JPH0317302B2 - - Google Patents
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- JPH0317302B2 JPH0317302B2 JP14922084A JP14922084A JPH0317302B2 JP H0317302 B2 JPH0317302 B2 JP H0317302B2 JP 14922084 A JP14922084 A JP 14922084A JP 14922084 A JP14922084 A JP 14922084A JP H0317302 B2 JPH0317302 B2 JP H0317302B2
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- antibody
- polymer
- antigen
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、例えば血清、尿などに含まれる抗
原、すなわち薬物あるいは各種疾患に由来する微
量成分などを酵素免疫測定法により測定する方法
に関するものである。
原、すなわち薬物あるいは各種疾患に由来する微
量成分などを酵素免疫測定法により測定する方法
に関するものである。
（従来の技術）
酵素免疫測定法には種々の方法が知られてお
り、そのひとつに測定対象と同じ抗原に酵素基質
を結合させ、これに抗体及びこの結合を分解する
酵素を反応させて分解物を測定することによつて
抗原の量を求める方法が知られている。
り、そのひとつに測定対象と同じ抗原に酵素基質
を結合させ、これに抗体及びこの結合を分解する
酵素を反応させて分解物を測定することによつて
抗原の量を求める方法が知られている。
（発明が解決しようとする問題点）
この方法には、分解物の量が少ないため感度が
低いという問題点があつた。
低いという問題点があつた。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、酵素１−抗原（抗体）複合物
（コンジユゲート）の酵素１により、基質複合体
より、酵素１に対する基質を遊離せしめ同時に遊
離する重合体基質を酵素２により単量体とし、こ
れを分析することにより抗原（抗体）を感度に測
定出来ることを見出し、この知見に基いて本発明
を完成するに至つた。
（コンジユゲート）の酵素１により、基質複合体
より、酵素１に対する基質を遊離せしめ同時に遊
離する重合体基質を酵素２により単量体とし、こ
れを分析することにより抗原（抗体）を感度に測
定出来ることを見出し、この知見に基いて本発明
を完成するに至つた。
すなわち、本発明は測定対象の抗原又は抗体を
該抗原又は抗体に対する抗体の不溶化物と反応せ
しめ、この抗体の不溶化物に測定対象の抗原又は
抗体と共通の抗原決定基を有する物質と酵素１と
の結合物を反応せしめ、該抗体不溶化物と酵素２
を酵素１によつて切断される部分と酵素２によつ
て末端から切断される重合体部分を有している基
質複合体に作用せしめ、この重合体を末端から切
断する酵素による該重合体の分解物を測定するこ
とを特徴とする抗原又は抗体の測定方法に関する
ものである。
該抗原又は抗体に対する抗体の不溶化物と反応せ
しめ、この抗体の不溶化物に測定対象の抗原又は
抗体と共通の抗原決定基を有する物質と酵素１と
の結合物を反応せしめ、該抗体不溶化物と酵素２
を酵素１によつて切断される部分と酵素２によつ
て末端から切断される重合体部分を有している基
質複合体に作用せしめ、この重合体を末端から切
断する酵素による該重合体の分解物を測定するこ
とを特徴とする抗原又は抗体の測定方法に関する
ものである。
測定対象の抗原及び抗体は特に制限されるもの
ではなく、例えばジゴキシン、テオフイリン、フ
エニトイン、アミカシン等の薬物、プロスタグラ
ンジン、テストステロン、サイロキシン、インシ
ユリン、TSH、サイログロブリン等のホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB等のウイルス抗原、その抗
体、α−フエトプロテイン、その抗体、癌胎児性
抗原などである。
ではなく、例えばジゴキシン、テオフイリン、フ
エニトイン、アミカシン等の薬物、プロスタグラ
ンジン、テストステロン、サイロキシン、インシ
ユリン、TSH、サイログロブリン等のホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB等のウイルス抗原、その抗
体、α−フエトプロテイン、その抗体、癌胎児性
抗原などである。
後述する酵素１と結合させる物質（以下、リガ
ンドという。）は測定対象の抗原又は抗体と共通
の抗原決定基を有するものである。抗原決定基は
少なくともひとつが共通であればよく、全てが共
通であつてもよい。従つて、リガンドは測定対象
の抗原又は抗体と同一であつてもよい。
ンドという。）は測定対象の抗原又は抗体と共通
の抗原決定基を有するものである。抗原決定基は
少なくともひとつが共通であればよく、全てが共
通であつてもよい。従つて、リガンドは測定対象
の抗原又は抗体と同一であつてもよい。
酵素１は基質複合体の重合体部分を酵素２が作
用しうるように切り離すものであり、例えばエス
テラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、スルフアタ
ーゼなどである。
用しうるように切り離すものであり、例えばエス
テラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、スルフアタ
ーゼなどである。
リガンドと酵素１との結合方法は双方の官能基
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakano法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。などである。
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakano法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。などである。
共通の抗原決定基と反応する抗体は公知の方法
に準じて製造することができる。すなわち、抗原
リガンド又はこれらと蛋白の結合物を兎、山羊、
馬、モルモツト、ニワトリなどの温血動物に体重
１Kgあたり0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツ
トパツド、大腿筋等にアジユバントとともに注射
して当該動物の体内に形成させる。この抗体は血
清をそのまま用いてもよく、血清から抗体すなわ
ち免疫グロブリンを採取する公知の方法によつて
精製してから用いてもよい。
に準じて製造することができる。すなわち、抗原
リガンド又はこれらと蛋白の結合物を兎、山羊、
馬、モルモツト、ニワトリなどの温血動物に体重
１Kgあたり0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツ
トパツド、大腿筋等にアジユバントとともに注射
して当該動物の体内に形成させる。この抗体は血
清をそのまま用いてもよく、血清から抗体すなわ
ち免疫グロブリンを採取する公知の方法によつて
精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
この抗体にはＦ（ab′）2、Fab′、Fabなどのフラ
グメントも含まれる。
グメントも含まれる。
この抗体はビーズなどに固定化してから使用す
る。固定化方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。
る。固定化方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。
測定対象の抗原又は抗体をまず上記の抗体の不
溶化物と反応させ、次に、この抗体の不溶化物に
前記の結合物を反応させる。これらの抗原抗体反
応をさせる溶液のPH及び温度は要は反応しやすい
条件に保てばよく通常PH4.5〜10.5で20〜45℃程
度にあればよい。反応時間は通常は充分に抗原抗
体反応する程度がよく、60〜120分間程度でよい。
溶化物と反応させ、次に、この抗体の不溶化物に
前記の結合物を反応させる。これらの抗原抗体反
応をさせる溶液のPH及び温度は要は反応しやすい
条件に保てばよく通常PH4.5〜10.5で20〜45℃程
度にあればよい。反応時間は通常は充分に抗原抗
体反応する程度がよく、60〜120分間程度でよい。
酵素２は後述する重合体を末端から切断するも
のであり、重合体に応じて異なる。酵素２の例と
してはカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペ
プチダーゼＢ、グルコアミラーゼ、ポリエチレン
グリコールオキシダーゼ、Exo−Poly
Phosphatase、エキソ−１，３−β−Ｄ−キシロ
シダーゼ、エキソ−１，４−β−Ｄ−グルコシダ
ーゼ、エキソ−１，６−α−Ｄ−グルコシダー
ゼ、エキソ−ポリガラクチユロナーゼ、エキソ−
１，２−１，３−α−Ｄ−マンノシダーゼ、エキ
ソ−β−Ｄ−フルクトシダーゼ、エキソ−ポリ−
α−Ｄ−ガラクチユロノシダーゼ、エキソ−１，
３−α−グルカナーゼ、エキソ−セロビオハイド
ロラーゼ、エキソ−β−Ｎ−アセチルムラシダー
ゼ、エキソ−イソマルトハイドロラーゼ、エキソ
−イソマルトトリオハイドロラーゼ、エキソ−マ
ルトヘキサハイドロラーゼ、エキソリボヌクレア
ーゼ、エキソリボヌクレアーゼＨ、エキソ−デ
オキシリボヌクレアーゼなどを挙げることがで
きる。
のであり、重合体に応じて異なる。酵素２の例と
してはカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペ
プチダーゼＢ、グルコアミラーゼ、ポリエチレン
グリコールオキシダーゼ、Exo−Poly
Phosphatase、エキソ−１，３−β−Ｄ−キシロ
シダーゼ、エキソ−１，４−β−Ｄ−グルコシダ
ーゼ、エキソ−１，６−α−Ｄ−グルコシダー
ゼ、エキソ−ポリガラクチユロナーゼ、エキソ−
１，２−１，３−α−Ｄ−マンノシダーゼ、エキ
ソ−β−Ｄ−フルクトシダーゼ、エキソ−ポリ−
α−Ｄ−ガラクチユロノシダーゼ、エキソ−１，
３−α−グルカナーゼ、エキソ−セロビオハイド
ロラーゼ、エキソ−β−Ｎ−アセチルムラシダー
ゼ、エキソ−イソマルトハイドロラーゼ、エキソ
−イソマルトトリオハイドロラーゼ、エキソ−マ
ルトヘキサハイドロラーゼ、エキソリボヌクレア
ーゼ、エキソリボヌクレアーゼＨ、エキソ−デ
オキシリボヌクレアーゼなどを挙げることがで
きる。
基質複合体は酵素２によつて切断される結合に
よつて連結された重合体が酵素１によつて切断さ
れる結合によつて連結されているものである。
よつて連結された重合体が酵素１によつて切断さ
れる結合によつて連結されているものである。
重合体はアミノ酸、糖、エチレンオキサイド、
ビニルアルコール、リン酸、ヌクレオチドなどの
重合体であり、例えばＬ−チロシン重合体、Ｌ−
トリプトフアン重合体、Ｌ−フエニルアラニン重
合体、Ｌ−リジン重合体、グルコースのα−１，
４結合重合体、β−ガラクトシド重合体、デキス
トラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルア
ルコール、ポリリン酸、ポリヌクレオチドなどで
ある。重合度は２以上であり特に制限されない
が、通常５〜5000分子程度が重合されたものが好
ましい。
ビニルアルコール、リン酸、ヌクレオチドなどの
重合体であり、例えばＬ−チロシン重合体、Ｌ−
トリプトフアン重合体、Ｌ−フエニルアラニン重
合体、Ｌ−リジン重合体、グルコースのα−１，
４結合重合体、β−ガラクトシド重合体、デキス
トラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルア
ルコール、ポリリン酸、ポリヌクレオチドなどで
ある。重合度は２以上であり特に制限されない
が、通常５〜5000分子程度が重合されたものが好
ましい。
この重合体は酵素１によつて切断される結合に
よつて連結される必要があり、従つて結合対象は
酵素１の種類によつて異なる。結合対象の例とし
ては脂肪酸、リン酸、硫酸、糖などを挙げること
ができる。
よつて連結される必要があり、従つて結合対象は
酵素１の種類によつて異なる。結合対象の例とし
ては脂肪酸、リン酸、硫酸、糖などを挙げること
ができる。
重合体を結合対象に結合させる方法は結合の種
類に応じ公知の方法から適宜選択すればよい。
類に応じ公知の方法から適宜選択すればよい。
基質複合体の例としては、１−ホスホペンタオ
ース、ジアシルポリエチレングリコール、Ｌ−フ
エニルアラニル−Ｌ−ポリリジン、Ｌ−アルギニ
ル−ポリ−Ｌ−フエニルアラニン、１−アシルポ
リサツカライド、ジホスホポリエチレングリコー
ル、ジスルホポリエチレングリコール、DNA、
オリゴデオキシリボヌクレオチド、デキストラ
ン、ポリ１−４−α−Ｄ−ガラクチユロニド、
１，３−β−Ｄ−キシラン、カルボキシメチルセ
ルロース、マンナン、フラクタン、ペクチン酸、
２，３−α−Ｄ−グルカンなどを挙げることがで
きる。
ース、ジアシルポリエチレングリコール、Ｌ−フ
エニルアラニル−Ｌ−ポリリジン、Ｌ−アルギニ
ル−ポリ−Ｌ−フエニルアラニン、１−アシルポ
リサツカライド、ジホスホポリエチレングリコー
ル、ジスルホポリエチレングリコール、DNA、
オリゴデオキシリボヌクレオチド、デキストラ
ン、ポリ１−４−α−Ｄ−ガラクチユロニド、
１，３−β−Ｄ−キシラン、カルボキシメチルセ
ルロース、マンナン、フラクタン、ペクチン酸、
２，３−α−Ｄ−グルカンなどを挙げることがで
きる。
結合物と酵素２を基質複合体に接触させる順序
は問うところではなく、いずれが先であつてもあ
るいは同時であつてもよい。また、さらにこれら
は測定対象の抗原又は抗体とリガンドと酵素１の
結合物を抗体に加える際に一緒に加えてもよい。
反応を速やかに行なわせるために酵素２はなるべ
く多く加えることが好ましい。各酵素反応は酵素
の作用しやすい条件下で行なわせることが好まし
いことはいうまでもなく、従つて各酵素に応じて
適当な温度、PH等が設定される。
は問うところではなく、いずれが先であつてもあ
るいは同時であつてもよい。また、さらにこれら
は測定対象の抗原又は抗体とリガンドと酵素１の
結合物を抗体に加える際に一緒に加えてもよい。
反応を速やかに行なわせるために酵素２はなるべ
く多く加えることが好ましい。各酵素反応は酵素
の作用しやすい条件下で行なわせることが好まし
いことはいうまでもなく、従つて各酵素に応じて
適当な温度、PH等が設定される。
分解物の測定方法は重合体の種類に応じて適当
な方法が選択され、例えばアミノ酸の場合には、
ニンヒドリンを用いて比色定量する方法アミノ酸
オキシダーゼで酸化して生成するH2O2を酵素法
あるいは化学的方法により比色定量あるいは螢光
分析法で定量する方法などで定量することができ
る。このほか、チロシンが遊離する場合にはチロ
シナーゼを用いて共役酵素系で測定することもで
きる。
な方法が選択され、例えばアミノ酸の場合には、
ニンヒドリンを用いて比色定量する方法アミノ酸
オキシダーゼで酸化して生成するH2O2を酵素法
あるいは化学的方法により比色定量あるいは螢光
分析法で定量する方法などで定量することができ
る。このほか、チロシンが遊離する場合にはチロ
シナーゼを用いて共役酵素系で測定することもで
きる。
重合体が糖の場合には、例えば分解生成物がグ
ルコースであればグルコースオキシダーゼを作用
させ、生成するH2O2を化学発光させてもよくあ
るいはフエノール、パーオキシダーゼ及び４−ア
ミノアンチピリンを使用して酸化縮合させ生成す
るキノンイミン色素を比色定量してもよい。その
ほか、O2電極で測定することもできる。
ルコースであればグルコースオキシダーゼを作用
させ、生成するH2O2を化学発光させてもよくあ
るいはフエノール、パーオキシダーゼ及び４−ア
ミノアンチピリンを使用して酸化縮合させ生成す
るキノンイミン色素を比色定量してもよい。その
ほか、O2電極で測定することもできる。
重合体がポリエチレングリコールの場合には、
ポリエチレングリコールオキシダーゼを作用させ
て２，５−ジクロロフエノールインドフエノール
を還元させ、これにより色素の退色を比色定量す
ればよい。
ポリエチレングリコールオキシダーゼを作用させ
て２，５−ジクロロフエノールインドフエノール
を還元させ、これにより色素の退色を比色定量す
ればよい。
ポリリン酸、ポリヌクレオチドの場合ポリリン
酸の場合は、エキソポリホスホリラーゼにより末
端から加水分解し、遊離する無機リンにプリンヌ
クレオチドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダ
ーゼを順次作用させ、生成するH2O2をパーオキ
シダーゼ４−アミノアンチピリン−フエノールに
より定量すればよい。ポリヌクレオチドの場合
は、エキソリボヌクレアーゼを作用させ、生成す
るモノヌクレオチドにホスフアターゼを作用さ
せ、遊離する無機リンを前記と同様の操作により
定量すればよい。
酸の場合は、エキソポリホスホリラーゼにより末
端から加水分解し、遊離する無機リンにプリンヌ
クレオチドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダ
ーゼを順次作用させ、生成するH2O2をパーオキ
シダーゼ４−アミノアンチピリン−フエノールに
より定量すればよい。ポリヌクレオチドの場合
は、エキソリボヌクレアーゼを作用させ、生成す
るモノヌクレオチドにホスフアターゼを作用さ
せ、遊離する無機リンを前記と同様の操作により
定量すればよい。
（作用）
本発明の方法は原理的にみて従来より行なわれ
ている競合法と同様であるが、相違は、従来法で
はコンジユゲートの酵素により遊離する基質をそ
のまま定量しているのに比べ、本法は複合体基質
を用いることによりこの複合体基質より遊離（コ
ンジユゲートの酵素１の作用により分解、遊離す
る）する重合体基質を酵素２によつて単量体化さ
せ増幅された酵素１の活性を知ることにより抗原
（抗体）を定量するものである。
ている競合法と同様であるが、相違は、従来法で
はコンジユゲートの酵素により遊離する基質をそ
のまま定量しているのに比べ、本法は複合体基質
を用いることによりこの複合体基質より遊離（コ
ンジユゲートの酵素１の作用により分解、遊離す
る）する重合体基質を酵素２によつて単量体化さ
せ増幅された酵素１の活性を知ることにより抗原
（抗体）を定量するものである。
（発明の効果）
本発明の方法においては１分子の結合物から複
数のシグナル物質を生成することから抗原を高感
度で測定できる。また、反応に必要な試薬類は一
時に投入できることから操作も簡単であり、臨床
分析法としてもすぐれている。
数のシグナル物質を生成することから抗原を高感
度で測定できる。また、反応に必要な試薬類は一
時に投入できることから操作も簡単であり、臨床
分析法としてもすぐれている。
（実施例）
CHM化リパーゼの調製
クモノスカビ由来リパーゼ１mgを100mMリ
ン酸緩衝液PH6.3 １mlに溶かし、これに４−
（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カル
ボン酸）サクシンイミドエステル（CHMS）
２mg／mlのジメチルホルムアミド（DMF）溶
液100μを加えて室温で１時間放置して反応
させた。この反応液をセフアデツクスＧ−25の
カラムに入れ、PH6.3の100ｍＭリン酸緩衝液を
流してゲル過を行ない、素通り分画を分取し
た。
ン酸緩衝液PH6.3 １mlに溶かし、これに４−
（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カル
ボン酸）サクシンイミドエステル（CHMS）
２mg／mlのジメチルホルムアミド（DMF）溶
液100μを加えて室温で１時間放置して反応
させた。この反応液をセフアデツクスＧ−25の
カラムに入れ、PH6.3の100ｍＭリン酸緩衝液を
流してゲル過を行ない、素通り分画を分取し
た。
SH化ヒトα−フエトプロテインの調製
ヒトα−フエトプロテイン５mgを5mM
EDTAを含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶か
し、これにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無
水物９mg／mlのDMF溶液100μを加えて37℃
で１時間反応させた。この反応液に1M−ヒド
ロキシルアミン水溶液（PH7.5）110μを加え、
37℃でさらに30分間加温した。続いて、セフア
デツクスＧ−25を用いてゲル過し、素通り分
画を分取した。
EDTAを含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶か
し、これにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無
水物９mg／mlのDMF溶液100μを加えて37℃
で１時間反応させた。この反応液に1M−ヒド
ロキシルアミン水溶液（PH7.5）110μを加え、
37℃でさらに30分間加温した。続いて、セフア
デツクスＧ−25を用いてゲル過し、素通り分
画を分取した。
リパーゼ−ヒトα−フエトプロテイン結合物
の調製 前記のCHM化リパーゼ溶液とSH化α−フ
エトプロテイン溶液を混合し、１mlまで濃縮
し、４℃で一夜放置して反応させた。反応液を
セフアアクリルＳ−300を充填したカラムに入
れ、PH7.0の20mMリン酸緩衝液を流してゲル
過を行ない、１：３に結合した結合物の分画
を分取した。
の調製 前記のCHM化リパーゼ溶液とSH化α−フ
エトプロテイン溶液を混合し、１mlまで濃縮
し、４℃で一夜放置して反応させた。反応液を
セフアアクリルＳ−300を充填したカラムに入
れ、PH7.0の20mMリン酸緩衝液を流してゲル
過を行ない、１：３に結合した結合物の分画
を分取した。
ヒトα−フエトプロテインの測定
１％ウシ血清アルブミンを含むトリス塩酸緩
衝液（液）を、試験管に400μ分注し、こ
れに検体10μを加え、混和した。これに抗体
不溶化ビーズ（酵素免疫測定法、医学書院、第
２版、p385）を１個加え、十分混和した後、
37℃で１時間反応させた。反応後、液をアス
ピレーターで取り除きさらに生理食塩水２mlを
加え洗浄した。この操作を３回行ない、で調
製した酵素標識したヒトα−フエトプロテイン
（100倍希釈）トリス−塩酸緩衝液PH7.5 300μ
加え十分混和した後37℃で１時間加温し反応さ
せた。反応終了後アスピレーターで反応液を吸
入して除去した。さらに、生理食塩水２mlを加
え洗浄する操作を３回くり返した。
衝液（液）を、試験管に400μ分注し、こ
れに検体10μを加え、混和した。これに抗体
不溶化ビーズ（酵素免疫測定法、医学書院、第
２版、p385）を１個加え、十分混和した後、
37℃で１時間反応させた。反応後、液をアス
ピレーターで取り除きさらに生理食塩水２mlを
加え洗浄した。この操作を３回行ない、で調
製した酵素標識したヒトα−フエトプロテイン
（100倍希釈）トリス−塩酸緩衝液PH7.5 300μ
加え十分混和した後37℃で１時間加温し反応さ
せた。反応終了後アスピレーターで反応液を吸
入して除去した。さらに、生理食塩水２mlを加
え洗浄する操作を３回くり返した。
洗浄終了後試験管に基質反応液〔ポリエチレ
ングリコールパルミテイト10mM、ポリエチレ
ングリコールオキシダーゼ4000U／Ｌ、ジクロ
ロフエノールインドフエノール0.01mMを含む
PH8.2トリス−塩酸緩衝液〕３mlを加え37℃で
10分間反応させた。その後0.5％Triton Ｘ−
100水溶液１mlを加え反応を停止させた。測定
は前述と同様に処理した標準液およびブランク
を対照に、標準曲線より求めた。
ングリコールパルミテイト10mM、ポリエチレ
ングリコールオキシダーゼ4000U／Ｌ、ジクロ
ロフエノールインドフエノール0.01mMを含む
PH8.2トリス−塩酸緩衝液〕３mlを加え37℃で
10分間反応させた。その後0.5％Triton Ｘ−
100水溶液１mlを加え反応を停止させた。測定
は前述と同様に処理した標準液およびブランク
を対照に、標準曲線より求めた。
図面は本発明の一実施例で得られた標準曲線で
ある。
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 測定対象の抗原を該抗原に対する抗体の不溶
化物と反応せしめ、この抗体の不溶化物に測定対
象の抗原と共通の抗原決定基を有する物質と酵素
１との結合物を反応せしめ、該抗体不溶化物と酵
素２を酵素１によつて切断される部分と酵素２に
よつて末端から切断される重合体基質部分を有し
ている基質複合体に作用せしめ、この重合体を末
端から切断する酵素による該重合体の分解物を測
定することを特徴とする抗原の測定方法。 ２ 重合体が二量体である特許請求の範囲第１項
記載の抗原の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14922084A JPS6128867A (ja) | 1984-07-18 | 1984-07-18 | 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14922084A JPS6128867A (ja) | 1984-07-18 | 1984-07-18 | 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6128867A JPS6128867A (ja) | 1986-02-08 |
| JPH0317302B2 true JPH0317302B2 (ja) | 1991-03-07 |
Family
ID=15470478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14922084A Granted JPS6128867A (ja) | 1984-07-18 | 1984-07-18 | 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6128867A (ja) |
-
1984
- 1984-07-18 JP JP14922084A patent/JPS6128867A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6128867A (ja) | 1986-02-08 |
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