JPH03175992A - アネキシンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の産業上の利用分野） 本発明は、アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎｅ）の精製方法
に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）殆どの
哺乳類には、抗凝固性を有するタンパク質がある。これ
らのタンパク質は、それらの異なる活性の機構に基いて
三つの群に分けることができる。

１、凝固因子と複合体を形成し、それにより凝固因子を
効力のないようにするタンパク質。これらは下記のタン
パク質を含む。

ａ）　抗トロンビン−ｍ　（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、
　５巻４３９〜４５２頁（１９７４年）） ｂ）　　α−プロテアーゼインヒビター（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　５２巻、６５５〜７０
９頁（１９８３年）） Ｃ）　　α２−マクログロブリン（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２巻、６５５〜７０９頁（１９８
３年））ｄ）　　ｃ、−インヒビター（Ｂｉｏｃｈｅｏ
＋１ｓｔｒｙ　２０巻、２７３８〜２７４３頁（１９８
１年）〉ｅ）　プロテアーゼネキシン（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｓｓ。

２５８頁、　　１０４３９〜１０４４４頁（１９８３年
））。

２、凝固因子をタンパク質分解により切断し、それによ
り凝固因子を失活するタンパク質。従来記載された、こ
の種の唯一のタンパク質は、プロティンＣである（Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５１巻。

３５５〜３６３頁（１９７６年））。

３、負の荷電したリン脂質を区切る（ｓｃｒｅｅｎ　ｏ
ｆｆ）か、または加水分解し、その結果、凝固機構のリ
ン脂質依存性反応が抑制される、タンパク質。

従来、種々の型の蛇毒から単離されたホスホリパーゼの
みが記載されている（Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１１２巻、２５〜３２頁（１９８０年））。

段階的に進行する凝固系が、近年、徹底的に研究されて
きた。それは、或種の酵素が酵素源を活性形態に変換す
る、種々の相互関連したタンパク質分解反応の自己増強
性（ｓｅｌｆ−ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ）多段階系で
あると理解される（ジャクリン（Ｊａｃｋｓｏｎ）Ｃ，
Ｍ。ネマーソン（Ｎｅ＋＋＋ｅｒｓｏｎ）　Ｙ、著、＾
ｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４９巻、７６５〜８１１頁（１９８
０年）を参照のこと）。この反応の速度は、リン脂質並
びに因子Ｖａ及び因子■ａの如き、補助因子の存在によ
り非常に増加される。生体内で、前凝固反応は、凝固カ
スケードのわずかな活性化後に爆発性塞栓損傷を防止す
る種々の抑制機構により制御される。

抗凝固機構は、以下のように分けることができる（Ｒ，
Ｄ、ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）　、　Ｊ、
　Ｓ。

ローゼンベルグ著、　Ｊ、Ｃｆ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、
　７４巻、１〜６頁（１９８４年））。

１、　セリンプロテアーゼ因子Ｘａ及びトロンビンハ、
抗トロンビン■または抗トロンビン／ヘパリン複合体に
結合する結果、失活される。また、プロトロンビン活性
化及びフィブリンの形成の両方が、このようにして抑制
し得る。抗トロンビン■の他に、例えば、α２マクログ
ロブリン及び抗トリプシンの如き、種々のその他の血漿
−プロチア−ゼインヒビターがあり、その効果は時間に
依存する。

２、　プロティンＣの発見は、その他の抗凝固機構の発
見をもたらした。プロティンＣが一旦活性化されると、
それはプロティン補助因子、因子Ｖａ及び因子■ａの選
択的酵素分触により抗凝固剤として作用し、補助因子に
よりプロトロンビナーゼ及び因子Ｘと反応する酵素が失
活される。

３、血漿は単量体フィブリンｌ、即ちフィブリノーゲン
に対するトロンビンの作用の生産物を開裂し、それによ
り不溶性フィブリンの形成を防止する（Ｈ，Ｌ、ノッセ
ル（Ｎｏｓｓｅｌ）著、　Ｎａｔｕｒｅ。

２９１巻、１６５〜１６７頁（１９８１年））。

上記の凝固プロセスに関与する天然タンパクのうち、抗
トロンビン■のみが現在臨床に使用される。しかしなが
ら、このタンパク質の使用の重大な欠点は、出血する傾
向が増すことである。

抗凝固剤として従来使用された全ての薬剤は、それらが
本来天然のものであろうと、また台底のも、のであろう
とも、凝固因子を何らかの方法で不活性にし、それによ
り、凝固プロセスに不利な影響を及ぼし得る副作用を生
じる。

驚くことに、これらのタンパク質の他に、特別な条件下
で所望の抗凝固性を示すが出血のリスクを増大しない、
その他の天然物質が、今、単離された。重度の出血の場
合、これらのタンパク質は、それらの抗凝固性を失ない
、その結果、それらの使用はこのような場合に生存に必
要な凝固プロセスを妨害しない。それらは強く血管新生
化された組織から最初に単離されたので、それらは血管
抗凝固性タンパク質、即ちＶＡＣとして知られる。

制得血管及び胎盤の如き、強く血管新生化された組織か
ら単離されたタンパク質は、約７０　Ｘ　１０３約６０
Ｘ１０３．約３４Ｘ１０３及び約３２×１０３の分子量
を有し、そのうち、３４Ｘ１０’及び３２Ｘ１０３の分
子量を有する物質が単一のポリペプチド鎖からなる。こ
れらのタンパク質の正確な生化学的特性づけ及びそれら
を単離、精製する方法が欧州特許第１８１４６５号に見
られる。

ＶＡＣ活性を有するタンパク質は、二つの位置で血液凝
固カスケードを妨げる天然の血液凝固インヒビターであ
る。最初に、それらは、因子ＩＸａ及び因子■ａにより
触媒作用を受けて、Ｘａへの因子Ｘの活性化を抑制し、
次にそれらはトロンビンを生成するためのプロトロンビ
ンの開裂を抑制し、この開裂は因子Ｘａ及び因子Ｖａに
より媒介される。両方の活性化工程に共通の一つの事実
は、それらがカルシウムイオン及びリン脂質を必要とす
ることである。明らかに、ＶＡＣタンパク質はまたリン
脂質と相互作用することができ、この結合の結果、凝固
因子の活性化工程を妨げる。

ＶＡＣのように、カルシウムに依存する方法でリン脂質
に結合し、リン脂質表面に依存するプロセスを妨害する
物質の全系統群があることが、その間に見い出された。

アネキシンとしても知られるこの系統群は、リボコルチ
ン１１カルバクチンＩ、プロティン■、リボコルチンｎ
ｌ、ｐ６フーカレレクトリンを含むだけでなく、またＩ
ＢＣ，ＰＡＰ、、ＰＡＰＩ、ＰＰ４、エンドネキシン■
及びリポコルチンＶを含む。

アネキシンの共通の構造上の特徴は、おそらくそれらの
同様なＣａ”結合性及びリン脂質結合性の基礎を形成す
る。この−船釣な性質は全てのアネキシンに当てはまる
が、Ｃａ”及び種々の型のリン脂質に対するそれらのア
フィニティに関して明らかな個性がある。

アネキシンの生理機能は、膜に関連するプロセスに関係
する。ＶＡＣの抗凝固効果の基本的な機構は、ＶＡＣを
その表面に結合し、こうして表面上に凝固促進複合体の
生成を防止することによる、リン脂質の触媒能の抑制と
して認められていた。

また、その他のアネキシンが、凝固を抑制し得るが、Ｖ
ＡＣが最も有効なインヒビターであるようである。

結合の研究は、ＶＡＣがカルシウムに依存する方法で前
凝固性（ｐｒｏ−ｃｏａｇ−ｕｌａｔｏｒｙ）　　リン
脂質と可逆的に会合することを示した。

また、系列のＣｄ”　、　Ｚｎ”°、　Ｍｎ”及びｃｏ
２′″から選ばれたその他の二価の陽イオンは会合に対
して陽性の効果を有するが、Ｃａ２°と同し程度の効果
をもたない。

これらの性質は、薬理学の観点から、それらのタンパク
質を重要で、しかも極めて有価な活性物質にする。ＶＡ
Ｃタンパク質を生産することを可能にした遺伝子操作法
が、欧州特許第２９３５６７号に記載されており、その
特許の教示が本明細書に特別に参考にされる。

本発明の目的は、ＶＡＣタンパク質の単離、精製のため
の欧州特許第２９３５６７号に記載された方法を改良す
ることであった。

欧州特許第２９３５６７号により知られる方法に於いて
、形質発現されたタンパク質を単離、精製するために、
凍結バイオマスが好適な溶菌緩衝７夜中で懸濁された。

その後、例えばマントン−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇ
ａｕｌｉｎ）プレスを用いて、細胞が機械で破壊される
。ポリエチレンイミンの如き、非タンパク質成分用の沈
殿剤の添加後に、固体成分が、例えば遠心分離により除
去された。好ましくは硫酸アンモニウム分別により、タ
ンパク質を沈殿させ、沈殿を溶解し、沈殿剤を除去し、
溶液を清澄にした後、こうして得られた抽出物が種々の
クロマトグラフィー精製操作にかけられた。タンパク質
の沈殿に代えて、粗ＶＡＣ抽出物はまた、それがその後
の清浄サイクルにかけられることを条件として、クロマ
トグラフィー予備精製により梢製し得る。ＳｊＯ□が、
例えば、予備精製用のカラム材料として好適であること
がわかったが、同様の性質を有するその他の材料がまた
好適である。

その発明によれば、メソサーズ・ブレース（Ｍｅｓｓｒ
ｓＧｒａｃｅ）により製造されたシリカ触媒担体銘柄９
５３Ｗが使用された。

その発明のタンパク質精製に適したクロマトグラフィー
精製サイクルは、例えば、ＤＥＡＥ−ファースト−フロ
ー−セファローズ（Ｆａｓｔ−ＦｌｏｉｖＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）、セファクリル（ｓｅｐｈａｃｒｙ）　Ｓ　−
２００高分解能クロマトグラフィー及びＱ−セファロー
ズ−ファースト−フロー−クロマトグラフィーからなっ
ていた。このようにして得られたその発明のタンパク質
の純度は、５ＤＳ−パージ（ＰＡＧＥ）。

ウェスタンプロット、ゲル透過ＨＰ　Ｌ　Ｃ、逆相ＨＰ
ＬＣ及び等電点電気泳動により測定された。

この従来技術の方法に従って行なわれた溶菌及び抽出工
程は、更に精製を必要とする物質を約５０％の収率で与
えた。

本発明の方法に従ってこの工程を改良することにより、
驚くことに、この工程後の収率を８０％以上に増大する
ことが可能である。

（課題を解決するための手段） 一つの特徴に於いて、本発明は、 ａ）均一化された細胞物質のｐＨ値を８゜０〜１０．０
に調節する工程、 ｂ）Ｃａ”、Ｃｄ”、Ｚｎ”、Ｍｎ”及びＣｏ”°から
選ばれた少なくとも一種の二価の陽イオンを添加する工
程、 Ｃ）リン脂質を添加する工程、 ｄ）不溶性細胞残渣を洗浄して可溶性成分を除去する工
程、及び ｅ）キレート剤を用いてアネキシンを細胞残渣から抽出
する工程 を含むことを特徴とするアネキシンの特製方法を提供す
る。

本発明の方法は、均一化された物質中に含まれるアネキ
シン、例えばＶＡＣタンパク質が宿主生物、好ましくは
大腸菌の不溶性細胞残渣または膜に吸着されることを確
実にする。この現場吸着工程は、望ましくない可溶性物
質を均一化された物質から単に洗浄することにより排除
されることを可能にする。固体゛キャリヤー“に結合さ
れたアネキシン、例えばＶＡＣタンパク質の脱着は、キ
レート剤を用い、好ましくはＥＤＴＡを含む緩衝液を用
いて行なわれる。

二価の陽イオンの混合物、例えばＺｎ”と組合せてＣａ
”が使用されることが有利であり、夫々の陽イオンのモ
ル比は不溶性細胞残渣へのＶＡＣの如きアネキシンの吸
着を最大にするように調節される。

驚くことに、大腸菌中の形質発現により調製されたアネ
キシンが精製された場合、大腸菌タンパク質（巳ＣＰと
称する）の量は、イオン化し得る基、好ましくは強カチ
オン性基を有する樹脂、例えばＢＰＡ　（）−ソーハー
ス（Ｔｏｓｏｈａａｓ）　、スタットガルト、ドイツに
より製造されたバイオプロセシング・エイズ（Ｂｉｏｐ
ｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ａｉｄｓ）　）の添加により著し
く減少できた。例えば、ＢＰＡ−１０００（強カチオン
性基（四級アミン）で官能化された架橋ポリメタクリル
酸エステル）、ＢＰＡ−１０５０（弱カチオン性基（三
級アミン）で官能化された架橋ポリメタクリル酸エステ
ル）、ＢＰＡ−２１００（強アニオン性基（スルホン酸
）で官能化されたジビニルペンゾール架橋ポリスチレン
）、好ましくはＢＰＡｌｏｏＯがＥＤＴＡ抽出後に得ら
れた粗抽出物に添加され、ついで撹拌された。添加され
る量は、１〜２０容量％、好ましくは５〜ｌＯ容量％、
更に好ましくは１０容量％であってもよい。沈殿は遠心
分離により除去される。これに続いて、タンパク質沈殿
操作及びクロマトグラフィー操作が行なわれる。ＢＰＡ
を添加することにより、この段階でさえも、ＥＣＰ含量
を初期の量のわずかに２％まで低下することが可能であ
った。一方、ＶＡＣ含量は、わずかに６％だけ減少され
た。

驚くことに、収率の更に改良が、細胞の破壊の前に発酵
混合物の細胞を失活することにより達成された。好適な
失活剤は、とりわけ、ベンゼン、トルエン、フェニル、
キシレンまたはクレゾールの如きＰＭ　ｉＦ−な芳香族
化合物を含む。ｍ−クレゾールを使用することが特に有
利である。

本発明の第一の特徴と併せて、この予備失活工程を含む
ことにより、抽出収率を９８％以上に増大することが可
能になった。

吸着／脱着工程の後に、欧州特許第２９３５６７号によ
り知られる精製工程が行なわれる。これに必要とされる
パラメーター、例えば温度、檀、個々の工程の順序、ｐ
Ｈ値、特別な試薬、等は、当業者に公知である。所望に
より、以下の実施例は、当業者に既知の好適な方法で改
良されてもよい。特に、それらは、精製すべきタンパク
質に関して制限をなすものではない。アネキシンの共通
の構造上の特徴及び全般の性質に鑑みて、本発明の方法
はまたその他のアネキシンの精製に適用でき、それはア
ネキシンＩＢＣ，ＰＡＰ、ＰＡＰ　Ｉ、ＰＰ４、エンド
ネキシン、リボコルチンＶ及びＶＡＣを精製するのに特
に適する。更に、本発明は組換え宿主からＶＡＣを得る
ことに関して記載されるが、それは、例えば強く血管新
生化された組織からアネキシンを得るのに使用し得る。

使用される試薬に関する情報は、単に、例示の源に関す
る情報であり、制限をなすものではない。

本発明が、図面を参照して、非限定的な実施例により説
明される。

大韮丹上 １、細胞の破壊 Ｃａ”＋　びレシチンの　　　パ　び 発酵Ｍ５２４からのクローン大腸菌１１ＢＩＯＩ／ｐＲ
Ｉ＋２９１の凍結された非失活細胞物質１２２ｇを解凍
し、撹拌（約１時間、氷で冷却）により溶菌緩衝液５０
０−で懸濁し、ついでウルトラータラソクス（Ｕｌｔｒ
ａ−Ｔｕｒｒａｘ）　Ｔ　４６　／　６を用いて均一化
した（約１分、氷で冷却）。

産遺援蚤櫃 １００ｍＭ　　）リス　（ＴＲＩＳ）　　１２．１４　
ｇ　／　１０００−メルク（Ｍｅｒｃｋ）８３８２ １　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　　　　　　０．３７　ｇ　／
　１０１００Ｏチドリブレツクス（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ
） ■、メルク７８４１８ ２００　ｍＭ　　ＮａＣ１１１，６９ｇ　／　１０００
−メルク４０４ ３２　％（７）１（ｃ　１を用イテｐｌ＋を９．０　＋
　０．１　ニ調節する。

マントン−ガラリンプレス、型式１５Ｍ８ＴＡ（その中
で、受器が氷で冷却される）を用いて、懸濁液を約４２
２ｋｇ／ｃｄ　（６０００ｐｓｉ　）で３回均一化する
。ついでその装置を溶菌緩衝液１５０〜２００　ｍｌで
２回洗浄する（抽出物の合計容量＝１０００ｍｇ）。

２、不溶性細胞残渣にＶＡＣを吸着するためのＣａ″及
びレシチンの添加。

新しく溶解したく最終濃度５　ｍＭ）塩化カルシウム（
メルク２０８３）０．５５ｇ及びレシチン溶液（クロロ
ホルムｌ　ｍｌ当り２００ｗ）　６．１ｍｌを、均一化
された物質に添加する。最終濃度は１ｇレシチン／１０
０ｇバイオマスである。

混合物をウルトラータラソクスで１分間均一化し、水浴
中で６０分間攪拌する。

レシチン二大豆、ブラクト、、セルバ（ｐｒａｃｔ。

５ｅｒｖａ）　５７５５６からのレシチン。

ついで５％のボリア多ンン容液（５０％のポリアミンＰ
１セルバ３３１４１から調製し、５％に希釈し、５ＮＩ
＋Ｃ６でｐｉ（８に中和した）１１０ｍＪ！を添加し、
混合物を更に３０分間攪拌する。最終濃度は０．５％で
ある。ついで懸濁液を透明になるまで遠心分離する（ベ
ックマン高速遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎｌｌｉｇｈ　
５ｐｅｅｄ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）　Ｊ　２−２１、
ローター（Ｒｏｔｏｒ）　Ｊ　Ａ　１０．８０００ｒｐ
ｍ、３０分、設定２℃）。

上澄層上：１０２０ｄ＜４．２５■タンパク質／ｍｌ　
；　０．０５　ｍｇＶ　Ａ　Ｃ／ｄ）。

３、可溶性物質を除去するための細胞残渣の洗浄。

ウルトラータラソクスを用いて細胞残渣を洗浄緩衝液６
００−で懸濁し、ついで３０分間攪拌する。

跣１彊１液： １００ｍＭ　　トリス ２００　ｍＭ　　ＮａＣｌ　２ ５ｍＭ　　ＣａＣ＃ｚ ３２％のＩｌｌを使用して、ｐＨを９．０±０．１に調
節する。

細胞残渣を、上記のように遠心分離することにより得る
。

上１Ｌ虹土：　５８０　ｍｌ　（１，３５ｍｇタンパク
質／　ｍｌ　；０、０４　ｍｇ　Ｖ　Ａ　Ｃ／　ｍｌ　
）３５０　ｍｌの洗浄緩衝液中の懸濁、その後の均一化
及び攪拌を、もう−度繰り返す。ついで、混合物を遠心
分離する。

圭１１虹叫：　３４０ｍｌ　（０，９３ｍｇタンパク質
／ｍｄ；０．０２■ＶＡＣ／ｄ） ４、　　ＥＤＴＡを含む緩衝液によるＶＡＣの抽出。

ウルトラータシックス中でベレットを抽出緩衝液９００
　ｍｌで均一化し、ついでコールドストアー巾で一夜撹
拌する。抽出物を前記のようにして遠心分離し、透明溶
液、即ち粗抽出物を得る。

剋１１坦粗：９１５ｄ（１，９８■タンパク質／Ｍ１；
０．６５■ＶＡＣ／ｍｆ） 袖上口彊１液： ２０ｍＭ）リス ５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ ｐＨを５　Ｎ　Ｎａ０ｆｌで７．５±０．１に二周節す
る。

ン　ζ　１　　　び　　　の　　・ 上澄液１　：１０１０２Ｏ！　　４３３５ｍｇタンパク
質　４９＊ＶＡＣ上澄液Ｕ　：　　５８０ｄ　　７８３
Ｎタンパク質　２２ｘＶＡＣ上澄液ｍ　：　　３４０ｍ
’　　３１６ｍｇ＆　７Ｒ’）　　　５ｍｇＶＡＣ５４
３４■タンパク質　７６■Ｖ＾Ｃ （１１χ） 粗抽出ＶＡＣ９１５ｄ　　１８１６ｍｇタンパク質５９
４■ＶＡＣ細胞物質１２２ｇ中のＶＡＣ合計６７０■（
８９χ）尖宛明童 要約 １、失活 ２、細胞破壊 ３、不溶性細胞残渣にＶＡＣを吸着するためのＣａ”＋
及びレシチンの添加 ４、可溶性成分を排除するための細胞残渣の洗浄５、　
　ＥＤＴＡを含む緩衝液によるＶＡＣの抽出６、３５％
の飽和硫酸アンモニウム液の添加及び沈殿の除去 ７、　フェニル−セファローズ・ファースト・フローに
よるクロマトグラフィー ８、ＶＡＣ−プールの透析及びＱ−セファローズ・ファ
ースト・フローによるクロマトグラフィ９、ＶＡＣ−プ
ールの濃縮及びセファクリル８２００ＨＨによるクロマ
トグラフィー １、失活 発酵の終了が、培地中のリン酸塩の消費から約１７時間
後に達成される。この時点で、ＣａＣｊ！。

１０ｍＭを添加し、温度をできるだけ早く冷却して５〜
８℃に調節する。その他の制御されるパラメーター（例
えば、通気攪拌、ｐＨ，圧力、等）は、全て同じままで
ある。約１０分後に、ｍ−クレゾール７　ｎｒｌ　／　
１を添加し、ついで圧力、通気及びｐＨの調節を停止し
、攪拌を、発酵液がクレゾールと適当に混合されるが、
泡の形成が制限されることを確保する水準に下げる。こ
れらの条件下で、失活が少なくとも３時間で１５時間以
下の期間にわたって行なわれる（温度は５〜８℃に留ま
る）。

２、細胞破壊 Ｃａ”＋　びレシチンの　　　′　び ｍ−クレゾールで失活させた、クローンＩＩＢＩＯＩ／
ｐＧＮ２５の凍結細胞￥ｌＱ質２８６ｇを解凍し、攪拌
（約１時間、氷で冷却）により溶菌緩衝液７５０ｍ１で
懸濁し、ついでウルトラータラックスＴ４５／６を用い
て均一化する（約１分間、氷で冷却）。

産倦復査液 １００ｍＭ　　トリス １　ｍＭ　　ＥＤＴＡ ２００　ｍＭ　　ＮａＣ１ ｐ）１を３２％のＨ（ｌで９．０±０．１に調節する。

懸濁液を、マントン−ガラリンプレス、型式１５Ｍ８Ｔ
Ａを使用し、その受器を氷で冷却しながら約４２２ｋｇ
／ｄ　（６０００ｐｓｉ　）で３回均一化する。ついで
、その装置を溶菌緩衝液１５０〜２　ｏ　ｏ　ｍｙで２
回洗浄する。均一化された’ｓｔの容量：ｘｏｏｍｔ ２、不溶性細胞残渣にＶＡＣを吸着させるためのＣａＯ
及びレシチンの添加。

Ｃａ（Ｊ、　　（メルク２０８３）Ｏ１５５ｇ／１００
０１００Ｏ（最終濃度５ｍＭ）を、均一化された物質（
水均１Ｑｍｌに溶解）に添加し、クロロホルム（約０．
２ｇ／ｍ０中に溶解された、Ｉｇのレシチン／１００ｇ
のバイオマスを添加する。

その混合物を、ウルトラータラックスを用いて１分間均
一化し、水浴中で６０分間攪拌する。

レシチン：大豆、プラツト、セルバ５７５５６からのレ
シチン ついで５％のポリアミンン容液（５０％のポリアミンＰ
、セルバ３３１４１から調製し、５％に希釈し、５Ｎｌ
ｌＣ１でｐＨ８に中和した）０．１１培容を添加し、混
合物を更に３０分攪拌した。最終濃度は０゜５％である
。ついで懸濁液を透明になるまで遠心分離する（ベック
マン高速遠心分離機Ｊ２−２１、ローターＪＡ１０．８
０００ｒｐｍ、３０分、設定２℃）。

上澄液１：１２００ｄ（５，８■タンパク質／−；０、
０　１　ｍｇＶ　Ａ　Ｃ／ｄ）　　。

３、　可溶性物質を排除するための細胞残渣の洗浄。

ウルトラータラソクスを用いて、細胞残渣を洗浄緩衝液
中１０１００Ｏで懇濁し、ついで３０分間攪拌する。

迭企榎盪産 １００ｍＭ　　ト’Ｊス ２００　ｍＭ　　ＮａＣ（１ ５ｍＭ　　ＣａＣ１ｚ ３２％の１ｉｔｕを用いてｐＨを９，０±０．１に調節
する。

細胞残渣を、上記のように遠心分離することにより得る
。

圭Ａし虹垂：１０００−（１，９４■タンパク質／ａｌ
ｌ　；　０．０１　ｔａｇ　Ｖ　Ａ　Ｃ／　ａ！１り１
０００ｄの洗浄緩衝液中の懸濁、その後の均一化及び攪
拌を、もう１回繰返し、最後に遠心分離を行なう。

↓ＡＬ虹唾：　１０００ｄ　（０，７９ｍｇタンパク質
／ｙｎｌ　；　０．０　１ｍｇＶＡＣ／−）４、　　Ｅ
ＤＴＡを含む緩衝液によるＶＡＣの抽出ベレットを、ウ
ルトラータラソクス中で抽出緩衝液１３５０−で均一化
し、ついでコールドストアー中で一夜撹拌する。抽出物
を上記のように遠心分離し、透明溶液、即ち粗抽出物を
得る。

旦１Ｌ距け：１３５０＋ｄ（３，３５■タンパク質／ｄ
；１．４６■ＶＡＣ／ｄ） 狛北量四盈； ２０ｍＭ１−リス ５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ ５　Ｎ　ＮａＯＨを用いて、ｐＨを７．５±０．１に調
節する。

洗逢且由４じ臼姐旧入４許 上澄液１　：　１，２００　ｍｆｌ　６．９６０ｗタン
パク質１２　ｍｇｖ八〇へ澄液■：　１．０００　ｍｌ
’　１．９４０■タンパク質１０ｍ＋ｒＶＡＣ上？Ｒ’
を夜ｍ　：　１，０００　ｍｌ　　　７９０ｍ１ｒ　　
ンパク　　エ０　［ＶＡＣ９，６９０ｍｇタンパク質３
２　ｍｇＶＡＣ（２ｚ） 粗抽出ＶＡＣ１，３５０ｍ！　４，５２２ｎ＋ｇタンパ
ク質１．９７１ｎｗ　　ＶＡＣ 細胞物質２８６ｇ中、ＶＡＣ合計２００３■（９８χ）
５−６．３５％の飽和硫酸アンモニウム液による沈殿及
びフェニル−セファローズ・ファースト・フローによる
クロマトグラフィー アンモニウムによる゛ 固体硫酸アンモニウム（メルク１２１７）２０９ｇ／ｌ
を攪拌しなから粗抽出物に徐々に添加する。

これは３５％の飽和水準を生じる。コールドストアー中
で少なくとも１時間攪拌した後、溶液を透明になるまで
遠心分離しく上記と同し条件下で）、沈殿を廃棄する。

ＦＰＬＣ装置を用いて、溶液を８〜１０ｄ／分の速度で
、調製されたフェニルセノアローズＦＦにポンプ輸送す
る。

遠心分離した３５％の硫酸アンモニウム上澄液を二つの
ほぼ等しいバッチ中で更に処理し、全てのその後の精製
工程を連続して２回行なう。

皇ｉ五坐選盟 ファーマシア０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏｌｕ
ｍｎ）、型ＸＫ２６／４０　（床容積約２００１ｎｌ）
に、フェニル−セファローズ・ファースト・フロー（フ
ァーマシア、コード番号１７−０９６５）を充填し緩衝
液Ａで平衡にづ−る。２〜３ＣＶ（カラム容積）の緩衝
液が、これに必要とされる。カラムはＦＰＬＣ装置に連
結される。全てのクロマトグラフィーは、周囲温度で行
なわれる。

１肌 ５０Ｉｌ１Ｍトリス 濃塩酸を用いて、その緩衝液をｐｌ＋７．２±０．１に
調節する。

ついで固体硫酸アンモニウム（メルク１２１７）２０９
ｇ／１０００１００Ｏを添加する。

猥韮叙」ニー 緩衝液Ａと同様であるが、硫酸アンモニウムが添加され
ない。

クロマトグラフィー 溶出液を、Ｏ，Ｄ、２８０ｎｍを測定することにより監
視する。調製がカラムに施されてすぐに、０、Ｄ、がそ
の初期値に戻るまで、カラムを緩衝液Ａで洗浄する。つ
いで、５カラム容積（１０００−）のＯ〜１００％Ｂの
緩衝液Ａ、緩衝液Ｂの勾配を使用して、結合されたＶＡ
Ｃを溶出する。ＶＡＣは勾配の開始後の最初の主要なピ
ークである（第１図の溶出図形を参照のこと）。通過流
（ｔｈｒｏｕｇｈ　ｆｌｏｗ）のアリコート、ＶＡＣ−
プール及びＯ，Ｄ、プロフィールのその他のピークを５
ＤＳ−ページにより調べる。ＶＡＣ−プールの試験：タ
ンパク質測定、ＶＡＣ−試験、５ＤＳ−ページ。

皇立左段盃生± フェニル・セファローズを２倍容の６Ｍの尿素で再生す
る。尿素を洗い出した（Ｉ　ＣＶの蒸留水で）後、それ
を２４％のエタノール中に貯蔵する。

カラムの上端で着色成分を除去し、または避けるため、
更に徹底的な洗浄及び再生法を使用する。

１、ＩＣＶの蒸留水 ２．２ＣＶの６Ｍの尿素（メルク８４８７）３、ＩＣＶ
の蒸留水 ４、１Ｃ■の０．１　ＭのＮａＯＨ ５６洗浄及び２４％のエタノール中の貯蔵６．３ＣＶの
緩衝液Ａによる使用前の平衡？、　　Ｑ−セファローズ
・ファースト・フローによるクロマトグラフィー Ｑ−セファローズの適用緩衝液によるＶＡＣプールの透
析の際に多すぎる緩衝液の使用を避けるために、プール
を最初にアミコン−限外濾過（ＡＭＩ−ＣＯＮ−Ｕｌｔ
ｒａｆｉｌｔｒａｔｔｏｎ）セル及びＹＭＩＯ−フィル
ター中で約１５０−まで濃縮する。ついで、それを緩衝
液入で透析する。

援黴鹿人± ２０ｍＭビス−トリス（Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ）５ＮのＨＣ
ｅを用いて、ｐｌ＋を６．３±０．１に調節する。

数枚ｌ± 緩衝液Ａ＋０．３５Ｍ　ＮａＣｆｆ ２０ｍＭビス−トリス ３５０ｍＭ　　ＮａＣ１ ５ＮのＨＣｊ２を用いて、ｐＨを６．３±０．１に調節
する。

なｊ１痕膿匙製 型ＨＲｌ　６１５０フアーマシア・カラム（ＣＶｌｏｃ
Ｉ）をＦＰＬＣ系に連結し、充填装置を用いてＱ−セフ
ァローズ・ファースト・フロー（ファーマシア〉を充填
する。それを２ＣＶの緩衝液Ａで平衡にする。クロマト
グラフィーを周囲温度で行なう。

クロマトグラフィｍ： 試料を４ｍ１／分の流量で適用する。ついで、溶出液の
○、Ｄ、２８０ｎｍが初期値に低下するまで、それを緩
衝液Ａで洗浄する。勾配プログラムは、以下のとおりで
ある。

０．５ＣＶ（７）０〜３０％Ｂ ｓ、　ｏ　ｃ　ｖの３０〜７０％Ｂ（ここで、分離が行
なわれる） 約ｉ、　ｏ　ｃ　ｖの１００％Ｂ 洗身１〕じ這えた ＵＶ−活性化物質が１００％Ｂで溶出されない時に、洗
浄プログラムが開始する。

２ＣＶの蒸留水 ２ＣＶの０．５ＮのＮａ０Ｈ ２ＣＶの蒸留水 貯蔵：２４％エタノール 使用前に、それを２〜３ＣＶの緩衝＞（ｉＡで洗浄する
。

ｐＨ−６，３に調節する。

ＶＡＣＯ前に、不純物をプログラム中で溶出する。溶出
プロフィールを本明細書に添付する（第２図）。

８、　セファクリルＳ−２００ＨＲによるクロマトグラ
フィー アミコン−限外濾過器ＹＭ−１０を用いて、■ＡＣ−プ
ールを約ＩＱ＋＋＋ｆｆｉに濃縮する。ＶＡＣは、問題
を生じないで１００■／ｄ　（バイオラット（Ｂｉｏ　
Ｒａｄ））まで濃縮し得ることがわかる。

専立嘉耕袈± 約４００ｍ１の床容積を有するに２６／１００カラム〈
ファーマシアにより製造）に、指示に従ってセファクリ
ルＳ−２００高分解能充填材（ファーマシア）を充填し
、溶出緩衝液（２ＣＶ）で平衡にする。

虜１目東枦鉱よ ２０ｍＭ　　リン酸ナトリウム　ｐＨ＝　７．２１５０
ｍＭ　　ＮａＣ１または２０ｍＭのコハク酸のナトリウ
ム塩（ｐｆ＋＝　７．０　） ０．０１％　トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０１ＮのＨ
ＣＩを用いてｐＨを７．０±０．１に調節する。

クロマトグラフィー二 クロマトグラフィーをコールドストアー中で行なう。流
量は、８ＯＮ！／時間である。Ｏ，Ｄ。

２８０ｎｍで記録されたピークを集める。このようにし
て精製されたＶＡＣは９９％以上の純度であった。（Ｒ
Ｐ−ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析）。

セフ　クリルカラムの　　： 洗浄プログラム： ＩＣＶの蒸留水 ２ＣＶの０．５　Ｎ　Ｎａ０１１　　（＋数日間の貯蔵
）（更に長く貯蔵するためには、１ＭＮａＣ１＋０．０
０２５％Ｎａ０１１を使用することが推奨される）再生
： ＩＣＶの蒸留水 ２ＣＶの溶出緩衝液 全 上澄液ｌ 上澄液■ 上澄液■ 粗抽出 １．２００ ０００ １．０００ １．３５０ ９６０ １．９４０ ９０ ５２２ フェニルセファ■−ズ　ＦＦ−プール 充填　Ωセファロース　ＦＦ Ｑ　セファトズ　ＦＦ−ブール 充填セフ７クーハシＳ−２００１１Ｒ ０５０ ３，０６２ ６６０ ４４６ （１，８５９）”” ２．０４１ ２．２フ７ ０８２ ｎ、ｄ。

＊） バイオラッ ドタンパク質分析 （標準物質： ウシ血清アルブミン） ＊＊）ＶＡＣα分析：プロトロンビンからトロンビンの
生成の抑制（ロイテリングスペルゲル（Ｒｅｕｔｅｌｉ
ｎｇｓｐｅｒｇｅｒ）ホルンストラ（Ｈｏｒｎｓ　ｔｒ
ａ）及びヘムケル（Ｈｅｍｋｅｒ）、Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５１巻、６２５〜６２９頁；１９
８５年）。精製された■ＡＣα澗製物金製物として使用
した。

＊＊＊）純粋なＶＡＣαに関して測定された因子を用い
てＯ，Ｄ、２８０ｎｍを測定することにより決定された
タンパク質含量：ＯＤ、　　２８０ｎｎ＋Ｘ　１．２７
７−ＶＡＣ−ｃｘ（■／　ｍｌ　） 実施例１及び２に記載された精製を、ＥＤＴ＾を含む緩
衝液による抽出（工程４）まで行なった。出発物質は、
夫々、２９５ｇ及び２４０ｇのバイオマスであった。

粗抽出物を得た後、１０容量％のＢＰＡｌｏｏＯを添加
し、混合物を１０分間攪拌した。生成した沈殿を遠心分
離（ベックマンにより製造された高速遠心分離機、ロー
ターＪＡＩＯ１８０００ｒｐｍ、２℃で３０分）により
除去した。

更に精製を以下のように行なった。

固体硫酸アンモニウムを３５％飽和まで添加しフェニル
・セファローズ・ファースト・フローにより更にクロマ
トグラフィーにかけたく前記の指示を参照のこと〉。

一去一 出発物ｇｔ：　ハイ、ｔマス（ハツチ８００５００１）
　２９５　ｇ粗抽出 ００ ４．０ １．８７　（１３０９） １２６、０００ ＢＰＡｌｏｏＯの後 ００ ２．７ １．７７　（１２３９） １１、７００ 出発物質：バイオマス（バッチＢＯＯ５００１）　２４
０　ｇ粗抽出 ８０ ３．２０ １．５８　（１３０９） ７７６、０００ ＢＰＡｌｏｏＯの後 ８０ ２．００ ０．９５　（６４６） ９６００ プール（最終生残１カッ

【図面の簡単な説明】 第１図は、フェニル−２０セフアローズ・ファースト・
フロー（←→＝ＶＡＣ−プール）に関スるクロマトグラ
フィー溶出プロフィールを示す。 第２図は、Ｑ−セファローズ・ファースト・フロー（−
−＝ＶＡＣ−プール）に関するクロマトグラフィー溶出
プロフィールを示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）均一化された細胞物質のｐＨ値を８．０〜１
   ０．０に調節する工程、 ｂ）Ｃａ＾２＾＋，Ｃｄ＾２＾＋，Ｚｎ＾２＾＋，Ｍｎ
   ＾２＾＋及びＣｏ＾２＾＋から選ばれた少なくとも一種
   の二価の陽イオンを添加する工程、 ｃ）リン脂質を添加する工程、 ｄ）不溶性細胞残渣を洗浄して可溶性成分を除去する工
   程、及び ｅ）キレート剤を用いてアネキシンを細胞残渣から抽出
   する工程、 を含むことを特徴とする、アネキシンの精製方法。
2. （２）イオン化し得る基を有する樹脂が工程（ｅ）の後
   に添加され、生成された沈殿が分離される請求項１記載
   の方法。
3. （３）樹脂が強カチオン性基で官能化される、請求項２
   記載の方法。
4. （４）工程（ｅ）で得られたアネキシンが、それ自体既
   知の方法でタンパク質沈殿工程及びその後のタンパク質
   精製工程により更に精製される、請求項１または請求項
   ２記載の方法。
5. （５）工程（ａ）に於けるｐＨが９．０に調節される、
   請求項１または請求項２記載の方法。
6. （６）Ｃａ＾２＾＋が工程（ｂ）で二価の陽イオンとし
   て添加される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法
   。
7. （７）Ｃａ＾２＾＋及びＺｎ＾２＾＋が工程（ｂ）で二
   価の陽イオンとして添加される、請求項６記載の方法。
8. （８）レシチンが工程（ｃ）でリン脂質として添加され
   る、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
9. （９）工程（ｂ）及び工程（ｃ）が実質的に同時に行な
   われる、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
10. （１０）ＥＤＴＡが工程（ｅ）でキレート剤として使用
    される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
11. （１１）細胞が均一化及び工程（ａ）の前に失活される
    、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
12. （１２）細胞が、ベンゼン、トルエン、フェノール、キ
    シレン及びクレゾールから選ばれた薬剤により失活され
    る、請求項１１記載の方法。
13. （１３）ｍ−クレゾールが失活剤として使用される、請
    求項１２記載の方法。
14. （１４）精製されるアネキシンがＶＡＣまたはその類縁
    体である、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。