JPH03167102A - 抗菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、第３級アミン基又は第４級アンモニウム基に
よって誘導した水溶性β−１，３−グルカンおよびその
架橋化合物を活性成分として含有する抗菌剤に関するも
のである。

〔従来の技術及び解決すべき問題点〕

従来、病原菌による感染に対する治療薬の多くは投薬上
安全性の観点から副作用が問題となり、また薬効の観点
からは薬剤耐性菌の出現による効力の低下や抗菌スペク
トルの減少の問題が挙げられている。

一方、いくつかのβ−１，３−グルカン類では身体の防
御機構を改善し抗腫瘍活性や抗ウィルス活性を示すこと
が知られており、例えばスエヒロタケの生産するシゾフ
ィラン（日本農芸化学会誌４４巻、第３３７頁〜第３４
２頁；　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、、８９、１２
１　（１９旧））やシイタケの生産するレンチナン（「
癌と免疫増強」、千原呉朗著講談社発行第５１頁、　　
（１９８０）；　Ｎａｔｕｒｅ、　２２２．６８７　（
１９６９）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、、　４７
．９９　（１９７６）；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

３０、２７７６　（１９７Ｇ））、キクラゲ属の生産す
るβ−１，３−グルカン（特開昭５４−６３０１２）等
が挙げられる。また多糖に化学修癖を加えることでこれ
らの活性の発現または増強が試みられており、例えば第
一アミノ基を誘導し大食細胞の活性化に有効な水溶性β
−１，３−グルカン誘導体（特開昭６Ｏ−１９９００２
）等が挙げられる。本発明者等は種々のβ−１，３−グ
ルカンの化学修飾体の菌類に対する動物の防御機能の活
性化をマウスを用いｉｎ　ｖｉｖ。

の試験で探究したところ、第３級アミン基及び第４級ア
ンモニウム基を導入した水溶性β−１，３−グルカンを
投与した群で菌類に対する感染防御機能を特異的に高め
ることを見い出し本発明に到った。ここで言う第３級ア
ミン基は−Ａ−ＮＲ’□で表わされ、第４級アンモニウ
ム基は−Ａ−ＮＲ’２Ｒ”Ｘ−で表わされ、Ａは−ＣＩ
□＋ＣＩｌ□１．−．−Ｃ１１□０１１（Ｃ１１□）１
−υ ないし３の整数であり、Ｒ１は炭素数１ないし４の直鎖
又は分岐したアルキル基又はその２個が一緒になって形
成した環構造のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は
炭素数１ないし４の直鎖又は分岐したアルキル基である
が、Ｒ１及びＲ２の炭素原子は８を越えず、更にＸはハ
ロゲン原子である。

本発明でグルコースの水酸基を置換する試薬としては１
例えば第３級アミン基の置換剤としてはＮ、Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルクロリド、塩酸２−クロルトリメチルア
ミン等が挙げられ、第４級アンモニウム基の置換剤とし
ては３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルア
ンモニウムクロライド、３−クロロ−２−ヒドロキシプ
ロピルトリメチルアンモニウムブロマイド、グリシジル
トリメチルアンモニウムクロライド、２−３−エポキシ
プロビルトリメチルアンモニウムクロライド等が挙げら
れるが、これらで特に使い易いものとしては、Ｎ、Ｎ−
ジメチルアミノエチルクロリド及び３−クロロ−２−ヒ
ドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドで
ある。

β−１，３−グルカンの免疫増強作用については、β−
１，３−結合主鎖に対するβ−１，６−結合分岐鎖の比
率が高いものが好ましいことが知られているが、われわ
れは側鎖を持たないとされているユーグレナ属の産する
パラミロン及び側鎖の比率のきわめて少ないとされてい
るアルカリ土類金属等の細菌の産するカードラン（ＴＡ
に）の化学修飾体について身体防御機能の活性化を取り
上げて検討したものであり、在来のものをヒントにした
訳ではない。このようにユーグレナやアルカリゲネス等
の微生物をβ−１，３−グルカンの起源に使用すること
は、産業上大量生産性の見地から担子菌類を起源とする
場合に比べ有利であり、医薬原料の他に食品、化粧品等
において殺菌、消毒剤としてまた家畜・養殖魚の飼料に
感染予防を目的に配合する等の幅広い応用を可能にする
ものである。

さらに本発明におけるβ−１，３−グルカン誘導体の抗
菌活性の発現は同架橋物においても同様の効力が見られ
るので、製剤上の必要に応じ架橋物を調製し粘性、乳化
安定性等の諸性質の改善を試みることも可能であり、同
様に酸や酵素による低分子化物を調製し溶解性及び親和
性等の諸性質の改善を試みることも可能である。また医
薬上受容しうる担体と組み合わせて本発明によるβ−１
，３−グルカン誘導体を活性成分として含有することも
勿論可能である。

この場合の架橋剤は基本的に２官能性以上の物質であっ
てジカルボン酸類、ジアルデヒド類、ジグリシジル類等
が挙げられ、又はエピクロルヒドリン等も含まれる。

上記の通り本発明ではβ−１，３−グルカンを使用する
から、特許請求の範囲を含めβ−１，３−グルカンの語
は本発明の木質に影響を及ぼさない範囲において少量の
β−１，６−結合を含んでいる実質的なβ−１，３−グ
ルカンを云うものとする。

本発明におけるβ−１，３−グルカン誘導体が、どのよ
うな作用で抗菌性を発現するかは明らかではない。一般
に知られるカチオン系界面活性剤と同様にカチオン性官
能基が細菌細胞膜の脂質等の疎水性部に吸着し、細菌と
水との界面張力の降下環により細胞膜等の構成破壊や酵
素タンパクの阻害といった直接的な作用様式も考えつる
が、マウスに対して感染前に投与した実験系で顕著な防
御機能の増強が示されている点から見てもカチオン系殺
菌剤とは別に免疫賦活化機能を有することが示唆されて
いる。この免疫賦活化に関してはわれわれの研究から基
本的に多形核白血球（ＰＭＮ）以外の細ＩＩの活性化が
関与していると考えている。

本発明で使用されるβ−１，３−グルカンとしては、例
えば原生動物ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）が細Ｕ内に
生産するパラミロン（Ｐａｒａｍｙｌｏｎ）　（特開昭
６４−３７２９７）　、アルカリゲネス（八Ｉｃａｌ　
ｉｇｅｎｅｓ）属またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌か生産するカードラン（Ｃ
ｕｒｄｌａｎ）　（特公昭４８−３２６７３、特公昭４
８−３２６７４）　、生薬萩苓に含まれるパキマン（Ｐ
ａｃｈｙｍａｎ）　、褐藻類の成分であるラミナラン（
Ｌａｍｙｎａｒａｎ）あるいは酵母綿１題壁成分である
グルカン等が挙げられるが、中でも産業上生産性の面で
有利なパラミロン、カードランが好ましい。

以下に実施例等により具体的に述べる。

（製造例１）パラミロンの製造 多糖体原料となるパラミロンは、例えば以下に述べる方
法で製造した。二一グレナ　ダラシリス（Ｅｕｇｌｅｎ
ａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）株を前培養培地（第１表）５　
ｍｊ２を含む試験管に植菌し２８℃において３日間振盪
培養した。ついで、培養液を前培養培地１００ＩＩＩＩ
Ｌを含む坂ロフラスコに植菌し２８℃において６０時間
振盪培養した。得られた培養液を本培養培地（第２表）
１．２Ｌを含む２Ｌジャーファーメンタ−中でグルコー
ス及び硫安より成る栄養液をｐＨコントロール用の水酸
化ナトリウム溶液の一定比を同時流加し、培地グルコー
ス濃度を２％以内に制御しながら２８℃６０時間培養を
行った。ここで得られる培養液から遠心分離機で菌体を
集め、水２Ｌに再懸濁し：１５０　ｋｇ／ｃｍ２の圧で
高圧乳化機にかけ細胞を破砕した。その後で遠心分離機
にかけ下層の白色グルカン層を回収した。さらにラウリ
ル硫酸ナトリウムの１％水溶液２Ｌに懸濁して１００℃
で６０分間攪拌して脂質及びタンパクを除去した。次い
でこれを遠心分離水洗を繰り返し、アセトン中で分散脱
水した後、乾燥させ純度９９．８％より成るパラミロン
の白色粉末３０ｇを得た。ここで得られたパラミロンの
平均分子量はマナーズ法（Ｍａｎｎｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ
、、　＋９７１）により約５２０００と測定された。

第１表 第２表 （製造例２）Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチル化パラミロ
ン（ＤＭＡＥＰ）の製造 パラミロン２．０ｇをＩＮ水酸化ナトリウム溶液４０１
１ＩＩＬに溶解し、蒸留水５　ｍｌにＮ、Ｎ−ジメチル
アミノエチルクロリド　１．７ｇを溶かした液をこれに
攪拌しながら加えた。４０℃で１５０分攪拌反応を行い
蒸留水５０ｍ１を加え希釈した後、４Ｎ酢酸で中和し、
次にこれを透析脱塩した。得られた透析物を減圧濃縮、
凍結乾燥し置換率（全０■基に対する置換基の比率）５
％のＤＭＡＥＰ白色試料（Ａ）　　１．Ｏｇを得た。

同様にしでＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド０．
８７ｇ及び３．５ｇを添加し、置換率３．７％。

６．３％の白色試料（Ｂ）、（Ｃ）を調製した。

（製造例３）Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチル化パラミロ
ン架橋物（ＥＣＬ−ＤＭＡＥ Ｐ）の製造 パラミロン２．０ｇをＩＮ水酸化ナトリウム溶液４０　
ｓｊ！に溶解し、蒸留水５　＋ｉＩｔにＮ、Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルクロリド　１．７ｇを溶かした液をこれ
に攪拌しながら加えた。４０℃で１５０分攪拌反応を行
い、次いでエピクロルヒドリン０．７ｇを添加し５５℃
にて６０分間攪拌反応を行った０反応終了後、蒸留水１
００ａＩｌを加え希釈し、次いで透析脱塩及び凍結乾燥
を行いＥＣＬ−ＤＭＡＥＰの白色試料１．４ｇ　［平均
分子量５９４０００　（Ｇ　Ｐ　Ｃ−Ｌ　Ａ　Ｌ　ＬＳ
法）］を得た。

（製造例４）Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチル化カードラ
ン（ＤＭＡＥ−ＴＡに）及 びその架橋物（ＥＣＬ−ＤＭＡＥ− ＴＡに）の製造 カードラン（和光純薬）　　２．０ｇを製造例２の試料
（Ａ）の調製と同様にしてＤＭＡＥ−ＴＡにの白色試料
０．９ｇを得た。また、架橋物（ＥＣＬ−ＤＭＡＥ−Ｔ
Ａに）は製造例３の多糖原料をＴＡＫに置き換えた他は
同様にして調製し、白色試料１．２　ｇを得た。

（製造例５）Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノエチル化パラミロ
ン（ＤＥＡＥＰ）及びその架 橋物（ＥＣＬ−ＤＥＡＥＰ）の製造 パラミロン２．０ｇをＩＮ水酸化ナトリウム溶液４０　
ｍＡに溶解し、蒸留水５ＩＩＩＬに塩酸２−クロルトリ
エチルアミン２．１ｇを溶かした液を攪拌しながら加え
た。４０℃で１５０分攪拌反応を行い、蒸留水５０層１
を加え希釈した後４Ｎ酢酸で中和し、次にこれを透析脱
塩した。得られた透析物を減圧濃縮、次いで濃縮物を凍
結乾燥し置換率１０％のＤＥＡＥＰの白色試料１．６ｇ
を得た。また、架橋物（ＥＣＬ−ＤＥＡＥＰ）は製造例
３の置換試薬を塩酸２−クロルトリエチルアミンに置き
換えた他は同様にして調製し白色試料１．５ｇを得た。

（製造例６）２−ヒドロキシ−３−トリメチルアンモニ
オプロピルパラミロン（ＨＡ Ｐ）及びその架橋物（ＥＣＬ−ＨＡ Ｐ）の製造 パラミロン２゜ＯｇをＩＮ水酸化ナトリウム溶液４０　
ａｉｌに溶解し、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル
トリメチルアンモニウムクロライド５０％溶液４．５ｇ
をパラミロン溶液に攪拌しながら加えた。４０℃にて　
１５０分攪拌反応を行い、蒸留水５０−２を加え希釈し
た後４Ｎ酢酸で中和し、次にこれを透析脱塩した。得ら
れた透析物を減圧濃縮。

凍結乾燥し置換率４％のＨＡＰの白色試料１．２ｇを得
た。また、架橋物は製造例３の置換試薬を３−クロロ−
２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロラ
イド５０％溶液４，５ｇに置き換えた他は同様にして調
製し白色試料１．６ｇを得た。

以下に対照試料の製造例を示す。

（対照例１）カルボキシメチル化パラミロン（ＣＭＰ）
及びカルボキシメチル化カー ドラン（ＣＭ−ＴＡＫ）の製造 パラミロン２．５ｇ、またはＴＡＫ　２．５ｇをＩＮ水
酸化ナトリウム溶液５０ｍＪ２に溶解し、モノクロル酢
酸１．７ｇをこれに攪拌しながら加えた。４５℃にて２
１時間攪拌反応を行い４Ｎ酢酸で中和し、次にこれを透
析脱塩した。透析物を凍結乾燥し、置換率１４％のＣＭ
Ｐの白色試料１．３ｇ及び置換率１５％のＣＭ−ＴＡＫ
　１．２ｇを得た。

（対照例２）硫酸パラミロン（ｐｓ）の製造無水ピリジ
ン３０ｍ１を１００ｍｆｉの共栓付三角フラスコに入れ
、水冷下クロルスルホン酸２ｍｌ及びパラミロン１．Ｏ
ｇのジメチルスルホキシド３０ａ＋Ｊ１溶液を徐々に添
加した。８５℃にて３時間攪拌反応を行い、室温に冷却
後傾斜して上澄液を除き反応液に蒸留水１０ｍ１を加え
、生じた沈殿を濾過し５％ＮａＣ１１５０ｍｆｆ１を加
え、６Ｎ水酸化ナトリウムを加えｐＨ９とした。この溶
液に３倍容アセトンを加え生じた沈殿を乾燥し置換率５
３％のｐｓの褐色試料０．７ｇを得た。

（対照例３）ゲル状パラミロン（ＧＰ）の製造パラミロ
ン２．０ｇをＩＮ水酸化ナトリウム溶液４０ｍ１に溶解
し４Ｎ酢酸で中和ゲル化を行った。

得られたゲルを蒸留水中で洗浄し、凍結乾燥を行い無修
飾の無色水不溶性のＧＰ　　］、８ｇを得た。

（対照例４）エピクロルヒドリン架橋パラミロン（ＥＣ
ＬＰ）の製造 パラミロン１．ＯｇをＩＮ水酸化ナトリウム溶液１００
ｍｊ２に溶解し、エピクロルヒドリン５ｇ及び四ホウ化
ナトリウム０．５ｇを加えた。６０℃で２時間攪はん反
応を行い、ついで４Ｎ酢酸で中和し、次にこれを透析脱
塩した。透析物を凍結乾燥し、白色試料０．９ｇ　（平
均分子量３８００００　（Ｇ　Ｐ　Ｃ−ＬＡＬＬＳ法）
）を得た。

次に以上に述べたβ−１，３−グルカン及びその誘導体
による抗菌活性の評価を行った。以下実施例にてその結
果を示す。

（実施例１）種々の化学修鶴を行ったパラミロンの抗菌
活性の発現 製造例１、製造例２、製造例５、及び製造例６に示した
方法で調製した試料パラミロン、ＤＭＡＥＰ　（Ａ）、
ＤＥＡＥＰ、ＨＡＰ及び対照例１、対照例２及び対照例
３に示した方法で調製した対照試料のＣＭＰ、ＰＳ及び
無菌生理食塩水を各々雌ＩＣＲ（６−７退会）の腹腔内
に１回投与した。４８時間経過後、腹腔内に４　Ｘ　１
０’個の大腸菌（ＧＮ２４１１）を接種し、感染させた
、大腸菌感染５日後のマウス生存率により各サンプルの
抗菌活性を求めたところ、ＤＭＡＥ　（Ａ）、）ｉＡＰ
で有意な抗菌活性の増強が見られた。一方、ＣＭＰ、Ｐ
Ｓ、ＧＰ及びパラミロンの原体では有意な抗菌活性の増
強は見られず、またＤＥＡＥＰでは抗菌活性の増強は見
られたものの若干の毒性が検出された（第３表）。

第３表 （実施例２）パラミロン架橋物の抗菌活性の発現製造例
３、製造例４、製造例５及び製造例６で示した方法で調
製したＥＣＬ−ＤＭＡＥＰ、ＥＣＬ−ＤＥＡＥＰ、ＥＣ
Ｌ−ＨＡＰ、及び対照例４に示した方法で調製したＥＣ
ＬＰ及び無菌生理食塩水を実施例１で述べた方法と同様
にして実験を行フた。各サンプルの抗菌活性を求めたと
ころ、ＥＣＬＰでは抗菌活性の増強は見られなかったが
、ＥＣＬ−ＤＭＡＥＰ、ＥＣＬ−ＤＥＡＥＰ。

ＥＣＬ−）ＩＡＰでは非架橋物と同様に有意な抗菌活性
の増強が見られた（第４表）。

（実施例３）抗菌活性発現における置換率の影蕾製造例
２で示した方法で調製したＤＭＡＥＰ（Ａ）、ＤＭＡＥ
Ｐ（Ｂ）、ＤＭＡＥＰ（Ｃ）の各々における抗菌活性の
発現の影響を調べた。実験方法は実施例！で述べた方法
と同じ条件で実験を行った。各サンプルの抗菌活性を求
めたところ、修ｆＩＩＩｉ基の置換率の増加に伴って抗
菌活性は増強されることが示唆されたく第５表）。

第５表 （実施例４）パラミロン、ＴＡにの抗菌活性の発現と化
学修飾の影響 カードラン（ＴＡに）、製造例４で示した方法で調製し
たＤＭＡＥ−ＴＡに、対照例１で示したＣＭ−ＴＡに、
及びパラミロン、ＤＭＡＥＰ（Ａ）、ＣＭＰ、無菌生理
食塩水（対照）を各々１０匹以上の雌ＩＣＲ（６−７退
会）の腹腔内に８ｍｇ／ｋｇで投与し、４８時間後に大
腸菌（ＧＮ２４１１）を接種した。大ｌ１ｇ菌接種後継
時的に生存マウスの割合を求めたところ、ＴＡに、ＤＭ
ＡＥ−ＴＡに、ＤＭＡＥＰで有意な抗菌活性の発現が見
られたが、ＣＭ−ＴＡに投与系においては逆に抗菌活性
は低下した（第１図）。

（実施例５）薬剤投与量の影Ｗ（Ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ）パラミロン、ＤＭＡＥＰ　（Ａ）　、ＥＣＬ−
ＤＭＡＥＰ及びＴＡに、ＤＭＡＥ−ＴＡに、及び製造例
４で示した方法で調製したＥＣＬ−ＤＭＡＥ−ＴＡにに
おいて種々の投与量を設定し雌ＩＣＲの腹腔内に投与し
た。４８時間後に大腸菌（ＧＮ２４１１）を接種し、接
！Ｉ後５日目における生存マウスの割合（％）を求めた
ところ、ＤＭＡＥＰ　（Ａ）、ＥＣＬ−ＤＭＡＥＰ、Ｄ
ＭＡＥ−ＴＡにでは０．０８■ｇ／ｋｇ以上の有意な抗
菌活性の発現が見られた。

ＴＡに、ＥＣＬ−ＤＭＡＥ−ＴＡＫにおいては０．４Ｈ
／ｋｇ以上で有意な抗菌活性の発現が見られた。パラミ
ロンでは有意な抗菌活性を得るには２　ｍ８７ｋｇ以上
の投与量を必要とした（第２図）。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ及びＢはパラミロン、ＴＡに及び各々の化学修
飾物の抗菌活性の発現を示す。 第２図Ａ及びＢはパラミロン、ＴＡに及び各々のジメチ
ルアミノエチル化修飾物及びそれらの架橋物の薬剤投与
量による抗菌活性の発現の影響をホす。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記構造を有するβ−１，３−グルカン▲数式、
   化学式、表等があります▼ の構成単位であるグルコースの２位、４位又は６位の水
   酸基の水素原子を置換基−Ａ・Ｂによって、グルコース
   １残基当り０．１〜１．１個（ミクロケルダール法）置
   換して得られる一般式〔 I 〕［Ｃ＿６Ｈ＿７Ｏ＿２（
   ＯＡ・Ｂ）＿ｘ（ＯＨ）＿３＿−＿ｘ］＿ｎ〔 I 〕（
   式中、ｘは１〜３を表わし、ｎは約１００以上１０００
   以下の整数を示し、Ａは−ＣＨ＿２（ＣＨ＿２）＿ｍ−
   、−ＣＨ＿２ＣＨＯＨ（ＣＨ＿２）＿ｍ−又は▲数式、
   化学式、表等があります▼のいずれかであり、ｍは１な
   いし３の整数であり、Ｂは−ＮＲ＾１＿２又は−ＮＲ＾
   １＿２Ｒ＾２Ｘ＾−であり、Ｒ＾１は炭素数１ないし４
   の直鎖又は分岐したアルキル基又はその２個が一緒にな
   って形成した環構造のアルキレン基であり、Ｒ＾２は水
   素原子又は炭素数１ないし４の直鎖又は分岐したアルキ
   ル基であるが、Ｒ＾１及びＲ＾２の炭素原子は８を越え
   ず、更にＸはハロゲン原子である。）で示されるβ−１
   ，３−グルカン誘導体又はその塩を含有することを特徴
   とする抗菌剤。
2. （２）動物特に人類および商業上有用な動物の病原菌の
   感染予防または治癒に単独または他の成分に配合して使
   用するための前記特許請求の範囲第１項記載の水溶性β
   −１，３−グルカン誘導体。