JPH03170864A - 蛍光偏光法によるリガンドの測定法 - Google Patents

蛍光偏光法によるリガンドの測定法

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JPH03170864A
JPH03170864A JP2260302A JP26030290A JPH03170864A JP H03170864 A JPH03170864 A JP H03170864A JP 2260302 A JP2260302 A JP 2260302A JP 26030290 A JP26030290 A JP 26030290A JP H03170864 A JPH03170864 A JP H03170864A
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デビット・アール・ブロンスキ
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チャールズ・エイ・フレンティジ
J Hawksworth David
デビット・ジェイ・ホークスワース
W Pennington Charles Jr
チャールズ・ダブリュ・ペニントン・ジュニア
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、蛍光偏光法を用いた、試料（血清、血漿、尿
など）中に存在する生物学的対象物（たとえば、テオフ
ィリンなどのリガンド）レベルの決定方法に関する。
（従来の技術および発明か解決しようとする課題）試料
（血清、血漿、尿など）中に存在するバルブロン酸（ｖ
ａｌｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ）などの生物学的対象物のレ
ベルを決定するために蛍光偏光法を用いることは、たと
えば１９８６年６月３日にワング（Ｗａｎｇ）らに特許
された米国特許第４，５９３．０８９号明細書などに開
示されていることが知られている。
該特許明細書には、例を挙げて試料中のバルブロン酸レ
ベルを決定する方法が開示されており、その方法によれ
ば、トレーサーとしての２−エチルー５−アミノーペン
タン酸−５−［（４．６−ジクロロトリアジン−２−イ
ル）アミノ］フルオレセイン結合体、およびバルプロン
酸と該トレーサーとをともに認識する抗体としてのヒツ
ジ抗バルブロン酸抗体を試料と混合する。バルプロン酸
（リガンド）とトレーサーとはともに抗体と複合体を生
成する。トレーサーおよび抗体の濃度はともに一定に保
っておき、生成したトレーサー／抗体複合体に対するリ
ガンド／抗体複合体の比が試料中に存在するリガンドの
量に正比例するようにする。
それゆえ、上記混合物を偏光で励起させ、トレーサーお
よびトレーサー／抗体複合体により放射される蛍光の偏
光を測定することにより、試料中のリガンドの量を蛍光
偏光法で測定することができる。
上記ワングらの特許明細書にも開示されているように、
蛍光偏光法には、幾つかの試料（あるものは既知であり
、あるものは未知である）の蛍光の偏光を測定し、既知
試料のデータから濃度の関数としての偏光を示す標準曲
線を作成し、ついでこの標準曲線を用い、測定した偏光
から未知試料の濃度を決定することが含まれる。この特
許明細書にはまた該方法を種々のリガンドの濃度を決定
するために用いることができることも開示されており、
そのようなリガンドの例として、エストロン、エストラ
ジオール、コルチゾル、テストステロン、プロゲステロ
ン、ケノデオキンコール酸、ジゴキシン、コール酸、ジ
ギトキシン、デオキシコール酸、リトコール酸（ｌｉｔ
ｈｏｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、およびそれらのエステ
ルおよびアミド誘導体などのステロイド類；ビタミンＢ
−１２、葉酸、チロキシン、トリョードチロニン、ヒス
タミン、セロトニン、プロスタグランジン類（ＰＧＥＳ
ＰＧＦ，ＰＧＡなど）などのビタミン類：テ才フィリン
ｔどの抗喘息薬；アドリアマイシンやメトトレキセート
などの抗腫瘍剤；ディソピラミド、リドカイン、ブロカ
インアミド、プロブラノロール、キニジン、Ｎ−アセチ
ルブロカインアミドなど抗不整脈剤フェノバルビタール
、フェニトイン、プリミドン、バルブロン酸、カルバマ
ゼビンおよびエトサクンミドなどの抗痙彎剤：ペニシリ
ン類、セファ口スボリン類、エリスロマイシン、パンコ
マイノン、ゲンタマイシン、アミカシン、クロラムフェ
ニコール、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンな
どの抗生物質；サリチル酸塩などの抗関節炎剤ノルトリ
プチリン、アミトリプチリン、イミブラミンおよびデシ
ブラミンなどの三環系抗うつ薬を含む抗うつ薬：など、
およびそれらの代謝産物が挙げられている。
試料（血清、血漿、尿など）中に存在する生物学的対象
物（たとえば、バルブロン酸）のレベルを決定するため
の蛍光偏光法において、ある種のアミノメチルフルオレ
セインをトレーサーとして用いることができることちま
た知られている。その例として、たとえばキルケモ（Ｋ
　ｉｒｋｅｍｏ）らに１９８５年４月９日に特許された
米国特許第４．５　１　０２５１号明細書には試料中の
エストリオールおよびコルチゾルのレベルを決定する方
法が開示されており、該方法は、それぞれトレーサーと
してのエストリオールカルボキシメチロキシムアミノメ
チルフルオレセインおよびコルチゾル−３−カルボキシ
メチロキシムアミノメチルフルオレセイン、およびそれ
ぞれ抗体としてのエストリオールに対して産生した抗血
清およびコルチゾルに対して産生じた抗血清を試料と混
合し、ついでトレーサー／抗体結合体の量を蛍光偏光法
により決定することが含まれる。キルケモらの特許明細
書は、上記に挙げたりガンドを所定の方法により測定す
ることができることを開示しているとともに、モルヒネ
、ヘロイン、ヒドロモルホン、才キシモルホン、メタボ
ン（ｍｅｔａｐｏｎ）、コデイン、ヒドロコドン、ジヒ
ドロコデイノン、ジヒドロヒド口キンコデイノン、ホル
コジン（ｐｈｏｌｃｏｄｉｎｅ）、デキスト口メトルフ
ァン、フヱナゾシンおよびデオニン（ｄｅｏｎｉｎ）お
よびそれらの代謝産物などの乱用薬物も該方法により決
定することができることを開示している。
（課題を解決するための手段） 本発明は、測定しようとするリガンド、モノクローナル
抗体および一群のアミノメチルフルオレセイントレーサ
ーの構成員の一つを含む系で蛍光偏光法を用いて種々の
リガンドを測定する方法において、該系にグリセロール
を含ませることにより、該系中のモノクローナル抗体の
安定性が、そのような測定を行うために従来用いられて
きた系中でのモノクローナル抗体の安定性に比べて予期
せず、また有意に増大するという発見に基づいている。
本発明の方法により測定することのできるリガンドとし
ては、エストロン、エストラジオール、コルチゾル、テ
ストステロン、プロゲステロン、ケノデオキシコール酸
、ジゴキシン、コール酸、ンギトキシン、デオキシコー
ル酸、リトコール酸、およびそれらのエステルおよびア
ミト誘導体などのステロイド類；ビタミンＢ−１２、葉
酸、チロキシン、トリョードチロニン、ヒスタミン、セ
ロトニン、プロスタグランジン類（ＰＧＥ，ＰＧＦ，Ｐ
ＧＡなど）などのビタミン類；テオフィリンなどの抗喘
息薬；アドリアマイシンやメトトレキセートなどの抗腫
瘍剤；ディソピラミド、リドカイン、ブロカインアミド
、プロブラノロール、キニジン、Ｎ−アセチルブロカイ
ンアミドなど抗不整脈剤：フェノバルビタール、フェニ
トイン、プリミドン、バルプロン酸、カルバマゼビンお
よびエトサクシミドなどの抗痙牽剤；ペニシリン類、セ
ファロスボリン類、エリスロマイシン、パンコマイシン
、ゲンタマイシン、アミカシン、クロラムフェニコール
、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンなどの抗生
物質；サリチル酸塩などの抗関節炎剤二ノルトリブチリ
ン、アミトリブチリン、イミブラミンおよびデシブラミ
ンなどの三環系抗うつ薬を含む抗うつ薬；モルヒネ、ヘ
ロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホン、メタボン、
コデイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイノン、ジヒド
ロヒド口キノコデイノン、ホルコジン、デキストロメト
ルファン、フエナゾンンおよびデ才ニンおよびそれらの
代謝産物などの乱用薬物などが挙げられるが、これらに
限られるものではない。
本発明は特に、アミノメチルフル才レセイントレーサー
を認識することのできるモノクローナル抗体の緩衝溶液
の安定性が、該溶液中に約５％（重量％、以下同じ）〜
約２０％、好ましくは約８％〜約１２％、最も好ましく
は約ｌＯ％のグリセロールを含ませろことにより予期せ
ず、かつ有意に増大すること、およびそのようなグリセ
ロールの存在が当面の測定を妨害しないことの発見に基
づいている。
従って、本発明の態様の一つは、試料中のリガンドの測
定法であって、 （ｉ）試料を （ａ）式： （式中、Ｒはリガンド、またはりガンド類似体であって
、測定しようとするリガンドとトレーサー化合物中のリ
ガンドまたはリガンド類似体とがともに所定の抗体によ
り特異的に認識されるように該測定しようとするリガン
ドと共通するエビトープを少なくとも一つ有するリガン
ド類似体、Ｎは１−１０の整数である）で示されるトレ
ーサー化合物、または （ｂ）該トレーサー化合物の生物学的に許容し得る塩、 （ｃ）測定しようとするリガンドとトレーサー化合物と
をともに特異的に認識し得るモノクローナル抗体、およ
び （ｄ）グリセロール と，昆合し、ついで （ｉｉ）該抗体に結合したトレーサー化合物の量を蛍光
偏光法により測定して試料中のりガンドの量を決定する ことを特徴とする方法である。本発明の方法を行うに際
して試料中に用いるグリセロールは、該モノクローナル
抗体を含有する溶液の一部として導入する。該抗体溶液
中のグリセロールの量は、該モノクローナル抗体の安定
性を有意の範囲まで高めるのに充分なものでなければな
らない。−モノクローナル抗体溶液中のグリセロールが
５％〜２０％であるとモノクローナル抗体の安定性を高
めるのに有効であるが、該溶液が３０％のように上記範
囲を逸脱するグリセロールを含有するときはモノクロー
ナル抗体の安定性は減少することがわかりた。
本発明の別の態様は、測定しようとするリガンドと式： １’ｌ○ （式中、Ｒはリガンドまたはリガンド類似体、Ｎはｌ−
１０の整数である）で示されるトレーサー化合物とをと
もに特異的に認識し得るモノクローナル抗体、および溶
液中のモノクローナル抗体の安定性を有色に高めるのに
充分な量のグリセロール、からなる緩衝溶夜である。
本発明は、下記実施例により一層充分に理解されるであ
ろう。この実施例は、本発明者が現在のところ考え得る
最良の態様であるが、説明のみを目的としたものであり
、本発明を限定することを意図したものではない。
本明細書において「％」および「部ｊは、特に断らない
限り重量％および重量部を意味する。９はダラムを意味
する。ｍ９はミリグラムを意味する。ｎ２：土ナノグラ
ニを意味する。Ｃｌｌはセ．ンチメーターを意味する。
中はミリメーターを意味する。Ｑはリノトルを意味する
。μＱはマイクロリットルを意味する。ｍ　／　ｏ　：
よモルバーセントを意味し、組代物中の所定．成分のモ
ル数を組成物中の全モル数で除して１００倍した乙のて
ある。ｖ／ｖは容量％を意味する。Ｍ｛よモルを意味し
、溶液１（中の溶質のモル敗である。ｐｓｉはボンド／
平方インチを會味する。Ｍ　Ｐ　ａは＋０８パスカルを
意味する。温度は特に断らたい限りずべて℃てある。
実Ｉｉｉ！ｉ列 式（＋）で示されるテオフィリンーアミノメチルフル才
レセイン誘導体（式中、Ｎは５であり、Ｒで示される基
である）を、テトラヒド口フラン（４０２Ｑ）中に溶解
しｆ二８−カルポキンベンチルテオフィリン（６０．７
９）、Ｎ−ヒドロキンサクノンイミＦ（２　６　．　０
ｐ９＞、ノック口へキソル力ルホノイミト（４６．０ｙ
９）およびアミノメチルフルオレセイノ（８１　０■）
（米国特許第４，ＧＩ４．８２３号明細書、実施例２参
照）から製漬した。上記＼−ヒト口キノサクシンイミト
お上びジメチルポルムアミド（？ｆ！）を上記８−カル
ボキシベンチルテオフィリンに加え、約２０゜Ｃの室温
にて３時間反応させん。ついて、上Ｓ己アミノメチノレ
フノレオレセインおよびノメチルホルムアミド（２ｉ（
２）を反応混合物に加えｆ二。室温にて反応を完了まで
進行さｔ！−７二が、これには約１５分を要しｆ二。つ
いて溶媒を真空下に除いて粗製の生成物を得、これを１
５％ｖ／ｖメタノールを含有する塩化メチレンか皐なる
溶媒中に躊解し、プレバラティブ薄層クロマトグラフィ
に上り精製した。
ついで、上記で得たテオフィリンーアミノメヂルフル才
レセイン誘導体を、蛍光偏光イムノアソセイにおいてト
レーサーとして用いた。蛍光偏光イムノアッセイは下記
のようにして行った。
（１）容量を測定した漂準血清または被験血清を試験管
に送り、緩衝液で希釈する。
（２）ついで、既知濃度の本発明トレーサーを各試験管
に加える。
（３）既知ａ度の抗血清を試験管に加える３（４）反応
混合物を３５゜Ｃにてインキユベートする。ついで （５）モノクローナル抗体に結合したトレーサーの量を
蛍光偏光法により測定し、試料中のリガント（血清）の
量を測定する。
イムノアッセイには下記材料を用いた。
１．Ｏ．ｌＭ媛衝液（ｐＨ７．５）（０．０　１％ウシ
カンマグロプリン（ＢＧＧ）および０．１％アジ化ナト
リウムを含有する「トリス（ＴＲＭ；）Ｊの商品名で市
販されている）中の上記で製造したテオフィリンーアミ
ノメチルフル才レセイントレーサー２　０　１％アジ化
ナトリウム、１．０％ニワトリ卵アルブミン加水分解物
および０．９％塩化ナトリウムを含有する１０％水性グ
リセロール中の、マウス腹水から得た抗テオフィリンモ
ノクローナル抗体抗血清。
３．２．５％　５−スルホサリチル酸塩およびＯＩＭＴ
Ｒ［Ｓ溶液からなる前処理溶液。
４．ヒト血清またはテ才フィリンを含有する他の生物学
的流体の試料。
５．キュベット、キュベットとして用いるＩＯ×７５朋
ガラス培養管。
６，±０　００ｌ単位の精度で蛍光偏光を測定可能な蛍
光計。
アッセイ法には下記工程が含まれていた。
ｌ　試料（２１．６μのを抗血清（２５μのおよび前処
理溶液（２５μｇ）とともに前希釈コンテナー中にビベ
ットにて入れた。前希釈コンテナー中の溶液の容量をＢ
ＧＧ緩衝液で約５００μＱに希釈した。
２．前希釈コンテナーから上記躊液（Ｉ７５μ（２）を
ピペットにてキュベット中に入れ、ＢＧＧ援ｋ液で最終
容量０．９９．７１Ｑまて希釈しｆコ。
３．キュベットの中身をよく，昆合しｒ為３分後、蛍光
偏光のバックグラウンド決定を行った。
４．前希釈混合物をさらに１７５μＱとトレーサー（２
５μＱ）をキュヘットに加え、ＢＧＧａｔ衝液を加えて
キュベット中の全容量を約２　，　Ｏ　ｍ（ｌとした。
５　キュベットの中身をよく混合し、３５゜Ｃにて７分
インキユベートした。
６．ついで、適当医装置（蛍光計）を用い、キュベット
中の組成物の蛍光偏光値を決定した。
０〜４０ｎ９／ＭＱの濃度のテオフイリンを含有する一
連の血清標準の結果は下記の通りであった。
テオフィリン農度（ｎｙ／ｔｌ２）　　　　偏光０．０
０　　　　　　　０．２６５ ２．５００．２３２ ５．００　　　　　　　０．２０４ １０．００　　　　　　　０．１６２ ２０．００　　　　　　　０．１１６ ４　０．０　０　　　　　　　０．０　７　９種々の濃
度のグリセロールでの安定性を凋べるｆ二め、０．１％
アジ化ナトリウム、１．０％ニワトリ卵アルブミン加水
分解物および０．９％塩化ナトリウムを含有するｌＯ％
水性グリセロール中のマウス腹水由来抗テオフィリンモ
ノクローナル抗体抗血清（以下、「ｌＯ％グリセロール
」という）、並びに２０％グリセロールを含有する他は
同一の他の抗血清（以下、ｒ２０％グリセロール」とい
う）を調製した。ついで、これらの抗血清を用い、下８
２（ａ）〜（Ｃ）のそれぞれの血清テオフィリン試料に
ついて上記アッセイ法の１〜６の工程を行うことにより
アッセイした。
（ａ）新たに調製した試料 （ｂ）４５℃にて種々の期間貯蔵した試・料（ｃ）２〜
８℃にて種々の期間貯蔵した試料新たに調製した血清テ
オフィリン試料、４５°Ｃにて７日間貯蔵した後の血清
テオフィリン試料、および２〜８℃にて２箇月間貯蔵し
た後の血清テオフィリン試料のそれぞれ２つの試料につ
いて調べた偏光を下記にまとめた。
＊ｌ＊２＊３ ｌＯ％ク゛リセロール　２０８．７３　　１９９．０４
　　２０４．４６２０％ク゛リセロール　２０１．９７
　　１９５．４５　　１９７８８（注）＊ｌ：　新たに
調製した試料 ＊２：　　４５℃にて７日間貯蔵した後の試料＊３：　
２〜８℃にて２箇月間貯蔵した後の試料上記データは、
２つの血清テ才フィリン試料の安定性が充分なものであ
ることを示している。しかしながら、比較のため本発明
に従うことなく、一つは３０％のグリセロールを含有す
る以外は同一の試料、他はグリセロールを含有しない以
外：よ同一の試料を上記安定性試験に供したところ、い
ずれもアッセイにおいてより大きな変動がみら２′。、
安定性は不充分であると思われた。
上記実施例において８−カルボキシベンチルテオフィリ
ンの代わりに他の８−カルボキシアルキルテオフィリン
を等価量用いることにより、本発明の方法に使用するた
めの他のテオフィリンーアミノメチルフルオレセイント
レーサーを製造することができること、および他のカル
ボキシアルキルリガンドを等価量用いることにより他の
りガンドアミノメチルーフルオレセイントレーサーを製
造することができることが了解されるであろう。
同様にカルボキシアルキルリガンド類似体を代わりに用
いることにより、トレーサーとしてリガンド類似体−ア
ミノメチルフルオレセインを製造することができる。同
様に、他のりガンドーアミノメチルフルオレセインおよ
びリガンド類似体−アミノメチルフル才レセイントレー
サーおよびそのようなすべてのトレーサーの生物学的に
許容し得る塩を適当なモノクローナル抗体とともに上記
実施例の手順に用いて他のリガンドを決定するのに用い
ることもてきる。測定しようとするりガンドおよびトレ
ーサー中のリガンドもしくはリガンド類似体は少なくと
も一つの共通するエビトーブを有していなければならず
、モノクローナル抗体はリガンドとトレーサーの両方を
特異的に認識することができなければならない。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）試料中のリガンドの測定法であって、（ｉ）試料
    を （ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒはリガンド、またはリガンド類似体であって
    、測定しようとするリガンドとトレーサー化合物中のリ
    ガンドまたはリガンド類似体とがともに所定の抗体によ
    り特異的に認識されるように該測定しようとするリガン
    ドと共通するエピトープを少なくとも一つ有するリガン
    ド類似体、Ｎは１〜１０の整数である）で示されるトレ
    ーサー化合物、または（ｂ）該トレーサー化合物の生物
    学的に許容し得る塩、 （ｃ）測定しようとするリガンドとトレーサー化合物と
    をともに特異的に認識し得るモノクローナル抗体、およ
    び （ｄ）該モノクローナル抗体の溶液の一部として添加し
    たグリセロールであって、該モノクローナル抗体の安定
    性を高めるのに充分な量で該溶液中に存在するグリセロ
    ール と混合し、ついで （ｉｉ）該抗体に結合したトレーサー化合物の量を蛍光
    偏光法により測定して試料中のリガンドの量を決定する ことを特徴とする方法。
  2. （２）グリセロールが、モノクローナル抗体溶液中に約
    ５重量％〜約２０重量％の量で存在する、請求項（１）
    に記載の方法。
  3. （３）グリセロールが、蛍光偏光法に供する試料に添加
    するモノクローナル抗体溶液の約１０重量％を構成する
    、請求項（１）に記載の方法。
  4. （４）式（ I ）で示されるトレーサー化合物において
    Ｒが式： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） で示される構造を有し、Ｎが１〜１０の整数である、請
    求項（１）に記載の方法。
  5. （５）グリセロールが、モノクローナル抗体溶液中に約
    ５重量％〜約２０重量％の量で存在する、請求項（４）
    に記載の方法。
  6. （６）グリセロールが、蛍光偏光法に供する試料に添加
    するモノクローナル抗体溶液の約１０重量％を構成する
    、請求項（４）に記載の方法。
  7. （７）測定しようとするリガンドと式： （式中、Ｒはリガンドまたはリガンド類似体、Ｎは１〜
    １０の整数である）で示されるトレーサー化合物とをと
    もに特異的に認識し得るモノクローナル抗体、および溶
    液中のモノクローナル抗体の安定性を有意に高めるのに
    充分な量のグリセロール、からなる緩衝溶液。
  8. （８）グリセロールが溶液の約５重量％〜約２０重量％
    を構成する、請求項（７）に記載の溶液。
  9. （９）グリセロールが溶液の約８重量％〜約１２重量％
    を構成する、請求項（７）に記載の溶液。
  10. （１０）グリセロールが溶液の約１０重量％を構成する
    、請求項（７）に記載の溶液。
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