JPH03175991A - インフルエンザ菌の外膜タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の産業上の利用分野） 本発明は、インフルエンザ菌の外股タンパク質の精製方
法に関する。

（従来の技術） インフルエンザ菌す型は、特に乳児及び幼児に於いてよ
く見られる病原体として認められていたが、ごく最近、
類別し得ない（ｎｏｔｙｐａｂｌｇ）インフルエンザ菌
が重要な病原体として認められた。類別し得ないインフ
ルエンザ菌は、成人に肺炎、菌量病、脳膜炎、分娩後肢
血症、及び急性の熱性気管気管支炎をひき起こすことが
、現在よく確かめられている。その他に、類別し得ない
インフルエンザ菌は、新生児敗血症をひき起こし、しか
も乳児及び幼児の急性中耳炎に於いて、よく見られる病
因体である。それ故、インフルエンザ菌に関して、痰、
脳背髄液、血液その他の如き臨床試料を分析する方法を
発見することの重要性が明らかである。

類別し得ないインフルエンザ菌が成人及び幼児に重い感
染をひき起こすことの観察は、このバクテリアに関連す
る病原及び潜在的な病原性因子の研究の関心を刺激した
。インフルエンザ菌す型のりビトールカプセルは、生物
にとって病原性因子であり、カプセルの抗体は殺菌作用
及び／またはオプソニン化作用により宿主を保護する。

これらの観察は、インフルエンザ菌す型による感染に於
ける莢膜多糖の役割及びこれらの感染からの保護に関す
る多くの研究を生じた。しかしながら、類別し得ないイ
ンフルエンザ菌は多糖莢膜を欠き、その他のダラム陰性
バクテリアの外膜と同様に、インフルエンザ菌の外膜は
外膜タンパク質（ＯＭＰｓと称する）及びリボ多糖（Ｌ
ＰＳと称する）から構成される。それ故、類別し得ない
インフルエンザ菌の病原性と表面抗原との関係の研究は
、ＯＭＰｓ及びＬＰＳに集中する。

類別し得ないインフルエンザ菌のＯＭＰｓの分析は、菌
株の間にＯＭＰ組戒に著しい相違があることを示した。

例えば、ムーフィ　（Ｍｕｒρｈｙ）　　ら著、Ａ　Ｓ
ｔ＋ｂｔｙｐｉｎｇＳｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＮｏｎＬｙ
ｐａｂＩｅ　ｈ並迎ト１１ｕｓ　　１ｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ　Ｂａ５ｅｄ　　ｏｎ　　Ｏｕｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ　Ｐｒ。

ｔｅｉｎｓ　　、、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、
　　１９８３年、１４７巻、８３８〜８４６頁；バレン
カンプ （Ｂａｒｅｎｋａｍｐ）ら著、”０ｕｔｅｒ　Ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ　Ｂｉｏｔｙｐｅ　Ａ
ｎ（１３）ｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｎ
ｏｎｔｙｐａｂ−Ｉｅ　ｌ（ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１
ｎｆｌｕｅｎｚａ”　、、Ｉｎｆｅｃｔ、　ｒｍｍｕｎ
　。

１９８２年、３６巻、５３５〜５４０頁；ローブ（Ｌｏ
ｒｂ）　　ら著、”　０ｕｔｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｊｎ　Ｄｆ
ｓｅａｓｅ　ｌ５ｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｌ（ａｅｍｏｐ
ｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ　％　Ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｃ　ａｎｄ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏ１！、ｉｃ（１３
）Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　　％　Ｉｎｆｅｃｔ、　
Ｉｍｍｏｎ　、　１９８０年、３０巻、７０９〜１７頁
を参照のこと。

主要なＯＭＰｓに基く類別し得ないインフルエンザ菌に
関する亜型系（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）が
、以前に開発された。全ての菌株に保存される表面露出
抗原（免疫抗原）は、臨床被検物中のインフルエンザ菌
を同定する方法及びインフルエンザ菌に対するワクチン
を開発する上で重要な手段である。

保存された表面露出抗原を精製するための比較的簡単な
方法が望ましい。使用された方法は、外膜を最初に単離
する工程を含み、得られた生成物は、混在ＲＮＡ、その
他の細胞成分及び洗剤を含んでいた。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の目的は、比較的簡単であり、しかも増
大された収量の所望の抗原を生成する、保存された表面
露出抗原を精製する方法を提供することである０本発明
の別の目的は、混在ＲＮＡ及び望ましくない細胞成分を
含まない生成物を生成する精製方法を提供することであ
る。

（課題を解決するための手段） 本発明に従って、 （１）　　ペプチドグリカンと会合した免疫原性外膜タ
ンパク賞を含む第一画分を懸濁媒体中のインフルエンザ
菌の懸濁液から直接に得る工程、（上記の画分は上記の
懸濁媒体に不溶性である〉、（２）第一画分を懸濁液か
ら分離する工程、（３）　　外膜タンパク質と会合した
ペプチドグリカンが不溶性であり、且つ消化されたＲＮ
Ａが可溶性である第一液体中で消化性材料で処理するこ
とにより第一画分から混在ＲＮＡを消化して、外膜タン
パク質及びペプチドグリカンを含む第二画分を生成する
工程、 （４）上記の第一液体から上記の第二画分を分離する工
程、 （５）上記の外膜タンパク質が可溶性であり、且つペプ
チドグリカンが不溶性である第二液体中で第二画分を懸
濁して、可溶化外膜タンパク質を含む第三液体を得る工
程、ついで （６）可溶化外膜タンパク質を含む第三液体を不溶性ペ
プチドグリカンから分離し、外膜タンパク質を濃縮する
工程 を含むことを特徴とする、インフルエンザ菌（１１，ｆ
ｌｕと称する）の免疫原性外膜タンパク質の精製方法が
提供される。

（発明の詳細な説明） 本明細書に使用される“類別し得ないインフルエンザ菌
は、多糖莢膜を欠き、且つ外膜タンパク質（ＯＭＰｓ）
及びリボ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）を含む外膜を有するインフ
ルエンザ菌を意味する。

“免疫原性タンパク質”は、宿主生物に免疫抗体応答を
もたらすタンパク質を意味する。

“エピトープ”は、特異的な免疫応答をもたらす制限さ
れた免疫原性部分を意味する。

本発明に従って、１６，６００ダルトンの外膜タンパク
質（ｐ６）でエピトープを認識するマウスモノクローナ
ル抗体が、類別し得ないインフルエンザ菌に対して開発
された。このエピトープは、類別し得る菌株及び類別し
得ない菌株を含む、試験されたインフルエンザ菌の１１
５の分離株全てに存在していた。その他のバクテリアの
８９の菌株のスクリーニングは、このエピトープがイン
フルエンザ菌の高度に特異的なマーカーであることを示
した。何となれば、エピトープが試験されたその他のバ
クテリア種の全てに実際に存在していなかったからであ
る。類別し得ないインフルエンザ菌による菌血症の底入
からの回復期血清と二種のヒト血清試料を用いて、ウェ
スタン分析法を行なった。１６，６００ダルトンの外膜
タンパク質に対する抗体が、三種のヒト血清試料の全て
に存在していた。

８つのＯＭＰ亜型を代表する類別し得ないインフルエン
ザ菌の始原型菌株が、本発明者自体の収集により得られ
た。上記のムーフィらの文献を参照のこと。菌株３５２
４は、エリイ・カランティ・メディカル・センター（ｌ
Ｅｒｉｅ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ｍｅｄｉｃ（１３）Ｃｅｎｔ
ｅｒ）　　（バッファロー、ニューヨーク）で慢性気管
支炎の患者の痰から単離された。Ｓ、ベータ（Ｂｅｒｋ
）博士（Ｖ、　Ａ、メディカル・センター、マウンテン
　ホーム　テネシー）は、血？夜または経気管吸引液か
らの類別し得ないインフルエンザ菌の１４の菌株を提供
した。類別し得ないインフルエンザ菌の残りの菌株は、
エリイ・カランティ・メディカル・センター及びバッフ
ァローＶ、　Ａ。

メディカル・センターからの臨床分離株であった。

Ｊ、ワード（Ｗａｒｄ）博士（ロサンジエルスのカリフ
ォルニア大学）は、インフルエンザ菌す型の５４の菌株
を提供した。インフルエンザ菌す型の残りの菌株はバッ
ファロー・チルドレンズ・ホスピタル（Ｂｕｆｆ（１３
）ｏ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ　’　ｓ　　Ｈｏ５ｐｉｔ（１
３））からの臨床分離株であった。インフルエンザ菌の
その他の莢膜抗原型の参照菌株は、センターズ・フォー
・デイシーズ・コントロール（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ
　Ｄｉｓ−６ａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）　　（アトラン
タ）から得られた。

ヘモフィルス　バラフロフィルス（ハ悲狸肛旦ｕｓ　　
ａｒａ　ｈｒｏ　ｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ２９２４０％へ
モフィルスセクニス（勤悲炒ｈｉｌｕｓ並艶ｉｓ）　Ａ
ＴＣＣ１０９７７、ヘモフィルス　バラインフルエンザ
（Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　Ｐａｒａｍｆｌｕｅｎｚａ
ｅ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ７９０１及び９２７６、ヘモフィル
ス　エジブテイカス（ｌｌａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ａｅ
　　ｔｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ１１１１６、ヘモフィルス
　バラへモリイチカス（Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　−巴
Ｕ屁笠り旦叩紅ＡＴＣＣ１００１４、類別し得ないイン
フルエンザ菌ＡＴＣＣ１９４１８、アクチノバチルス　
アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｔｎｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍ　ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
）ＡＴＣＣ２９５２２、ＡＴＣＣ２９５２３、ＡＴＣＣ
２９５２４、ＮＣＴＣ９７０７、及びＮＣＴＣ９７１０
，アクチノバチルス　エクイリ（ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｅ　ｕｉｌｉ）ＡＴＣＣ１９３９２、アクチ
ノバチルス　セミニス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ　ｌｌｕ
ｓｓｅｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ１５７６８、及びアクチノ
バチルス　スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｔｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１５５５７は、Ｊ、ザムボン（
Ｚａｍｂｏｎ）博士（バッファローにあるニューヨーク
州の大学、スクール・オブ・デンティストリイ（Ｓｃｈ
ｏｏｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｔｉｓ　ｔｒｙ）　）により提供
された。全てのその他の種の分離株は、エリイ・カラン
ティ・メディカル・センターの臨床微生物学研究所によ
り提供された。

インフルエンザ菌の菌株の同定は、集団形態学並びにヘ
ミン及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに関す
る増殖要求量により確認された。

莢膜抗原型は、センターズ・フォー・デイシーズコント
ロールからの参照菌株及び抗血清の使用によりＣＩ・已
により決定された（ムーフィーらの上記文献を参照のこ
と）。菌株は、ξユーラーーヒントン（Ｍｕｅｌ　１ｅ
ｒ−旧ｎｔｏｎ）培養液＋１０％グリセロール中で一７
０℃で貯蔵された。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスは、０日日及び２８日日
日類別し得ないインフルエンザ菌株３５２４の１０９個
の細胞Ｑ、　ｌ　ｍｌで免疫化（ｉ　ｐ）された。初期
の免疫化後３２０目に、選択された動物がクロロホルム
で殺され、それらの肺臓が取り出され、肺臓リンパ球が
、最小必須培地による肺臓バルブの潅流により回収され
た。

ＮＳＩ　　（ＩｇＧＩＢＡ／ｃプラスマ細胞腫Ｐ　３　
ＸＡｇ　８の非分泌変異株）ブラスマ細胞腫細胞（ナシ
ョナル・カンサー・インスティテユートコントラクト（
Ｎａｔｉｏｎ（１３）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅｃｏｎｔｒａｃｔ）　Ｎ○ＩｃＢ−２３８８６とし
てサルク・インスティテユート・オブ・バイオロジイ（
Ｓ（１３）ｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｔｏｌｏ
ｇｙ）　（う・ジヨウ（［、ａ　Ｊｏｌｌ、ａ）　、カ
リフォルニア〕から得られた）中へのドナー肺臓細胞の
融合によるハイブリドーマ発生を得るため、３５％のポ
リエチレングリコールがケネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ）の
操作（Ｃｅｌｌ　Ｆｕｓｉｏｎ　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　−、１９７９年、５
８巻、３４５〜３５９頁）の改良に使用された。簡単に
云うと、１０’個の膵臓細胞が、血清を含む最小必須培
地中で１０６個のＮ５−１細胞と合わされた。細胞は２
５℃で１０分間１７０ｇで遠心分離された。

全ての上澄液が除去され、ベレットが軽くたたかれて、
それを取りはずす。血清を含まない最小必須培地中の３
５％のポリエチレングリコール１　０００（シグマ・ケ
ミカル・カンバニイ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｃｖｉｃ（１３
）　Ｃｏ、）　％　セニ／トルイス）２２ｍｊ！が添加
され、混合物が穏かに攪拌され２５℃で８分間放置され
、その最後の３分間は細胞をペレットにするため５００
ｇの遠心分離からなっていた。

その最初の８分の終了時に、血清を含む最小必須培地（
ＭＥＭと称する）５ｍＮが添加され、穏かに１回ピペッ
トで移されベレットを再１社濁した。混合物は、室温（
２５℃）で５分間遠心分離された。

上澄成金てが除去された。完全な最少必須培地（グルコ
ース〔４，５的ｇ／−〕を含む培地）５ｍｇが添加され
てペレットを再懸濁した。混合物は、適量の完全な最小
必須培地を含む２５ｄの三角フラスコに移されて３Ｘ１
０’個のブラスマ細胞腫細胞／−を得た。細胞は穏やか
に攪拌されてマイクロタイタウエルへの０．０５−の試
料中に分配された。

ポリエチレングリコール融合２４時間後に、ヒポキサン
チン（１’３．６μｇ／ｒｒＬｌ）、アミノプテリン（
０，３６μｇ／ｒ１ｔＩり、及びチミジン＜３．８μ／
ｒｎｌ）を含む培地０．０５−が夫々のウェルに添加さ
れた。

マイクロタイタブレートが、５％ＣＯ２及び９５％室空
気の雰囲気中で８５％の湿度で組織培養保温槽中に入れ
られた。ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジ
ンを含む新しい培地が７日間に添加され、１０日日の後
にプレートが顕微鏡的プラークに関して調べられた。全
てのウェルからの上澄液がＥＬＩＳＡ（酵素結合された
最少吸着剤分析）により抗体の存在に関して試験された
。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡｓはポリビニル９６−ウェルマイクロタ
イタ（ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　、アレキサン
ドリア、バージニア）中で行なわれた。２００μｌ容量
が各工程に使用された。ウェルは、ジョンストン（Ｊｏ
ｈｎｓ　ｔｏｎ）の方法（ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｃａｅ　　
、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｆＭｘｃ
ｒｏｂ＋ｏｌｏｇｙ、　ｌ　９７３年、１２１〜１２９
頁〉により調製された類別し得ないインフルエンザ菌株
３５２４の細胞外膜調製物（１０μｇ／−）で被覆され
た。プレートは３７℃で１時間保温され、その後４℃で
一夜保温された。ウェルは、各工程の間でＰＢＳ（ＩＪ
ン酸塩緩衝食塩水）＋０．０５％トウイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　２０　（商標）界面活性剤で３回洗浄された。プ
ラスチックの未結合部位はＰＢＳ中の３％の牛血清アル
ブミンで３７℃で２時間封鎖された。モノクローナル抗
体を含むＭ１織培養上澄液〈または連続実験中のマウス
腹水液の希釈液〉がウェル中で４℃で一夜保温された。

ついで、マウスＩｇＧ及びＩｇＭに対するウサギ抗体が
３７℃で２時間保温され、その後タンパク質Ａ−ペルオ
キシダーゼが３７℃で２時間保温された。ついで、基質
２００μｌが夫々のウェルに添加された。基質は、０−
フェニレンジアミン１０ｍｇをメタノール１−に溶解し
、この溶液をクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（ｐＨ５，０
） ９９ｍｊ！＋３％ＨｚＯｚ０．１ｍＮに添加することに
より調製された。基質が室温で暗所に４５分間保温され
た後、反応が４　Ｎ　　Ｈｚ　Ｓ　Ｏａ　５０　ｕ　Ｒ
で停止された。ＯＤ４．。が測定された。試験されるモ
ノクローナル抗体に代えてＮ５−１組織培養上澄液また
は腹水液が使用される対照を用いて、ＥＬＩＳＡｓの各
組が行なわれた。ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果に基
いて、選択されたクローンが、−層大きな組織培養ウェ
ルにその後移すことにより、増殖された。多量の抗体が
、組織培養液中で、１０５個のハイブリドーマ細胞をプ
リスタンで感作されたＢＡＬＢ／Ｃマウスにｉｐ注射す
ることにより生成された。得られた腹水液が３〜４週間
で回収され、特異性に関して試験された。

分析される菌株が９５％室空気及び５％ＣＯ。

の雰囲気中で３７℃で一夜チａコレート寒天（または、
種に応じて、その他の適当な培地〉で増殖された。一つ
のプレートからの細胞が、ＰＢＳ中の懸濁ついで１０，
０００ｇで２０分間の遠心分離により回収された。得ら
れたベレ７）が充分なＰＢＳ中で懸濁されて、懸濁液が
マイクロピペットに抜き取られた。バクテリアの懸濁液
１／ＩＭが試料緩衝液（０，０６Ｍ）リス、１．２％Ｓ
ＤＳ、１％Ｂ−メルカプトエタノール、及び１１，９％
グリセロール）０，４−に添加され、沸騰水浴中で５分
間加熱された。得られた生物が、全細胞調製物と称され
る。

全細胞調製物の１０ｐｌＯ液滴がニトロセルロースシー
ト（シュライチェル・アンド・シュエル・インコーポレ
ーション（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　　ａｎｄｓｃｈｕｅ
ｌｌ、、　Ｉｎｃ、　）　、キイーン、ニューハンプシ
ャー）の上に置かれ、空気乾燥された。ついで、そのシ
ートがバッファーＡ＜０．０１２Ｍ）リス及び０．１５
Ｍ　Ｎａ　Ｃ１、ｐｔ１７．４）中の３％ゼラチン中に
１時間置かれた。シートがバッファー八ですすがれた後
、それは抗体の適当な希釈液中に置かれて、室温で一夜
振とうされた。シートがバッファーＡですすがれ、タン
パク質Ａペルオキシダーゼ（ザイムド・ラボラトリイズ
（Ｚｙｍｅｄ　ＬａｂｏｒａＬ。

ｒｉｅｓ　）、サンフランシスコ）のｌ　：　３，００
０希釈液中に入れられ、室温で１時開拡とうされた。そ
のシートがすすがれ、ホースラデイツシュペルオキシダ
ーゼ発色溶液（０，０１５％Ｈ２Ｏ２、バイオ−ラッド
（Ｂｔｏ−Ｒａｄ）　、リッチモンド、カリフォルニア
）中に４５分間浸漬された。各シート上で分析された対
照は、試料緩衝液（ネガティブ対照）を含んでいた。ド
ツトがバ・ツクグラウンドの色と異ならない場合に、ネ
ガティブ結果が記録され、ドツトが紫−青に変った場合
に、ポジティブ結果が記録された。ドツト分析の約９０
％が、明らかにポジティブまたはネガティブであった。

ドツト分析であいまいな結果を生じた菌株が、ウェスタ
ンプロット分析法にかけられた。

Ｌ、ＰＳ旦星楚 リボ多ＩＪ！（ＬＰＳ）が、二つの方法により類別し得
ないインフルエンザ菌株から調製された。第一の方法は
、ウェストファール（Ｗｅｓｔｐｈ（１３））及びジャ
ン（Ｊａｎｎ）のフ玉ノールー水抽出法（Ｂａｃｔｅ−
ｒｉ（１３）　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｓ　　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂ−ｏｈｙｄ
ｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９６５年、５巻、
８３−９１頁）の改良であった。第二の方法は、ヒツチ
コック（ＩＩ　ｉ　ｔｃｈｃｏｃｋ）及びブラウン（Ｂ
ｒｏｗｎ）の方法（Ｊｏｕｒｎ（１３）　ｏｆ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙｓ　１９８３年、１５４巻、２６９
〜２７７頁）であった。後者の方法は、酵素ブロテイナ
ーデＫ（ボーリンガ−・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　Ｇｍｂｔｌ、マンハイム
、ドイツ連邦共和国）を使用し、この酵素はクンバク質
を加水分解するが、ＬＰＳに影響しない。

全細胞調製物及びＬＰＳ調製物が、１１％または１３．
２％の分離ゲルを用いて、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）にか
けられた（ムーフィらの上記の文献を参照のこと）。電
気泳動が完結された時、蒸留水中で前もって沸騰された
ニトロセルロースシートと一緒にゲルが置かれ、そのシ
ートが０．３Ｍクエン酸ナトリウム＋３ＭＮａＣＡ中に
浸漬された。電気泳動転移がトランス−プロット（Ｔｒ
ａｎｓＢｌｏｔ、商標）セル（パイオーラッド）中で５
０Ｖで９０分間行なわれた。電極緩衝液は、０、０２５
　Ｍ　）リス、ρ１１８．３．０．１９２Ｍグリシン、
及び２０％メタノールであった。ついで、ニトロセルロ
ースシートが、ドツト分析に関して記載されたように正
確に処理された。それは３％ゼラチンで封鎖され、抗体
７Ｆ３、タンパク質入−ベルオキシダーゼ、及び基質ホ
ースラデイツシュペルオキシダーゼ発色剤でもって連続
に保温された。

１　　　　ＯＭＰｓの　　　ラベリング表面露出ＯＭＰ
ｓの外因性ラベリングが、ラクトペルオキシダーゼ触媒
による放射性ヨウ素化操作（ハンセン（ｌ！ａｎｓｅｎ
）ら著、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。

１９８１年、３２巻、１０８４〜１０９２頁を参照のこ
と）を用いて行なわれた。

マイクロタイタブレートに被覆された類別し得ないイン
フルエンザ菌株３５２４の外膜を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ
は、７Ｆ３と称されるハイブリドーマが、バクテリアの
外膜中の決定因子を認識した抗体７Ｆ３を生産している
ことを示した。ゲル免疫拡散は、この抗体が１ｇＧ３イ
ソタイプのものであることを示した。第１図は、抗体７
Ｆ３により認識された決定因子が１６．６００ダルトン
の分子の大きさをもつタンパク質にあったことを示すウ
ェスタンプロットを示す。レーンＡは、ニトロセルロー
スシート上の分子量標準を示し、レーンＢは類別し得な
いインフルエンザ菌株３５２４の全細胞調製物中の抗体
７Ｆ３により認識された１６．６００ダルトンのタンパ
ク質を示す。詳細には、レーンＡは１３．２％のゲルか
ら転移された分子量標準を示す。レーンＢは、抗体７Ｆ
３、タンパク質Ａ−ペルオキシダーゼ、及びペルオキシ
ド基質と共に保温された類別し得ないインフルエンザ菌
株３５２４の全細胞調製物を示す。そして、レーンＣは
、！！Ｊで外因的にラベルされたバクテリアからつくら
れた類別し得ないインフルエンザ菌株３５２４の全細胞
調製物のオートラジオグラフである。三つのレーン全て
が同しゲルからのものであった。

インフルエンザ菌の２５の菌株に於いて、この方法によ
り１行なわれたウェスタンプロット分析法は、抗体７Ｆ
３が各菌株中のこの１６．６００ダルトンのタンパク質
の決定因子を認識したことを示した。抗体は多数の菌株
中の同し分子の大きさのクンバク質の決定因子を認識し
たので、本発明者らは、ウェスタンプロットよりもむし
ろドツト分析を使用して多数の菌株をスクリーニングし
た。

抗体７Ｆ３により認識されたタンパク質が外因的にラベ
ルし得るか否かを決定するため、本発明者らは１２Ｊで
インフルエンザ菌株３５２４をラベルした。タンパク質
が５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられ、ニトロセルロースシー
トに移された。一つのレーンはＸ−線フィルムに暴露さ
れ、一つのレーンは７Ｆ３、タンパク質入−ペルオキシ
ダーゼ複合体は、及び基質と共に保温された。第１図は
、抗体７Ｆ３により認識された帯（レーンＢ）が＋２□
５■−ラベルされた帯（レーンＣ）と一致することを示
す。

更に、抗体７Ｆ３により認識されたエピトープがタンパ
ク質またはＬＰＳにあったか否かを分析するため、本発
明者らは二つの別の実験を行なった。ＥＬＩＳＡは上記
のようにして行なわれ、ここで幾つかのウェルが類別し
得ないインフルエンザ菌株３５２４の細胞外膜調製物で
被覆され、その他のウェルがフェノール−水沫（上記の
ウエストファルの文献を参照のこと）により類別し得な
いインフルエンザ菌株３５２４から調製されたＬＰＳで
被覆された。抗体７Ｆ３はＯＭＰｓ及びＬＰＳを含んだ
細胞外膜調製物（ＯＤ、０．３７５）（上記のジョンス
トンらの文献を参照のこと）と反応性であったが、ＬＰ
Ｓ　（ＯＤ、０１０６２）と反応性ではなかった。この
知見は、抗体７Ｆ３により認識されたエピトープがＯＭ
Ｐにあることを示す。

第２図は、抗体７Ｆにより認識されたエピトープがタン
パク質またはＬＰＳにあるか否かを分析するのに設計さ
れた別の実験を示すウェスタンプロット分析である。Ａ
で示されたレーンは、菌株３５２４の細胞のプロティナ
ーゼに溶菌により調製されたＬＰＳ　　（ヒツチコック
ら著、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ−ｉｏｌ、１９８３年、１５
４巻、２６９〜２７７頁を参照のこと）を含み、Ｄで示
されたレーンはフェノール−水沫（ウエストファルらの
上記の文献を参照のこと〉により調製された菌株３５２
４のＬＰＳを含み、Ｃで示されたレーンは菌株３５２４
の全細胞調製物を含む。全ての試料は同じゲルで分析さ
れ、同じニトロセルロースシートに移された。

第２図の左側のものは抗体７Ｆ３　（腹水液希釈液、１
：５００）と共に保温され、第２図の右側のものは抗体
３Ｄ２〈腹水液希釈液、ｌ：５００）、即ちインフルエ
ンザ菌の脂質ＡＮ分を認識するモノクローナル体と共に
保温された。抗体７Ｆ３はＬＰＳ調製物のいずれにも結
合せず、全細胞調製物中の１６．６００の分子量をもつ
帯にのみ結合する。

この観察は、抗体７Ｆ３がＬＰＳではなくタンパク質の
エピトープを認識することを示す。

詳細には、第２図は、１３．２％ゲルからのウェスタン
プロット分析（（左側）抗体７Ｆ３と一緒に保温、（右
側）抗体３Ｄ２　（これはインフルエンザ菌の脂質Ａの
エピトープを認識する）と−緒に保温）を示す。Ａで示
されたレーンは、ブロテイナーゼＫによる細胞の溶菌に
より調製された類別し得ないインフルエンザ菌株３５２
４のＬＰＳを含み、Ｂで示されたレーンは菌株３５２４
のフェノール−水抜で調製されたＬＰＳを含み、Ｃで示
されたレーンは菌株３５２４の全細胞調製物を含む。分
子量の標準が右側に示されている。

抗体７Ｆ３により認識された抗原の種特異性を測定する
ための研究が行なわれた。インフルエンザ菌の１１５の
分離株の全細胞調製物が、ドツト分析またはウェスタン
プロット分析のいずれかにより研究される。菌株は、７
３のｂ型、３７の類別し得ない菌株、及び夫々１のａ型
及びＣ％　ｆ型を含んでいた。インフルエンザ菌の１１
５の菌株の全てが抗体７Ｆ３により認識されるエピトー
プを含んでいた。結果は、このエピトープがインフルエ
ンザ菌株の中の共通の抗原であることを示す。

このエピトープがインフルエンザ菌以外のバクテリアに
存在するか否かを決定するため、種々のバクテリア種の
６０の分離株が研究された。６０のこれらの菌株全てが
抗体７Ｆ３により認識される決定因子を欠いていたく表
１を参照のこと）。

表−一一一上 種々のバクテリア種に関する ダラム陰性 ダラム陽性 インフルエンザ菌以外のへモフィルス種の２９の菌種が
研究された。これらの分離株のうち２５は、７Ｆ３エピ
トープを欠いていた（表２を参照のこと）。ヘモフィル
ス　パラへモリチカスの二つの菌株は、決定因子を含ん
でいた。その他、ヘモフィルス　パ２Ｃ乙旦≦し仁／ｌ
／２の一つの菌株及びエジプトへモフィルスの一つの菌
株は、抗体７Ｆ３により認識される２０．０００ダルト
ンのタンパク質を含んでいた。

表−２ ヘモフィルスの種々の種に関する インフルエンザ菌 へモフィルス　パラへモリチカス ヘモフィルス　バラフロフィ）トス ヘモフィルス　セグニス エジプト　へモフィルス 八　　　二 ４ ９ ＊　ウェスタンプロット分析に於いて、抗体７Ｆ３は、
これらの菌株中で２０．０００ダルトンのタンパク質を
認識した。

ヒト血清抗体 ヒト血清が、ウェスタンプロット分析法により、１６、
６００ダルトンのＯＭＰに対する抗体の存在に関して試
験された。第３図は、同じゲルで分析されニトロセルロ
ース紙に移された類別し得ないインフルエンザ菌株３５
２４の全細胞調製物を示す。

レーンＡは、７Ｆ３復水液こ共に保温されたものテアリ
、１６．６００ダルトンタンパク質に相当する単−帯を
示し、レーンＢｕびＣは正常のヒト血清の二つの異なる
試料と共に保温されたものであり、レーンＤは類別し得
ないインフルエンザ菌による、菌血症の１７日後の成人
から得られた血清と共に保温されたものである。ヒト血
清の三つの試料全ては、抗体７Ｆ３により認識される決
定因子を含む１６．６００ダルトンのＯＭＰに対する抗
体を有する。

この１６．６００ダルトンの外膜タンパク質を形質発現
する遺伝子のＤＮＡ配列は、ヌクレオチド１２５で始ま
ると考えられ、ヌクレオチド５２６まで続く。このアミ
ノ酸配列は、インサートの一部として含まれる。その遺
伝子は、第６図に示される配列を有すると思われる。

この帯は、ヒト血清中の抗体により認識される最も主要
なものの中にあることが注目に値する。

詳細には、第３図は、１３，２％のゲルからのウェスタ
ンプロット分析を示す。４つのレーンは全て、同じゲル
からの類別し得ないインフルエンザ菌株３５２４の全細
胞調製物を含むが、夫々のレーンは異なる抗血清と共に
保温された。即ち、レーンＡは抗体７Ｆ３と共に保温さ
れ、レーンＢ及びＣは正常なヒト血清の二つの異なる試
料（希釈液、１：５００）と共に保温され、レーンＤは
成人中の類別し得ないインフルエンザ菌による菌血症１
７日後に得られた血清（希釈液、１：５００）と共に保
温された。抗血清と一諸の保温に続いて、タンパク質入
−ペルオキシダーゼ及びペルオキシド基質と一緒に保温
された。矢印は、ヒト血清の三つの試料の全てが７Ｆ３
エピトープを含む１６．６００ダルトンのＯＭＰに対す
る抗体を含むことを示す。

本発明に従って、類別し得ないインフルエンザ菌の表面
で１６，６００ダルトンのＯＭＰのエピトープを認識す
るＩｇＧ３マウスモノクローナル抗体が開発された。こ
のエピトープは、類別し得る菌株及び類別し得ない菌株
を含む、試験されたインフルエンザ菌の１１５の分離株
の全てに存在する。

非ヘモフィルス種の６０の菌株のスクリーニングは、エ
ピトープがこれらの全てのバクテリア中に存在しないこ
とを示した。エピトープはバラインフルエンザ菌の２４
の菌株中に存在しなかったが、その他のへモフィルス種
の４〜５菌株中に存在した（表２を参照のこと）。これ
らの種はヒトの異常な病原である。それ故、臨床的に妥
当な分乱株の観点から、抗体７Ｆ３がインフルエンザ菌
に対して高度に特異的である。

インフルエンザ菌株 共通エピトープを認識するこのモノクローナル抗体は、
臨床的な微生物学研究所に於いて手段として有用である
。臨床的分離株のインフルエンザ閑（類別し得る菌また
は類別し得ない菌）としての同定を確かめる迅速試験は
、このような抗体に基いて開発し得た。この特異なエピ
トープを利用するためのＤＮＡプローブをつくるため、
ｐ６を暗号化する遺伝子の配列が決定される。ＤＮ、Ａ
配列に基いて、活性ｐ６タンパク質のアミノ酸配列が推
定し得る。この情報は、エピトープ遺伝地図作製として
知られるものを行なうのに使用し得る。

エピトープ遺伝地図作製は、幾つかの小さいペプチドの
構成及びモノクローナル抗体７Ｆ３との反応性に関する
これらのペプチドの試験を伴なう。

７Ｆ３により認識されるエピトープはインフルエンザ菌
に対して特異的であるので、その抗体によりＬ２識され
る相当するペプチドはインフルエンザ菌の特異的な決定
因子を代表する。そのペプチドのアミノ酸配列が一旦知
られると、そのセグメントのＤＮＡ配列が推定し得る。

インフルエンザ菌はこのエピトープを暗号化する遺伝子
を含むので、バクテリアはこの配列に相当する配列を有
するＤＮＡを含むことが知られる。それ故、ＤＮＡプロ
ーブはｐ６の特異的なエピトープを暗号化する核酸に一
致するようにつくられる。プローブが一旦つくられると
、それは、例えば放射性メンバーでラベルし得る。つい
で、このプローブは、インフルエンザ菌の存在に関して
、痰、脳を髄液、血液及びその他の如き臨床試料を分析
するのに使用し得る。これは、ＤＮＡプローブがインフ
ルエンザ菌のゲノム中に存在するその相補的塩基対に結
合するので、可能である。このプローブが一旦つくられ
ると、この試みはヘミン及びニコチンアミドアデニン　
ジヌクレオチドに対する増殖要求量を示す現行の広く使
用される方法よりも利点を与える。特異的なモノクロー
ナル抗体による分析は、２４時間程度で結果を生じる。

ＯＭＰｓ及びＬＰＳはグラム陰性バクテリアの外膜と密
接に関連する。この事実及び抗体７Ｆ３により認識され
る決定因子が、Ｌ　Ｐ　Ｓが分離する分子量範囲にある
という観察は、この決定因子がタンパク質またはＬＰＳ
にあるか否かという疑問をいだかせる。幾つかの実証系
列は、抗体７Ｆ３により認識されるエピトープがタンパ
ク質にあることを示す。第一に、ＳＤＳゲルのクーマシ
ーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）による染色
は、インフルエンザ菌の全ての菌株に於いて、１６．６
００ダルトンで抗体７Ｆ３により認識される帯の存在を
示した。

クーマシーブルーはタンパク質を染色するがＬＰＳを染
色しないので、この観察は抗体７Ｆ３がタンパク質決定
因子を認識するという推定証拠である。第二に、５ＤＳ
−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロットに関する帯の配置は
タンパク質に関して典型的であった。ＬＰＳは抗体７Ｆ
３エピトープが存在する帯よりも一般にはっきりしない
複数の帯を示した。この点は、ＬＰＳ決定因子を認識す
るモノクローナル抗体が、抗体７Ｆ３により認識される
良く輪郭づけられた単一の帯と対照的に、全細胞調製物
のウェスタンプロット分析に於いて典型的な“ＬＰＳ”
パターンを示したという観察により、更に確証される。

第三に、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより、抗体７Ｆ３はＯＭＰｓ
＋ＬＰＳを含む細胞外膜調製物との反応性を示したが、
その抗体は単離ＬＰＳとの反応性を示さなかった。最後
に、ウェスタンプロット分析（第２図）に於いて、抗体
７Ｆ３は全細胞調製物中の帯を認識したが、二つの異な
る方法を使用することにより調製されたＬＰＳの決定因
子を認識し得なかった。これらの観察は一緒にされて、
抗体７１”　３により認識されるエピトープがＯＭＰに
あることを示す。

抗体７Ｆ３エピトープを含むＯＭＰが表面露出されたか
否かを判断するため、ＯＭＰはラクトペルオキシダーゼ
触媒による放射能ヨウ素化操作（上記のハンセンらの文
献を参照のこと）を用いてラベルされた。第１図は抗体
７Ｆ３エピトープを含むタンパク質が放射能ラベルされ
ることを示す。この観察は、この１６，６００ダルトン
のＯＭＰが表面露出されることを示唆する。本発明の目
的のため、“表面露出された”または“外膜”は、抗体
結合に利用可能なことを意味する。

類別し７得ないインフルエンザ菌のＯＭＰｓは、５ＤＳ
−ＰＡＧＥ分析により示されるように、実質的な菌株変
位性を示す。３２，０００〜４２，０００ダルトンの範
囲の主要なＯＭＰｓに於ける、この変位性は、類別し得
ないインフルエンザ菌に関する亜型系の基準である（上
記のムーフィらの文献を参照のこと）。三つの研究所か
らのインフルエンザ菌のＯＭＰｓの研究は独立に研究さ
れた・ｆンフルエンザ菌の全ての菌株中の“１６．６０
０”ダルトンのＯＭＰの存在を注目していたことは重要
である（上記のムーフィらの文献、バレンカンプらの文
献及びローブらの文献を参照のこと）。抗体７Ｆ３によ
り認識される抗原性決定因子を含むのは、このタンパク
質である。本研究は、この低分子量ＯＭＰの抗体７Ｆ３
により認識されるエピトープがインフルエンザ菌の全て
の菌株に共通の抗原であることを示す。菌株の中で共通
の表面抗原を同定することは、ワクチン開発の観点から
有用である。何となれば、単一の共通抗原による免疫化
は多くの菌株による病気からの保護を誘導し得るからで
ある。加えて、この１６，６００ダルトンのタンパク質
が進化の過程でその他のＯＭＰｓよりはるかに少なく変
化したという観察は、このタンパク質がバクテリアに対
して重要な機能を果たすという推論、及びその機能がそ
の構造の保存に密接に関係するという推論へと導く。

ダラム陰性バクテリアの外膜は、宿主防禦機構へのそれ
らの接近可能性のため、免疫学的に重要な構造である。

事実、インフルエンザ菌す型のＯＭＰ３に対する抗体は
底入に広く存在し、インフルエンザ菌による感染から快
復しつつある乳児の血清中に検出される。１６，６００
ダルトンのＯＭＰ（ｐ６）に対する抗体がヒト血清中に
存在することが、全実証された（第３図を参照のこと）
、正常のヒト血清中のこのＯＭＰに対する抗体の存在は
、ＯＭＰがインフルエンザ菌に対するヒトの抗体に関し
て重要であることを示唆する。

幾つかの観察は、ｐ６がインフルエンザ菌に対する免疫
に於いて重要な標的であることを示唆する。

ｂ型苗株から分離されたｐ６から生した抗体は、乳児ネ
ズ兆モデルで保護する。

２）　ｐ６に対して送られるモノクローナル抗体７Ｆ３
は、インフルエンザ菌に対するヒトの殺菌活性を阻害す
る。

■） ３）　アフィニティクロマトグラフによる正常のヒト血
清からｐ６の減少は、インフルエンザ菌に対するその血
清の減少された殺菌活性をもたらした。

４）　そして、ヒト血清からのｐ６に対する免疫精製抗
体は殺菌性であった。

ｐ６は、バクテリア染色体ＤＮＡの源としてインフルエ
ンザ菌、ゲノムライブラリーの構成に於けるベクターと
してλｇｔｌｌバクテリオファージ、遺伝子をサブクロ
ーン化して配列を容易にするのに使用されるベクターと
してｐｔＪｃ１８プラスミド、宿主菌株として大腸菌を
使用して分子的にクローン化し得る。これらの結果は、
ｐ６に対する実験的免疫及びヒトの免疫の両方の分子基
礎を更に分析することを可能にし、且つそれがインフル
エンザ菌に対するワクチンに使用することが一旦証明さ
れると、多量のｐ６が生産されることを可能にする。

ｐ６の分子クローン化： 本明細書中、ｐ６と称される１６，６００ダルトンのタ
ンパク質は、それ故、インフルエンザ菌の類別し得る菌
株及び類別し得ない菌株の両方の外膜中に存在し、イン
フルエンザ菌に対する免疫に於ける重要な標的であり得
る。この１６，６００ダルトンの外股タンパク質を形質
発現する遺伝子のＤＮＡ配列は、ヌクレオチド１２５で
開始すると思われ、ヌクレオチド５２６まで続く。ｐ６
は、バクテリア染色体ＤＮＡの源としてインフルエンザ
菌の類別し得ない菌株、ゲノムライブラリーの構成に於
けるベクターとしてλｇｔｌｌバタテリオファージ、遺
伝子をサブクローン化して配列を容易にするー・フタ−
としてＰＵＣ１８プラスごド、宿主菌株として大腸菌を
使用して分子的にクローン化される。

前記のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清が
ｐ６の形質発現をスクリーニングするのに使用された。

ゲノムライブラリーの一部がスクリーニングされて、４
つのポジティブ組換え体の検出をもたらした。一つのク
ローンＯは、高い度数で形質発現された充分な長さの遺
伝子生産物を生産するようである。このクローンのＤＮ
Ａインサ−トが遺伝子をプラスミドベクターにサブクロ
ーン化するのに使用された。また、大腸菌形質転換体は
、充分な長さの遺伝子生産物を形質発現するようである
。転写はｐ６ｉ！！伝子の実際のプロモーターから開始
されるようである。何となれば、クローンＯ及び形質変
換体７−９Ｂの両者が未誘導状態及び誘導状態の両方で
遺伝子生成物を形質発現するからである。ｐ６に関する
遺伝子の分離及び配列は、ｐ６に対する実験的な免疫及
びヒトの免疫の両方の分子基礎を更に分析することを可
能にする。

更に詳細には、組換えＤＮＡ技術が、類別し得ないイン
フルエンザ菌（ＮｔＨｉ）の１６，６００ダルトンの表
面タンパク質、即ちｐ６の遺伝子を大腸菌にクローン化
するのに使用された。臨床分離株からの染色体ＤＮＡが
剪断され、λｇｔｌｌアームにつながれ、ファージヘッ
ドに詰め込まれた。４つの組換えファージが、モノクロ
ーナル抗体及びポリクローナル抗血清でスクリーニング
することにより検出された。一つのクローンＯは、Ｅｃ
ｏＲｌで制限され、プラスミドベクターｐＵｃ１８につ
ながれて配列を容易にした。組換えプラスくドを有する
大腸菌はスクリーニングされて、一つのポジティブ７−
９Ｂを生じた。クローンＯ及び７−９Ｂの両者は、ウェ
スタンプロット分析により測定してネガティブｐ６に等
しいか、または近似する見掛は分子量を有するタンパク
質を生産する。スクリーニングに際し、インフルエンザ
菌ｐ６遺伝子の転写及び翻訳は、いずれかのベクターの
ｌａｃオペレーター及びプロモーターに依存しないこと
が決定された。免疫蛍光法を用いて、組換え遺伝子生産
物のｐ６エビトープがこれらの大腸菌の表面に局在化で
き、抗体に接近し得た。

インフルエンザ菌株１４７９は、ヘム（１０，＋ｚｇ／
　ｍｌ　）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（１０μｇ　／ｍｅ）で補充された脳心臓注入ブロース
中で３７℃で増殖された。

大腸菌株ｙ１０９０　（ｉ　ｍ”）がバクテリオファー
ジλｇｔｌｌの溶菌成長に使用され、宿主としての菌株
ＪＭ８３がプラスミドｐＵｃ１８に使用された。大腸菌
は、宿主菌株に応じて、アンピシリン５０μｇ／−を用
いて、または用いずに、Ｌ−ブロース（ＬＢ）中、また
は寒天上で増殖された。夫々の宿主菌株の使用に関する
更に詳細な説明は、ほかの所に見られる。ヤング（Ｙｏ
ｕｎｇ）ら著、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２巻、７７８〜７
８２頁、Ｍｅｒｓｉｎｇ　Ｒｅｃ、　ＤＮＡ　　Ｔｅｃ
ｈ、　Ｂｕｌｌ、　　２巻、４３〜４８頁を参照のこと
。

７５０Ｗｄｌの培養菌からのインフルエンザ菌１４７９
細胞のベレットが、１０ｍＭのへベス（ＨＥＰＥＳ）緩
衝液（ｐｆ１７．４　）　　１０　ｍｌ中で再懸濁され
た。この混合物にＥＤＴＡが５ｍＭの濃度まで添加され
、ＳＤＳが０．５％ｗ　／　ｖの濃度まで添加され、つ
いで６０℃で３０分間保温された。ついで、この溶菌液
がプロナーゼ（１０ｍｇ／　ｍＡ’）　０．５−で３７
℃で２時間消化され、ついで２回のフェノール／ＣＩＡ
Ａ抽出にかけられ、続いて１回のＣｒＡＡ抽出にかけら
れた。塩化ナトリウムが水相に０．２　Ｍの濃度まで添
加され、ＤＮＡが２．５容量の冷却エタノールで沈殿さ
れた。冷却液中の沈殿後に、ＤＮＡは遠心分離によりベ
レットにされ、トリス−ＥＤＴＡｌｉ衝液中で再懸濁さ
れ、０．１ｍｇ／ｄの濃度のデオキシリボヌクレアーゼ
を含まないリボヌクレアーゼで３７℃で１時間処理され
た。最後に、ＤＮＡがフェノール／ＣＩＡＡで抽出され
、塩化ナトリウム及びエタノールで沈殿され、遠心分離
によりベレットにされた。ＤＮＡはトリス−ＥＤＴＡ緩
衝液中で再懸濁され、Ａ２６０／Ａ２８０により濃度に
ついて測定され、４℃で貯蔵された。

ファージライブラリーは、モノクローナル抗体７Ｆ３で
スクリーニングされた。また、インフルエンザ菌株１８
０８の可溶化ｐ６ＲＪｉＪ製物による免疫化により生産
されたウサギポリクローナル抗血清が、スクリーニング
に使用された。

インフルエンザ　１４７９ゲノムライブラリーの構成第
４図に示されたライブラリーの構成に関する計画は、実
質的にヤング及びデービス（Ｄａｖｉｓ）により記載さ
れたものであった（１９８５年、７巻、２９〜４１頁、
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　、プレナム
・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　、ニューヨー
ク）。インフルエンザ菌１４７９ＤＮＡが或種の１０秒
の群発（２にセットした出力コントロール）による音波
処理により平均長さ２〜４キロ塩基対（ｋｂ）に剪断さ
れた。剪断の程度は、アガロースゲル電気泳動に監視さ
れた。この剪断ＤＮＡ５０μｇのＥｃｏＲ１部位がＥｃ
ｏＲメチラーゼを用いてメチル化された。メチル化ＤＮ
Ａの末端がタレノーポリメラーゼ及びデオキシヌクレオ
チドトリホスフェートの添加により平滑にされた。この
反応及び酢酸す）　ＩＪウムの０．３Ｍの濃度までの添
加の後、Ｄ　Ｎ　Ａが沈殿された。遠心分離後、ペレッ
トがトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中で再懸濁された。ついで
、ＤＮＡが、ホスホリル化されたＥｃｏＲ１リンカ−（
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　
、ベセスダ、メリーランド）につながれた。連結反応は
、混合物を７０℃に加熱することにより停止され、つい
で過剰のＥｃｏＲ１！Ｊンカーが過剰のＥｃｏＲｌを用
いて消化された。ＥｃｏＲ１！Ｊンカーに平滑末端でつ
ながれたメチル化インフルエンザ菌１４７９ＤＮＡは、
１０ｍＭトリス　（ｐ）１７．５）　、１００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１，１＋ｎＭＥＤＴＡを含むカラム緩衝液を用いて
ゲル′濾過カラム（バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　ｐ　
６０、バイオラド・ラボラトリイズ（ＢＩＯＲＡＤ　Ｉ
ａｂｏｒａｔｏｒｉ、ｅｓ）、リッチモンド、カリフォ
ルニア）に通すことにより過剰のリンカ−から精製され
た。画分はＡ２８０及びアガロースゲル電気泳動により
監視さた。所望の大きさ範囲のＤＮＡを含む画分が溜め
られ、沈殿された。ＤＮＡは遠心分離によりペレ・ノド
にされ、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液４μＣに再）耐層され
た。ＤＮＡは、合計反応容量１０μｌ中で脱ホスホリル
化λｇｔｌｌアーム（ストラタゲン・クローニング・シ
ステムズ（５ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ　　ＣｌｏｎｒｎｇＳ
ｙｓ　ｔｅｍｓ）、サンジエゴ、カリフォルニア）３μ
ｇにつながれた。連結混合物は、製造業者（ギガバック
（Ｇｉｇａｐａｃｋ、商標）、ストラタゲン・クローニ
ング・システムズ）の指示に従って、二つのパッケージ
ング抽出物を用いて詰め込まれた。詰め込まれたファー
ジは、プラーク形成単位の力価を測定し、且つＬＢ＋Ａ
ＭＰプレート上のＩＰＴＧ及びＸ−ガル（Ｘ−ｇ（１３
））　　による増殖により非組換えバンクグラウンドを
測定するため、大腸菌株ｙ１０９０に塗布された。ライ
ブラリーは、５％以下のバックグラウンドを有する約１
．５Ｘ１０ｂ個の独立の組換えクローンを含む。

ライブラリーのスクリーニング 第５図は、スクリーニングに使用した方法を示す。ｙ１
０９０の塗布株、即ち１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４中に再懸
濁されたｙ１０９０ペレット０．２　ｎ＋１が、夫々の
８５ｍｍのプレートに関しλｇｔｌｌライブラリーの１
．５Ｘ１０”　ＰＦＵ　（プラーク形成単位）で感染さ
れた。吸着保温後に、細胞がＬＢ−７ガロース緩衝液と
混合され、ＬＢ＋ＡＭＰプレートの上に注がれ、均一に
広げられた。ついで、プレートは４２℃で３時間保温さ
れた。ついで、各プレートは、１０ｍＭ　　ＩＰＴＧ中
で予め飽和された乾燥ニトロセルロースフィルターデス
クで上に重ねられた。ついで、プレートは、３７℃で３
時間保温された。フィルターを除去する前に、配向が記
録され、フィルター及び夫々のプレートがラベルされた
。フィルターはバッファーＡ（０，０１Ｍトリス、Ｏ，
ｌ　５Ｍ　ＮａＣＣｐＨ７，４）　テ簡単にすすカレ、
バッファーＡ中の３％ゼラチン中に１時間置かれた。フ
ィルターがバッファーＡで再度すすがれた後、それらは
抗体のスクリーニング混合物中で室温で一夜保温された
。スクリーニング混合物は、１：１０００の力価の７Ｆ
３腹水液を含むバッファーＡであった。使用したモノク
ローナル抗体は、大腸菌宿主菌株と交差反応性を共有し
なかったが、アンチ（ａｎｔｉ）　−１８０８抗血清は
感受性及び特異性を維持するため１　：　ｔｏ、　００
０の希釈作業を必要とした。フィルターがバッファーＡ
ですすがれ、タンパク貿Ａ−ペルオキシダーゼ複合体の
１：３０００希釈液中に入れられ、室温で１時開拡とう
された。フィルターはバッファー、八で再度すすがれ、
ついでホースラデイツシュペルオキシダーゼ発色液（０
，１５％Ｈ２Ｏ２；バイオラド、リッチモンド、カリフ
ォルニア〉中に４５分間浸漬された。ポジティブに現わ
れたプラークは、それらの夫々のプレートから除去され
、ＳＭ緩衝液５００μｌ中に再懸濁され、再度スクリー
ニングされた。再度のスクリーニングでポジティブであ
ったプラークは、その後、スクリーニングン昆合物でな
く個々の抗体に対して再度スクリーニングされた。

皇Ｊ二しＬ乙ｚ！二二比り梶 インフルエンザ菌対照、ｙ１０９０組換え体、及び分子
量標準物は、０，０６　Ｍ　Ｉ−リス（ｐ）１６．８）
、１．２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、１
１．９％グリセロール及び０．００３％ブロモフェノー
ルブルーを含む試料緩衝液中で１００℃で５分間加熱す
ることにより調製された。調製物は１５％の分離用ゲル
上で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。ゲルは、茅留水中
で予め沸騰されたニトロセルロースシート上に置かれ、
０．３Ｍクエン酸ナトリウム、３ＭＮａＣｌ１？Ｓ液中
に浸漬された。電気泳動転移は、０．０２５Ｍ１−リス
（ｐＨ８，３）、０．１９２Ｍグリシン及び２０％メタ
ノールのｌｌｉ液中でトランスフォア（Ｔｒａｎｓｐｈ
ｏｒ　、商標〉電気泳動装置（ホーファー・サイエンテ
ィフィック・インストルメンツ（ｌｌｏｅｆｅｒ　５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ　［ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、サンフ
ランシスコ、カリフォルニア）を用いて５０ボルトで９
０分間行なわれた。抗体、複合体の連続製力■による封
鎖及び基質発生は、プラークスクリーニングに記載され
たのと同様に行なわれた。

プラスミドベクターへのサブクローン 配列を容易にするための計画が工夫された。

ｐ６エビトープを形質発現する（スクリーニングにより
決定されるように）組換えファージのＤＮＡインサート
（８６７の残基からなる）が、プラスミドベクターにサ
ブクローン化された。

ｐＵｃ１８が、選択手段、誘導プロモーター及びファー
ジクローン化ベクターλｇｔｚにより剪断されたＥｃｏ
Ｒ１制限部位特徴を含む幾つかの理由のため、サブクロ
ーン化のプラスごドベクターとして選択された。組換え
ファージのＤＮＡがＥｃｏＲｌで制限され、ついでＥｃ
ｏＲＩで制限されたｐＵｃ１８につながれ、仔ウシ゛の
腸アルカリホスファターゼを用いて脱ホスホリル化され
た。その連結混合物は、受容大腸菌株を形質変換するの
に使用された。形質変換体は、ＩＰＴＧ及びＸ−ガルで
上塗りされたＬＢ＋ＡＭＰプレートでの増殖により選択
された。プラスミドベクタ−トを含むＪＭ３に相当する
と考えられる白色コロニーが個々に取り出され、Ｌ−ブ
ロース＋ＡＭＰ−１−１０％グリセロールを含むマイク
ロタイタのウェルに移された。プレートは３７℃で一夜
保温された。

くし装置が、マイクロタイタブレートから、ＩＰＴＧ中
に予め含浸され、ＬＢ＋ＡＭＰプレートの上に重なるニ
トロセルロースシートの上に植菌するのに使用された。

プレートは３７℃で一夜保’ｔ＝され、ついでニトロセ
ルロースシートが取す出された。ニトロセルロースは、
クロロホルム蒸気を含む室中で１５分間つるされ、コロ
ニーを溶菌し、４０μｇ／ｍｌのリソチームを含む３％
ゼラチン中で封鎖され、ゲノムライブラリーと同様にし
てスクリーニングされた。

猪−果： ゲノムライブラリーのスクリーニング及び組　え　の特
性 約４５，０００のプラークがスクリーニングされ、未増
幅ライブラリーの残りが７％ＤＭＳ○中のアリコート中
で一７０℃で凍結された。λｇｔｌｌ−インフルエンザ
菌１４７９クローンｏ、ｐ、８、及び１０と称される４
つの反応性クローンか、見られた。クローンＯ及びＰは
８または１０より多い量であり、且つ／またはネガティ
ブタンパク質、ｐ６の立体構造に更に近似する遺伝子生
産物を形質発現するようであるので、試験はクローン０
及びＰに集中した。

クローン０及びＰを含むプレートが、注意してこすられ
、ウェスタンプロット分析用のタンパク質を回収した。

ウェスタンプロットは、クローンＯ及びＰの両者がネガ
ティブｐ６に大きさが同しか、または近似するタンパク
質を生産することを示す。しかしながら、クローン○は
、クローンＰに較べると、タンパク質を多量に生産する
。それ故、クローンＯがプラスミドベクター中にサブク
ローン化するＤＮＡの源用の組換えファージとして選択
された。

プラスミドベクター中へのサブクローン化び　　　　　
　　の 同じ形質変換からの１０００の形質変換体がスクリーニ
ングされて、一つの７−９Ｂがポジティブであることが
わかった。７−９Ｂが純粋培養であることを確かめるた
めに、ポジティブコロニが取り出され、継代され、再度
スクリーニングされた。プレートの上及びブロース中に
増殖された７−９Ｂのウェスタンプロットは、この組換
え体がまたネガティブｐ６と等しいか、または近似する
見掛は分子量の遺伝子生産物を生産することを示す。７
−９Ｂから単離された組換えプラスミドはＥｃｏＲｌを
用いて制限され、アガロースゲル電気泳動にかけられて
インサートの大きさを測定した。制限分析はｐ６遺伝子
を含む２．５ｋｂ　　ＤＮＡインサートの存在を明らか
にする。

分子クローン化技術を用いて、インフルエンザ菌１４７
９ｐ６、即ち１６．６　Ｋダルトンの外膜タンパク質を
暗号化する遺伝子を含む組換えプラスミド及び＆ＩＩ換
えファージの両方が生産された。そのタンパク質は、核
酸１２５〜核酸５２６の核酸配列により包括的に記載し
得る。ファージクローン０による、及びＭｉ換えプラス
ミド７−９Ｂによる遺伝子生産物の形質発現は、Ｂ−ガ
ラクシダーゼプロモーターの誘導とは独立である。この
知見は、クローン０の遺伝子生産物及び組換え体７−９
Ｂの遺伝子生産物の間に電気泳動の移動度の差が明らか
にないことを示すウェスタンプロット分析と対になって
、組換え遺伝子生産物がそれ自体のｐ６遺伝子の構成プ
ロモーターから開始されるという可能性の確証を与える
。

１６、６　Ｋダルトンのタンパク質のエピトープは、大
腸菌形質変換体７−９Ｂの表面のモノクローナル抗体７
Ｆ３に接近し得る。

特にことわらない限り、全ての微生物菌株は一般に入手
し得る。本明細書に記載された全てのこのような菌株は
、チモシイ・ムーフィー（ＴｉｍｏｔｌｉｙＭｕｒｐｈ
ｙ）博士（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ。

５ｔａｔｅ　　［Ｉｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　　Ｃ１１ｎｉｃ（１３）　　Ｃｅｎｔｅ
ｒｓ４６２　Ｇｒｉｄｅｒ　５ｔｒｅｅｔｓバツフアロ
ー、ニューヨーク１４２１５　）から人手し得る。イン
フルエンザ菌株３５２４及び１４７９、プラスミド７−
９Ｂを含む大腸菌株ＪＭ８３及びハイブリドーマ７Ｆ３
は、ブタペスト条約に従って、ザ・アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ
　ＤｒｉｖｅＳＲｏｃｋｖｉｌｌｅ　、、　ＭａｒｙＩ
ａｎｄ２０８５２　）に寄託されている。

インフルエンザ　の　　タンパク　の インフルエンザ菌の外膜タンパク質の精製方法が、本発
明に開示される。

本明細書に開示された方法は、従来の方法よりもかなり
簡単である。水抜は、洗剤を含む緩衝液中の保温のため
の出発原料として全バクテリアを利用し、それ故、従来
の方法で必要であったような外膜を分離する初期工程を
省く。全バクテリアは、バクテリアが未処理状態で使用
されることを意味する。

懸濁媒体中のインフルエンザ菌が、ペプチドグリカンと
会合した外膜タンパク質を含む第一画分を直接得るのに
使用される。懸濁媒体は、その画分が不溶性である液体
であり、洗剤緩衝液であってもよい。洗剤緩衝液は、外
膜タンパク質及びペプチドグリカンが不溶性である、洗
剤を含む緩衝液を意味する。好適な洗剤は、ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳと称する）を含む。好適な洗剤緩
衝液の例は、バッファーＢである。バ、、ファーＢは１
％ＳＤＳ、０．１％β−メルカプトエタノール、０．０
１Ｍトリス、０．５　Ｍ　ＮａＣ１，（ｐｔ１８．０　
）を含む。ペプチドグリカンと会合した外膜タンパク質
（ｐ６）を含む第一画分は、連続的に懸濁液を熱処理し
遠心分離することにより得られる。懸濁液は、細胞の？
：！、濁を助けるために簡単に音波処理されてもよい。

熱処理は、当業者に知られるいずれの好適な手段による
ものであってもよい。熱処理の好適な手段の例は、約２
０℃−約３７℃で約２０〜４０分間の保温である。遠心
分離は、周囲温度で約３０〜６０分間約２０，０００ｇ
〜約４０．０００　ｇである。ここで使用される周囲温
度は約り０℃〜約２７℃を意味する。連続的な熱処理及
び遠心分離は、懸濁媒体中のインフルエンザ菌が、ペプ
チドグリカンと会合したｐ６を含む第一画分が生成され
るまで、熱処理され、ついで遠心分離され、ついで懸濁
媒体中に再懸濁され、熱処理され遠心分離されることを
意味する。

ついで、混在ＲＮＡが、第一液体中の消化性材料の使用
により第一画分から消化され、第一液体中で外膜タンパ
ク質と会合したペプチドグリカンは不溶性のままであり
、消化された混在ＲＮＡが可溶性であり、その結果第二
画分が生成される。

第二画分は、第一液体に不溶性であり、ペプチドグリカ
ンと会合した外膜タンパク質を含む。混在ＲＮＡは、ｐ
６及びペプチドグリカンと共に第二画分中に存在するＲ
ＡＮを意味する。消化性材料は混在ＲＮＡの消化を可能
にし、一方ｐ６はそのペプチドグリカンとの会合のため
不溶性形態のままである。消化性材料の例はりボヌクレ
アーゼＡである。第一液体は、上記の如き洗剤緩衝液で
あってもよい。可溶性は、第二画分に関して選択的に懸
濁可能または除去可能であることを意味する。

消化性材料は洗剤緩衝液に添加され、混合物が連続的に
熱処理され、遠心分離される。熱処理及び遠心分離は、
上記のとおりである。連続的な熱処理及び遠心分離は、
混在ＲＮＡが消化され、第二画分が生成されるまで、第
一画分が消化性材料を含む洗剤緩衝液中で懸濁され、熱
処理され、遠心分離されることを意味する。

外膜タンパク質（ｐ６）は、外膜タンパク質が可溶性で
あり、且つペプチドグリカンが不溶性である第二液体中
で懸濁し、ついで熱処理して外膜タンパク質をペプチド
グリカンから遊離して可）容化外膜タンパク質を含む第
三液体を得ることにより、第二画分から分離される。外
膜タンパク質が可溶性であり、ペプチドグリカンが不溶
性である液体の例は、洗剤を含まない緩衝液である。洗
剤を含まない緩衝液は、洗剤が添加されていない緩衝液
を意味する。好適な洗剤を含まない緩衝液の例は、トリ
ス緩衝液、ＰＢＳ及びテトラホウ酸ナトリウム緩衝液で
ある。好ましい洗剤を含まない緩衝液は、テトラホウ酸
ナトリウム緩衝液である。

第二画分は、洗剤を含まない緩衝液中で懸濁され、約５
０〜７５℃で約３０〜６０分間熱処理される。

ついで、懸濁液は、外膜タンパク質を含む上澄液（第三
液体）が得られるまで、充分な温度で充分な時間にわた
って約８０．０００ｇ〜約１２０，０００　ｇで遠心分
離される。ついで、望ましくない細胞成分を含まない、
ｐ６の可溶性調製物を含む上澄液が、回収される。望ま
しくない細胞成分は、リポオリゴ糖、ｐ６以外のタンパ
ク質、ペプチドグリカン、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。

ついで、上澄液が、当業者に知られる手段により濃縮さ
れる。この手段は加圧濾過法を含む。

以下の実施例は、本発明を実施し使用する方法を記載し
、本発明を行なうための本発明者により意図される最良
の態様を示すが、本発明を限定するものと解すべきでは
ない。

バクテリアをブロース中で増殖し、バクテリア２５ｇを
バッファーＢ中で懸濁し、簡単に音波処理して細胞の懸
濁を助け、３７℃で３０分間保温した。保温後、懸濁液
を２５℃で３０分間２０，０００ｇで遠心分離した。上
澄液を捨て、不溶性画分をバッファーＢ中に再懸濁し、
保温し、上記のように遠心分離した。保温及び遠心分離
のこのサイクルを、合計５回繰返した。最後の２回の保
温に関して、リボヌクレアーゼＡ（１０μｇ／ｍｌ）を
バッファーＢに添加する。この工程でリボヌクレアーゼ
を含むことは、混在ＲＮＡの消化を可能とし、一方ｐ６
はペプチドグリカンとそれとの会合のため不溶性形態の
ままである。このようにして、リボヌクレアーゼ及びＲ
ＮＡ分解生戒生成可溶性のままであり、一方ｐ６及びペ
プチドグリカンは不溶性のままである。

ｐ６／ベブチドグリカン不溶性画分を、０．１　Ｍテト
ラホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中で懸濁し、
６５℃で３０分間保温した。ついで、混合物を３５℃で
１時間１００，０００　ｇで遠心分離した。

この工程はペプチドグリカンからｐ６をｔｊ、Ｈシ、そ
の結果、可溶化ｐ６が上澄液中に留まる。ついで、この
上澄液を加圧濾過により約１０倍に濃縮した。容量をそ
のもとの容量にもどし、再度濃縮した。ホウ酸緩衝液を
用いて、この濃縮及び洗浄操作を５回行なった。得られ
たｐ６調製物は、以下のように特性決定された。５ＤＳ
−ＰＡＧＥは約１６，０００ダルトンの分子量で単一の
タンパク買置を生じる。調製物は、モノクローナル抗体
を用いて検出し得るリボオリゴ糖を含まない。可溶性ｐ
６の吸光度スペクトルは、２７５ｎＭの波長でピークを
示した。アガロースゲル電気泳動は、調製物がＤＮＡ及
びＲＮＡを含まないことを明らかにした。それ故、最終
調製物はインフルエンザ菌から精製された可溶化ｐ６タ
ンパク質を含む。この物質のアミノ酸分析は、アミノ酸
含量が本明細書に開示されたＤＮＡ配列から予想される
アミノ酸含量と一致することを示す。

本発明のその他の実施態様は、本明細書の考察または本
明細書に開示された本発明の実施から、当業者に明らか
である。特許請求の範囲に特定さ、れる本発明の精神及
び範囲に入るその他の実施態様があり得ることが、理解
されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗体７Ｆ３により認識された決定因子が１６
．６００ダルトンの分子の大きさをもっタンパク質にあ
ったことを示すウェスタンプロットを示すＶ−真？”／
）ン６ 第２図は、抗体７Ｆにより認識されたエピトープがタン
パク質またはＬＰＳにあるか否かを分析するのに設計さ
れた別の実験を示すウェス１クンブロア）脅印−含毒喝
４を示イ写Ａ７−ｈｓ。 第３図は、同一のゲルで分析され、ニトロセルロース紙
に移された類別し得ないインフルエンリ′菌株の全細胞
調製物のウェスタンブロンドを示ず写真マ・・７）、５
゜第４咳は、インフルエンザ菌１４７９ゲノムライブラ
リーの構成に関する計画を図示する。 第５図は、スクリーニングに使用した方法を図示する。 第６図は、１６　、６００ダルトンの外膜タンパク質を
形質発現する遺伝子のアごノ酸配列を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）ペプチドグリカンと会合した免疫原性外膜タ
   ンパク質を含む第一画分を懸濁媒体中のインフルエンザ
   菌の懸濁液から直接に得る工程、（上記の画分は上記の
   懸濁媒体に不溶性である）、 ｂ）第一画分を懸濁液から分離する工程、 ｃ）外膜タンパク質と会合したペプチドグリカンが不溶
   性であり、且つ消化されだＲＮＡが可溶性である第一液
   体中で消化性材料で処理することにより第一画分から混
   在ＲＮＡを消化して、外膜タンパク質及びペプチドグリ
   カンを含む第二画分を生成する工程、 ｄ）上記の第一液体から上記の第二画分を分離する工程
   、 ｅ）上記の外膜タンパク質が可溶性であり、且つペプチ
   ドグリカンが不溶性である第二液体中で第二画分を懸濁
   して、可溶化外膜タンパク質を含む第三液体を得る工程
   、ついで ｆ）可溶化外膜タンパク質を含む第三液体を不溶性ペプ
   チドグリカンから分離し、外膜タンパク質を濃縮する工
   程 を含むことを特徴とする、インフルエンザ菌の免疫原性
   外膜タンパク質の精製方法。
2. （２）ａ）洗剤緩衝液中で懸濁し、ひき続いて熱処理し
   、遠心分離してペプチドグリカンと会合した免疫原性外
   膜タンパク質を含む不溶性画分を生成することによりイ
   ンフルエンザ菌を集菌する工程、 ｂ）外膜タンパク質と会合したインフルエンザ菌ペプチ
   ドグリカンが不溶性である洗剤緩衝液中で消化性材料で
   処理することにより、工程ａで生成された不溶性画分か
   ら混在ＲＮＡを消化する工程、 ｃ）緩衝液を含まない洗剤中で懸濁し、熱処理し、遠心
   分離して外膜タンパク質を含む上澄液を得ることにより
   、工程ｂで生成された不溶性画分から外膜タンパク質を
   分離する工程、ついで ｄ）上澄液中の外膜タンパク質を濃縮する工程を含むこ
   とを特徴とする、インフルエンザ菌の免疫原性外膜タン
   パク質の精製方法。
3. （３）外膜タンパク質がｐ６である、請求項２記載の方
   法。
4. （４）不溶性画分生成工程が、 ａ）インフルエンザ菌細胞を洗剤緩衝液中で懸濁する工
   程、 ｂ）約２０〜３７℃で約２０〜４０分保温する工程、 ｃ）約２０，０００ｇ〜約４０，０００ｇで周囲温度で
   約３０〜６０分間遠心分離する工程、 ｄ）洗剤緩衝液中に再懸濁する工程、ついで ｅ）不溶性画分を生成するのに充分な時間にわたって工
   程ｂ及びｃを繰返す工程を含む、請求項３記載の方法。
5. （５）洗剤緩衝液がバッファーＢである、請求項４記載
   の方法。
6. （６）バッファーＢが１％ＳＤＳ、０．０１Ｍトリス、
   ０．５Ｍ　Ｎａ　Ｃｌ、０．１％β−メルカプトエタノ
   ール（ｐＨ８．０）を含む、請求項５記載の方法。
7. （７）懸濁工程が細胞の懸濁を助けるのに充分な時間に
   わたって音波処理する工程を更に含む、請求項４記載の
   方法。
8. （８）懸濁工程が細胞の懸濁を助けるのに充分な時間に
   わたって音波処理する工程を更に含む、請求項６記載の
   方法。
9. （９）保温が３７℃で３０分間である、請求項５記載の
   方法。
10. （１０）保温が３７℃で３０分間である、請求項７記載
    の方法。
11. （１１）遠心分離が２０，０００ｇで３０分間である、
    請求項４記載の方法。
12. （１２）遠心分離が２０，０００ｇで３０分間である、
    請求項７記載の方法。
13. （１３）遠心分離が２０，０００ｇで３０分間である、
    請求項９記載の方法。
14. （１４）消化工程が ａ）消化性材料を含む洗剤緩衝液中で工程１で生成され
    た不溶性画分を懸濁する工程、 ｂ）約２０〜３７℃で約２０〜４０分間保温する工程、 ｃ）約２０，０００ｇ〜約４０，０００Ｇで周囲温度で
    ３０〜６０分間遠心分離する工程、 ｄ）上澄液を捨てる工程、ついで ｅ）工程ａ、ｂ、ｃ、及びｄを繰返す工程を含む、請求
    項３記載の方法。
15. （１５）消化工程が ａ）消化性材料を含む洗剤緩衝液中で工程１で生成され
    た不溶性画分を懸濁する工程、 ｂ）約２０〜３７℃で約２０〜４０分間保温する工程、 ｃ）約２０，０００ｇ〜約４０，０００Ｇで周囲温度で
    約３０〜６０分間遠心分離する工程、 ｄ）上澄液を捨てる工程、ついで ｅ）工程ａ、ｂ、ｃ及びｄを繰返す工程を含む、請求項
    １３記載の方法。
16. （１６）消化性材料がリボヌクレアーゼＡである、請求
    項１４記載の方法。
17. （１７）消化性材料がリボヌクレアーゼＡである、請求
    項１５記載の方法。
18. （１８）リボヌクレアーゼＡがバッファーＢ１ｍｌ中約
    １０μｇの量で存在する、請求項１６記載の方法。
19. （１９）リボヌクレアーゼＡがバッファーＢ１ｍｌ中約
    １０μｇの量で存在する、請求項１７記載の方法。
20. （２０）保温が約３７℃で約３０分である、請求項１４
    記載の方法。
21. （２１）保温が約３７℃で約３０分である、請求項１５
    記載の方法。
22. （２２）保温が約３７℃で約３０分である、請求項１９
    記載の方法。
23. （２３）遠心分離が２０，０００ｇで２０分である、請
    求項１４記載の方法。
24. （２４）遠心分離が２０，０００ｇで２０分である、請
    求項１５記載の方法。
25. （２５）遠心分離が２０，０００ｇで２０分である、請
    求項２２記載の方法。
26. （２６）分離工程が ａ）不溶性画分を、洗剤を含まない緩衝液中で懸濁する
    工程、 ｂ）約５０〜７５℃で約３０〜６０分間保温する工程、 ｃ）ｐ６を含む上澄液が得られるまで、充分な温度で充
    分な期間にわたって約８０，０００〜約１２０，０００
    ｇで遠心分離する工程、ついでｄ）上澄液を回収する工
    程 を含む、請求項３記載の方法。
27. （２７）分離工程が、 ａ）不溶性画分を、洗剤を含まない緩衝液中で懸濁する
    工程、 ｂ）約５０〜７５℃で約３０〜６０分間保温する工程、 ｃ）ｐ６を含む上澄液が得られるまで、充分な温度で充
    分な期間にわたって約８０，０００〜約１２０，０００
    ｇで遠心分離する工程、ついでｄ）上澄液を回収する工
    程 を含む、請求項１５記載の方法。
28. （２８）分離工程が、 ａ）不溶性画分を、洗剤を含まない緩衝液中で懸濁する
    工程、 ｂ）約５０〜７５℃で約３０〜６０分間保温する工程、 ｃ）ｐ６を含む上澄液が得られるまで、充分な温度で充
    分な期間にわたって約８０，０００〜約１２０，０００
    ｇで遠心分離する工程、ついでｄ）上澄液を回収する工
    程を含む、請求項２５記載の方法。
29. （２９）洗剤を含まない緩衝液がｐＨ９．５を有する０
    ．１Ｍのテトラホウ酸ナトリウム溶液である、請求項２
    ６記載の方法。
30. （３０）洗剤を含まない緩衝液がｐＨ９．５を有する０
    ．１Ｍのテトラホウ酸ナトリウム溶液である、請求項２
    ７記載の方法。
31. （３１）洗剤を含まない緩衝液がｐＨ９．５を有する０
    ．１Ｍのテトラホウ酸ナトリウム溶液である、請求項２
    ８記載の方法。
32. （３２）保温が６５℃で３０分間である、請求項２６記
    載の方法。
33. （３３）保温が６５℃で３０分間である、請求項２７記
    載の方法。
34. （３４）保温が６５℃で３０分間である、請求項２８記
    載の方法。
35. （３５）保温が６５℃で３０分間である、請求項３１記
    載の方法。
36. （３６）遠心分離が３７℃で１時間１００，０００ｇで
    ある、請求項２６記載の方法。
37. （３７）遠心分離が３７℃で１時間１００，０００ｇで
    ある、請求項２７記載の方法。
38. （３８）遠心分離が３７℃で１時間１００，０００ｇで
    ある、請求項３５記載の方法。
39. （３９）上澄液が加圧濾過により濃縮される、請求項３
    記載の方法。
40. （４０）上澄液が加圧濾過により濃縮される、請求項３
    ８記載の方法。