JPH0273158A

JPH0273158A - 試料中の物質の測定方法

Info

Publication number: JPH0273158A
Application number: JP22588888A
Authority: JP
Inventors: Isamoto Matoba; 的場　功始; Mamoru Kawaguchi; 守川口; Kenichiro Ishibashi; 石橋　健一郎; Hisahide Hiura; 久英日裏
Original assignee: International Reagents Corp
Current assignee: Sysmex International Reagents Co Ltd
Priority date: 1988-09-08
Filing date: 1988-09-08
Publication date: 1990-03-13
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: JP2688943B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、生化学、免疫学をはじめ医学、薬学などの分
野、とりわけ臨床検査の分野で利用される試料中の物質
の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

近年、血液中の微量成分を測定することにより癌をはじ
めとする種々の疾患や感染症などの診断に有用なことが
明らかになってきた。また血液中の微量成分として患者
の血液中の薬剤についてもその濃度を測定することによ
り、あらかじめ投与された薬剤量をモニターすることが
できる。このように血液等の体液中の微量成分の測定は
、臨床医学や検査の分野で重要になってきた。

従来、このような目的で開発された試料中の微量成分の
測定法には種々のものがあるが、その中でも、免疫化学
反応を利用したラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏ　１
ｍＩＩｕｎｏａｓｓａｙ、　ＲＩ　Ａ）及びエンザイム
イムノアツセイ（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ、　Ｅ　Ｉ　Ａ）は特異性や感度の点で優れた方法と
してよく知られた方法である。これらは、微量測定可能
な放射性同位元素又は酵素を標識物質とし、標識物質と
抗体（又は抗原）とが結合した標識抗体（又は抗原）を
用い、抗原抗体反応の特異性を利用して試料中の微量成
分を測定する方法である。上記のｉＴｌ定方法中、ＲＩ
Ａは測定に特殊な設備や装置が必要で、また放射性物質
の取扱に危険性を含んでいることや廃棄物の公害汚染の
問題などがあることから、上述ような欠点がないＥＩＡ
が注目されるようになってきた。ＥＩＡは、普及性の点
で利点があり、特に臨床検査の分野で今後使用される頻
度が増えて来ることが予想されている。

ＥＩＡによる測定方法としては、その測定システムの差
異からサンドイツチ法、二抗体法、ホモジニアスＥＩＡ
法等の種々の方法が知られているが、酵素で標識した抗
原（又は抗体）を測定すべき抗体（又は抗原）と反応さ
せて、その結合したもの（ｂｏｕｎｄ　ｆ’ｏｒｍ）と
結合しなかったもの（ｆｒｅｅｆｏｒｍ）とを、固相に
固定化された抗原又は抗体を用いて分離する、いわゆる
Ｂ／Ｆ分離を行なうことにより、測定精度の向上が図ら
れることが知られ、汎用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、ＥＩＡ法は一般に測定感度は比較的高い
が、測定時の反応時間が長いという問題があった。特に
日常の臨床検査では多数の試料（検体）を取り扱ってい
るため、短時間で測定できる必要があることから、反応
時間の短い測定方法が要望されていた。

測定時間を短縮する方法としては、従来より種々の手段
が構じられてきたが、その結果、逆に感度の低下をきた
すことになる等の問題があり、有用なものは見出されて
いない。その−例として、標識抗原や標識抗体の濃度を
上げると測定時間は短縮できることが知られている。し
かし、上記の固相を用いる方法では、目的とする抗原抗
体反応とは異なる単なる物理化学的な吸着現象で標識抗
原や標識抗体が固相上に吸着されるので、測定可能な標
識物質も固相上に固定化される結果となる。

そのため、固相上に吸着された上記非特異物質が測定時
のバックグラウンドの上昇をもたらし、実質的に感度上
昇に障害を与えている。

本発明は上記の課題を解決すべくなされたちので、血液
をはじめとする種々の試料中の物質、微量成分を測定す
るにあたり、従来の免疫化学的測定方法の問題点を改良
し、測定時間の短縮が図れるとともに、バックグラウン
ドの上昇等を伴わず且つ測定感度を上げることができる
方法を開発し、特に臨床検査の分野で利用される有用な
測定方法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段及び作用〕上記の課題を解
決すべくなされた本発明の測定方法は、試料中の物質を
測定するために固相及び標識物質を用いる免疫化学的測
定法であり、一対の非共有性結合物質の一方が固定化さ
れた固相を用い、当該固相上の物質に上記一対の非共有
性結合物質の他方を含有する物質を介して、試料中の被
検物質量の指標となり得且つ標識物質を含有する物質を
結合させ、次いで固相上に形成された前記非共有性結合
物質間、の結合を解き、少なくとも試料中の被検物質量
の指標となり得且つ標識物質を含有する物質を固相から
脱離させ、当該物質を測定することを特徴とするもので
ある。

本発明は上記の構成よりなり、試料中の被検物質量の指
標となり得且つ標識物質を含有する物質を固相上から脱
離させた後測定を行なうので、物理化学的な吸着により
固相上に結合した非特異物質は固相上に残存し、その影
響を排除することができるので、標識抗原や標識抗体の
濃度を上げても測定精度が低下することがなく、測定時
間の短縮が図れる。

上記構成よりなる本発明を詳述すると、まず、試料中の
被検物質（抗原、抗体、ハプテンなど）と免疫化学反応
に関与できる物質との反応を行わせ、反応生成物を固相
に結合させる。この際、当該免疫化学反応に関与できる
物質としては、被検物質と免疫化学的に反応するか又は
競合する物質と一対の非共有性結合物質の一方の物質と
を結合させたものを少なくとも使用し、さらに被検物質
と免疫化学的に反応するか又は競合する物質と標識物質
とを結合させたものを併用する。従って、試料中には、
被検物質と免疫化学反応に関与できる物質とが結合した
種々の反応生成物が生成し、これら反応生成物のなかに
は、試料中の被検物質量の指標となり得且つ標識物質を
含有する物質も存在する。なお、上記の被検物質と免疫
化学的に反応するか又は競合する物質と標識物質とを結
合させたものは、反応生成物を固相に結合させた後に反
応させてもよい。また、上記の固相には、−対の非共有
性結合物質の他方の物質が固定化されたものが使用され
ており、その結果、種々の反応生成物中、少なくとも一
対の非共有性結合物質の一方を含有する物質が固相上に
結合する。

上述の反応が終了したのち固相を洗浄し、固相に結合し
ていない種々の物質を除去する（いわゆるＢ／Ｆ分離）
。

次に、固相上に形成された一対の非共有性結合物質間の
結合を、該結合を解離させる脱離剤を添加することによ
り解き、固相上に結合した反応生成物から、少なくとも
試料中の被検物質量の指標となり得且つ標識物質を含む
物質を固相から脱離させて分離し、標識物質検出剤を添
加する等の公知の方法で標識物質を測り、その値から被
検物質の量（例えば、質量、濃度、活性など）に換算す
ることにより試料中の物質の測定を行うことができる。

本発明において使用される一対の非共有性結合物質とし
ては、非共有性の結合性を有するとともに所定の条件下
で解離する性状を有する物質を示し、解離する条件とし
ては、例えば、（ａｌ上記結合性を有する物質の一方と
より強い結合性を有する物質を用いて結合を解き解離さ
せる方法；　（ｂ）　ｐ　Ｈを変化させて解離させる方
法；（Ｃ）その他の方法（例えば、濃度変化による解離
、酵素の作用による解離等）等が例示される。より具体
的には、上記（ａｌの方法としては、まずやや弱い結合
性を有する一対の物質量の結合を固相上で形成した後、
その一方の物質より結合性の強い物質を脱離剤として加
えることで、新たな結合が生じ、先に結合した他の物質
を脱離させる方法である。この具体的な例としては、ア
ビジンとビオチンが強い結合性があり、それに比べると
アビジンとイミノビオチン、アビジンとジチオビオチン
、アビジンとりポエート、アビジンとＨＡＢＡ　［２−
（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸］などの順に
結合定数が低下し、結合性が弱くなる。従って、例えば
本発明の方法において、免疫化学反応に関与できる物質
としてアビジンとイミノビオチンのいずれか一方を含有
する物質を用い、固相には他方の物質が結合したものを
用いて結合させた後、ビオチンを脱離剤として加えると
、このアビジンとイミノビオチンの結合が解かれ、アビ
ジンとビオチンの結合に変わる。この場合特記すべきこ
とは、これらの結合とは無関係に吸着現象により固相上
にある前述の非特異物質は、該脱離剤では固相から脱離
することがないので、測定に影響を与えないことである
。

アビジンとビオチン系以外の例としてはコンカナバリン
Ａと糖類系が例示され、コンカナバリンＡとグルコース
との結合に比べ、コンカナバリンＡとβ−ガラクトシダ
ーゼ、コンカナバリンＡとペルオキシダーゼ等の結合は
やや弱くなるので、この結合性の差を利用する例が挙げ
られる。

また前記中）の方法は、一対の非共有性結合物質間の結
合をｐＨの変化により解くもので、例えばプロティンＡ
とＩｇＧは結合性を有するが、その結合はｐＨを低下さ
せることにより解離する。従って、例えば、前記免疫化
学反応に関与できる物質としてプロティンＡ又はＩｇＧ
のいずれか一方を含有する物質を用い、他方を固相に固
定化した場合、これらは固相上で一対の結合を形成する
とともにｐＨを低下させると該結合を解くことができる
。

さらに（Ｃ）の方法は、−例として濃度変化を利用して
解離させる方法が挙げられ、例えば、ＮＡＤとアルコー
ル・デヒドロギナーゼは結合性を有するが、その結合は
ＮＡＤの濃度を上昇させることにより解くことができる
。この他にも非共有性の結合を物理化学的又は生物学的
方法で脱離する方法などもあり、これらの例示に限定さ
れるものではない。

本発明において、固相として使用される材料としては、
従来のＥＩＡ等において使用されている材料のいずれも
使用でき、例えば、アガロース、セファロ−、ス等の多
糖類、ガラス、セラミックス、プラスチックス等が例示
される。これら固相材料上に、一対の非共有性結合物質
の一方を固定化する方法としては、従来、ＥＩＡ等で固
相上に抗体等を固定化する方法等が適用でき、例えば、
ブロムシアン法、グルタルアルデヒド法、シランカップ
リング法等が例示できる。

また、標識物質としては、ＥＩＡで用いられているよう
な酵素をはじめ、ＲＩＡで用いられているような放射性
同位元素、螢光発生や発色に結び付くような物質を使用
することができる。このような標識物質は、それ自身で
直接測定できる場合もあり、またそれを検出して測定で
きる状態に変換する標識物質検出剤（例えば、酵素にあ
っては基質等）を添加して測定する。

上記の標識物質又は一対の非共有性結合物質と、抗原、
抗体、ハプテン等とが結合した化合物の調製は、従来か
ら用いられている方法、例えば、グルタルアルデヒド法
、中板法（多糖類を含有する標識物質において１、該多
糖類を酸化し、次いで抗体、抗原、ハプテン等のアミノ
基とシッフ塩基を形成する方法）、マレイミド法、混合
酸無水物法、カルボジイミド法等を用いて行なうことが
できる。

また、被検物質と免疫化学的に反応する物質としては、
被検物質が抗原又はハプテンである場合にはその抗体（
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）、被検物
質が抗体の場合にはその抗原等が例示され、これらは慣
用の方法にて得ることができる。

〔具体例〕

次に、本発明の測定方法の具体例を、固相に固定化され
る物質としてアビジンを用い、アビジンと結合性を有す
る物質としてイミノビオチンを用いた例である添付図面
に基づいて説明する。

第１図は、本発明の方法を用いて被検物質としての抗原
Ａを測定する方法を模式的に示した概略工程図である。

同図において、Ｂ１は抗原Ａに対する抗体、Ｂ２はＢ１
と抗原認識部位を異にする抗原Ａの抗体、Ｃはイミノビ
オチン、Ｄは標識物質、Ｅはアビジン、Ｆはビオチン及
びＧは標識物質検出剤を示す。また（１）は被検物質と
しての抗原Ａ、（２）は抗体Ｂ１とイミノビオチンＣと
が結合した化合物、（３）は抗体Ｂ２と標識物質りとが
結合した化合物を示す。同図に示される方法の概略は以
下のとおりである。まず、？＃１定対象である抗原Ａを
含有する試料に、予め調製された化合物■及び（３）を
所定量添加する（（ａｌ工程）。その結果、試料中には
抗原Ａに化合物■及び（３）が結合した結合体（４）が
生成するとともに未反応の化合物（２）及び（３）が存
在する。この試料を、アビジンＥが結合した固相（５）
に添加すると、該固相（５）のアビジンＥには試料中の
上記生成結合体（４）及び化合物（２）がイミノビオチ
ンＣ部分を介して結合するとともに、未反応物である化
合物（３）が物理化学的な吸着により結合し、固相（６
）が生成する（（ｂ）工程）。次いで、このようにして
生成した固相（６）を緩衝液等で洗浄して夾雑物等を除
去した後、アビジン−イミノビオチン間の結合を切断す
る脱離剤（７）（この場合にあっては、イミノビオチン
Ｃより固相上のアビジンＥと強い結合を形成するビオチ
ンＦ）を加えてアビジン−イミノビオチン間の結合を切
断し、次いでアビジン−ビオチン間の結合が形成された
固相（９）と液相とを分離する（（Ｃ］ｌ工程。分離さ
れた液相には、標識物質検出剤（８）を添加し、標識物
質りと結合させることにより発色、螢光発生等に基づき
測定可能な状態である結合体００）が生成する（曲工程
）。この結合体００）を測定することにより試料中の抗
原Ａの量が測定される。すなわち、試料中の抗原Ａ量が
多いと上記結合体００）の生成量も多くなる。従って、
抗原Ａ量と結合体００）量との検量線をあらかじめ作成
し、測定された結合体００）量と検量線とを比較するこ
とにより試料中の抗原量を求めることができる。

なお、上記方法において、固相（６）上に吸着により結
合した化合物（３）は脱離剤■の影響を受けず固相上に
結合したまま残置するので、測定系である液相には化合
物（３）が実質的に存在しない。従って、液相には測定
可能な物質としては結合体００）のみが実質的に存在し
、化合物（３）に起因するパックグラランドの上昇等の
妨害が防止でき、感度の上昇が図れる。

第２図は試料中の被検物質であるハブテンＡ−を本発明
の方法により測定する場合の概略工程図を示し、第１図
の素材と同一の素材は同一の符号及び番号を付す。同図
中、ＢはハブテンＡ′に対する抗体、（１２）はハブテ
ンＡ′とイミノビオチンＣとが結合した化合物及び（１
３）は抗体Ｂと標識物質りとが結合した化合物を示す。

上記の例においては、まず、ハブテンＡ″を含有する試
料に、所定量の化合物（１２）と化合物（１３）とを添
加する。その結果、試料中にはハブテンＡ′と化合物（
１３）が結合した結合体（１４）及び化合物（１２）と
化合物（１３）が結合した結合体（１５）が生成し、さ
らに未反応物である化合物（１３）が存在する（（ａ）
工程）。この試料を、アビジンＥが結合した固相（５）
に添加すると、該固相（５）上のアビジンＥには上記結
合体（１５）がイミノビオチンＣを介して結合するとと
もに未反応物である化合物（１３）が物理化学的な吸着
により結合し、固相（１６）が生成する（山）工程）。

次いで、このようにして生成した固相（１６）を緩衝液
等で洗浄し、夾雑物を除去した後、第１図に示される方
法と同様にして、脱離剤（７）によりアビジン−イミノ
ビオチン間の結合を切断し、固相（１７）と液相に分離
する（（Ｃ）工程）。分離された液相には、標識物質検
出剤（８）を添加し、該標識物質検出剤が結合した結合
体く１８）を測定する（曲工程）。上記方法においては
、試料中のハブテンＡ″と化合物（１２）は競合的に化
合物（１３）と結合するので、一定量の化合物（１２）
を用いた場合、試料中のハブテン量が多いと生成結合体
く１８）量が少なくなり、また逆に試料中のハブテン量
が少ないと生成結合体（１８）ｆＥｔが多くなる。従っ
て、ハブテンＡ′量と結合体く１８）の生成量との検量
線をあらかじめ作成し、測定された結合体（１８）量と
検量線とを比較することにより試料中のハブテン量を求
めることができる。

上記の例においても、固相上に結合した化合物（１３）
は脱離剤（７）による影響を受けず固相上に結合したま
まであるので、化合物（１３）による妨害を排除するこ
とができる。

第３図は、本発明の方法を用いて、試料中の被検物質で
あるハブテンＡ′を測定する他の例を示す概略工程図で
あり、第１図及び第２図の素材と同一の素材には同一の
符号及び番号を付した。同図において、（１９）はハブ
テンＡ′に対する抗体ＢとイミノビオチンＣとが結合し
た化合物及び（２１）はハブテンＡ′と標識物質りとが
結合した化合物を示す。上記の例においては、まずハブ
テンＡ゛を含有する試料に所定量の化合物（１９）を添
加する。

その結果、試料中にはハブテンＡ′と化合物（１９）が
結合した結合体（２０）が生成し、さらに未反応物であ
る化合物（１９）が存在する（（ａｔ工程）。この試料
液を、アビジンＥが結合した固相（５）に添加すると、
該固相（５）上のアビジンＥには上記結合体（２０）及
び未反応物である化合物（１９）がイミノビオチンＣを
介して結合する。次いで、ハブテンＡ′と標識物質りと
が結合した化合物（２１）を添加すると、該化合物（２
１）はハブテンＡ゛を介して固相上の遊離の抗体Ｂとの
み結合するとともに化合物（２１）が物理化学的な吸着
により固相上に結合し、固相（２２）が生成する（（ｂ
）工程）。このようにして生成した固相（２２）を緩衝
液等で洗浄し、夾雑物を除去した後、第１図に示される
方法と同様にして、脱離剤（７）によりアビジン−イミ
ノビオチン間の結合を切断し固相（２３）と液相に分離
する（（Ｃ）工程）。

分離された液相には、標識物質検出剤（８）を添加し、
該標識物質検出剤が結合した結合体（２４）を測定する
（（ｄ）工程）。上記方法においては、結合体（２０）
と化合物（１９）は競合的に固相（５）上のアビジンＥ
と結合し、また標識物質りを含有する化合物（２１）は
固相（５）上の遊離の抗体Ｂとのみ結合するので、−定
量の化合物（１９）を用いた場合、試料中のハブテンＡ
′量が多いと生成結合体（２４）量が少なくなり、また
逆に試料中のハブテンＡ′量が少ないと生成結合体（２
４）量が多くなる。従って、ハブテンへ゛量と結合体（
２４）の生成量との検量線をあらかじめ作成し、ｎ１定
された結合体（２４）量と検量線とを比較することによ
り試料中のハブテン量を求めることができる。

上記の例においても、固相上に結合した化合物（２１）
は脱離剤（７）による影響を受けず固相上に結合したま
まであるので、化合物（２１）による妨害を排除するこ
とができる。

第４図は、本発明の方法を用いて、試料中の被検物質で
あるハブテンＡ゛を測定する他の例を示す概略工程図で
あり、第１図、第２図及び第３図の素材と同一の素材に
は同一の符号及び番号を付した。上記の例においては、
まず、ノーブテンＡ′を含有する試料中に所定量の化合
物（２１）を添加し、さらに化合物（１９）を添加する
。その結果、試料中にはハブテンＡ′と化合物（１９）
が結合した結合体（２０）及び化合物（１９）と化合物
（２１）とが結合した結合体（２５）が生成し、さらに
未反応物である化合物（１９）が存在する（（ａｌ工程
）。この試料液を、アビジンＥが結合した固相（５）に
添加すると、該固Ｆ目（５）上のアビジンＥには上記結
合体（２０）及び（２５）並びに未反応物である化合物
（１９）がイミノビオチンＣを介して結合し、固相（２
Ｂ）が生成する（山）工程）。

このようにして生成した固相（２Ｂ）を緩衝液等で洗浄
し、夾雑物を除去した後、第１図に示される方法と同様
にして、脱離剤（ハによりアビジン−イミノビオチン間
の結合を切断し、固相（２７）と液相に分離する（（Ｃ
］工程）。分離された液相には、標識物質検出剤（８）
を添加し、該標識物質検出剤が結合した結合体（２８）
を測定する（（ｄ）工程）。上記方法においては、試料
中のハブテンＡ′と化合物（２１）は競合的に化合物（
１９）と結合するので、一定量の化合物（２１）を用い
た場合、試料中のノ１ブテン量が多いと生成結合体（２
８）量が少なくなり、また逆に試料中のハブテン量が少
ないと生成結合体（２８）量が多くなる。従って、ハブ
テン量と結合体く２８）の生成量との検量線をあらかじ
め作成し、測定された結合体（２４）ｆｆｉと検量線と
を比較することにより試料中のハブテン量を求めること
ができる。

第５図は、本発明の方法を用いて、試料中の被検物質で
ある抗体Ｂ′を測定する例を示す概略工程図であり、第
１図の素材と同じ素材には同一の符号及び番号を付した
。同図において、Ａ１は抗体Ｂ″に対する抗原及びＨは
抗体Ｂ′に対する第２抗体を示し、また（３０）は抗原
Ａ１とイミノビオチンＣとが結合した化合物及び（３４
）は第２抗体Ｈと標識物質りとが結合した化合物を示す
。上記の例においては、まず、抗体Ｂ゛を含有する試料
中に所定量の化合物（３０）を添加する。その結果、試
料中には、抗体が２価基であることから、抗体Ｂ′と２
分子の化合物（３０）が結合した結合体（３１）及び１
分子の化合物（３０）が結合した結合体（３２）が生成
し、さらに未反応物である化合物（３０）が存在する（
（ａｔｌ工程。この試料を、アビジンＥが結合した固相
（５）に添加すると、該固相（５）上のアビジンＥには
上記結合体（３１）及び（３２）並びに未反応物である
化合物（３０）がイミノビオチンＣを介して結合し、固
相（３３）が生成する（山）工程）。次いで、固相（３
３）に、第２抗体Ｈと標識物質りとが結合した化合物（
３４）を添加すると、該化合物（３４）は、固相上の抗
体Ｂ″と結合し、固相（３５）が生成する（（Ｃ）工程
）。このようにして生成した固相（３５）を緩衝液等で
洗浄し、夾雑物を除去した後、第１図に示される方法と
同様にして、脱離剤（７）によりアビジン−イミノビオ
チン間の結合を切断し、固相（３６）と液相に分離する
（（Ｃ）工程）。分離された液相には、標識物質検出剤
（８）を添加し、該標識物質検出剤が結合した結合体（
３７）及び（３８）を測定する（（ｄ）工程）。上記方
法においては、試料中の抗体Ｂ′量が多いと生成する結
合体（３７）及び（３８）ｆｆｉも多くなる。従って、
抗体Ｂ′量と結合体（３７）及び（３８）の生成量との
検量線をあらかじめ作成し、測定された結合体（３７）
及び（３８）量と検量線とを比較することにより試料中
の抗体量を求めることができる。

上記の例においても、固゛相上に結合した化合物（３４
）は脱離剤（７）による影響を受けず固相上に結合した
ままであるので、化合物（３４）による妨害を排除する
ことができる。

なお、本発明の方法は上記の例に限定されるものではな
く、例えば、上記例で固相上に結合されているアビジン
をイミノビオチンとし、抗原等と結合しているイミノビ
オチンをアビジンとしたものでもよく、また使用されて
いる一対の非共有性結合物質を前記のようににｐＨ変化
により解離するような物質等としてもよく、さらに標識
物質検出剤の種類によっては、脱離剤と併用し、脱離工
程と同時に作用させてもよい。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明する
。

実施例１（１）酵素標識抗体の調製人アルファフェトプロティン（ＡＦＰ）に対する公知の
モノクローナル抗体を公知の方法でペプシン分解し、Ｐ
（ａｂ’）ｚ画分を得た。これを１０ｍＭメルカプトメ
チルアミンの存在下で還元処理し、あらかじめ調製して
おいたマレイミド化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ）と混合することにより酵素標識抗体であるＰＯ
Ｄ標識抗ＡＦＰ抗体を調製した。

（２）イミノビオチン標識抗体の調製イミノビオチンとスクシニイミドを結合させスクシニイ
ミドイミノビオチンを作製し、これと上記（１）で使用
したモノクローナル抗体と抗原認識部位を異にする抗Ａ
ＦＰ抗体とを水溶液中で混合した後、１〜３時間反応さ
せ未反応のスクシニイミドイミノビオチンを除き、イミ
ノビオチン標識抗体であるイミノビオチン化洗ＡＦＰ抗
体を調製した。

（３）アビジン固定化固相の調製ブロムシアン活性化アガロールゲルに公知の方法でアビ
ジンを固定化してアビジン固定化固相を調製した。この
ときゲル１１！あたりアビジン量は２〜Ｌｏｎｇが適当
であった。

（４）　Ａ　Ｆ　Ｐの測定ＡＦＰの濃度が、１０００．５００．２５０．１２５．
６２．５゜３１．３及び１５．８　（ｎｇ／　ｙｉｌ　
）である試料液各２０μｇに、上記のイミノビオチン化
洗ＡＦＰ抗体１００μｇを加え、さらにＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ抗体１００μｇを加えて５分間反応させる。次いで
アビジン固定化固相と混和して４分間反応させたあと、
０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍホウ酸ナナトリ
ウム緩衝液ｐＨ８５を用いてよく洗浄する。

次に２０ｍＭビオチンを含む前記緩衝液からなる脱離剤
液０．５１１で２回脱離操作し、固相から分離し、その
溶液のＰＯＤ活性をＩＩ定した。

ＰＯＤ活性は、１８　ｍ　Ｍ　ｏ−フェニレンジアミン
と６ｍＭ過酸化水素を含む溶液からなる基質液１１！を
加え１５分間反応させ、そのあと２Ｎ硫酸１１！を加え
て反応を停止させる。そして波長４９２ｎ１こおける吸
光度を測定することにより行なった。

この結果を第６図に示す。同図に示されるように、ＡＦ
Ｐ！１度２５０　ｎｇ／　１１まで直線の検量線が得ら
れた。そしてＡＦＰ濃度ＬＯＯＯｎｇ／　１１までは漸
次吸光度の上昇が認められ、いわゆるプロゾーン現象は
みられなかった。またＡＦＰ濃度１２５　ｎｇ／　ＩＩ
における吸光度は０．６以上あり、従来のＥＩＡに比べ
て高感度で測定できることがわかる。

また測定時間に関しても、上記の測定は２４分間で行う
ことができるが、通常のＥＩＡ法でのＡＦＰの測定は２
〜３時間かかることから、本発明の方法は短時間で感度
よ＜　Ｕｌ定できることが証される。

比較例本発明の方法の効果を明らかにするため、上記の本発明
の脱離工程を含む方法と、対照として脱離しないでアビ
ジン固定化固相に吸着させたままでＰＯＤ活性を測定し
たものとを比較した。その結果を第１表に示す。同表に
おいて、Ｓ／Ｎ比は各吸光度をＡＦＰｇ度が０のときの
吸光度で除した値で、この数字が大きい程バックグラウ
ンドの上昇がなく測定できることを示すものである。

第１表から明らかなように、本発明の方法は脱離工程を
含むことによりＳ／Ｎ比を高くとることのできる測定法
であることがわかる。

第１表〔発明の効果〕以上のように、本発明の測定方法によれば、固相」二に
形成された一対の非共有性結合物質間の結合を解くこと
により、試料中の被検物質量の指標となり得且つ標識物
質を含有する物質を固相より脱離させて」ｊ定するので
、固相に非特異的に吸着結合した当該免疫化学反応に関
与しなかった標識物質等は固相上に残存し、その影響を
排除することができる。従って、固相上に吸着した物質
に起因するバックグラウンドの上昇が除かれ、標識抗原
や標識抗体の濃度を上げても何ら支障なく短時間でのδ
Ｐ１定と感度の上昇が可能になるという特有の効果を奏
する。

【図面の簡単な説明】

第１図から第５図は、それぞれ本発明の方法の具体例を
示す概略工程図、第６図は、実施例１におけるＡ　Ｆ　Ｐ　濃度と吸光度
との関係を示す図である。Ａ・・・・・・・・・被検物質である抗原Ａ゛・・・・
・・被検物質であるハブテンＢ゛・・・・・・被検物質
である抗体Ｃ・・・・・・・・・イミノビオチンＥ・・・・・・・・・アビジンＧ・・・・・・・・・標識物質検出剤

Claims

【特許請求の範囲】

１、試料中の物質を測定するために固相及び標識物質を
用いる免疫化学的測定法において、一対の非共有性結合
物質の一方が固定化された固相を用い、当該固相上の物
質に上記一対の非共有性結合物質の他方を含有する物質
を介して、試料中の被検物質量の指標となり得且つ標識
物質を含有する物質を結合させ、次いで固相上に形成さ
れた前記非共有性結合物質間の結合を解き、少なくとも
試料中の被検物質量の指標となり得且つ標識物質を含有
する物質を固相から脱離させ、当該物質を測定すること
を特徴とする試料中の物質の測定方法。