JPH07816A - エンドトキシン吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エンドトキシンを選択的に吸着除去すること
により、エンドトキシン血症の治療、予防から水、水溶
液などの精製、純化など広範囲な用途に適用が可能なエ
ンドトキシン吸着材を提供する。 【構成】 粒子径２０ないし２０００μｍ、平均細孔径
２００ないし３００００Åのセルロース、架橋ポリアク
リル酸、ポリビニルアルコール、ポリスチレンまたはこ
れらの誘導体に分子量１０００から２００００のキトサ
ンを、アミノ基含量０．０５ないし３．００ｍｅｑ／ｇ
の範囲で固定化したエンドトキシン吸着材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はグラム陰性細菌の細胞壁
成分であるエンドトキシンを選択的に吸着除去すること
により、グラム陰性細菌感染によるエンドトキシン血症
の治療、防止あるいはグラム陰性細菌により汚染された
水、水溶液などの精製、純化を目的とした吸着材に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】グラム陰性細菌には大腸菌、サルモネラ
菌、赤痢菌、緑膿菌、霊菌など多くのものが身近に知ら
れている。エンドトキシンはこれらのグラム陰性細菌の
細胞壁成分であるリポ多糖体が相当し、分子量が数十万
ないし数百万の巨大分子を形成している。リピドＡがそ
の活性中心であり、致死毒性、発熱原性、免疫アジュバ
ンド活性、Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ反応、カブトガニ血
球成分凝固反応、インターフェロン誘導活性、抗腫瘍活
性など多種多様な生物学的活性を有し、生体内において
きわめて重要な作用を示す。

【０００３】エンドトキシンの選択除去に対するニーズ
は医学、生化学をはじめ広範囲に及んでいる。医学領域
ではグラム陰性細菌特に腸内細菌感染によるエンドトキ
シン血症の治癒、予防が挙げられる。グラム陰性細菌感
染症の経過中には悪寒、発熱などを伴い、急速な血圧降
下、末梢循環不全の状態を惹起しいわゆるエンドトキシ
ンショックを起こすことがある。こうしたエンドトキシ
ン血症の治療方法としてステロイドの大量投与あるいは
その他の抗ショック療法などが試みられてきたがその成
功率は非常に低いものである。

【０００４】また血液浄化のみならず医学領域では生体
内に直接投与する注射用水、生理食塩水、グルコース、
ビタミン類などの栄養源を含有する輸液あるいは透析液
などは滅菌処理だけでなく、エンドトキシンの厳密な除
去までが要求される。また生化学領域においても、たと
えば無菌動物の飼育に用いる水、栄養液に関しても同様
のことが当てはまる。

【０００５】さらには近年のバイオテクノロジー技術の
急速な進歩により、多くの医薬品や種々の有用タンパク
質などの遺伝子組換え技術による大量生産が可能になっ
ている。遺伝子組換えを行なう際の宿主としては、培養
の容易な点などから大腸菌が広く用いられており、この
分野においても精製に際してエンドトキシンの厳密な除
去が要求されている。

【０００６】無菌水の製造やタンパク質溶液などからの
菌体の除去は通常は多孔質膜を用いた濾過により行なわ
れるが、エンドトキシンの除去は完全ではなくまた他の
有用成分も同時に除去されてしまう。そこで各種担体を
用いた吸着による選択除去が多く試みられている。

【０００７】エンドトキシン吸着材としては血液浄化の
領域では抗生物質の一種であるポリミキシンＢを水不溶
性担体であるポリスチレン繊維に固定化したＰＭＸ−Ｆ
（人工臓器１７（２）５８３〜５８６（１９８８））、
芳香族環を含む有機低分子化合物をポリビニルアルコー
ルを主構成成分とした架橋高分子に固定化した吸着材
（特開昭５９−２２５５７号）などが報告されている。
しかしポリミキシンＢを固定化した場合は血液中や処理
液中にポリミキシンＢが脱離した際の安全性が問題であ
り、芳香族環を含む有機低分子化合物を固定化した場合
にはエンドトキシンの吸着容量が低いといった問題があ
る。またいずれの場合も血液中のエンドトキシン除去に
使用する場合には血液適合性に問題があり、血漿分離操
作や多量の抗凝固剤の投与が必要であり、出血傾向等の
副作用を惹起する等の欠点がある。またその他のエンド
トキシン血症の治療方法としては、たとえば抗エンドト
キシンヒトモノクロナール抗体の投与による効果も報告
されているが安全性やコスト面での課題が残る（ファル
マシア２７（９）９３５〜９３６（１９９１））。

【０００８】また水、水溶液などにおける精製用のエン
ドトキシン吸着材としてはヒスチジンをヘキサメチレン
ジアミンをスペーサーとしてセファロースに固定化した
ダイセル化学工業のＰｙｒｏ Ｓｅｐ（バイオサイエン
スとインダストリー４７（２）２２２〜２２３（１９８
９））、多孔質キトサンを架橋した栗田工業のクリムソ
ーバーII（特開平３−１０９９４０号）など多くのもの
がある。しかしこれらは吸着特異性や汎用性の点では十
分なものではない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記のような
背景に基づき、吸着性能および特異性あるいは血液適合
性の点においても優れ、血液浄化をはじめ水、水溶液あ
るいは医薬品の精製など適用範囲の広いエンドトキシン
吸着材を提供しようとするものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明のエンドトキシン吸着材はキトサンを水不溶性担体に
固定化させたことを要旨とするものである。また本発明
のエンドトキシン吸着材は目的に応じてアミノ基含量、
粒子径、細孔径あるいは充填量などを制御することによ
り広範囲な領域における適用が可能であるものであるも
のである。

【００１１】本発明で用いられる水不溶性担体としては
セルロース、架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコー
ル、ポリスチレンおよびその誘導体が挙げられる。この
中で吸着特異性および固定化反応の容易さから、セルロ
ースが特に好ましい。形状としては繊維状、膜状、中空
糸状なども考えられるが、表面積の確保や調製時の取扱
いの容易さなどの点から粒子状のものが望ましい。

【００１２】リガンドとしてエンドトキシンとの高親和
性を有するキトサンを、上記水不溶性担体に導入する。
キトサンはエビ、カニなど甲殻皮の外殻皮の構成多糖で
あるキチンをアルカリと共に加熱することで脱アセチル
化して得られるものである。キトサンの分子量は吸着材
調製時の溶解性などその取扱いの点などから１０００な
いし２００００のものが適しており、２０００から１０
０００のものがより好ましい。

【００１３】またエンドトキシンの吸着効率を向上させ
るにはキトサンの導入率の影響も重要である。吸着材の
キトサン含量が少ないと吸着効率が十分でなくなるが、
逆に多過ぎると担体ゲルの安定性が低下する。アミノ基
含量にして０．０５ないし３．００ｍｅｑ／ｇの範囲が
好ましく、０．２０ないし１．５０ｍｅｑ／ｇの範囲の
導入がより好ましい。

【００１４】吸着材の粒子径としては平均粒子径が２０
ないし２０００μｍが好ましいが、血液浄化の際には特
に粒子径が小さ過ぎると血球成分などによる影響や圧力
損失の影響を受けやすくなり、逆に大き過ぎると表面積
が十分でなくなることから、５０ないし１０００μｍの
範囲がより好ましい。また水、水溶液などの精製の際に
は２０ないし２００μｍの範囲がより好ましい。

【００１５】また細孔に関しては平均細孔径が２００な
いし３００００Åのものが好ましいが、血液浄化に際し
ては３００ないし３０００Åの範囲がより好ましく、
水、水溶液などの精製の際には１０００ないし２０００
０Åの範囲がより好ましい。

【００１６】本発明における水不溶性担体へのキトサン
の導入方法は共有結合、電子線照射によるグラフト化な
ど特に制限されないが、請求項第４項に記載したような
［セルロース］−［キトサン］を得る場合、以下の方法
が好ましい。 （１） セルロースの改質 過ヨウ素酸ナトリウムを０．１ないし５．０規定、好ま
しくは０．５にいし１．５規定の硫酸に溶解した溶液に
平均粒子径が２０ないし２０００Å、平均細孔径が２０
０ないし３００００Åの粒状多孔質セルロースを添加
し、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃から２０℃で
５時間から３０時間好ましくは１０時間から２４時間反
応させる。上記過ヨウ素酸ナトリウム−硫酸溶液の過ヨ
ウ素酸ナトリウム濃度は２重量％から１５重量％、好ま
しくは４重量％から１０重量％である。また上記粒状多
孔質セルロースの過ヨウ素酸ナトリウム溶液への浴比は
１０容量％から３０容量％、好ましくは１５容量％から
２５容量％である。

【００１７】この反応混合物を濾過して精製物を回収
し、十分に水洗して、膨潤状態でアルデヒド含量０．１
０ないし４．００ｍｅｑ／ｇ、好ましくは０．２０ない
し３．００ｍｅｑ／ｇのアルデヒドセルロースを得る。
このアルデヒドセルロースは化１にその部分構造を示す
ように、一部のグルコースユニットが開環した構造を有
している。

【００１８】

【化１】

【００１９】（２） キトサンの導入 ゲル浸透クロマトグラフィ（以下ＧＰＣと言う）による
ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと言う）換算で１
０００ないし２００００、好ましくは２０００ないし１
００００のキトサンをｐＨ９．５の緩衝液に溶解させて
おき、これに上記（１）で得たアルデヒドセルロースを
添加して撹拌しながら１０℃から５０℃好ましくは２０
℃から３０℃で５時間から３０時間、好ましくは１０時
間から２４時間反応させる。上記キトサン−緩衝液の濃
度は０．２重量％から５．０重量％、好ましくは０．４
重量％から３．０重量％で、この溶液へのアルデヒドセ
ルロースの浴比は３容量％から２０容量％、好ましくは
５容量％から１５容量％である。

【００２０】この反応混合物を濾過して生成物を回収、
水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、水素化
ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から５０℃、好まし
くは２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好まし
くは１０時間から２４時間反応させてシッフ塩基の水素
添加を行なう。含シッフ塩基［セルロース］−［キトサ
ン］の緩衝液への浴比は３容量％から２０容量％、好ま
しくは５容量％から１５容量％で、含シッフ塩基［セル
ロース］−［キトサン］と水素化ホウ素ナトリウムの仕
込比は２０／１から３／２、好ましくは１５／１から３
／１（いずれも容量／重量比）である。こうしてアミノ
基含量０．０５から３．００ｍｅｑ／ｇ、好ましくは
０．２０から１．５０ｍｅｑ／ｇの［セルロース］−
［キトサン］を得る。

【００２１】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は特に注釈を加えない場合は重量部を意味す
る。 ＜実施例１＞粒子径２０ないし２０００μｍ、平均細孔
径２００ないし３０００Åの範囲内である数種類の粒状
多孔質セルロース１０００部（容量）を過ヨウ素酸ナト
リウム３２５部を１規定硫酸５０００部に溶解した溶液
に添加し、２５℃で１８時間反応させた後、濾別、水洗
し、アルデヒド含量０．５ないし１．４ｍｅｑ／ｇのア
ルデヒドセルロース（以下ＣＡ−１と言う）を得た。

【００２２】アルデヒドの定量はオキシム法によって行
なった。すなわちＣＡ−１約１．０ｍｌを正確に秤量し
（この量をＶ1 ｍｌ とする）、これに０．５規定塩酸
ヒドロキシルアミン溶液（塩酸ヒドロキシルアミン３５
ｇを水１６０ｍｌに溶解し、９５％エタノールで希釈し
て１１としたもの）３５ｍｌを加えた。この懸濁液（以
下サンプル１と言う）をＣＡ−１を入れずに０．５規定
塩酸ヒドロキシルアミン溶液１０ｍｌとピリジンブロム
フェノールブルー溶液３５ｍｌを加えたもの（以下ブラ
ンクと言う）と合せて超音波洗浄器内に１５分間放置し
た。サンプル１とブランクを取り出し、サンプル１の呈
する色がブランクと同じになるまで０．１規定水酸化ナ
トリウム−メタノール溶液を滴下した。この際滴下した
水酸化ナトリウム量をＷ1 、力価をＦ1 とすると、アル
デヒド含量ｘ1 ｍｅｑ／ｇは次式によって得られる。 ｘ1 ＝（０．１×Ｆ1 ×Ｗ1 ）／Ｖ1

【００２３】ＧＰＣ（島津製作所ＬＣ−６Ａ）によるＰ
ＥＧ換算で分子量約５０００のキトサン３０部をｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０００部（容量）に溶解させてお
き、これに上記で得たＣＡ−１を２５０部（容量）を添
加して撹拌しながら２５℃で１８時間反応させた。この
反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐ
Ｈ９．０の炭酸緩衝液５０００部（容量）に分散させ、
水素化ホウ素ナトリウム７０部を添加して２５℃で１８
時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行なった。こう
してキトサン由来のアミノ基含量０．１０ないし１．２
０ｍｅｑ／ｇの［セルロース］−［キトサン］（以下Ｃ
Ｃ−１と言う）を得た。

【００２４】アミノ基の定量は以下の方法によって行な
った。ＣＣ−１約０．１ｍｌを正確に秤量し（この量を
Ｖ2 ｇとする）、０．１規定塩酸水溶液１０ｍｌ（力価
をＦ2 とする）を加え、この懸濁液をジオキサンで希釈
して全量で４０ｍｌにする（この懸濁液を以下サンプル
２と言う）。サンプル２を約３０分撹拌した後、自動滴
定装置（平沼産業製ＣＯＭＴＩＴＥ１０１）を用いて
０．１規定水酸化ナトリウム水溶液（力価をＦ2 ′とす
る）で滴定を行なう。サンプル２を中和するまでに要し
た０．１規定水酸化ナトリウム水溶液の量をＷ2 ｍｌと
すると、ＣＣ−１のアミノ基含量ｘ2 ｍｅｑ／ｇは次式
によって得られる。 Ｖ2 ×ｘ1 ＋０．１×Ｆ2 ′×Ｗ2 ＝０．１×Ｆ2 ×１
０

【００２５】上記の方法により得られた吸着材を生理食
塩水で洗浄した後、内径４cm、長さ８cmのカラムに充填
して、これにエンドトキシンを添加したウシ血液を供す
ることにより吸着性能を評価した。エンドトキシンはリ
ポポリサッカライドＢ（Ｄｉｆｃｏ社製、Ｅ．ｃｏｌｉ
０１１１：Ｂ４由来）を用いた。またエンドトキシンの
定量はトキシノメーターＥＴ２０１（和光潤約工業製）
を用いてリムルス法により行なった。

【００２６】エンドトキシン添加ウシ血液による評価に
際しては、まず１００Ｕ／ｍｌのヘバリンを含む生理食
塩水１５０ｍｌ、続いて１Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生
理食塩水１５０ｍｌでカラム内および血液回路内を洗浄
した。一方上記エンドトキシンを１００ｍｇ／ｍｌの濃
度で添加したクエン酸添加ウシ血液１１をプールして５
０ｍｌ／ｍｉｎの流速で２時間循環させた後の血液中の
エンドトキシン量を定量した。

【００２７】また循環前後の血液中の総タンパク質量、
アルブミン量、白血球数の定量を行なった。結果は後記
の表１および表２に示した通りである。なお、総タンパ
ク質量はＬｏｗｒｙ法により、アルブミン量はアルブミ
ンＢテストワコー（和光純薬工業製）により、白血球数
はコールターカウンターＺＭ型（コールターエレクトロ
ニクス社製）により測定した。なおエンドトキシン量に
ついては実際の測定値を、総タンパク質量、アルブミン
量、白血球数については残存率で表示した。

【００２８】＜実施例２＞上記吸着材を内径１０mm、長
さ２００mmのカラムに充填して、エンドトキシンを添加
したウシ血清アルブミン（和光純薬工業製、以下ＢＳＡ
と言う）の生理食塩水溶液を供することにより吸着性能
の評価を行なった。エンドトキシン添加ＢＳＡ水溶液に
よる評価に際しては、上記エンドトキシンを５００ｍｇ
／ｍｌの濃度で添加した１ｍｇ／ｍｌ濃度のＢＳＡ生理
食塩水溶液１１を１ｍｌ／ｍｉｎの速度で通液し、溶出
液についてエンドトキシン濃度およびアルブミン濃度を
実施例１と同様にして定量した。結果は後記の表３に示
す通りである。なおエンドトキシン量については実際の
測定値を、アルブミン量については残存率で表示した。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】

【表３】 なお、表中のＮ．Ｄ．は測定不可を示し、表２中の数値
は残存率（％）を示す。

【００３２】＜比較例１＞粒子径１５０μｍ、平均細孔
径１００Åの粒状多孔質セルロースを実施例１に示した
方法により、アルデヒド含量０．０５ｍｅｑ／ｇおよび
１．２ｍｅｑ／ｇのアルデヒドセルロース（以下ＣＡ−
２と言う）を得た。さらにＣＡ−２を実施例１と同様に
してキトサンの導入を行ない、キトサン由来のアミノ基
含量０．０２ｍｅｑ／ｇおよび０．５０ｍｅｑ／ｇの
［セルロース］−［キトサン］を得た。こうして得られ
た吸着材を生理食塩水で洗浄後、実施例１と同様にエン
ドトキシン添加ウシ血液による吸着性能の評価を行なっ
た。結果は表１および表２に示した通りである。

【００３３】＜比較例２＞比較例１に示した吸着材を、
実施例２に示した方法により上記エンドトキシン添加Ｂ
ＳＡ溶液による吸着性能の評価を行なった。結果は表３
に示した通りである。

【００３４】＜比較例３＞粒子径１５０μｍ、平均細孔
径１００００Åの粒状多孔質セルロースを実施例１に示
した方法により、アルデヒド含量０．０５ｍｅｑ／ｇの
アルデヒドセルロース（以下ＣＡ−３と言う）を得た。
さらにＣＡ−２を実施例１と同様にしてキトサンの導入
を行ない、キトサン由来のアミノ基含量０．０２ｍｅｑ
／ｇの［セルロース］−［キトサン］を得た。こうして
得られた吸着材を生理食塩水で洗浄後、実施例１と同様
にエンドトキシン添加ウシ血液による吸着性能の評価を
行なった。結果は表１および表２に示した通りである。

【００３５】＜比較例４＞比較例３に示した吸着材を、
実施例２に示した方法により上記エンドトキシン添加Ｂ
ＳＡ溶液による吸着性能の評価を行なった。結果は表３
に示した通りである。

【００３６】

【発明の効果】本発明によるエンドトキシン吸着材はエ
ンドトキシン吸着特異性に優れている。血液適合性に関
しても良好であり、エンドトキシン血症の治療あるいは
予防に用いることが可能である。また水、水溶液の精製
に用いることも可能であり、医学領域のみではなく、広
範囲な用途に対して適用が期待できるものである。

フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水不溶性担体に分子量１０００から２０
   ０００のキトサンをアミノ基含量が０．０５ないし３．
   ００ｍｅｑ／ｇの範囲で固定化してなるエンドトキシン
   吸着材。
2. 【請求項２】 水不溶性担体がセルロース、架橋ポリア
   クリル酸、ポリビニルアルコール、ポリスチレンまたは
   これらの誘導体であることを特徴とする請求項１記載の
   エンドトキシン吸着材。
3. 【請求項３】 水不溶性担体が粒子径２０ないし２００
   ０μｍ、平均細孔径２００ないし３００００Åであるこ
   とを特徴とする請求項１記載のエンドトキシン吸着材。
4. 【請求項４】 アルデヒド含量０．１ないし４．０ｍｅ
   ｑ／ｇのセルロースに分子量１０００ないし２００００
   のキトサンのアミノ基を縮合させてシッフ塩基を形成
   し、これを還元することによりキトサンを固定化して得
   られることを特徴とする請求項１記載のエンドトキシン
   吸着材。