からウィルス誘導蛋白質が検出された
（第５図）。５種のベリマー・ウィルス蛋白質が検出さ
れ、そのうち３種は１８０Ｋｄ、５２Ｋｄおよび２９Ｋ
ｄＢＥＦ蛋白質と同じ分子量であった。ベリマー・ウィ
ルス感染細胞における糖蛋白質は二重の帯として存在し
、下方の帯は、ＢＥＦ糖蛋白質の二重の帯の場合よりも
僅かに速＜（７５Ｋｄ）ＳＤＳゲル中を移動した。

ベリマー・ウィルス感染細胞における４０Ｋｄ蛋白質は
、４３ＫｄＢＥＦ蛋白質に対応すると思われた。

ＢＥＦ糖蛋白質の生合成 ＢＥＦ糖蛋白質の合成における細胞内前駆体および中間
体を調べた。ＢＨＫ−２１細胞を、１０ｐｆｕ／細胞の
増殖率でＢＥＦ’により模擬感染または感染させた。感
染の１２時間後、０，３μｇ／２１２アクチノマイシン
Ｄを含むメヂオニン不含有培地で細胞を処理した。感染
の１６時間後、細胞をＩＯ分間同培地中で１００μＣｉ
／岬のｔ，　　［３５ｓ］メチオニンによりパルス標識
し、次いでｌ　ｍ９／ｍＱのメチオニノを含む培地によ
りチェイスした。

標識後時々、細胞を採取し、上記と同様ＳＤＳＰＡＧＥ
および蛍光写真法により分析した。結果を第６図に示す
。パルス標識直後に２つの細胞内糖蛋白質帯（７７Ｋｄ
および７９Ｋｄ）が検出された。

ヂエイス期間の最初の３０分間、これらの帯において殆
ど変化は無かった。標識の１時間後までに、７７Ｋｄ形
態は存在せず、７９Ｋｄ形態はあまり顕昔ではなく、８
１Ｋｄおよび９０Ｋｄにおいてさらに拡散した帯が現れ
た。２時間後およびさらに後の時点で、８１Ｋｄおよび
９０Ｋｄ形態のみが検出された。８１Ｋｄの帯はビリオ
ン糖蛋白質と似ており、感染細胞から除去されると思わ
れた。９０ＫｄｌＭ蛋白質は、感染細胞において８１Ｋ
ｄ形態と同様の量で現れたが、ＢＥＦビリオンにおいて
は検出されなかった。

Ｎ一結合オリゴサッカリド構造をもたない細胞内糖蛋白
質前駆体を同定するため、ＢＥＦ感染細胞を、！μｙ／
ｘＱのツニカマイシンの存在下、上記と同ｔＪＩＬ−［
”Ｓ］一メチオニンにより１０分間パルス標識し、ツニ
カマイシンおよび！＊９／＊ｅメチオニンを含む培地に
よりチェイスした。６７Ｋｄおよび７１Ｋｄにおいて２
つの糖蛋白質前駆体が検出された（第７図）。ツニカマ
イシンの存在下でのメチオニン・チェイスの結果、標識
６時間後以内に２つの帯における標識のパターンはほと
んど変化しなかった。ツニカマイシンの存在下、細胞を
Ｄ−［６−３８］一グルコサミンにより１時間標識し、
グルコースを多量に含む培地によりチェイスするという
手順で似た実験を行った。６７Ｋｄおよび７１Ｋｄ形態
への標識の取り込みの証拠は無かった。

蓄積されたウィルス糖蛋白質を同定するため、ＢＨＫ−
２１細胞を、ＩＯｐｒｕ／細胞の増殖率でＢＥＦ’ウィ
ルスにより感染させ、感染の１６時間後Ｄ−［６−’Ｈ
］一グルコサミンにより１時間標識した。次いで、ＩＯ
ｙｇ／ｘＱグルコースを含む培地により細胞をチェイス
した。パルス標識後時々、細胞を採取し、上述のＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法により分析した。２つの拡
散した糖蛋白質帯はパルス期間中終始明白であった。高
い方の分子量帯（９０Ｋｄ）は、ｔ，　　４６ｓ］一メ
チオニンによるパルス標識の１時間後に感染細胞で検出
されたものと同一であると思われた（第８図）。低い方
の帯は、標識期間直後には７７Ｋｄ、７９Ｋｄおよび８
１Ｋｄ蛋白質を含むと思われたが、３０分間のチェイス
後には、８１Ｋｄ成分しか残っていなかった。標識期間
の８時間後以内では８１Ｋｄおよび９０Ｋｄ帯が感染細
胞に残存していた。

ＢＥＦ蛋白質の機能帰属 ＢＥＦウィルス蛋白質について、それらのサイズ、相対
数度および他の特性に従い、狂犬病ウィルスおよび他の
ラブドウィルスの場合に対応する機能を割り当てた（第
１表）。分子量およびデタージェント耐性コア粒子の随
伴を考慮すると、１８０　ＫｄＩ３　Ｅ　ｒ；’蛋白質
はラプドウィルス・ポリメラーゼ（Ｌ）に対応する。８
１Ｋｄビリオン表面糖蛋白質（Ｇ）は、ビリオンにおけ
ろＤ−［６−３Ｈ］グルコサミンの取り込み、感染細胞
におけるツニカマイシン感受性および精製ビリオンのデ
タージェント可溶性エンベローブ・フラクションの随伴
により明らかに同定される。５２ＫｄＢＥＦ蛋白質は、
狂犬病ウィルス核蛋白質（Ｎ）に対応すると思われる。

狂犬病Ｎ蛋白質と同様、５２Ｋｄ蛋白質は、燐酸化され
、デタージェントおよび塩耐性コア粒子を随伴し、ビリ
才ンおよびビリオン感染細胞において最も多量に存在す
る成分である。残りの２種のＢＥＦ蛋白質（４３Ｋｄお
よび２９Ｋｄ）は、ビリオンをデタージェントおよび塩
で処理することにより部分的に可溶化され、狂犬病ウィ
ルスの膜関連Ｍ１およびＭ，蛋白質に類似していると思
われる。４３ＫｄＢＥＰ蛋白質は、ビリオンよりも感染
細胞の方に比較的多く存在し、狂犬病Ｍ，蛋白質に対応
すると思われる。２９ＫｄＢＥＦ蛋白質は、狂犬病マト
リックス蛋白質（Ｍ，）と似た分子量の主要ビリ才ン成
分である。しかしながら、狂犬病ウィルスとは異なり、
ＢＥＦでは、Ｍ１蛋白質ではなくマトリックス蛋白質（
Ｍ，）が燐酸化されている。ＢＥＦ感染細胞において検
出された非構造的糖蛋白質の９０Ｋｄ成熟形態はＧ　　
と命ＮＳ 名された。

也辻 ラブドビリダエ（Ｒｈａｂｄｏｖ　ｉ　ｒ　ｉｄａｅ）
科におけるうし滝行熱ウィルスの種類は、それが、４２
８１本鎖ＲＮＡゲノムを含む弾丸状ビリ才ン、並びに水
ほう性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）および狂犬病ウィルス
と似た分子量の蛋白質を有することに基づいて確立され
た［マーフィー等、「アルヒーフ・フユール・ディー・
ゲザムテ・フィルスフォルシュングＪ（Ａｒｃｈｉｖ　
ｆｕｒ　ｄｉｅ　ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓ
ｃｈｕｎｇ）、３６、２３４−２３９（１　９７２）、
デラボルタおよびブラウン、＋９７９１。しかしながら
、他のラブドウィルスとは異なり、ＢＥＦは、６Ｎのビ
リオン蛋白質を含むことが報告された。この構造は、こ
のウィルスが狂犬病ウィルスおよびＶＳＶとは別の属に
含まれることを示唆した［デラボルタおよびブラウン、
「ジャーナル・オブ・ジエネラル・パイロロジーＪＣＪ
　．　Ｇｅｎ．　Ｖ　ｉｒｏｌ．）、４４、９９−１１
２、１９７９］。

この発明では、うし流行熱ウィルスの蛋白質を再検討し
、狂犬病ウィルスの場合と似た構造を同定した。感染性
ＢＥＦビリオンおよびＢＥＦ感染細胞において５種の蛋
白質が検出された。また、密接に関連した血清型のベリ
マー・ウィルスにより感染した細胞では、５種のウィル
ス誘導蛋白質が検出された。ＢＥＦについては、サイズ
、相対数度、デタージェント溶解性および翻訳後修飾に
従って、蛋白質を’Ｌ（１　８　０　Ｋｄ）、Ｇ（８１
Ｋｄ）、Ｎ（５２Ｋｄ）、Ｍ．（４　３　Ｋｄ）お上び
Ｍ，（２９Ｋｄ）として割り当てた。デラボルタおよび
ブラウン（ｌ９７９）は、ＢＥＦ蛋白質について顕著に
異なる分子量を報告した。それらの推定値は、一次蛋白
質標準は参考にせず、狂犬病およびＶＳｖ蛋白質との比
較により得られた。狂犬病およびＶｓＶ蛋白質の代わり
にさらに近い分子量推定値を用いることにより［ザイデ
ス等、「ジャーナル・オブ・パイ口ロジーＪ（Ｊ．　Ｖ
ｉｒｏ１．）、２９、＋２２６−１２２８、ｌ９７９、
ウンナー等、「イミュノヶミストリー・オブ・パイラシ
ーズＪ（ｌｍＩＩｌｕｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙｏｆＶｉ
ｒｕｓｅｓ）］、３６７−３６８、エルセビア・プレス
、１９８５］、彼等のデータから我々の推定値との近い
相関関係を得ることができる。デラボルタおよびブラウ
ン（１９７９）により報告された第６のビリオン蛋白質
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて狂犬病ウィルスＭ．蛋白
質（３７Ｋｄ）と共に移動する小成分であった。我々は
幾つかのウィルス標本から似たサイズの蛋白質を検出し
たが、これらはさらに精製することにより除去され、ウ
ィルス感染性に関して本質的なものではなかった。この
サイズのウィルス蛋白質はＢＥＦ感染細胞からは検出さ
れなかった。

ＢＥＦビリオンから検出された２Ｆｌの燐蛋白質（Ｎお
よびＭ，）は、デラボルタおよびブラウン（１９７９）
により以前に報告されたものと一致した。

狂犬病ウィルスでは、ＮおよびＭ，Ｉ白質は燐酸化され
ている［ソコル等、「ジャーナル・オブ・ジェネラル・
パイロロジーＪ（Ｊ　，　Ｇｅｎ．　Ｖ　ｉｒｏｌ．）
、２４、４３３−４４５、ｌ９７４、ディーツショール
ド等、「バイａｏジー」（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、９８、
６３７５、１９７９］。ベシクロウィルス（ｖｅｓｉｃ
ｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）では、ＮＳおよびＭ蛋白質の燐
酸化が報告されている〔ソコル等、ｌ９７４、前出、イ
ンプラムおよびワグナー、「ジャーナル・オブ・バイｏ
ｏジーＪ（Ｊ　．　Ｖ　ｉｒｏ１．）、＋３、＋１３−
１２４、１９７４］。ＶＳＶ　ＮＳ蛋白質の燐酸化は、
ウィルス転写の調節において重要な役割を有すると思わ
れ［スー等、「ジャーナル・オブ・パイ口ロジーＪ（Ｊ
　．　　Ｖ　ｉｒｏ１．）、工主、１０４−１１２、Ｉ
９８２］、狂犬病ウィルスでは、Ｍ１蛋白質は機能的に
類似していると仮定された［コックス等、「ザ・レブリ
ケーション・オブ・ネガティブ・ストランド・バイラシ
ーズＪ（Ｔｈｅ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｎｅ
ｇａｔｉｖｅ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）、６３
９−６４５、エルセビア・プレス、＋９８１３。ＢＥＦ
　　Ｍ．蛋白質の低レベルの燐酸化はこの試験からは検
出されな゜かった可能性がある。

ＢＥＦ’の８夏ＫｄＧ蛋白質は、［３Ｈ〕−グルコサミ
ン標識およびビリオンのデタージェント崩壊により同定
された。精製ビリオンの小戊分として見出されたＢＥＦ
　　Ｇ蛋白質のフラグメントは、グリコシル化され、Ｇ
蛋白質中和モノクローナル抗体を結合していた。これら
のフラグメントは一貫して精製ビリオンにおいて見出さ
れたが、ＢＥＦ感染細胞からは検出されなかった。幾つ
かのマイナス鎖ウィルスの場合、ビリオン糖蛋白質の蛋
白質加水分解的開裂が感染に不可欠なこともあるが［オ
ーベルおよびノルビー、「イミュノケミストリー・オブ
・パイラシーズＪ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ＋ｓｉｓｔｒｙ
　ｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）、２４１−２６４、エルセビ
ア・プレス、１　９　８　５］、ＢＥＦビリオンから検
出された糖蛋白質フラグメントが感染において本質的役
割を有するか否かはまだ確かではない。

ＢＥＰ感染細胞では、２つの異なる形態の糖蛋白質が検
出された。ツニカマイシン処理細胞からは非グリコシル
化６７Ｋｄおよび７１Ｋｄ前駆体が検出された。ツニカ
マイシンの非存在下での短い放射性標識期間中、Ｎ一結
合コア・オリゴサッカリドを含む７７Ｋｄおよび７９Ｋ
ｄ糖蛋白質が形成された。その後、これらは、成熟ウィ
ルス糖蛋白質を表すと思われる８１Ｋｄおよび９０Ｋｄ
生成物に修飾された。成熟糖蛋白質の出現の遅れは、Ｖ
ＳＶの場合、ゴルジ体への輸送が完全なオリゴサッカリ
ドの形成に必要とされることを示唆している［ツィルバ
ースタイン等、コールド・スプリング・ハーバー・シン
ボノア・オン・クオンテイティブ・バイオロジー（Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ．　Ｑ
ｕａｎｔ．　Ｂｉｏ１．）、４６、７８５−７９５、１
　９　８　２］。８１Ｋｄ成熟ＢＥＦ糖蛋白質は、ビリ
オンＧ蛋白質と同等であると思われた。９０Ｋｄ形態（
ＧＮ８）は感染細胞では同様の虫で蓄積されたが、ビリ
オンからは検出されなかった。

以前の報告は、ＣＶＳ一狂犬病ウィルスのビリオンＧ蛋
白質が、同じペブチド地図を有するが炭化水素含有率の
異なる２つの形態に分離され得ることを示している［デ
ィーツショールド等、１９７９、ｉｉｉ出、コスレット
等、「ジャーナル・才ブ・ジェネラル・バイ００ジーＪ
（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．）、４９、　１６１−
１８０、　＋９８０］。トルドおよびボッホＥ「バイラ
ス・リサーチＪ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．Ｘ補遣）、主、
２０、＋９８８］は、ｐｖ一狂犬病ウィルスに感染した
細胞から２つのＧｍＲＮＡを検出した［トルドおよびボ
ッホ、１９８８、前出］。各々Ｇ蛋白質暗号化配列を含
むが、長い方は、ＧＬ遺伝子間領域中へ約３５０ヌクレ
オチド伸びている［トデ才等、「プロシーディングス・
才ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エイｊ（Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．ＡｃＭ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８３、３９１４−
１８、１９８６］。この転写物が感染細胞において通常
のＧ終止コドンを越えて翻訳されるか否かは測定されて
いないが、異なるリーディング・フレームにおいて別の
終止コρンが同定されている（トルド等、１９８６、前
出）。ＢＥＦ　Ｇ蛋白質の２つの形態は、各々免疫プロ
ットにおいて異なるモノクローナル抗体と反応するため
、異なる暗号化配列を含むと思われる。ツニカマイシン
処理細胞において［３Ｈ］一グルコサミンにより標識さ
れ得なかった２つの安定した前駆体ポリペブチドの存在
は、これら２つの形態が独立して翻訳されることを示す
。しかしながら、各形態のペプチド地図は、異なる構造
配列の存在を明白に確立するのに必要とされる。Ｇ蛋白
質遺伝子の最後における穏やかな終止シグナルの存在は
、狂犬病ウィルス（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）属にＢＥＦ
が含まれることと一致するゲノム戦略のさらに別の証拠
を提供する。

表 ＢＥＦウィルス蛋白質の分子量および特性α王量　機能
割当　作置　　　　翻訳後修飾１８０００Ｏ　　　Ｌ　
　　　コア関連９００００６ＮＳ　　非構造的　　グリ
コシル化ｇｔｏｏｏ　　　ｃ　　　　エンベローブグリ
コシル化５２０００　　　Ｎ　　　コア　　　　燐酸化
４３０００　　　Ｍ，　　　コア関連 ２９０００　　　Ｍｔ　　　コア関連　　燐酸化（図面
の説明） 第１図．沈降速度および平衡密度勾配遠心分離により感
染細胞培養肢から精製されたＢＥＦビリオンおよびＤＩ
粒子における蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動。クーマシー・ブルーにより染色されたビリオ
ン蛋白質（ａ）。感染中Ｌ−［”Ｓ］一メチオニンによ
り標識されたビリオン蛋白質のフル才ログラム（ｂ）。

感染中Ｌ−［３５Ｓ］一メチオニンにより標識されたＤ
Ｉ粒子蛋白質のフルオログラム（ｃ）。感染中Ｄ−［６
−’Ｈ］−グルコサミンにより標識されたビリオン蛋白
質のフルオログラム（ｄ）。ＢＥＦ中和モノクローナル
抗体ＤＢＳにより染色されたビリオン蛋白質の免疫プロ
ット（ｅ）。

第２図．感染中ｔ，　　［３５Ｓ］一メチオニン（ａ）
および［３ｔｐ］一才ルトホスフェート（ｂ）により標
識され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離されたＢＥＦビリオ．ン蛋白質のフルオログラム
。

第３図．ＢＥＦビリオンのデタージェント崩壊。

ＢＥＦを感染中ｔ，　　［３６Ｓ］一メチオニンにより
標識し、感染細胞培養液（ａ）から精製した。ビリオン
を、室温で２０分間ＮＴＥＱ衝液（ｂおよびＣ）、Ｎａ
Ｃｌｌ衝岐中０．２％トリトンＸ−１００（ｄおよびｅ
）またはＮＴＥＩＩ衝液中０，２％トリトンＸ一１００
および５００ミリ・モルＮａＣ１（ｆおよびｇ）により
処理し、水上で冷やし、４℃で２０分間７０　０　０　
０　ｒｐｍで超遠心分離を行った（ベックマンＴＬＡ　
Ｉ　Ｏ　Ｏローター）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写
真法により、可溶性（ｂ，　ｄおよびｒ）および不溶性
（ｃ，　ｅおよびｇ）フラクションを分析した。

第４図．ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞において合成され
た蛋白質。細胞をＢＥＦにより模擬感染（Ｃ）または感
染させ、図示されている通り感染の６、８、Ｉ２、ｌ６
、２０、２４および２８時間後にｔ，　　［３５Ｓ］一
メチオニンにより３０分間標識し、採取し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび蛍光写真法により分析した。誘導された蛋
白質を精製ビリ才ンの場合（Ｖ）と比較した。

第５図．ベリマー感染ＢＨＫ−２１細胞において合成さ
れた蛋白質。細胞をベリマー・ウィルスにより模擬感染
（Ｃ）または感染させ、示されている通り感染の６、８
、１２、！６、２０、２４、２８および３２時間後にＬ
［３Ｓｓ］一メチオニンにより３０分間標識し、採取し
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法により分析した。

第６図．ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞における糖蛋白質
の成熟。細胞をＢＥＦにより模擬感染（Ｃ）または感染
させ、感染の１６時間後Ｌ−［”Ｓ］一メチオニンによ
り１０分間パルス標識した。標識後、感染細胞を直ちに
採取するか（０）、または１０分（１　０）、２０分（
２０）、６０分（６０）、２時間（２）、４時間（４）
および６時間（６）、過剰の非標識メチオニンによりチ
ェイスし、採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法
により分析した。

ウィルス誘導蛋白質をビリオン蛋白質（Ｖ）と比較した
。

第７図．ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞におけるＮ一結合
糖蛋白質のツニカマイシンー阻害。細胞をＢＥＦにより
模擬感染（Ｃ）または感染させ、感染のｌ６時間後ツニ
カマイシンの存在（Ｔ十）または非存在（Ｔ一）下、ｔ
，　　［３Ｓｓ］一メチオニンによりＩＯ分間パルス標
識した。標識後、１０分（１０）、２０分（２０）、３
０分（３０）、６０分（６０）、２時間（２）および６
時間（６）、過剰の非標識メチオニンによりツニカマイ
シン処理感染細胞をチェイスした。細胞を採取し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法により分析した。ウィル
ス誘導蛋白質をビリオン蛋白質（Ｖ）と比較した。

第８図．ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞において合成され
た糖蛋白質。細胞をＢＥＰにより模擬感染（Ｃ）または
感染させ、感染の！６時間後Ｄ−［６’Ｈ］一グルコサ
ミンにより１時間パルス標識した。標識後、感染細胞を
直ちに採取するか（０）、またはＩＯ分（ｌＯ）、２０
分（２０）、３０分（３０）および６０分（６０）間、
過剰のグルコースによりチェイスした。細胞を採取し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光写真法により分析した。ウ
ィルス誘導蛋白質をｔ，　　［３５ｓ］一メチオニン標
識ビリオン蛋白質（Ｖ）と比較した。

ワクヂン製造用の原材料および方法 ウィルス ＢＥＰ味ＢＢ７７２１は、■９６８年にオーストラリア
のチャーターズ・タヮーズで感染した動物の血液から単
離された（ドハーティ一等、！９６８、前出）。子牛で
２ｕ代および乳のみマウスで６ｕ代後、細胞培養に適合
させた府記ウィルスからワクチンを製這した。細胞培養
への適合には、ブラーク・クローニング前にＢＨＫ−２
１細胞において２ｌ継代、ベロ細胞において３回および
ＢＨＫ−２１細胞においてさらにｆｕ代を要した。

ビルレント攻撃ウィルス（ＢＥｐｉＢＢ７　７　２　＋
）を牛において８回継代させた。

査生 約１８−２４月令の４頭の雌ヘレフオード牛を接種試験
中保護下で家畜小屋に閉じ込め、攻撃期間中防虫収容施
設に移した。

細胞培養およびウィルスの生長 ８５０Ｇがローラー・フラスコ中、ｌＯ％牛胎児血清、
ＩＯＯＵ，’ｏ２ペニシリンおよび１００μ９／ｍ（ｌ
のストレプトマイシンを浦ったｌ６４０培地において３
７℃でＢｌ−ＩＫ−２１細胞を生長させた。Ｉ３ＨＫ−
２１細胞の全面単層を０　．　５　ｐｒｕ／細胞の増殖
率でＢＥＦにより感染させ、３７℃で６０分間インキユ
ベーションした。接種物を除去し、２８ミリモルＨＥＰ
ＥＳ％０．１％牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、Ｉ　
０　０　Ｕｌｍ＆のべニンリンおよび１００μｇ／ｍＱ
のストレプトマイシンを含むｌ６４０培地と置き換えた
。感染の約２４時間後に充分な細胞変性作用が細胞単層
において囮察されたとき、ウィルスを含む細胞培養肢を
採取した。

ウィルス精製 前述の通り、感染細胞培養岐からウィルスを精製した。

感染細胞培養上清を３０分間１０００ｏｒｐｍで遠心分
離（ベックマンＪＡ−１０ローター）することにより、
細胞屑を除去した。ウィルスが９０分間３　２　０　０
　０　ｒｐｍで上清から沈澱し（コント口ンＴＦ’Ｔ４
　５．９４ローター）、これを小容気の１２０ミリモル
ＮａＣｌ，１．２ミリモルＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　，Ｏ　ｌ％
ＢＳＡ，０．１ミリモルＰＭＳＦ，１２ミリモルのトリ
スーＨＣＩ（＋）Ｈ７．６ＸＮＴＥ／ＢＳＡ）に再吐濁
した。沈澱したウィルスを、ＮＴＥ／ＢＳＡ中１５％−
６０％（ｔｖ／　ｗ）　Ｌ　ヨ糖勾配に適用し、ｚ６時
間４　０　０　０　０　ｒｐｍで平衡密度に遠心分離し
た（コントロンＴＳＴ５５ローター）。ウィルス帯を２
倍容量のＮＴＥ／ＢＳＡ中で希釈し、７　０　０　０　
０　ｒｐｍで１０分間ウィルスを沈澱させた（ベックマ
ンＴＬＡ．１００．３，ローター）。精製ウィルス沈澱
物をＢＳＡ不含有ＮＴＥ緩衝液１ｘ（ｌに再Ｓ！！！濁
した。

ワクチン製造 １ｘＱのＮＴＥＩ衝液中ｔｓｏ−３ｏｏｇｙのウィルス
蛋白質を含む精製ＢＥＦ’ウィルスを、室温で２０分間
１．０％トリトンＸ−［００で処理し、水上で冷却し、
４℃で２０分間７　０　０　０　０　ｒｐｍで遠心分離
した（ベックマンＴＬＡ．Ｉ　Ｏ　０．３，ローター）
。上清フラクシタンを集め、ワクチン抗原として使用し
た。沈澱物を１＊ＱのＮＴＥ緩衝液に再懸濁し、分析用
に保存した。

以下、第ｌ、第２および第３接種実験に関する接種方法
について記載する。

第１接種実験 ０，７および３５日目、注射前に１ｘＱのキノレＡ（　
ｌ　ｕ／ｚ＆）アジュバントと混合した新鮮な精製ワク
チン抗原５−１０μ９により、３頭の牛に皮下接種を行
った。■頭の対照牛には！村のキルＡのみを注射した。

４５日目、全部の牛にＩＲＱの攻撃ウィルスにより静脈
内接種を行った。接種後、動物を８時間間隔で攻撃に対
するそれらの臨床的および血ｉｆｆ学的応答についてモ
ニターした。

第２接種実験 ０、７および３６日目、−２０℃で５週間以下の間佇蔵
されていたＭ製ワクチン抗原５−１０μ９により４頭の
牛に皮下接種を行った。接種直前、抗原をｌａ＋（ｌの
キルＡ　（　ｌｍ９／　ｘ（！）アジュバントと混合し
た。４頭の対照牛にはＩｔｘＱのキルＡのみを注射した
。

４６日目、ＩＩｌ（の攻撃ウィルスにより全部の牛に静
脈内接種を行い、第ｌ接種実験の場合と同様、それらの
臨床的および血清学的応答に関してモニターした。

第３接種実験 ０、７および３６日目、６頭の牛に対し、８μｇ（２頭
の牛）、０．８μ９（２頭の牛）および０．０８μｇ（
２頭の牛）の貯蔵精製ワクチン抗原により皮下接種を行
った。接種直前、各抗原をｌｍ（ｌのキルＡ（１１Ｎ９
／ｘ＆）アジユバントと混合した。２頭の対照牛にはＩ
ｙ（ｌのキルＡのみを注射した。４６日目にＩｊｌ（！
の攻撃ウィルスを牛に接種し、上記と同様モニターした
。

ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動４％スクッキ
ング・ゲルでオーバーレイ（被覆）したｌＯ％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動を行った。レ
ムリ（１９７０年、前出）に従いゲルを製造し、前記と
同様垂直ミニゲルにおいて移動させた。

免疫プロッティング 本質的にウォーカー等（１９８７年、前出）による記載
と同様に蛋白質免疫プロッティングを行った。電気プロ
ット法［トービン等、「プロシーディングス・オプ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エイｊ（Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ
．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ）、７６、４
３５０−４３５４、ｌ９７９コにより、蛋白質をポリア
クリルアミドゲルからニトロセルロース紙へ移動させた
。マウス腹水肢またはネズミモノクローナルＩｇＧを用
いて検出するため、ニトロセルロースを３％ゼラチンで
プロックし、抗体、次いでｌ％ゼラヂン中ビオチニル化
ひつじ抗マウスＩｇＧ（アマージャム）およびビオチン
ストレプトアビジンーベルオキシダーゼ複合体（アマー
シャム）により処理した。うし血清中のＢＥＦ抗体を検
出するため、精製ＢＥＦを抗原として使用し、電気泳動
後５％低脂肪粉乳によりニトロセルロースをブロックし
た。うし抗体インキュベーノヨンは、５％低脂肪粉乳、
次いでｌ％ゼラチン中ビオチニル化抗うしＩｇＧ（ＫＰ
Ｌ）およびビオチンストレブトアビジンーベルオキシダ
ーゼ複合体（アマーシャム）において行なわれた。基質
４−クロロｌ−ナフトール（バイオ・ラド）を用いて、
免疫プロットを展開した。

遮断ＥＬ　Ｉ　ＳＡ 後述のモノクローナル抗体を用いたＢＥＦ糖蛋白質上の
抗原性部位のマッピングに記載された方法により、型特
異的ＢＥＰ抗体の遮断ＥＬ　Ｉ　ＳＡを行った。この遮
断ＥＬｒＳＡ実験では、マッピング実験で使用される川
めのモノクローナル抗体の代わりに牛血清を使用した。

中和試験 以前、チビンスキーが「ベテリナリー・マイクロバイオ
ロジーＪ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、±３、ｌ−９（１９８７）に記載した方法に
より、９６−ウエルのマイクロタイター・プレートにお
いて微細中和試験を行った。

ウィルス単離 ウレン等、「ベテリナリー・マイクロバイオロジーＪ（
Ｙｅｔ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｘ　１　９　８　９　
）により記載された方法に従い、一アエデス・アルボピ
クツス（Ａｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（ｃ　６
　／　３　６　）セルラインを用いてＥＤＴＡ一処理血
肢の軟膜分画からウィルスを単離した。

感染の血液学的パラメーター 攻撃後、直腸温度の変化について各動物をモニターし、
総白血球数を測定した。この時点で全血およびＥＤＴＡ
一処理血夜を採取し、血清、血しようおよび軟膜分画と
して貯蔵した。

結果 ワクヂン抗原の分析 精製ウィルスをデタージェントで処理することにより、
接種実験用にＢＥＦ糖蛋白質を製造した。

ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、精製
ウィルスおよびトリトンｘ−ｔｏｏ可濱性および不溶性
フラクションを分析した。勾配精製ウィルスは、５種の
ウィルス蛋白質（Ｌ，Ｇ，Ｎ、Ｍ１およびＭ！、第９図
ａ）を含んでいた。また、ＢＳＡ担体蛋白質の残基も存
在したが、この調製物は、細胞蛋白質をほとんど含まな
かった。．デタージェント処理後、大部分のウィルス蛋
白質がデタージェント不溶性フラクションから検出され
た（第９図Ｃ）。糖蛋白質（Ｇ）およびＢＳＡ残基のみ
が、デタージェント可溶性ワクチン抗原に存在していた
（第９図ｂ）。

中和性ＢＥＦモノクローナル抗体ＤＢＳを用いた免疫プ
ロツテイングにより、精製ウィルスからは糖蛋白質のみ
が検出された（第９図ｄ）。糖蛋白質の大部分は、デタ
ージェント可溶性ワクチン・フラクション中へ放出され
た（第９図ｅ）。低比率の糖蛋白質のみが不溶性の状態
であった（第９図『）デタージェント処理の前後にワク
チン抗原の感染性を測定した。勾配精製ウィルスは、９
　．　８　９ｏｇ，。ｐｆｕ／ｘ（！のＢＥＦを含んで
いた。デタージェント処理後、最低試験希釈率において
（１／２００ノ Ｏ）、可溶性または不溶性フラクションのどちらからし
、感染性は検出されなかった。最低試験希釈率（４　．
　０　ｃｏｇｌＯｐｒｔｔ／ｌＱ）において、ワクチン
抗原から感染性ウィルスは検出され得なかった。

接種実験 上記の要領で３つの接種実験を行った。第１の実験では
、ワクチン抗原として新たに調製した糖蛋白質（Ｇ蛋白
質）を使用した。第２の実験では、一２０℃で貯蔵され
ていたＧ蛋白質を使用した。

第３の実験では、有効な防御に必要とされる量のＧ蛋白
質を試験した。接種および攻撃方法の詳細は、上記の関
連した接種方法に示されている。

接種実験！ 動物の血清学的応答： 中和試験、遮断ＥＬ　Ｉ　ＳＡおよび蛋白質免疫プロッ
ティングを用いて、精製糖蛋白質による接種およびビル
レント・ウィルスによる攻撃後の牛の血清学的応答をモ
ニターした。接種後毎週および攻撃後毎日、動物から採
血した。第２接種の１週間後、全動物から中和性抗体が
検出された（第ｌＯ図）。第３接種まで力価は中程度の
レベルのままであったが、その後、力価における２番目
の急激な上昇が起こった。攻撃後、接種した動物からは
顕著な変化は検出されなかった。非接種動物では、中和
性抗体は攻撃の７日後に初めて検出され、力価はその後
の試料において上昇し続けた。

中和性Ｇ蛋白質特異モノクローナル抗体ＤＢ５および１
２Ａ５を用い、同じ血清において、遮断ＥＬ　Ｉ　ＳＡ
試験を行った。結果は、中和試験で得られたパターンと
似たパターンを示した（第１１図）。第２および第３接
種後、阻害力価は増加したが、攻撃後、接種動物では増
加しなかった。ＤＢＳ抗体に対する力価は、接種動物お
よび非接種対照の感染後の両方においてｌ　２Ａ５抗体
に対する力価よりも高かった。

接種および攻撃後の血清において蛋白質免疫プロットを
行った。接種動物では、攻撃の前後にＧ蛋白質抗体のみ
が検出された。Ｇ蛋白質の着色強度は、中和性および遮
断抗体の力価と平行していた。非接種動物では、Ｇ蛋白
質およびＭ蛋白質抗体の両方が攻撃後に検出された。

攻撃に対する臨床的応答： 攻撃後、非接種動物は重い流行熱の典型的症状を示した
。３日目に直ｍ温度は４１’Ｃに上昇し、３６時間高い
状態のままであった。他の症状としては、ひどい鼻汁、
硬直、震えを伴うこぶ胃アトニーおよび衰弱が蜆察され
た。絶対的リンパ球減少症を含む白血球減少症および相
対的好中球増加症は体瓜上昇を伴った。また、血しよう
フイブリノゲンの典型的上昇も観察された。

接種動物の中で、ＢＥＦ感染の何等かの臨床的または血
肢学的兆候を示した動物は無かった。しかしながら、攻
撃の４−６日後、全部の牛に単球増加症が現れた。

ウィルス単離： ウィルス単離用として、攻撃後８時間間隔で全動物から
血しょうを集めた。結果を第１２図に示す。感染の５６
時間〜１０４時間後、非接種動物からウィルスを回収し
た。接種動物の中でウィルスの証拠を示すものは無かっ
た。

貯蔵糖蛋白質による接種およびビルレント・ウィルスに
よる攻撃後の牛の血清学的応答を、Ｇ蛋白質特異的モノ
クローナル抗体ＤＢＳを用いた遮断ＥＬＩＳＡ試験によ
りモニターした（第１３図）。

実験１の場合と同様、全接種動物において、第２および
第３接種後に強い抗体応答が現れたが、攻撃後の接種動
物には現れなかった。非接種対照牛では、攻撃の１週間
後に抗体力価の急速な増加が生じた。

攻撃に対する臨床的応答： 攻撃後、全ての非接種対照動物は臨床的流行熱を発現し
た。全動物において直腸温度が持続的に上昇した。他の
臨床的兆候は実験ｌの場合と同様であった。接種動物の
中で何等かのＢＥＰ感染の臨床的または血液学的兆候を
示したものは無かった。

ウィルス単離： 攻撃後８時間間隔で全動物から血しょうを集めた。攻撃
の５６−１３６時間後、全非接種対照動物からウィルス
を回収した。攻撃の０−２０８時間後、接種動物からは
ウィルスは回収されなかった。

Ｇ蛋白質特異的モノクローナル抗体ＤＢＳを用いた遮断
ＥＬＩ　ＳＡ試験ｊこより、３投与濃度（８μｇ、０，
８μ９および０．０８μｇ）の精製糖蛋白質による接種
お上びビルレント・ウィルスによる攻撃後の牛の血清学
的応答をモニターした（第１４図）。８μ１のＧ蛋白質
により接種された２頭の牛は、第２および第３接種後に
強い抗体応答を示した。０．８μ９のＧ蛋白質による接
種を受けた２動物のうち、一方には第２接種後に強い抗
体応答が現れたが、他方の牛は第３接種まで低レベルの
抗体を示した。０．０８μ９のＧ蛋白質による接種を受
けた２動物のうち、一方には第３接種後に抗体が現れた
が、他方には攻撃時点まで検出可能な抗体力価は現れな
かった。攻撃後、８μ９および０，８μ９のＧ蛋白質を
接種された動物では抗体力価は高い状態のままであった
。０．０８μ９のＧ蛋白質を接種されたｌ動物は、抗体
の増加が検出される前に臨床的ＢＥＦのため死亡した（
下記参照）。

０．０８μ２のＧ蛋白質を接種された他の動物および２
非接種対照動物には、攻撃後に増加中の抗体力価が現れ
た。

攻撃後、８μｇおよび０．８μ９のＧ蛋白質を接種され
た動物は全て、ＢＥＦの臨床的または血肢学的兆候を一
切示さずに生存していた。０．０８μ９のＧ蛋白質を接
種された動物は、両方とも流行熱の典型的な臨床的およ
び血液学的兆候を発現し、これらのうち一方は死亡した
。非接種対照動物は、実験ｌの記載と同様に両方とも流
行熱の典型的な臨床的および血液学的兆候を発現した。

接種実験の要約 精製Ｇ蛋白質による接種およびビルレントＢＥＦウィル
スによる攻撃後の全動物の応答を第１表に要約する。合
計９動物に５−ｌＯμ９のＧ蛋白質による接種を行った
結果、全て、臨床的または亜臨床的ＢＥＰ感染の証拠を
示さずに攻撃後も生存していた。２動物に０．８μ９の
Ｇ蛋白質を接種した結果、各々攻撃後にＢＥＦ感染の証
拠を示さなかった。０．０８μ９のＧ蛋白質を接種され
た２動物は、各々攻撃後に臨床的ＢＥＦを発現し、これ
らのうち一方は流行熱により死亡した。また、７非接種
対照動物は全て、臨床的流行熱の典型的症状を発現した
。

これらの結果は、０．８μｇまたはそれ以上の精製Ｇ蛋
白質を適当なアジュバントと共に皮下投与することによ
り、動物が、ビルレント流行熱ウィルスによる実験的攻
撃から有効に防御され得ることを示す。

（図面の説明） 第９図．トリトンＸ−１００で精製ＢＥＦを処理するこ
とにより可溶性糖蛋白質ワクチンが生成される。感染細
胞培養液からＢＥＦウィルスを精製し（ａおよびｄ）、
室温で２０分間１％トリトンＸ−１００により処理し、
水上で冷却し、４℃で２０分間７　０　０　０　０　ｒ
ｐ＋ｓで遠心分離した。上清フラクンヨンを集め、ワク
チン抗原として使用した（ｂおよびｅ）。沈澱したフラ
クション（Ｃおよび『）を同容量の緩衝液に再懸濁した
。フラクションを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析し、クーマシー・ブリリアント・ブル
ーにより染色するか（ａ，　ｂおよびＣ）、またはＧ蛋
白質特異的モノクローナル抗体ＤＢＳを用いて免疫プロ
ソトした（ｄ，　ｅおよびｆ）。

第ｌＯ図．接種および攻撃中、接種動物（Ｄ３９３、Ｄ
３９９およびＤ４０１）および非接種対照動物（Ｄ３９
８）から集められた血清において中和試験を行った。血
清採血物ｌは第ｌ接種前に採取され、採血物２−９は接
種後１週間間隔で採取された。採血物１　０−２　１は
、ビルレントＢＥＦウィルスによる攻撃後８時間間隔で
採取さ−れた。

第１１図．接種および攻撃中、接種動物（Ｄ３９３、Ｄ
３９９およびＤ４　０　１）および非接種対照動物（Ｄ
３９８）から集められた血清において遮断ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ試験を行った。血清採血物！−２１は、第１０図にお
ける記載と同様に採取された。

示された通り、Ｇ蛋白質特異的中和性モノクローナル抗
体ＤＢＳ（口）および１２Ａ５（■）を用いて遮断ＥＬ
Ｉ　ＳＡ試験を行った。また、各血清に関する中和試験
力価も示されている（・・・）。

第１２図，ビルレントＢＥＰウィルスによる攻撃．後、
接種動物（Ｄ　３　９　３、Ｄ３９９およびＤ４０Ｋ）
および非接種対照動物（Ｄ３９８）から集められた白血
球フラクションからのウィルス単離。（＋）は陽性ＢＥ
Ｆウィルス単離を示し、（−）は、ウィルスが試料から
単離されなかったことを示す。

第１３図．０、７および３６日目での接種および４６日
目での攻撃後の接種動物６９９、７００、７０１および
７０２並びに非接種対照動物７０３、７０５、７１２お
よび７２０におけるＧ蛋白質抗体に関する遮断ＥＬ［Ｓ
Ａ試験。実験２一佇蔵されたＧ蛋白質。

第１４図．９、７および３６日目での接種および４６日
目での攻撃後の接種動物２４、２８（８μｇ）、２６、
３０（０．８μｇ）および２３、２５（０，０８μｇ）
並びに非接種対照動物２７、２９におけるＧ蛋白質抗体
に関する遮断ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験。

実験３一用量応答。

ＢＥＦウィルスのＧ％Ｍ１、Ｍ，およびＮ蛋白質に対し
て３２のモノクローナル抗体を製造した。

きっ抗的結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより、Ｇ蛋白質上の少な
くとも３つの抗原部位に１３の中和性モノクローナル抗
体を割り当てた。３種のＢＥＦウィルス株および３種の
ＢＥＦ関連ウィルスを用いた中和試験および免疫蛍光検
定は、異なる供給源からのＢＥＦ株は同一ではないこと
、および免疫蛍光検定法において主に交差反応性に関与
する蛋白質はＭ，蛋白質であることを示した。マウスに
おける受動防御試験は、中和力価および攻撃に対する抵
抗性の間の相関関係を示した。

上述のＧ蛋白質は、ビリオン表面上に突出物を形成し、
トリプシンまたは非イオン性デタージェントにより除去
され得るＮ−グリコシル化膜蛋白質である。狂犬病の場
合、Ｇ蛋白質は、中和性抗体を産生させ、これと反応す
ると考えられる抗原である［ウィクター等、「ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジーＪ（Ｊ．　ｌａ＋ａｉｕｎｏ
１．）、１１０１２６９−２７６（＋９７３））。ウィ
ルス中和性モノクローナル抗体を用いた狂犬病ウィルス
に関する研究により、ＣＶＳ−１１株の糖蛋白質におけ
る少なくとも３つの抗原性部位およびＥＲＡ株における
５つの抗原性部位に関する証拠が提供されたＥラフォン
等、「ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジー」
（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏ１．）、６４、８４３−５
１（１９８３）］。ピットマンームーア株の追加部位は
、ゾンショーテン等［「ジャーナル・オプ・ジェネラル
・バイ０ロジーＪ（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．）、
７０、２９＋−２９８（１９８９）］により記載された
。この実験では、１３の中和性モノクローナル抗体の特
性検定を行ない、きっ抗的結合検定に基づいてそれらを
ＢＥＦ　Ｇ蛋白質上の抗原性部位に割り当て、マウスの
受動防御における中和性抗体の役割を立証した。３種の
ＢＥＦ株および３種のＢＥＦ’関連ウィルスについて、
４つのＢＥＦ蛋白質に対する中和性および非中和性モノ
クローナル抗体の交差反応性を調べた。

感染牛の血液から採取されマウスにおいて単離された、
ＢＥＦウィルスのｆ３Ｂ７７２１味（ドハーティー等、
１９６８）を、モノクローナル抗体の製造および試験に
使用した。蚊から採取されマウスにおいて単離された、
ＢＥＦウィルス株ＣＳＩ　ＲＯ４　２およびＣＳＩＲＯ
５３［スタンドファースト等、「オーストラリアン・ベ
テリナリー・ジャーナルＪ（Ａｕｓｔ．　Ｙｅｔ．　Ｊ
．）、５２、２４２、ｌ９７６］、ベリマー（ＢＲＭ）
ウィルス株ＤＰＰ６３、キンバリー（Ｋｉｍｂｅｒｌｅ
ｙＳＫ　Ｉ　Ｍ）ウィルス株ＣＳＩｌ１０３６８、およ
びアデレード・リバー（Ａｄｅｌａｉｄｅ　Ｒｉｖｅｒ
，　ＡＲ）ウィルス株ＤＰＰ６１を、健康な牛からのＢ
ＨＫ２１組織培養物において単離した［ガード等、１９
８３、前記参照、ガード等、「オーストラリアン・ベテ
リナリー・ジャーナルＪ（Ａｕｓｔ．　Ｙｅｔ．　Ｊ　
．）、６　１，２３２（１　９８４）］。全ウィルスを
ＢＨＫ２＋細胞において増殖させ、ベロ細胞においてプ
ラーク精製した。

ねずみハイプリドーマの製造 ２タイプの抗原を用いることにより、マウスにおいてＢ
ＥＰ抗体を産生させた。Ｉ）ＢＥＦウィルス感染させた
乳のみマウスの脳を、１０％ＰＢＳｕＥ液中でホモジネ
ートした。これを１０００ｇて遠心分離し、上清を接種
物として使用した。

２）ＢＥＰ抗原を上記と同様に製造し、次いでトリトン
Ｘ−１００で処理することによりＧ蛋白質を除去し、７
　０　０　０　０　ｒｐｍでの遠心分離にかけ、Ｇ蛋白
質を殆どまたは全く含まない沈澱物を接種物として使用
した。成熟雄Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに対し、Ｂ
ＥＰ抗原および等容量のフロインド完全アジュバントか
ら成る混合物０６５〜ｇの腹腔内注射を行った。１週間
後、フロインド不完全アジュバントを用いて同様の接種
を行い、次いで、アジュバントは使用せずにＢＥＦ抗原
０　．　５　ｍ（ｌを用いて、その後２か月にわたって
４回の腹腔内注射を行った。最終注射の４日後、コーラ
ーおよびミルスタインの方法［「ヨーロビアン・ジャー
ナル・オブ・イミュノロジーｊ（Ｅｕｒｏ．　Ｊ．　ｌ
ｍｍｕｎｏｌ．）、６、５１１−５　＋　９（１　９７
６）］に基づいた方法により融合を行った。ＢＥＦ免疫
ひ臓細胞およびＰＩＸ６３−Ａｇ８−６５３ミエローマ
細胞間の融合［カーネイ等、「ジャーナル・オブ・イミ
ュノロジー」（Ｊ．　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｏ１．）、１２３
、５１１−５１９、Ｉ９７９コは、７５ミリモルＨＥＰ
ＥＳ（ベーリンガー・マンハイム）中ＰＥＧ１５００［
５０％（ｗ／ｖ）］により誘導された。マウス腹腔内マ
クロファージを、２４または９６ウェルの組織培養プレ
ートにおける供給細胞層として使用した。免疫蛍光検定
法（ｒＰＡ）を用いることにより、上清をＢＥＦ特異性
に関してスクリーニングし、限定希釈により陽性クロー
ンをサブクローン化した。プロデュール等による記載［
「ジャーナル・オプ・イミュノロジカル・メソツズＪ（
Ｊ．　ｌｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２１、２
６５−２７２（１　９８４）］に従い、０　．　３　ｘ
Ｑのプリスタン（２．６，１　０．１　４−テトラメチ
ルペンタデカン）により１−３週間前にプライムしてお
いたＢＡＬＢ／ｃ？ウスへｌ　Ｏ”−　１　０’ハイブ
リッド細胞を腹腔内接種することにより、腹水液におけ
る高濃度のＩｇＧが得られた。腹水液を清澄化し、５６
℃で３０分間加熱不活化し、−２０℃で貯蔵した。

抗体試験 チビンスキーおよびザクルツエブスキーにより記載され
た［「ベテリナリー・マイクロバイオ口ノ−Ｊ（ｖｅｔ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　）、８、２２＋−２３５（＋
９８３）］間接的ＩＦ’Ａを用いて、ハイプリドーマ上
清をスクリーニングし、スライドの代わりに９６ウエル
の平底組織培養プレートで使用するために修飾した。ベ
ロ細胞の単層に、５００の５０％組織培養感染用量のＢ
ＥＦウィルスを接種した。

５％ＣＯ，の雰囲気中３７℃で２２時間のインキュベー
ンヨン後、プレートをＰＢＳ中５０％アセトンでリンス
し、次いで！００μＱ／ウェルのＰＢＳ中７０％アセト
ンにより３０分間固定した。フルオレセイン・イソチオ
シアナートーコンジュゲートうさぎ抗マウス免疫グロブ
リン（ＤＡＫＯ）を加え、３７℃で３０分間インキユベ
ーションし、ＰＢＳで洗浄した後、プレートを蛍光顕微
鏡により観察した。同様の方法で、他のウィルスに対す
る［ＦＡ抗体の存在が険出された。

非希釈ハイプリドーマ上清または２倍希釈液での腹水岐
を用い、＋００の５０％組織培Ｐ！感染用最の試験ウィ
ルスを加える、チビンスキー等により記載された方法［
「オーストラリアン・ベテリナリー・ジャーナルＪ（Ａ
ｕｓｔ．　Ｙｅｔ．　Ｊ．）、５４、！−３（１　９　
７　８）］の修正法により、中和性試験を行った。ウエ
ルの５０％においてウィルスを中和する腹水液の相互希
釈率として力価を表した。サルトレリ等「ジャーナル・
オブ・イミュノロジー」（ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．）、９
６、６７６−６８２（１　９６５）並びにチビンスキー
およびザクルツェブスキー、「ベテリナリー・マイクロ
バイオ口ノーＪ（Ｙｅｔ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、
８、２２　１−２３５（＋　９８３）による記載に従い
、交差中和性試験で使用するためのポリクローナル抗体
をマウスまたはウサギにおいて製造した。

アイソタイピング ウレアーゼ標識抗マウスＦａｂコンジュゲートによりＩ
ｇ重鎖および軽鎖を検出するマウス・モノクローナル・
アイソタイピング・キット（コモンウェルス・セーラム
・ラボラトリーズ、才一ストラリア）を用いて、抗体の
アイソタイピングを行った。

前記と同様の要領でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および蛋白質免疫プロツテ
ィングを行った。

免疫グロプリンの精製 ＤＥＡＥ−アフィゲル・ブルー（バイオ・ラド）を用い
た腹水液のアフィニティー・クロマトグラフィーにより
、モノクローナル抗体を精製した。

２０ミリモルのトリスーＭＣＩ（ｐＨ７．２）における
塩勾配（０−１５０ミリモル）を用いて、ｒｇＧを選択
的に溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＦＡによりＬ
ｇＧピークからのフラクションを分折し、純枠なＢＥＦ
特異的１ｇＧを含むフラクションをプールし、２０ミリ
モルのトリスーＨＣＩ中５０％グリセリンに対して透析
したディアフロ限外ろ過膜ＹＭＩＯ（アミコン）を用い
た限外ろ過により濃縮し、〜２０℃で貯蔵した。バイオ
・ラドのガンマーグロプリン標準を用いる、レディンバ
ウフおよびキャンベル、「アナリティカル・バイ才ケミ
ストリーヨ（Ａｒ＋ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｔ）、１４７
、１４４−１４７（１９８５）に記載された方法により
、ＩｇＧの濃度を評価した。

きっ抗的結合検定 精製モノクローナル抗体をＩＯＯミリモルＮａＨ　Ｃ　
Ｏ　，（ｐＨ　８　．　２　）に対して透析し、約ＩＲ
ｇ／＊（ＩｇＧに希釈した。グレッチ等、「アナリティ
ヵル・バイオケミストリーｊ（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）、１６１、２７０−２７７（１　９８７）によ
る記載に従い、ノメチルスルホキシド中ＮＨＳ−ＬＣビ
オチン（ピアス・ケミカルズ）を加え、室温で２時間反
応させ、次イテ生成物をＰＢＳ中０．０２％ＮａＮｚに
対して充分に透析し、４゜Ｃで貯蔵した。

上記遮断検定を実施する前、ＥＬ［ＳＡプレートを、上
記に従い製造された勾配精製ＢＥＦ抗，京により＝Ｉ　
’Ｃで一夜被覆した。後続のインキュベーンヨンは全て
室温で行なわれた。まず、非結合部位を１％ゼラチンに
よりブロックし、次いで、プレートを最初のモノクロー
ナル抗体の希釈肢とインキユベーションし、次いで予め
定められた希釈率でビ才チニル化抗体を加え、１時間イ
ンキスヘーンヨンした。Ｉ／＋０００に希釈したストレ
ブトアピジン・ビオチニル化西洋わさびベルオキシダー
ゼ（アマーシャム）を加え、１時間インキユベーンヨン
し、次いで０．０　０　２％Ｈ．Ｏ，を含む堰質５−ア
ミノサリチル酸を加えた。３０分後、色素展開を４９２
ｎｍでＥＬＩＳＡ読み取り器（タイターテック・ミルテ
ィスカンＭＫＩＩ）においてＡがきっ抗物質の非存在下
における光学密度（ＯＤ）である場合、Ｂは泪同抗体存
在下におけるＯＤであり、Ｎはきっ抗抗体存在下におけ
るＯＤてある［ヒューズ等、「アーカイブス・オブ・パ
イロロジーＪ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ）、１０３−、４７６０、ｌ９８８コ。きっ抗（〉
７５％）、部分的きっ抗（３５％〜７５％）、非きっ抗
（−２０％〜３４％）および促進または陰性きっ抗（＜
−２０％）として反応を等級付けした。

受動マウス防御試験 ！腹の１〜２日令マウスに対し、中和性または非中和性
モノクローナル抗体を含む３０μＱ腹水岐による腹腔内
接種を行い、残りの対照マウスには抗体を接種しなかっ
た。２時間後、それらのマウスに対し、マウス脳で生長
させたｌ０００の５０％致死用量のＢＥＰウィルス２０
μＱによる大脳内接種を行った。マウスを１４日間毎日
調べ、死亡を記録した。

結果 モノクローナル抗体の特性検定 接種物としてＢＥＦ抗原Ｌを用いることにより、クロー
ニング後２９の安定したモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマが得られた。それらのうち、１０はＧ蛋白質と
反応し、５つはＭ２蛋白質と反応し、４つはＭｌ蛋白質
と反応し、残りｌＯはウエスタン・プロット分析におい
てＢＥＦ抗原に結合しなかった。１３はインビト口でＢ
ＥＦウィルスを中和し得、これらのうち９つはウエスタ
ン・プロット分析においてＧ蛋白質と反応したが、他の
抗体の結合は抗原の３次元立体配置により異なると考え
られた。接種物としてＢＥＦ抗原２．を用いることによ
り、７９のモノクローナル抗体産生ハイプリドーマがＩ
ＦＡにより検出され、これらは、主としてＮ蛋白質に特
異的であった。

クローン化されたｌＯのハイブリッドのうち６つは、安
定したハイブリッドを産生した。第ＩＡ表は、ＧＳＭｌ
およびＭ２蛋白質反応性モノクローナル抗体および３つ
のＮ蛋白質反応性抗体を、それらの中和状態およびアイ
ソタイプと一緒に列挙したものである。中和能力はハイ
ブリドーマ上清から検出されたが、腹水液はそれよりｌ
０００倍以下高い力価を呈した。表されたアイソタイプ
は、ＩｇＧ２ａ，ｒｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３であった。

全てカッパ軽鎖を有した。

１２氏程４像Ｌ １３の中和性モノクローナル抗体をビオチニル化し、相
互きっ抗結合検定を行うことにより、ビオチニル化モノ
クローナル抗体の抗原結合に対する各モノクローナル抗
体の阻害能を試験し、その結果、抗原性部位の位相関係
に関する情報が得られた。ビオチニル化抗体は全て、相
同性抗体により有効にブロックされ、各異種抗体の場合
、過剰のきっ抗抗体による約ｌ００％または０％におけ
る「プラトー（安定状態）」が存在している。しかしな
がら、幾つかの例外としては、両方向において部分的き
っ抗を示すだけの９Ｃ５および１３Ａ３があった。幾つ
かの抗体は、他の抗体の結合により増強された。

第２表は、上記プラトーから平均値をとった上述のデー
タの要旨を示し、ＢＥＰ　Ｇ蛋白質上に少なくとも３つ
の抗原性部位が存在することを示している。Ｇ１部位が
線状部位であり、６２部位が立体配座部位である場合、
サブ部位Ｇ３ａおよびＧ３ｂを含む６３部位は、線状お
よび立体配座エピトーブの両方により構戊されると思わ
れる。

中和および免疫蛍光。

第３表は、ポリクローナル抗体を用いたＢＥＦ群ウィル
スの交差中和力価を示す。ＢＲＭウィルスは、ＢＥＦウ
ィルス株ＢＢ７７２１腹水液との一方向交差反応性を与
えたが、第２の腹水液は、二方向交差反応性を与えた。

ＣＳＩＲＯ４２および（，ＳＩＲＯ５３は、ＢＥＦウィ
ルスの変異体であると考えられるが、交差中和試験では
幾つかの差異が示された。第４表は、ＢＥＦウィルスの
ＢＢ７７２１％ＣＳ　ＩＲＯ４２およびＣＳＩＲＯ５３
株、並びにＢＥＦウィルスに対して血清学的に関連性を
有することが示された他の３Ｎのウィルス（ＢＲＭ％Ｋ
ＩＭおよびＡＲウィルス）を用いた中和性モノクローナ
ル抗体に関する中和およびＩＦ’Ａ試験の結果を示す。

（チビンスキー等、１９７８、前出）。腹水液に関する
中和試験の結果は、総じてハイブリドーマ上清に関する
ＩＦＡにより得られた結果と一致していたか、低い中和
力価および低いＩｇＧａ度を有する６３部・αの２つの
エピトープ（８８６および８Ｄ３）は例外であった。

第５表は、ＩＦＡを用いた４種のＩ３ＥＦ蛋白質に対す
る非中和性抗体のウィルス特異性を示す。Ｍ２蛋白質に
対する抗体は最も交差反応性が高かった。Ｇ蛋白質特異
的抗体のうちの一つ（３Ａ２）は、６種のウィルス全部
と反応した。

抗原性部位Ｇｌのみを認識する抗体のうち４つは、ＢＥ
Ｆウィルス株と反応したが、関連ウィルスとは反応せず
、またｌ抗体（９Ｃ５）はＢＲＭウィルス株と反応した
が、１　２Ａ５の力価は、ＢＥＦウィルスとの場合より
らＢＲＭとの場合の方が顕著に低かった。Ｇ３部位に割
り当てられたモノクローナル抗体のうち、１つのみが中
和によりＣＳＩＲＯ５３と反応したが、２つは［ＦＡに
よりＣＳｒＲＯ５３と反応した。３つは中和および■Ｆ
ＡによりＣＳＩＲＯ４２と反応したが、３Ｄ６の中和力
価はＢＥＦウィルスとの場合よりもかなり低かった。ま
た、ｌ抗体８Ｄ３はＩＦＡによりＫＩＭウィルスと反応
した。

第４表および第５表のＩＦＡ結果を要約すると、ＢＥＦ
ウィルスのＢＢ７７２１株と反応する３２のモノクロー
ナル抗体のうち、２９はＢＥＦウィルスのＣＳ　ＩＲ０
４　２株と反応し、２５はＢ　Ｅ　ＦウィルスのＣＳＩ
ＲＱ５３味と反応した。ｌ６はＢＲＭウィルスと反応し
、ＩＩはＫＩＭウィルスと反応し、６のみがＡＲウィル
スと反応した。

マウス防御。

ＢＥＦウィルスによる攻撃の２時間前、モノクローナル
抗体を含む腹水液を接種した乳のみマウスの平均生存時
間（日数）を第６表に示す。インビトロ中和力価との比
較は、マウスにおけるこれらの力価と５．３〜ｌ　＝１
日以上の範囲の生存時間の間のある程度の相関関係を示
す。対照マウスの平均生存時間は４．７日であったが、
ＧＳＮＳＭ１およびＭ２蛋白質と反応する８種の非中和
性抗体を接種したマウスの場合は５．００ないし５．５
０日であった。５種の抗体の場合、実験終了時の１４日
後に生存していたマウスらあった。

塗壮 中和、ＩＦＡおよびきっ抗的結合結果のパターンについ
て熟慮すると、試験された１３のモノクローナル抗体は
、ＢＥＦ　Ｇ蛋白質上の少なくとら１０の異なるエピト
ーブと反応すると思われる。

これらのうち幾つかは、部分的に一致することか与３つ
の抗原性部位を代表する群に包含される。

６１部位を認識する５つのモノクローナル抗体の群は、
変性したＢＥＦ　Ｇ蛋白質と反応するため、前記部位は
、Ｇ蛋白質の３次元構造とは関係無く、大部分アミノ酸
の線状配列により構成されると考えられる。この群にお
けるｌ抗体（９Ｃ５）のみがＢＲＭウィルスを認識する
が、池の４つはＢＥＦウィルス株に特異的であった。さ
らに、ｌ　３Ａ３および２つの他の抗体により一部分の
みのきっ抗が観察されたという事実は、この群が、同じ
ｌエピトープではなく少なくとも４つのエピトープを認
識することを示す。狂犬病ウィルスに関する研究は、ウ
ィルス中和性抗体が立体配座エピトーブを優先的に認識
することを示唆しているため、この線状抗原性部位は特
に興味深い。（プンショーテン等、ｌ９８９、前出）。

しかしながら、狂犬病ウィルスのピットマンームーア株
により免疫化されたマウスにおいて産生された！モノク
ローナル抗体は、新規の立体配座依存性抗原決定基を認
識した（ブンショーテン等，１９８９、前出）。

６２部位と反応する４つのモノクローナル抗体がウエス
タン・プロット分析において変性抗原を認識しなかった
ことから、抗原の正確な３次元立体配座がこの部位への
抗体結合に必要であることが判る。抗体のうちの一つ（
ＩＩＤＩ）は、群の他の構成員との部分的きっ抗を示し
、部分的に重複するエビトーブとの反応性を示した。

６３部位は、抗原部位Ｇ３ａおよびＧ３ｂと命名された
部分的に重複するかまたは極めて接近している２つの部
位と反応すると思われる４つのモノクローナル抗体によ
り構成される。郎位Ｇ３ａは２味の１３’ＥＦウィルス
で見出されるが、部位Ｇ３ｂは３種のＢＥＦウィルス株
およびＢＲＭウィルスにおいて見出される。部位Ｇ３は
、線状および立体配座の両エピトーブにより構成され、
これらか機能的に異なる部（立を表すことを示している
。

幾つかのモノクローナル抗体の興味深い特徴は、他の抗
原性部位において抗体結合を増強する能力である。これ
は、抗体の結合がＧ蛋白質の形状を変えるため、分子の
他の部分の部位に影響を与え得ることを示す。この現象
は、牛ヘルペス・ウィルス１型糖蛋白質ＩＶに関して記
載されている（ヒューズ等、Ｉ９８８、前出）。これら
の抗体が本当に現れるか否か、およびそれらが抗体結合
の促進においてある役割を有するか否かについて予測す
ることは興味深い。１つはＣＳ　ＩＲＯ４　２を中和せ
ず、３つはＣＳＩＲＯ５３を中和し得なかったため、Ｇ
３部位に対する抗体を用いることにより、この試験で使
用される３種のＢＥＦ株を区別することができる。ｌ抗
体（８Ｄ３）はＩＦＡ試験においてＫＰＭウィルスに結
合したが、このウィルスの場合中和は観察されなかった
。しかしながら、この抗体に関するＢＥＦウィルスによ
る中和力価は非常に低かった（８）。ＢＥＦ株ＢＢ７７
２ＩおよびＣＳ　ｌ　ｆｌ０４　２による３Ｄ６の中和
力価の差異は、認識されたエピトープがこれら２種のウ
ィルスにおいて同一ではないことを示している。

同様に、ＢＥＦウィルスの株において１２Ａ５により認
識されたエビトーブは、ＢＲＭウィルスにおける場合と
同一ではなかった。

ＡＲウィルスは、この試験における中和性モノクローナ
ル抗体のいずれからも認識されなかった。

このことは、このウィルスがＢＥＦウィルスよりも狂犬
病ウィルスの方に密接な関連性を有するという見解を支
持するものである。

ＢＥＦは、構造的および血清学的に狂犬病ウィルスとの
関連性を示すが、これらのウィルスは、宿主範囲および
組織屈性並びにＧ蛋白質のサイズの点が相異している。

狂犬病ウィルスのＣｖＳ株のＧ蛋白質の抗原性マッピン
グにより３つの中和郎位が画定され、狂犬病ウィルスの
ＥＲＡｎＧ蛋白質において５つの中和部位か立証された
（ラフォン等、１９８３、ウィクタ一等、＋９８３）。

追加の部位は、狂犬病ウィルスのピットマンームーア株
を用いてゾンンヨーテン等（＋　９　８　９）により見
出されたか、これはまた、ＣＶＳおよびＥ　Ｒ　．Ａ株
に存在することが示された。

異なる供給源から得られたＢＥＦウィルスの牛単離物は
全て、血清学的および抗原的に同じであることが、スノ
ードン等［「オーストラリアン・ヘテリナリー・ジャー
ナルＪ（ＡｕｓＬ．　Ｖｅｔ．　Ｊ．）、４６、２５８
−２６６（１　９７０）コにより報告されている。これ
らの結果は、昆虫から得られた２種のＢＥＦ単離物はモ
ノクローナル抗体の使用によりＢ８７７２１株から区別
され得たが、ＣＳＩＲＯ４２は、このウィルスを認識し
ない３２のＢＥＰ抗体のうち３種のみと非常に密接な関
連性を有したことを示す。ＡＲウィルスは６種のＢＥＦ
’抗体によってのみ認識され、これらのうち５種はＭ２
蛋白質に対して指向した。これらの結果は、Ｍ２蛋白質
が試験された４つの蛋白質のうち抗原的に最も交差反応
性の高いことを示す。従って、これはまた最も可変性の
低い蛋白質であり、ＩＦＡによりポリクローナル抗体と
の間で示された交差反応性のかなりの部分に関与すると
仮定され得る。同じ株に対して異なる抗体を用い、異な
る株のＢＥＦウィルスとの交差中和において観察された
可変性は、抗体力価がＧ蛋白質上の異なるエビトーブに
灯して産生された抗体の比率に部分的に依存するという
仮定により説明され得る。

ＢＥＦ疾患は小動物では再生されなかったが、脳内接種
すると乳のみマウスても容易に感染し、その結果、ＢＥ
Ｆウィルスの存在の好都合な指標を提供する。中和性モ
ノクローナル抗体により乳のみマウスの前処理を行うと
、ＢＥＦウィルスによる後続攻撃に対して様々な程度の
防御が為された。若干の場合において、マウスは実験終
了時の１４日目を越える期間生存したが、対照マウスお
よび非中和性モノクローナル抗体を接種されたマウスは
、４　７ないし５．５日間しか生存しなかった。これは
、少なくともマウスにおいて中和性抗体が防御性を示し
得ること、および防御力は中和力価と相関していること
を示す。これは、牛において攻撃に対する抵抗が中和力
価とは無関係であることを示すデラボルタおよびスノー
ドン（！９７９）の発見とは対月的である。マウスにお
いてｌ００％相関関係が存在しない場合、他の因子もま
た防御においてある役割を演じていると仮定しなければ
ならず、マウスにおける受動防御結果が牛において再生
され得るか否かは依然として未知である。マウスに関し
て防御性を示す抗体を明らかに誘導する線状中和性エピ
トープの存在は、将来におけるサブユニットＢＥＦワク
チンに関してある程度の希望をつなぐものである。

前述したことに関して述べると、上記実験で示されたＢ
ＨＫセルラインおよびベロセルラインは、最初コモンウ
エルス・セーラム・ラボラトリーズ（ＣＳＬ，４５ボプ
ラー・ロード、パークビル、ビクトリア、３０５２）か
ら入手され、トロピカル・アニマル・プロダクション（
ロング・ポケット・ラボラトリーズ、クイーンズランド
）のｃｓ１　１’ｌｏｗＪ門テ維持された。ＢＨＫ−２
１細胞（ヘビー・ハムスター腎細胞）は、最初マクファ
ーソンおよびストーカー、Ｆバイａｏジーコ（　Ｖ　ｉ
　ｒｏｌｏｇｙ）上６，１４７−１５１（１９６２）に
おいて記載された。ベロ細胞（すなわち、アフリカン・
サバンナモンキー腎細胞）は、最初リーブヘイバ一等、
「プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティー・フォ
ー・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシンＪ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓ
ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１２５、
６３６−６４３（１　９６７）において記載された。

現在、ヨーロビアン・セル・カルチャー・コレクション
ではモノクローナル抗体！２Ａ５に対応するハイブリド
ーマの寄託の手配が為されている。

この寄託は１９８９年９月４日になされ、受け入れ番号
８９０９０８０１が割り当てられた。モノクローナル抗
体！２Ａ５は、試験された全ＢＥＦ株およびベリマーウ
ィルスと交差反応する。従って、これは、この発明に従
い抗原およびワクチンか製造され得るＢＥＦおよび関連
ウィルスを明確にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、比降速度および平衡密度勾配遠心分離により
感染細胞培養液から精製されたＢＥＦビリ才ンおよびＤ
Ｉ粒子における蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動を示す。 第２図は、感染中Ｌ　　［：ｌｌＳ］一メチオニン（ａ
）および［３ｔｐ］一オルトホスフエート（ｂ）により
標識され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離されたＢＥＦビリオン蛋白質のフルオログラム
を示す。 第３図は、ＢＥＦビリオンのデタージェント崩壊の電気
泳動プロフィールを示す。 第４図は、ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞において合成さ
れた蛋白質の電気泳動プロフィールを示す。 第５図は、ベリマー感染ＢＨＫ−２１細胞において合成
された蛋白質の電気泳動を示す。 第６図は、ＢＥＦ感染ＢＨＫ＝２１細胞における糖蛋白
質成熟を示す電気泳動プロフィールである 第７図は、ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞におけるＮ一結
合糖蛋白質のツニカマインン゛一阻害を示す電気泳動プ
ロフィールである。 第８図は、ＢＥＦ感染ＢＨＫ−２１細胞において合成さ
れた糖蛋白質の電気泳動を示す。 第９図は、トリトンＸ−１００で精製ＢＥＦを処理する
ことにより生成された可溶性糖蛋白質ワクチンに関する
電気泳動プロフィールを示す。 第ｌＯ図は、接種および攻撃中、接種動物（Ｄ３９３、
Ｄ３９９およびＤ４０１）および非接種対照動物（Ｄ３
９８）から集められた血清において行った中和試験の結
果を示す。 第１１図は、接種および攻撃中、接種動物（Ｄ３９３、
Ｄ３９９およびＤ４０１）および非接種対照動物（Ｄ３
９８）から集められた血清において行った遮断ＥＬＩＳ
Ａ試験の結果を示す。 第１２図は、ビルレントＢＥＦウィルスによる攻撃後、
接種動物（Ｄ３９３、Ｄ３９９およびＤ４０ｌ）および
非接種対照動物（Ｄ３９Ｂ）から集められた白血球フラ
クションからのウィルス単離状況を示す。 第１３図は、０、７および３６日目での接種および４６
日目での攻撃後の接種動物６９９、７００、７０１およ
び７０２並びに非接種対照動物７０３、７０５、７１２
および７２０におけるＧ蛋白質抗体に関する遮断ＥＬ　
Ｉ　ＳＡ試験の結果を示す。 第１４図は、０、７および３６日目での接種および４６
日目での攻撃後の接種動物２４、２８（８μｇ）、２６
、３０（０．８μ９）および２３、２５（０．０８μ９
）並びに非接種対照動物２７、２９におけるＧ蛋白質抗
体に関する遮断ＥＬＩ　ＳＡ試験の結果を示す。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）うし流行熱ウィルス（すなわち、ＢＥＦウィルス
   ）に感染した細胞からのＢＥＦウィルス・サブユニット
   抗原の単離方法であって、 （ｉ）細胞培養においてＢＥＦウィルスを繁殖させ、 （ｉｉ）（ｉ）段階から得られた感染細胞培養物を精製
   することにより、精製ウィルス抽出物を得、（ｉｉｉ）
   精製ウィルス抽出物をデタージェントで処理することに
   より、ＢＥＦウィルスの外部リボ蛋白質エンベローブま
   たは鞘を溶かす 段階を含む方法。
2. （２）デタージェントが、オクチルグルコシド、トリト
   ン系列、ブリージ系列およびノニデット系列から選ばれ
   た非イオン性デタージェントである、請求項１記載の方
   法。
3. （３）糖蛋白質に対応する８１Ｋｄの表面抗原が、（ｉ
   ｉｉ）段階後のウィルスから放出される、請求項１また
   は２記載の方法。
4. （４）表面抗原を遠心分離によりデタージェント調製物
   から単離する方法であり、それが上清フラクションに存
   在するものである、請求項３記載の方法。
5. （５）表面抗原以外のウィルス抗原が、遠心分離後の不
   溶性フラクションにおいて見出される、請求項４記載の
   方法。
6. （６）不溶性フラクションをデタージェントと混合する
   ことにより、表面抗原以外の前記ウィルス抗原が単離さ
   れ、これらの抗原が、５２Ｋｄの燐酸化核蛋白質、２９
   Ｋｄの燐酸化マトリックス蛋白質、１８０Ｋｄの蛋白質
   および４３Ｋｄの蛋白質を含むものである、請求項５記
   載の方法。
7. （７）感染細胞をツニカマイシンで処理した後、６７Ｋ
   ｄおよび７１Ｋｄの分子量を有する非グリコシル化表面
   抗原蛋白質前駆体が得られる、請求項３記載の方法。
8. （８）ツニカマイシンの非存在下、感染細胞から７７Ｋ
   ｄおよび７９Ｋｄのグリコシル化表面抗原前駆体を得、
   さらにそれらを修飾することにより、８１Ｋｄ抗原およ
   び９０Ｋｄ細胞関連抗原が生成される、請求項３記載の
   方法。
9. （９）８１Ｋｄの糖蛋白質を含む表面抗原、さらに５２
   Ｋｄの燐酸化核蛋白質、２９Ｋｄの燐酸化マトリックス
   蛋白質、１８０Ｋｄの蛋白質および４３Ｋｄの蛋白質を
   含む抗原を含有する精製ＢＥＦウィルス抽出物。
10. （１０）アジュバントと共に請求項９記載の精製ウィル
    ス抽出物を含有する、うし流行熱を患う畜牛および水牛
    を含む動物の処置に使用されるワクチン。
11. （１１）アジュバントがキル（Ｑｕｉｌ）Ａである、請
    求項１０記載のワクチン。
12. （１２）精製ウィルスのデタージェント可溶性エンベロ
    ーブを随伴し、少なくとも１０種の相異なるエピトーブ
    および少なくとも３種の相異なる抗原部位を有する、分
    子量８１Ｋｄであり感染細胞においてツニカマイシンに
    対し感受性を示す８１Ｋｄ糖蛋白質を含むうし流行熱ウ
    ィルスの表面抗原。
13. （１３）請求項１２の抗原の抗原性サブユニット。
14. （１４）糖蛋白または抗原性サブユニットが組替え体Ｄ
    ＮＡ技術または他の合成ルートまたは請求項１−８の何
    れか１項に定義した方法により生産されたものである、
    分子量８１Ｋｄの糖蛋白またはその抗原性サブユニット
    を含むＢＥＦ表面抗原。
15. （１５）アジュバントと共に請求項１２記載の表面抗原
    を含むワクチン。
16. （１６）アジュバントがキルＡである、請求項１３記載
    のワクチン。
17. （１７）うし流行熱ウィルスに感染した細胞から得られ
    た精製ウィルス抽出物抗原およびアジュバントを含むワ
    クチンであり、前記細胞が速度または平衡密度遠心分離
    により精製されたものであるワクチン。
18. （１８）アジュバントがキルＡである、請求項１５記載
    のワクチン。