JPS6128867A - 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 - Google Patents
基質複合体を用いた酵素免疫測定法Info
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- JPS6128867A JPS6128867A JP14922084A JP14922084A JPS6128867A JP S6128867 A JPS6128867 A JP S6128867A JP 14922084 A JP14922084 A JP 14922084A JP 14922084 A JP14922084 A JP 14922084A JP S6128867 A JPS6128867 A JP S6128867A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、例えば血清、尿などに含まれる抗原、すなわ
ち薬物あるいは各種疾患に由来する微量成分などを酵素
免疫測定法によシ測定する方法に関するものである。
ち薬物あるいは各種疾患に由来する微量成分などを酵素
免疫測定法によシ測定する方法に関するものである。
（従来の技術）
酵素免疫測定法には種々の方法が知られており、そのひ
とつに測定対象と同じ抗原に酵素基質を結合させ、これ
に抗体及びこの結合を分解する酵素を反応させて分解物
を測定することによって抗原の量を求める方法が知られ
ている。
とつに測定対象と同じ抗原に酵素基質を結合させ、これ
に抗体及びこの結合を分解する酵素を反応させて分解物
を測定することによって抗原の量を求める方法が知られ
ている。
（発明が解決しようとする問題点）
この方法には、分解物の量が少々いため感度が低いとい
う問題点があった。
う問題点があった。
（問題点を解決するだめの手段）
本発明者らは、酵素１−抗原（抗体）複合物（コンノー
ケ゛−ト）の酵素１によシ、基質複合体よシ、酵素１に
対する基質を遊離せしめ同時に遊離する重合体基質を酵
素２により単量体とし、これを分析することにより抗原
（抗体）を感度に測定出来ることを見出し、この知見に
基いて本発明を完成するに至った。
ケ゛−ト）の酵素１によシ、基質複合体よシ、酵素１に
対する基質を遊離せしめ同時に遊離する重合体基質を酵
素２により単量体とし、これを分析することにより抗原
（抗体）を感度に測定出来ることを見出し、この知見に
基いて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は測定対象の抗原又は抗体を該抗原又
は抗体に対する抗体の不溶化物と反応せしめ、この抗体
の不溶化物に測定対象の抗原又は抗体と共通の抗原決定
基を有する物質と酵素１との結合物を反応せしめ、該抗
体不溶化物と酵素２を酵素１によって切断される部分と
酵素２によって末端から切断される重合体部分を有して
いる基質複合体に作用せしめることを特徴とする抗原又
は抗体の測定方法に関するものである。
は抗体に対する抗体の不溶化物と反応せしめ、この抗体
の不溶化物に測定対象の抗原又は抗体と共通の抗原決定
基を有する物質と酵素１との結合物を反応せしめ、該抗
体不溶化物と酵素２を酵素１によって切断される部分と
酵素２によって末端から切断される重合体部分を有して
いる基質複合体に作用せしめることを特徴とする抗原又
は抗体の測定方法に関するものである。
測定対象の抗原及び抗体は特に制限されるものではなく
、例えばジゴキシン、テオフィリン、フェニトイン、ア
ミカシン等の薬物、グロスフグランノン、テストステロ
ン、サイロキシン、インシーリン、ＴＳＨ１サイログロ
ブリン等のホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、
７エリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ等のウィルス抗原、そ
の抗体、α−フェトプロティン、その抗体、癌胎児性抗
原などである。
、例えばジゴキシン、テオフィリン、フェニトイン、ア
ミカシン等の薬物、グロスフグランノン、テストステロ
ン、サイロキシン、インシーリン、ＴＳＨ１サイログロ
ブリン等のホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、
７エリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ等のウィルス抗原、そ
の抗体、α−フェトプロティン、その抗体、癌胎児性抗
原などである。
後述する酵素１と結合させる物質（以下、リガンドとい
う。）は測定対象の抗原又は抗体と共通の抗原決定基を
有するものである。抗原決定基は少なくともひとつが共
通であればよく、全てが共通であってもよい。従って、
リガンドは測定対象の抗原又は抗体と同一であってもよ
い。
う。）は測定対象の抗原又は抗体と共通の抗原決定基を
有するものである。抗原決定基は少なくともひとつが共
通であればよく、全てが共通であってもよい。従って、
リガンドは測定対象の抗原又は抗体と同一であってもよ
い。
酵素１は基質複合体の重合体部分を酵素２が作用しうる
ように切シ離すものであり、例えばエステラーゼ、被ゾ
チダーゼ、ソノ４−ゼ、スルファターゼなどである。
ように切シ離すものであり、例えばエステラーゼ、被ゾ
チダーゼ、ソノ４−ゼ、スルファターゼなどである。
リガンドと酵素１との結合方法は双方の官能基を考慮し
て決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基
などを利用することができ、例えばアミン基相互間を結
合させる場合には、ツインシアネート法、グルタルアル
デヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知うれている。また、アミノ基とカルボキシル基と
の間を結合させる方法としては、カルボキシル基をサク
シンイミドエステル化する方法のほかカルビジィミド法
、ウッドワード試薬法等が知られておシ、アミノ基と糖
鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法 ）（Ｎａｋａｎｏ
法）もある。チオール基を利用する場合には、例えばも
う一方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル
化してこれに７ステインを反応させてチオール基を導入
し、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合
することができる。フェニル基を利用する方法としては
ジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれ
らの例示に限られるものではなく、このほか例えばｒ
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊあるいは「酵素免
疫測定法」等の放置に記載されている方法のなかから適
宜選択して利用することができる。結合比は１：１に限
らず、目的に応じて任意の比率をとることができること
はいうまでもない。反応後は、ダル濾過法、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー々どを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍
結乾燥法等で乾燥する。などである。
て決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基
などを利用することができ、例えばアミン基相互間を結
合させる場合には、ツインシアネート法、グルタルアル
デヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知うれている。また、アミノ基とカルボキシル基と
の間を結合させる方法としては、カルボキシル基をサク
シンイミドエステル化する方法のほかカルビジィミド法
、ウッドワード試薬法等が知られておシ、アミノ基と糖
鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法 ）（Ｎａｋａｎｏ
法）もある。チオール基を利用する場合には、例えばも
う一方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル
化してこれに７ステインを反応させてチオール基を導入
し、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合
することができる。フェニル基を利用する方法としては
ジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれ
らの例示に限られるものではなく、このほか例えばｒ
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊあるいは「酵素免
疫測定法」等の放置に記載されている方法のなかから適
宜選択して利用することができる。結合比は１：１に限
らず、目的に応じて任意の比率をとることができること
はいうまでもない。反応後は、ダル濾過法、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー々どを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍
結乾燥法等で乾燥する。などである。
共通の抗原決定基と反応する抗体は公知の方法に準じて
製造することができる。すなわち、抗原リガンド又はこ
れらと蛋白の結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワ
トリなどの温血動物に体重１ｋ１７あた。ｐｏ、３〜２
１ｎｇを１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等に
アジュバントとともに注射して当該動物の体内に形成さ
せる。この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清か
ら抗体すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法に
よって精製してから用いてもよい。
製造することができる。すなわち、抗原リガンド又はこ
れらと蛋白の結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワ
トリなどの温血動物に体重１ｋ１７あた。ｐｏ、３〜２
１ｎｇを１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等に
アジュバントとともに注射して当該動物の体内に形成さ
せる。この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清か
ら抗体すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法に
よって精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
この抗体にはＦ（ａｂ’）２ ｒ Ｆａｂ’ ＋ Ｆａ
ｂなどのフラグメントも含まれる。
ｂなどのフラグメントも含まれる。
この抗体はビーズなどに固定化してから使用す″る。固
定化方法は公知の方法に従って行なえばよい。
定化方法は公知の方法に従って行なえばよい。
測定対象の抗原又は抗体をまず上記の抗体の不溶化物と
反応させ、次に、この抗体の不溶化物に前記の結合物を
反応させる。これらの抗原抗体反応をさせる溶液のＰＨ
及び温度は要は反応しやすい条件に保てばよく通常ｐＨ
４，５〜１０５で２０〜４５℃程度にあればよい。反応
時間は通常は充分に抗原抗体反応する程度がよく、６０
〜１２０分間程度でよい。
反応させ、次に、この抗体の不溶化物に前記の結合物を
反応させる。これらの抗原抗体反応をさせる溶液のＰＨ
及び温度は要は反応しやすい条件に保てばよく通常ｐＨ
４，５〜１０５で２０〜４５℃程度にあればよい。反応
時間は通常は充分に抗原抗体反応する程度がよく、６０
〜１２０分間程度でよい。
酵素２は後述する重合体を末端から切断するものであり
、重合体に応じて異なる。酵素２の例としてはカルボキ
７−ξブチダーゼＡ１カルボキシ４ゾチダーゼＢ１グル
コアミラーゼ、ポリエチレングリコールオキシダーゼ、
Ｅｘｏ−Ｐａ ｌｙ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓエキン
ー１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、エキンー１．４−
β−Ｄ−グルコシダーゼ、エキソ−１，６−α−Ｄ−グ
ルコンダーゼ、エキソ−ポリガラクチュロナーゼ、エキ
ンーＬ２−１．３−α−Ｄ−マンノシダーゼ、エキソ−
β−Ｄ−フルクトシダーゼ、エキノー２リーα−Ｄ−ガ
ラクチユロノシダーゼ、エキノー１，３−α−グルカナ
ーゼ、エキンーセロビオハイドロラーゼ、エキンーβ−
Ｎ−アセチルムラシダーゼ、エキソーインマルトノ）イ
ドロラーゼ、エキノーインマルトトリオハイドロラーゼ
、エキノーマルトヘキザハイドロラーゼ、エキソリボヌ
クレアーゼ■、エキソリボヌクレアーゼＨ１エキソ−デ
オキシリボヌクレアーゼ■などを挙ケることかできる。
、重合体に応じて異なる。酵素２の例としてはカルボキ
７−ξブチダーゼＡ１カルボキシ４ゾチダーゼＢ１グル
コアミラーゼ、ポリエチレングリコールオキシダーゼ、
Ｅｘｏ−Ｐａ ｌｙ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓエキン
ー１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、エキンー１．４−
β−Ｄ−グルコシダーゼ、エキソ−１，６−α−Ｄ−グ
ルコンダーゼ、エキソ−ポリガラクチュロナーゼ、エキ
ンーＬ２−１．３−α−Ｄ−マンノシダーゼ、エキソ−
β−Ｄ−フルクトシダーゼ、エキノー２リーα−Ｄ−ガ
ラクチユロノシダーゼ、エキノー１，３−α−グルカナ
ーゼ、エキンーセロビオハイドロラーゼ、エキンーβ−
Ｎ−アセチルムラシダーゼ、エキソーインマルトノ）イ
ドロラーゼ、エキノーインマルトトリオハイドロラーゼ
、エキノーマルトヘキザハイドロラーゼ、エキソリボヌ
クレアーゼ■、エキソリボヌクレアーゼＨ１エキソ−デ
オキシリボヌクレアーゼ■などを挙ケることかできる。
基質複合体は酵素２によって切断される結合によって連
結された重合体が酵素１によって切断される結合によっ
て連結されているものである。
結された重合体が酵素１によって切断される結合によっ
て連結されているものである。
重合体はアミノ酸、糖、エチレンオキサイド、ビニルア
ルコール、リン酸、ヌクレオチドなどの重合体であシ、
例えばＬ−チロシン重合体、Ｌ−トリシトファン重合体
、Ｌ−７工ニルアラニン重合体、Ｌ −’）ジン重合体
、グルコースのα−１，４結合重合体、β−ガラクトシ
ド重合体、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポ
リビニルアルコール、ポリリン酸、ポリヌクレオチドな
どであ （る。重合度は２以上であ）特に制限
されないが、通常５〜５０００分子程度が重合されたも
のが好ましい。
ルコール、リン酸、ヌクレオチドなどの重合体であシ、
例えばＬ−チロシン重合体、Ｌ−トリシトファン重合体
、Ｌ−７工ニルアラニン重合体、Ｌ −’）ジン重合体
、グルコースのα−１，４結合重合体、β−ガラクトシ
ド重合体、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポ
リビニルアルコール、ポリリン酸、ポリヌクレオチドな
どであ （る。重合度は２以上であ）特に制限
されないが、通常５〜５０００分子程度が重合されたも
のが好ましい。
この重合体は酵素１によって切断される結合によって連
結される必要があり、従って結合対象は酵素１の種類に
よって異なる。結合対象の例としては脂肪酸、リン酸、
硫酸、糖などを挙げることができる。
結される必要があり、従って結合対象は酵素１の種類に
よって異なる。結合対象の例としては脂肪酸、リン酸、
硫酸、糖などを挙げることができる。
重合体を結合対象に結合させる方法は結合の種類に応じ
公知の方法から適宜選択すればよい。
公知の方法から適宜選択すればよい。
基質複合体の例としては、１−ホスホにンタオース、ジ
アシルポリエチレングリコール、Ｌ−フェニルアラニル
−Ｌ−ポリリジン、Ｌ−アルギニル−ｙｊｅ ＩＪ−Ｌ
−フェニルアラニル、１−アシルポリサッカライド、ジ
アシルポリエチレングリコール、ジアルポリエチレング
リコール、ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド、
デキストラン、２す１−４−α−Ｄ−ガラクチーロニド
、１，３−β−Ｄ−キシラン、カルボキシメチルセルロ
ース、マンナン、フラクタン、ペクチン酸、２，３−α
−り一グルカンなどを挙げることができる。
アシルポリエチレングリコール、Ｌ−フェニルアラニル
−Ｌ−ポリリジン、Ｌ−アルギニル−ｙｊｅ ＩＪ−Ｌ
−フェニルアラニル、１−アシルポリサッカライド、ジ
アシルポリエチレングリコール、ジアルポリエチレング
リコール、ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド、
デキストラン、２す１−４−α−Ｄ−ガラクチーロニド
、１，３−β−Ｄ−キシラン、カルボキシメチルセルロ
ース、マンナン、フラクタン、ペクチン酸、２，３−α
−り一グルカンなどを挙げることができる。
結合物と酵素２を基質複合体に接触させる順序は問うと
ころではなく、いずれが先であってもあるいは同時であ
ってもよい。また、さらにこれらは測定対象の抗原又は
抗体とりガントと酵素１の結合物を抗体に加える際に一
緒に加えてもよい。
ころではなく、いずれが先であってもあるいは同時であ
ってもよい。また、さらにこれらは測定対象の抗原又は
抗体とりガントと酵素１の結合物を抗体に加える際に一
緒に加えてもよい。
反応を速やかに行なわせるために酵素２はなるべく多く
加えることが好ましい。各酵素反応は酵素の作用しやす
い条件下で行なわせることが好ましいことはいうまでも
なく、従って各酵素に応じて適当な温度、ＰＨ等が設定
される。
加えることが好ましい。各酵素反応は酵素の作用しやす
い条件下で行なわせることが好ましいことはいうまでも
なく、従って各酵素に応じて適当な温度、ＰＨ等が設定
される。
分解物の測定方法は重合体の種類に応じて適当な方法が
選択され、例えばアミノ酸の場合には、ニンヒドリンを
用いて比色定量する方法アミノ酸オキシダーゼで酸化し
て生成するＨ２Ｏ２を酵素法あるいは化学的方法によシ
比色定量あるいは螢光分析法で定量する方法などで定量
することができる。
選択され、例えばアミノ酸の場合には、ニンヒドリンを
用いて比色定量する方法アミノ酸オキシダーゼで酸化し
て生成するＨ２Ｏ２を酵素法あるいは化学的方法によシ
比色定量あるいは螢光分析法で定量する方法などで定量
することができる。
このほか、チロシンが遊離する場合にはチロシナーゼを
用いて共役酵素系で測定することもできる。
用いて共役酵素系で測定することもできる。
重合体が糖の場合には、例えば分解生成物がグルコース
であればグルコースオキシダーゼヲ作用させ、生成する
Ｈ２Ｏ２を化学発光させてもよくあるいはフェノール、
パーオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを使用し
て酸化縮合させ生成するキノンイミ／色素を比色定量し
てもよい。そのほか、０２電極で測定することもできる
。
であればグルコースオキシダーゼヲ作用させ、生成する
Ｈ２Ｏ２を化学発光させてもよくあるいはフェノール、
パーオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを使用し
て酸化縮合させ生成するキノンイミ／色素を比色定量し
てもよい。そのほか、０２電極で測定することもできる
。
重合体がポリエチレングリコールの場合には、ポリエチ
レングリコールオキシダーゼを作用させテ２，５−ジク
ロロフェノールインドフェノールを還元させ、これによ
シ色素の退色を比色定量すればよい。
レングリコールオキシダーゼを作用させテ２，５−ジク
ロロフェノールインドフェノールを還元させ、これによ
シ色素の退色を比色定量すればよい。
ポリリン酸、ポリヌクレオチドの場合ポリリン酸の場合
は、エキソポリホスホリラーゼにより末端から加水分解
し、遊離する無機リンにプリンヌクレオチドホスホリラ
ーゼ、キサンチンオキシダーゼを順次作用させ、生成す
るＨ２Ｏ２を・ぐ−オキシダーゼ４−アミノアンチピリ
ン−フェノールにより定量すればよい。ポリヌクレオチ
ドの場合は、エキツリ？ヌクレアーゼを作用させ、生成
するモノヌクレオチドにホスファターゼを作用させ、遊
離する無機リンを前記と同様の操作によシ定量すればよ
い。
は、エキソポリホスホリラーゼにより末端から加水分解
し、遊離する無機リンにプリンヌクレオチドホスホリラ
ーゼ、キサンチンオキシダーゼを順次作用させ、生成す
るＨ２Ｏ２を・ぐ−オキシダーゼ４−アミノアンチピリ
ン−フェノールにより定量すればよい。ポリヌクレオチ
ドの場合は、エキツリ？ヌクレアーゼを作用させ、生成
するモノヌクレオチドにホスファターゼを作用させ、遊
離する無機リンを前記と同様の操作によシ定量すればよ
い。
（作用）
本発明の方法は原理的にみて従来よシ行なわれているサ
ンドイツチ法と同様であるが、相違は、従来法ではコン
ジュケ９−トの酵素によシ遊離する基質をそのまま定量
しているのに比べ、拳法は複合体基質を用いることによ
シこの複合体基質よシ遊離（コンジュケゝ−トの酵素１
の作用により分解、遊離する）する重合体基質を酵素２
によって単量体化させ増幅された酵素１の活性を知るこ
とにより抗原（抗体ンを定量するものである。
ンドイツチ法と同様であるが、相違は、従来法ではコン
ジュケ９−トの酵素によシ遊離する基質をそのまま定量
しているのに比べ、拳法は複合体基質を用いることによ
シこの複合体基質よシ遊離（コンジュケゝ−トの酵素１
の作用により分解、遊離する）する重合体基質を酵素２
によって単量体化させ増幅された酵素１の活性を知るこ
とにより抗原（抗体ンを定量するものである。
（発明の効果）
本発明の方法においては１分子の結合物から複数のシグ
ナル物質を生成することから抗原を高感度で測定できる
。また、反応に必要な試薬類は一時に投入できることか
ら操作も簡単であり、臨床分析法としてもすぐれている
。
ナル物質を生成することから抗原を高感度で測定できる
。また、反応に必要な試薬類は一時に投入できることか
ら操作も簡単であり、臨床分析法としてもすぐれている
。
（実施例）
■ＣＨＭ化リパーすの調製
（クモノスカビ由来すノや−ゼ１１ｖヲ１００ ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ５，３１ｍｌに溶かし、これに４−
（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）
サクシンイミドエステル（ＣＨＭＳ ） ２ ｍｇ／ｍ
１１！（Ｄジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）溶液１０
０μｌを加えて室温で１時間放置して反応させた。この
反応液をセファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ
６，３の１００ ｍＭ リン酸緩衝液を流してグル濾過
を行ない、素通シ分画を分取した。
（クモノスカビ由来すノや−ゼ１１ｖヲ１００ ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ５，３１ｍｌに溶かし、これに４−
（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）
サクシンイミドエステル（ＣＨＭＳ ） ２ ｍｇ／ｍ
１１！（Ｄジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）溶液１０
０μｌを加えて室温で１時間放置して反応させた。この
反応液をセファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ
６，３の１００ ｍＭ リン酸緩衝液を流してグル濾過
を行ない、素通シ分画を分取した。
■Ｓ）（化ヒトα−７エトプロテインの調製ヒトα−フ
ェトプロティン５ｍ９を５ ｍＭ ＥＤＴＡ ヲ含むｐ
Ｈ７，５の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液に溶かし、これ
ＫＳ−アセチルメル力ゾトコハク酸無水物ｇ ｍｇ７ｆ
ｎｌｌのＤＭＦ溶液１００μｌを加えて３７℃で１時間
反応させた。この反応液にＩＭ−ヒドロキンルアミン水
溶液（ｐＨ７，５）１１０μｌを加え、３７℃でさらに
３０分間加温した。続いて、セファデックスＧ−２５を
用いてグル濾過し、素通り分画を分取した。
ェトプロティン５ｍ９を５ ｍＭ ＥＤＴＡ ヲ含むｐ
Ｈ７，５の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液に溶かし、これ
ＫＳ−アセチルメル力ゾトコハク酸無水物ｇ ｍｇ７ｆ
ｎｌｌのＤＭＦ溶液１００μｌを加えて３７℃で１時間
反応させた。この反応液にＩＭ−ヒドロキンルアミン水
溶液（ｐＨ７，５）１１０μｌを加え、３７℃でさらに
３０分間加温した。続いて、セファデックスＧ−２５を
用いてグル濾過し、素通り分画を分取した。
■リパーゼーヒトα−フェトプロティン結合物の調製
前記のＣＨＭ化す・り−ゼ溶液とＳＨ化α−フェトプロ
ティン溶液を混合し、１ｎＩｌまで濃縮し、４℃で一夜
放置して反応させた。反応液をセファアクリル５−３０
’０ を充填したカラムに入れ、ｐ＋−１７，０の２
０ ｍＭ ！Ｊン酸緩衝液を流してダル濾過を行ない、
１：３に結合した結合物の分画を分取した。
ティン溶液を混合し、１ｎＩｌまで濃縮し、４℃で一夜
放置して反応させた。反応液をセファアクリル５−３０
’０ を充填したカラムに入れ、ｐ＋−１７，０の２
０ ｍＭ ！Ｊン酸緩衝液を流してダル濾過を行ない、
１：３に結合した結合物の分画を分取した。
■ヒトα−フェトプロティンの測定
１％ウシ血清アルブミンを含むトリス塩酸緩衝液（Ｉ液
）を、試験管に４００μｊ分注し、これに検体１０μｌ
を加え、混和した。これに抗体不溶化ビーズ（酵素免疫
測定法、医学書院、第２版、ｐ３８５）を１個加え、十
分混和した後、３７℃で１時間反応させた。反応後、■
液をアスピレータ−で取り除きさらに生理食塩水２ｍ／
！を加え洗浄した。この操作を３回行ない、■で調製し
た酵素標識した抗ヒトα−フェトプロティン（１００倍
希釈）トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５３００μｌ加え十
分混和した後３７℃で１時間加温し反応させた。反応終
了後アスピレータ−で反応液を吸入して除去した。さら
に、生理食塩水２ ｍ１３を加え洗浄する操作を３回ぐ
シ返した。
）を、試験管に４００μｊ分注し、これに検体１０μｌ
を加え、混和した。これに抗体不溶化ビーズ（酵素免疫
測定法、医学書院、第２版、ｐ３８５）を１個加え、十
分混和した後、３７℃で１時間反応させた。反応後、■
液をアスピレータ−で取り除きさらに生理食塩水２ｍ／
！を加え洗浄した。この操作を３回行ない、■で調製し
た酵素標識した抗ヒトα−フェトプロティン（１００倍
希釈）トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５３００μｌ加え十
分混和した後３７℃で１時間加温し反応させた。反応終
了後アスピレータ−で反応液を吸入して除去した。さら
に、生理食塩水２ ｍ１３を加え洗浄する操作を３回ぐ
シ返した。
洗浄終了後試験管に基質反応液〔ポリエチレングリコー
ルノやルミティト１０ ｍＭ１ポリエチレングリコール
オキシダーゼ４０００ Ｕ／Ｌ 、ジクロロフェノール
インドフェノール０．０１ｍＭを含むＰＨ８，２トリス
−塩酸緩衝液〕３ｍｌを加え３７℃で１０分間反応させ
た。その後０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液１
ｍｌを加え反応を停止させた。測定は前述と同様に処理
した標準液およびブランクを対照に、標準曲線より求め
た。
ルノやルミティト１０ ｍＭ１ポリエチレングリコール
オキシダーゼ４０００ Ｕ／Ｌ 、ジクロロフェノール
インドフェノール０．０１ｍＭを含むＰＨ８，２トリス
−塩酸緩衝液〕３ｍｌを加え３７℃で１０分間反応させ
た。その後０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液１
ｍｌを加え反応を停止させた。測定は前述と同様に処理
した標準液およびブランクを対照に、標準曲線より求め
た。
図面は本発明の一実施例で得られた標準曲線である。
Claims (2)
- （１）測定対象の抗原又は抗体を該抗原又は抗体に対す
る抗体の不溶化物と反応せしめ、この抗体の不溶化物に
測定対象の抗原又は抗体と共通の抗原決定基を有する物
質と酵素１との結合物を反応せしめ、該抗体不溶化物と
酵素２を酵素１によって切断される部分と酵素２によっ
て末端から切断される重合体基質部分を有している基質
複合体に作用せしめることを特徴とする抗原又は抗体の
測定方法 - （２）重合体が二量体である特許請求の範囲第１項記載
の抗原又は抗体の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14922084A JPS6128867A (ja) | 1984-07-18 | 1984-07-18 | 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14922084A JPS6128867A (ja) | 1984-07-18 | 1984-07-18 | 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6128867A true JPS6128867A (ja) | 1986-02-08 |
| JPH0317302B2 JPH0317302B2 (ja) | 1991-03-07 |
Family
ID=15470478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14922084A Granted JPS6128867A (ja) | 1984-07-18 | 1984-07-18 | 基質複合体を用いた酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6128867A (ja) |
-
1984
- 1984-07-18 JP JP14922084A patent/JPS6128867A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0317302B2 (ja) | 1991-03-07 |
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