JPH03167194A - レシチンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野】 本発明は、医薬品分野、特に注射剤の用途に好適なエン
ドトキシンフリーのレシチンを得る精製方法に関する． ［従来の技術］ レシチンは代表的なリン脂質であり、リポソーム（脂質
２分子膜小包体）を形成するので、薬剤のカプセルとし
て用いることができ、しかもこのようなリン脂質２分子
構造は生体膜の主要成分であり、またレシチンは人体に
対する安全性が高いので、近年新しいドラッグ・デリバ
リー・システムの一つとしてレシチンをリポソーム製剤
へ応用する試みが盛んに行われている． リポソーム製剤の投与方法としては種々の方法があり、
現在静脈注射投与が主流であるが、静脈注射投与する場
合，注射剤中にパイロジエン（発熱性物質）が含まれて
いないことが必須である．パイロジェンとは発熱性を示
す高分子性物質であり，それが喘乳類の血管内に入ると
一過性の発熱を引き起こし、時には当該動物をショック
死させることもある有害物質である．パイロジェンの中
でもダラム陰性菌細胞壁の外膜成分であるリポ多糖（Ｌ
ＰＳ）を主成分とするエンドトキシン（内毒素）は、パ
イロジエンの中でも特に発熱性が高く，普遍的に存在し
ているものである．このため日本薬局方では発熱性物質
の試験項目を設け、製剤中のパイロジェン量を規制して
いる．従って、リポソーム製剤の基材として用いられる
レシチンは発熱性物質試験の結果が陰性のものでなけれ
ばならない． エンドトキシンの除去方法としては，■加熱滅菌処理，
■化学的処理，■吸着剤処理、■膜ろ過処理、■蒸留処
理等が知られているが，そのうち■の加熱滅菌処理は、
エンドトキシンが熱に対し比較的安定であるため，２５
０℃で一時間加熱する必要があり，また■の化学的処理
も酸、アルカリや過酸化物を使用するため、レシチン自
体をも分解させてしまうので処理することが困難であり
、■の蒸留処理も物理的に極めて困難である．また，■
の吸着剤処理としては活性炭、あるいはイオン交換樹脂
を用いることが知られているが，いずれも効果が少なく
、試料成分のロスが大きいという問題があった．さらに
、■の膜ろ過処理としては、除菌フィルター（０．２ミ
クロンフィルター）ろ過、あるいは限外ろ過が知られて
いるが、除菌フィルターの効果は少なく、限外ろ過は通
常水溶液で行われるため水に難溶であるレシチンの処理
は困難であるという問題があった．即ち、既存のエンド
トキシンの除去方法は、般に水あるいはアミノ酸、糖、
抗生物質、ビタミン等の水溶性物質に対するもので、水
に難溶であるレシチンからエンドトキシンを除去するた
めの有効な方法はまだ知られていなかった．また、油溶
性物質中のエンドトキシンを定量する場合、通常被検物
質を有機溶剤に溶解させ、エンドトキシンフリー水で抽
出した水溶液をリムルス試験等で定量するが、被検物質
がレシチンの場合，レシチンとエンドトキシンの相溶性
によりエンドトキシンフリー水による抽出が困難なため
、正確な定量ができないという問題もあった．〔発明が
解決しようとする課題〕 本発明は、これら上記の問題点を解決し、レシチンに影
響を及ぼすことなく，エンドトキシンフリーのレシチン
を得ることを目的としている．

【課題を解決するための手段】

本発明者らは上記の目的を達或するために鋭意検討を重
ねた結果、レシチンをアルコールまたは水／アルコール
混合溶液に溶解させた後，エンドトキシンに親和性を持
つヒスチジンをリガンドとして固定化させた固定化ヒス
チジンと接触させることにより、エンドトキシンを選択
的に吸着除去でき、しかもこの方法によればレシチンに
何等悪影響を及ぼさず，きわめて安全性が高いことを見
いだし本発明に到達した． 本発明において処理するレシチンは，既存の天然系ある
いは合成系のあらゆるレシチンを用いることができるが
、本発明の目的である医薬品分野へ利用するためには高
純度に精製されたレシチンを用いることが好ましい．こ
こで、レシチンの精製法は既存のいかなる精製法であっ
ても差し支えない．例えば、溶剤抽出法、アセトン再沈
法、カラムクロマト分離法等のそれぞれ単独の精製方法
でも良いし、それらの数種類を組み合わせた精製方法で
も良い． 本発明において用いられる固定化ヒスチジンは，担体に
スベーサーを介して、エンドトキシンに親和性を持つヒ
スチジンをリガンドとして固定化させたものが好ましく
、担体としては高分子多糖類、合成高分子担体，無機担
体等を用いることができるが、セルロース、アガロース
のような高分子多糖類が好適である．このような固定化
ヒスチジンとして市販されている物では、例えばセファ
ロース（架橋アガロースゲル）にヘキサメチレンジアミ
ンをスペーサーとしてヒスチジンを共有結合させたダイ
セル化学工業■製「パイロセツブ』がある． 本発明においてレシチンを固定化ヒスチジンで処理する
方法としては．固定化ヒスチジンを充填剤としてカラム
に充填した後、レシチン溶液を溶出させるカラムクロマ
トグラフィー法、または吸着剤としてレシチン溶液に添
加し撹拌した後，ろ過して固定化ヒスチジンを除去する
という方法などを用いることができ，エンドトキシンは
カラム中または溶液中で選択的に吸着され除去される．
使用した固定化ヒスチジンは洗浄等の処理により再生し
、繰り返し使用することができる．本発明において使用
するアルコールとしては、メタノール、エタノールおよ
びインブロバノールを用いることができ、それぞれを単
独で用いても良いし混合して用いても良い． 本発明において使用する水／アルコール混合溶液の組成
は、処理するレシチンを完全に溶解する組成であればい
かなる組成であっても良いが、水の割合が多い場合脱溶
剤が困難になるため，水／エタノール＝Ｏ〜１０／９０
−１００容量％が望ましい．また、水／アルコール混合
溶液中のレシチン濃度は、処理するレシチンを完全に溶
解する濃度であればいかなる組成であっても良いが、作
業性を良くするために５〜２０重量％であることが望ま
しい． ［発明の効果】 本発明のエンドトキシンフリーのレシチンの製造法は、
レシチンをアルコールまたは水／アルコール混合溶液に
溶解させた後，固定化ヒスチジンと接触させることによ
って、効果的にレシチン中のエンドトキシンを吸着除去
する事ができ，安全性が高いので、医薬品分野、特に注
射剤への利用が可能となるため、産業上極めて益するこ
と大である． また、本発明のエンドトキシン除去処理法は、固定化ヒ
スチジンをカラムに充填し、レシチンの水／エタノール
混合溶液を通過させるという方法、またはレシチンの水
／エタノール混合溶液中に固定化ヒスチジンを添加し撹
拌・ろ過するとレ）う、いずれも比較的簡単な方法であ
るため、大量生産が可能となり、また吸着体として用い
られる固定化ヒスチジンは再生により繰り返し使用でき
るので工業的に極めて有用である．

【実施例】

本発明を実施例および比較例を用いて具体的に説明する
． なお、ここに実施例および比較例で使用する器具は、す
べて２５０℃で２時間以上乾熱滅菌、あるいは０．２モ
ルのＮａＯＨ水溶液（　２　０　ｖｏｌ％のエタノール
を含む）に１２時間以上浸漬し、エンドトキシンフリー
の水（注射用蒸留水）で洗浄してから使用した． また、用いた被処理レシチンはいずれもリムルス試験（
使用試薬：生化学工業■製バイロデイツプ）に陽性であ
ることを確認した後使用した．また，リムルス試験を行
う場合、レシチン中のエンドトキシンを注射用蒸留水で
抽出することが困難なため、すべて被検レシチンを２０
ｍｇ精秤し注射用蒸留水をｌｍＡ加えた後、５０〜６０
℃にて３０分超音波分散させた水縣濁溶液を検定試料と
して用いた． また、すべての処理はクラス１００のクリーンベンチに
て行った． 叉』ｌ劣」エ ５０ｍＩ２のビーカーに、レシチン純度９９，Ｏ重量％
の精製卵黄レシチンを２．０６ｇ秤取り，次いで水／メ
タノール＝５／９　５容量％の混合溶液をレシチン濃度
が１０重量％となるように加え完全に溶解した．次にこ
のレシチン溶液を、あらかじめ固定化ヒスチジン（ダイ
セル化学工業■製「パイロセップＪ）１０ｍβを充填し
た内径ＩＣｍのオーブンガラス力ラムにて、溶出速度１
．Ｏｍｌｌｌ分（ＳＶ＝６）で溶出させた後、水／メタ
ノール＝　５／９　５容量％の混合溶液３０ｍｌ２を１
．ＯｍＡｌ分で溶出させた．溶出液をすべて１００ｍβ
ナスフラスコに回収し、エバボレーターにて脱溶剤し固
形分１．９８ｇ　Ｃ回ｌＩｖ率９６．１％）を得た．得
られた固形分中のレシチン純度は９９．０重量％であり
、リムルス試験（使用試薬：生化学工業■製バイロデイ
ツブ）で陰性（Ｎ．Ｄ．）であった． 及五旦１ ５０ｍｇのビーカーに、レシチン純度９９．１重量％の
大豆水添レシチンを２．１２ｇ秤取り、次いで水／エタ
ノール＝５／９５容量％の混合溶液をレシチン濃度が５
重量％となるように加え完全に溶解した、次にこのレシ
チン溶液を、あらかじめ固定化ヒスチジン（ダイセル化
学工業■製「パイロセップＪ）１０ｍｌを充填した内径
１ｃｍのオーブンガラス力ラムにて、溶出速度０．　５
ｍβ／分（ＳＶ＝３）で溶出させた後、水／エタノール
＝５／９５容量％の混合溶液３　０ｍＩ２を０．　５ｒ
ｒ＋ｊ！／分で溶出させた．溶出液をすべて１００ｍｌ
ナスフラスコに回収し、エバボレーターにて脱溶剤し，
固形分２．０５ｇ　（回収率９６．７％）を得た．得ら
れた固形分中のレシチン純度は９９．１重量％であり、
リムルス試験（使用拭薬：生化学工業■製バイ口デイツ
ブ）で陰性（Ｎ．Ｄ．）であった。 ４五五』 ５０ｍＱのビーカーに，レシチン純度９９．８重量％の
合成ＤＭＰＣ　（ジミリストイルフオスファチジルコリ
ン）を２．１０ｇ秤取り、次いで水／イソブロバノール
＝５／９　５容量％の混合溶液をレシチン濃度が５重量
％となるように加え完全に溶解した、次にこのレシチン
溶液を、あらかじめ固定化ヒスチジン（ダイセル化学工
業■製「バイロセップＪ）Ｉｏｎβを充填した内径１ｃ
ｍのオーブンガラスカラムにて、溶出速度０，５ｍβ／
分（ＳＶ＝３）で溶出させた後、水／イソブロバノール
＝５／９５容量％の混合溶液３０ｍβを０．５ｍβ／分
で溶出させた．溶出液をすべて１００ｍＩｌナスフラス
コに回収し、エバポレーターにて脱溶剤し固形分２．０
５ｇ　（回収率９７．６％》を得た．得られた固形分中
のレシチン純度は９９．８重量％であり，リムルス試験
（使用試薬：生化学工業■製バイロデイップ）で陰性（
Ｎ．Ｄ．）であった． 及五旦１ １００ｍＩ２のビーカーに、レシチン純度９９．６重量
％の合成ＤＰＰＣ　（ジバルミトイルフォスファチジル
コリン）を１０．０４ｇ秤取り，次いで水／エタノール
＝０．２／９９．８容量％の混合溶液をレシチン濃度が
２０重量％となるように加え完全に溶解した、次にこの
レシチン溶液を、あらかじめ固定化ヒスチジン（ダイセ
ル化学工業■製「バイロセップＪ）１０ｍＡを充填した
内径ｌｃｍのオーブンガラス力ラムにて、溶出速度２．
０ｍＩ２／分（ＳＶ＝１２）で溶出させた後、水／エタ
ノール＝＝Ｑ，２／９９．８容量％の混合溶液３０ｍβ
を２．０ｍβ／分で溶出させた．溶出液をすべて１００
ｍｌナスフラスコに回収し，エバポレーターにて脱溶剤
し固形分９．８７ｇ《回収率９８．３％》を得た．ｍら
れた固形分中のレシチン純度は９９．６重量％であり，
リムルス拭験（使用試薬：生化学工業物製パイロディッ
プ》で躊性（Ｎ．Ｄ．）であった． 裏１口糺互 １００ｍβのビーカーに、レシチン純度９９．６重量％
の合成ＤＰＰＣ　（ジバルミトイルフォスファチジルコ
リン）を１０．１１ｇ秤取り、次いで水／エタノール＝
０．２／９９．８容量％の混合溶液をレシチン濃度が２
０重量％となるように加え完全に溶解した、次にこのレ
シチン溶液に、あらかじめパイロセップを水／エタノー
ル＝０．２／９９．８容量％の混合溶液で１　０ｍＩ２
となるように湿潤させたものを添加し、２５℃で１時間
撹拌した．次にＰＴＦＥ製０．２ミクロンの除菌フィル
ターにて溶出速度２．Ｏｍｉｔｌ分でろ過させた後、水
／エタノール＝０．２／９９．８容量％の混合溶液３０
ｍｌを２．０ｍ！／分洗浄ろ過させた．ろ液をすべて１
００ｒｒ＋４２ナスフラスコに回収し、エバボレーター
にて脱溶剤し固形分９．８３ｇ　（回収率９７．２％）
を得た．得られた固形分中のレシチン純度は９９．６重
量％であり、リムルス試験（使用試薬：生化学工業■製
バイロディップ）で陰性（Ｎ．Ｄ．）であった．止１ｔ
ユ ５０ｎ＋ｊ！のビーカーに、レシチン純度９９．６重量
％の合成ＤＰＰＣ　（ジバルミトイルフオスファチジル
コリン）を１０．０９ｇ秤取り、次いで水／エタノール
＝Ｑ，２／９９．８容量％の混合溶液をレシチン濃度が
２０重量％となるように加え完全に溶解した．次にこの
レシチン溶液を，ＰＴＦＥ製０．２ミクロンの除菌フィ
ルターにて、溶出速度２．０ｍｊ２／分でろ過させた後
、水／エタノール＝０．２／９９．８容量％の混合溶液
３０ｍβを２．０ｍβ／分洗浄ろ過させた．ろ液をすべ
て１００ｍＩ２ナスフラスコに回収し、エバボレーター
にて脱溶剤し固形分９．９１ｇ（回収率９８．２％）を
得た．得られた固形分中のレシチン純度は９９．６重量
％であったが，リムルス試験（使用試薬：生化学工業■
製パイロディップ）で陽性であった． これらの各実施例および比較例の結果から明らかなよう
に、固定化ヒスチジンで処理する本発明方法によりレシ
チンを精製した場合、レシチンに悪影響を及ぼすことな
く、効率よくエンドトキシンを除去できるのに対し、固
定化ヒスチジンによる処理を行なわず、除菌フィルター
でろ過しただけでは、効率よくエンドトキシンを除去す
ることができないことがわかる．

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、レシチンをアルコールまたは水／アルコール混合溶
   液に溶解し、固定化ヒスチジンで処理することを特徴と
   するレシチンの精製方法。