JPH07291999A - 血小板安定化因子ｉｘ−フラグメント、その製造方法及びこれを含有する薬剤 - Google Patents
血小板安定化因子ｉｘ−フラグメント、その製造方法及びこれを含有する薬剤Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血小板安定化因子ＩＸ- フラグメント、その
製造方法及びこれを含有する薬剤 【構成】 因子ＩＸａ- 凝固活性を有することなく無傷
のＥＧＦ- 及びＧｌａ-ドメインを有する血液凝固因子
ＩＸのフラグメント──これは化学的に変化せず、分子
量約１２０００及び５００００ダルトンであり、タンパ
ク質分解による分解によって抗血栓症作用を有する有効
物質として得られる──、並びにその製造方法及びこの
薬剤。
製造方法及びこれを含有する薬剤 【構成】 因子ＩＸａ- 凝固活性を有することなく無傷
のＥＧＦ- 及びＧｌａ-ドメインを有する血液凝固因子
ＩＸのフラグメント──これは化学的に変化せず、分子
量約１２０００及び５００００ダルトンであり、タンパ
ク質分解による分解によって抗血栓症作用を有する有効
物質として得られる──、並びにその製造方法及びこの
薬剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、凝固因子ＩＸのフラグ
メントに関し、これは生体内で血小板を安定化する有効
物質として無傷のＧＬＡ- 及びＥＧＦ- 様ドメインを含
有する。
メントに関し、これは生体内で血小板を安定化する有効
物質として無傷のＧＬＡ- 及びＥＧＦ- 様ドメインを含
有する。
【０００２】更に、本発明は、これらの物質の製造方法
及びこれらの物質を含有する薬剤に関する。
及びこれらの物質を含有する薬剤に関する。
【０００３】
【従来の技術】止血は複雑な処置であり、それは一連の
血漿タンパク質、血液細胞及び血管成分が関与する。止
血は血液の凝固によって、血管系の損傷に於ける血液損
失から生物を守る作用を有し、同時に凝固の増加を阻止
して生物全体中の血流を保つ。止血の障害は、血管閉塞
の形成、すなわち血栓を導く。血栓症疾患、たとえば心
臓発作、静脈血栓、ＤＩＣ及び脈拍の減少の予防及び治
療は、極めて困難である。というのは血液凝固の阻止
は、常に生命をおびやかす出血の危険を引き起こすから
である。
血漿タンパク質、血液細胞及び血管成分が関与する。止
血は血液の凝固によって、血管系の損傷に於ける血液損
失から生物を守る作用を有し、同時に凝固の増加を阻止
して生物全体中の血流を保つ。止血の障害は、血管閉塞
の形成、すなわち血栓を導く。血栓症疾患、たとえば心
臓発作、静脈血栓、ＤＩＣ及び脈拍の減少の予防及び治
療は、極めて困難である。というのは血液凝固の阻止
は、常に生命をおびやかす出血の危険を引き起こすから
である。
【０００４】抗血栓症物質の３つのクラスが知られてい
る。これらはトロンビン阻害剤、ビタミン- Ｋ- 拮抗剤
及び血小板凝集阻害剤である。臨床実験で、ヘパリンが
最も多く使用される抗凝血剤に属する。これは抗トロン
ビンＩＩＩによる血清プロテアーゼの複合体形成を凝血
段階で触媒する。その抗凝血作用は、主に血清プロテア
ーゼ、トロンビンの阻害からなる。
る。これらはトロンビン阻害剤、ビタミン- Ｋ- 拮抗剤
及び血小板凝集阻害剤である。臨床実験で、ヘパリンが
最も多く使用される抗凝血剤に属する。これは抗トロン
ビンＩＩＩによる血清プロテアーゼの複合体形成を凝血
段階で触媒する。その抗凝血作用は、主に血清プロテア
ーゼ、トロンビンの阻害からなる。
【０００５】しかしヘパリンを使用する場合、出血合併
症の危険が生じる。というのは完全なトロンビン阻害が
血液損失を防ぐ血管外凝血も阻害するからである。した
がってヘパリンの投与を生体内凝血テストによって正確
に調整しなければならない。この際ヘパリンの使用は、
有効な抗血栓症作用と出血合併症の発生の間でバランス
をとるのが難しい。
症の危険が生じる。というのは完全なトロンビン阻害が
血液損失を防ぐ血管外凝血も阻害するからである。した
がってヘパリンの投与を生体内凝血テストによって正確
に調整しなければならない。この際ヘパリンの使用は、
有効な抗血栓症作用と出血合併症の発生の間でバランス
をとるのが難しい。
【０００６】ヘパリンで治療された患者の１〜５％は、
血小板減少を生じる。ヒルジン、すなわちヒルのタンパ
ク質は、もっとも強力な天然のトロンビン阻害剤であ
る。これはトロンビンと共に化学量論的複合体を形成す
る。しかし現在臨床実験された、ヒルジンに対する解毒
薬は存在せず、したがって出血合併症を除くことができ
ない。
血小板減少を生じる。ヒルジン、すなわちヒルのタンパ
ク質は、もっとも強力な天然のトロンビン阻害剤であ
る。これはトロンビンと共に化学量論的複合体を形成す
る。しかし現在臨床実験された、ヒルジンに対する解毒
薬は存在せず、したがって出血合併症を除くことができ
ない。
【０００７】他の抗凝血剤は、ビタミン -Ｋ- 拮抗剤で
あり、これはたとえばワルフアリンの様にγ- カルボキ
シル化を阻害し、したがって活性ビタミンＫ- 依存性凝
血因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ及びＸの血漿濃度を減少させ
る。しかし十分な抗凝血作用は拮抗剤の使用後３６〜７
２時間になってようやく発現する。したがってこれらは
急性血栓症疾患の直ちの治療には向いていない。同様に
ヘパリンの場合と同様に出血合併症の危険が生じる。
あり、これはたとえばワルフアリンの様にγ- カルボキ
シル化を阻害し、したがって活性ビタミンＫ- 依存性凝
血因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ及びＸの血漿濃度を減少させ
る。しかし十分な抗凝血作用は拮抗剤の使用後３６〜７
２時間になってようやく発現する。したがってこれらは
急性血栓症疾患の直ちの治療には向いていない。同様に
ヘパリンの場合と同様に出血合併症の危険が生じる。
【０００８】血小板凝集阻害剤、たとえばアセチルサリ
チル酸は、今日使用されている抗血栓症物質の第三のク
ラスである。血漿性凝固因子の活性化は、凝集阻害剤に
よって阻害されない。その作用は動脈性血栓症の治療又
は予防に主に限定される。
チル酸は、今日使用されている抗血栓症物質の第三のク
ラスである。血漿性凝固因子の活性化は、凝集阻害剤に
よって阻害されない。その作用は動脈性血栓症の治療又
は予防に主に限定される。
【０００９】これらの例は、使用可能な薬剤を用いる血
栓症の今日の治療がいくつかの決定的な欠点を有するこ
とを示す。主に血液損失を防ぐ血管外凝血の妨害及び使
用される薬剤が凝血段階のほとんど完全な処置の後に初
めて作用するという事実は、コントロールされない出血
合併症を導く欠点として挙げられる。
栓症の今日の治療がいくつかの決定的な欠点を有するこ
とを示す。主に血液損失を防ぐ血管外凝血の妨害及び使
用される薬剤が凝血段階のほとんど完全な処置の後に初
めて作用するという事実は、コントロールされない出血
合併症を導く欠点として挙げられる。
【００１０】一般に抗血栓症治療に於て可能な限り早い
段階で凝血システムを妨害することが望まれる。凝血段
階が最初に一度停滞した場合、一部不可逆工程が進行し
（たとえば血小板活性）、その時可能な治療処置は損傷
の範囲だけに限られる。
段階で凝血システムを妨害することが望まれる。凝血段
階が最初に一度停滞した場合、一部不可逆工程が進行し
（たとえば血小板活性）、その時可能な治療処置は損傷
の範囲だけに限られる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、一方で血漿
性凝血を阻害することができ、同時に存在する血小板を
安定化して、血小板数の減少が生じない、他方で血管外
凝血は守られ、有効に作用する薬剤を見い出すことを課
題とする。
性凝血を阻害することができ、同時に存在する血小板を
安定化して、血小板数の減少が生じない、他方で血管外
凝血は守られ、有効に作用する薬剤を見い出すことを課
題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、この課
題を因子ＩＸのタンパク質分解性フラグメントの調製に
よって解決する。このフラグメントは無傷のγ- カルボ
キシグルタマート- ドメイン（Ｇｌａ）及び表皮性成長
因子- 様ドメイン（ＥＧＦ）を含有し、分子量約１２．
０００〜５０．０００ダルトンを有する。
題を因子ＩＸのタンパク質分解性フラグメントの調製に
よって解決する。このフラグメントは無傷のγ- カルボ
キシグルタマート- ドメイン（Ｇｌａ）及び表皮性成長
因子- 様ドメイン（ＥＧＦ）を含有し、分子量約１２．
０００〜５０．０００ダルトンを有する。
【００１３】驚くべきことに、本発明者は、本発明によ
る因子ＩＸ- フラグメントが因子ＩＸａによって生体内
で誘発される血小板減少を阻害することができることを
見い出した。
る因子ＩＸ- フラグメントが因子ＩＸａによって生体内
で誘発される血小板減少を阻害することができることを
見い出した。
【００１４】因子ＩＸは血栓症で重要な役割を果す。と
いうのは“外因性経路”がここで交わるからである（Ma
nn K. G., Jenny R. J. 等, Annu Rrv Biochem, ５７，
（１９８８），９１５〜９５６）。
いうのは“外因性経路”がここで交わるからである（Ma
nn K. G., Jenny R. J. 等, Annu Rrv Biochem, ５７，
（１９８８），９１５〜９５６）。
【００１５】因子ＩＸは４１６個のアミノ酸を有するビ
タミンＫ- 依存性プラズマグリコプロテインである。こ
れはγ- カルボキシ- グルタミン酸を有するアミノ末端
ドメイン１個と表皮性成長因子（ＥＧＦ）の配列と類似
する配列を有するドメイン２個を含有する (Thompson
A. R., Blood, ６７，（１９８６），５６５〜５７
２）。
タミンＫ- 依存性プラズマグリコプロテインである。こ
れはγ- カルボキシ- グルタミン酸を有するアミノ末端
ドメイン１個と表皮性成長因子（ＥＧＦ）の配列と類似
する配列を有するドメイン２個を含有する (Thompson
A. R., Blood, ６７，（１９８６），５６５〜５７
２）。
【００１６】種々の血栓モデルでの因子ＩＸ又は因子Ｉ
Ｘａの作用及び阻害の従来の実験結果は、因子ＩＸａの
内皮細胞レセプターへの結合を競合的に阻害することに
基づく。記載された凝固工程に於て血小板- 媒介された
凝固は小さな役割しか果さない。
Ｘａの作用及び阻害の従来の実験結果は、因子ＩＸａの
内皮細胞レセプターへの結合を競合的に阻害することに
基づく。記載された凝固工程に於て血小板- 媒介された
凝固は小さな役割しか果さない。
【００１７】ヨーロッパ特許第２６３，５２９号明細書
中で、因子ＩＸのＥＧＦ- ドメイン又はその連続部分を
含有し、分子量５００〜１０００ダルトンを有するペプ
チドがウエスラーのうっ血- 血栓症- 実験で血栓形成を
阻害することができると証明されている。このことは、
注射された因子ＩＸａと内皮細胞との相互作用が単離さ
れた血管部分中でＥＧＦ- 配列を含有するペプチドによ
って遮断されることに基づく。
中で、因子ＩＸのＥＧＦ- ドメイン又はその連続部分を
含有し、分子量５００〜１０００ダルトンを有するペプ
チドがウエスラーのうっ血- 血栓症- 実験で血栓形成を
阻害することができると証明されている。このことは、
注射された因子ＩＸａと内皮細胞との相互作用が単離さ
れた血管部分中でＥＧＦ- 配列を含有するペプチドによ
って遮断されることに基づく。
【００１８】ウエスラーの動物実験で、単離された血管
部分で血流の完全停止（うっ血）下に生じる血栓の発生
が重要である。このことは、正常の血流で進行する血小
板-媒介された凝固活性化が二次的な役割しか果たさな
いことを意味する。
部分で血流の完全停止（うっ血）下に生じる血栓の発生
が重要である。このことは、正常の血流で進行する血小
板-媒介された凝固活性化が二次的な役割しか果たさな
いことを意味する。
【００１９】ＥＧＦ- 様ペプチドが正常の血小板- 媒介
された凝固に同時の血小板減少と共に何らかの影響を与
えるかどうかは知られていない。血栓形成の著しい阻害
を得るためにある極めて高いペプチド濃度が必要であ
る。質量割合ペプチド：因子ＩＸａは約１６６０：１で
あり、これはペプチド：因子ＩＸａのモル割合６５００
０：１に相当する。
された凝固に同時の血小板減少と共に何らかの影響を与
えるかどうかは知られていない。血栓形成の著しい阻害
を得るためにある極めて高いペプチド濃度が必要であ
る。質量割合ペプチド：因子ＩＸａは約１６６０：１で
あり、これはペプチド：因子ＩＸａのモル割合６５００
０：１に相当する。
【００２０】この様な小さいペプチドを使用した場合、
数分である短い血管内半減期も欠点となる。Astermark
及び Stenflo, J. Biol. Chem., ２６０，２３４８−２
４４３では、牛- 因子ＩＸの種々のドメイン、試験管内
で血液凝固に関するその効果及び試験管内でこれと牛内
皮細胞の因子ＩＸ- レセプターとの相互作用が実験され
ている。血小板への単離された因子- ＩＸドメインの作
用は全く記載されていない。
数分である短い血管内半減期も欠点となる。Astermark
及び Stenflo, J. Biol. Chem., ２６０，２３４８−２
４４３では、牛- 因子ＩＸの種々のドメイン、試験管内
で血液凝固に関するその効果及び試験管内でこれと牛内
皮細胞の因子ＩＸ- レセプターとの相互作用が実験され
ている。血小板への単離された因子- ＩＸドメインの作
用は全く記載されていない。
【００２１】活性中心で Dansyl-Ｇｌｎ- Ｇｌｙ- Ａｒ
ｇ-(ＤＥＧＲ)-クロロメチルケトンによって化学的に不
活性化された因子ＩＸａを使用することで、電流によっ
て触発される閉塞性血栓形成を効果的に阻止することが
できる。これに反して天然因子ＩＸを用いた場合血栓形
成を阻止することはできない (Benedict, Ryan, 等.,J.
Clin. Invest., ８８，（１９９１），１７６０〜１７
６５）。
ｇ-(ＤＥＧＲ)-クロロメチルケトンによって化学的に不
活性化された因子ＩＸａを使用することで、電流によっ
て触発される閉塞性血栓形成を効果的に阻止することが
できる。これに反して天然因子ＩＸを用いた場合血栓形
成を阻止することはできない (Benedict, Ryan, 等.,J.
Clin. Invest., ８８，（１９９１），１７６０〜１７
６５）。
【００２２】化学的に不活性な因子ＩＸａを用いて、腫
瘍壊死因子が注射されたマウスの腫瘍組織中でフィブリ
ン血餅の形成が阻害されている。酵素原因子ＩＸを用い
た場合コントロールとの相違は検出されなかった（Tijb
urg, Ryan, 等.,J. Biol. Chem. ２６６，（１９９
１），１２０６７〜１２０７４）。
瘍壊死因子が注射されたマウスの腫瘍組織中でフィブリ
ン血餅の形成が阻害されている。酵素原因子ＩＸを用い
た場合コントロールとの相違は検出されなかった（Tijb
urg, Ryan, 等.,J. Biol. Chem. ２６６，（１９９
１），１２０６７〜１２０７４）。
【００２３】他の実験は、内皮細胞と血小板が因子ＶＩ
ＩＩと因子Ｘの存在下に因子ＩＸではなく因子ＩＸａに
対して高い親和性結合部位を有することが示されてい
る。このことは凝血の他の経過に重要である（Stern, N
awroth, J. Biol. Chem.２６０，６７１７〜６７２２；
Hoffmann, Monroe, Throm. a. Hemost., ６８，（１９
９３），７４〜７８及び Ahmad, Rawala-Sheik J. Bio
l. Chem., ２６４（１９８９），２００１２〜２００
１６）。
ＩＩと因子Ｘの存在下に因子ＩＸではなく因子ＩＸａに
対して高い親和性結合部位を有することが示されてい
る。このことは凝血の他の経過に重要である（Stern, N
awroth, J. Biol. Chem.２６０，６７１７〜６７２２；
Hoffmann, Monroe, Throm. a. Hemost., ６８，（１９
９３），７４〜７８及び Ahmad, Rawala-Sheik J. Bio
l. Chem., ２６４（１９８９），２００１２〜２００
１６）。
【００２４】したがって今日までに得られた因子ＩＸの
性質に関する知見から、本発明による因子ＩＸ- フラグ
メントの使用が、生体内で血小板を安定化することがで
きることは全く予想され得なかったことである。
性質に関する知見から、本発明による因子ＩＸ- フラグ
メントの使用が、生体内で血小板を安定化することがで
きることは全く予想され得なかったことである。
【００２５】驚くべきことに本発明者は、本発明による
因子ＩＸ- フラグメントによって血小板の安定化が行わ
れることを見い出した。これは通常血管内フィブリン形
成に正常の血流中で血小板が大きく関与し、それによっ
て血小板の消費を導くにもかかわらず行われる。 因子ＩＸ- フラグメントの製造：本発明による因子ＩＸ
の製造に対する出発化合物として、血漿から精製された
因子ＩＸ- 分画及び他の、たとえば遺伝子工学で製造さ
れた因子ＩＸを含有する溶液を使用することができる。
因子ＩＸ- フラグメントによって血小板の安定化が行わ
れることを見い出した。これは通常血管内フィブリン形
成に正常の血流中で血小板が大きく関与し、それによっ
て血小板の消費を導くにもかかわらず行われる。 因子ＩＸ- フラグメントの製造：本発明による因子ＩＸ
の製造に対する出発化合物として、血漿から精製された
因子ＩＸ- 分画及び他の、たとえば遺伝子工学で製造さ
れた因子ＩＸを含有する溶液を使用することができる。
【００２６】本発明によれば因子ＩＸをプロテアーゼで
Ｇｌａ- 及び少なくとも１個のＥＧＦ- ドメインが主に
無傷で存在し、分子量約１２．０００〜５０．０００を
有する因子ＩＸのフラグメントが生じる条件下で処理す
る。これはたとえばラッセルマムシ毒薬（Rnssell's Vi
per Venom)と同一の又は類似する作用を有する、特異的
プロテアーゼによって得ることができる。この際得られ
るフラグメントは、因子ＩＸ- 活性はもはや有さず、化
学的に変化されない。
Ｇｌａ- 及び少なくとも１個のＥＧＦ- ドメインが主に
無傷で存在し、分子量約１２．０００〜５０．０００を
有する因子ＩＸのフラグメントが生じる条件下で処理す
る。これはたとえばラッセルマムシ毒薬（Rnssell's Vi
per Venom)と同一の又は類似する作用を有する、特異的
プロテアーゼによって得ることができる。この際得られ
るフラグメントは、因子ＩＸ- 活性はもはや有さず、化
学的に変化されない。
【００２７】広範な特異性をプロテアーゼ、たとえばキ
モトリプシン又はトリプシンを使用する場合、タンパク
質分解による分解を、因子ＩＸのアミノ末端を保護する
条件で実施する。そのアミノ末端を有する因子ＩＸは可
逆的に、すなわち共有結合ではなく、固形担体と結合
し、固定化された形でプロテアーゼで処理するのが好ま
しい。次いで因子ＩＸの抗血栓症作用のフラグメントを
担体から溶出する。
モトリプシン又はトリプシンを使用する場合、タンパク
質分解による分解を、因子ＩＸのアミノ末端を保護する
条件で実施する。そのアミノ末端を有する因子ＩＸは可
逆的に、すなわち共有結合ではなく、固形担体と結合
し、固定化された形でプロテアーゼで処理するのが好ま
しい。次いで因子ＩＸの抗血栓症作用のフラグメントを
担体から溶出する。
【００２８】担体として因子ＩＸをアミノ末端で結合す
る因子ＩＸに対するアニオン交換体又は親和性担体を使
用することができる。因子ＩＸはα- ヒドロキシル- ア
ミノプロピル- 基を有するポリマー、たとえばフラクト
ゲルアミノ- ＴＳＫと結合するのが特に好ましい。
る因子ＩＸに対するアニオン交換体又は親和性担体を使
用することができる。因子ＩＸはα- ヒドロキシル- ア
ミノプロピル- 基を有するポリマー、たとえばフラクト
ゲルアミノ- ＴＳＫと結合するのが特に好ましい。
【００２９】本発明による因子ＩＸ- フラグメントの他
の製造可能性は、溶液の形で好ましくは担体に固定され
たプロテアーゼ、たとえばキモトリプシン又はトリプシ
ンで因子ＩＸのタンパク質分解による分解である。この
際因子ＩＸのアミノ末端をＧｌａ- 及びＥＧＦ- ドメイ
ンと結合する低分子物質で保護する。この様な保護物質
として好ましくは低分子アミン及び特に好ましくは１-
アミノ -２- プロパノールを使用する。しかし他の保護
物質、たとえばプロトアミンの使用も可能である。
の製造可能性は、溶液の形で好ましくは担体に固定され
たプロテアーゼ、たとえばキモトリプシン又はトリプシ
ンで因子ＩＸのタンパク質分解による分解である。この
際因子ＩＸのアミノ末端をＧｌａ- 及びＥＧＦ- ドメイ
ンと結合する低分子物質で保護する。この様な保護物質
として好ましくは低分子アミン及び特に好ましくは１-
アミノ -２- プロパノールを使用する。しかし他の保護
物質、たとえばプロトアミンの使用も可能である。
【００３０】因子ＩＸのタンパク質分解による分解生成
物を、場合により穏やかな還元剤、たとえばジチオスレ
イトールで穏やかな条件下に処理することができる。こ
の方法で、たとえば原則的に因子ＩＸａから阻害的に作
用し、化学的に共有結合でなく変化されたフラグメント
を因子ＩＸ- 活性を有さずに単離することができる。
物を、場合により穏やかな還元剤、たとえばジチオスレ
イトールで穏やかな条件下に処理することができる。こ
の方法で、たとえば原則的に因子ＩＸａから阻害的に作
用し、化学的に共有結合でなく変化されたフラグメント
を因子ＩＸ- 活性を有さずに単離することができる。
【００３１】α- キモトリプシンによる因子ＩＸの慣用
処理で無傷のＧｌａ- 又はＥＧＦ-ドメインを含有する
分解生成物が生じるか又はＧｌａ- 及びＥＧＦ- ドメイ
ンを有する分解生成物の収量は極めて少量であることは
知られている（Wildgoose 等、Biochem. 及び Biophy
s. Res. Comm., １５２（１９８８），１２０７〜１２
１２）。いかなる場合もタンパク質分解による分解がコ
ントロールされて実施されるのが従来問題となる。とい
うのは常に種々の分解生成物の混合物を生じるからであ
る。
処理で無傷のＧｌａ- 又はＥＧＦ-ドメインを含有する
分解生成物が生じるか又はＧｌａ- 及びＥＧＦ- ドメイ
ンを有する分解生成物の収量は極めて少量であることは
知られている（Wildgoose 等、Biochem. 及び Biophy
s. Res. Comm., １５２（１９８８），１２０７〜１２
１２）。いかなる場合もタンパク質分解による分解がコ
ントロールされて実施されるのが従来問題となる。とい
うのは常に種々の分解生成物の混合物を生じるからであ
る。
【００３２】これに対して本発明による方法を用いれ
ば、有効なフラグメントを技術的に再現可能な方法で及
び高収率で純粋な形で初めて製造することができる。本
発明による方法の利点は、特に次の通りである： １．分解に使用されるプロテアーゼの不活性化に高い毒
性のプロテアーゼ阻害剤（たとえばジイソプロピルフル
オロホスフアート）を使用しない。 ２．因子ＩＸ- 分解生成物を化学的に変化させない。 ３．因子ＩＸの穏やかなタンパク質分解──そのアミノ
末端をマトリックス 、好ましくは２- ヒドロキシル-
アミノプロピル- 基を有するマトリックスに 固着する
ためである──。 ４．アミノ末端に存在するドメインの保護のために低分
子アミンを使用して、因子ＩＸの穏やかなタンパク質分
解。 ５．抗血栓症に有効な因子ＩＸ- フラグメントを有効で
ないフラグメントからクロマトグラフィー分離。
ば、有効なフラグメントを技術的に再現可能な方法で及
び高収率で純粋な形で初めて製造することができる。本
発明による方法の利点は、特に次の通りである： １．分解に使用されるプロテアーゼの不活性化に高い毒
性のプロテアーゼ阻害剤（たとえばジイソプロピルフル
オロホスフアート）を使用しない。 ２．因子ＩＸ- 分解生成物を化学的に変化させない。 ３．因子ＩＸの穏やかなタンパク質分解──そのアミノ
末端をマトリックス 、好ましくは２- ヒドロキシル-
アミノプロピル- 基を有するマトリックスに 固着する
ためである──。 ４．アミノ末端に存在するドメインの保護のために低分
子アミンを使用して、因子ＩＸの穏やかなタンパク質分
解。 ５．抗血栓症に有効な因子ＩＸ- フラグメントを有効で
ないフラグメントからクロマトグラフィー分離。
【００３３】
【実施例】以下に、本発明を例によって説明する。 〔例１〕タンパク質分解の間α- キモトリプシンによっ
てフラクトゲルアミノＴＳＫと結合する、天然因子ＩＸ
から因子ＩＸ- 分解生成物の製造。
てフラクトゲルアミノＴＳＫと結合する、天然因子ＩＸ
から因子ＩＸ- 分解生成物の製造。
【００３４】フラクトゲルアミノ- ＴＳＫ（メルク社、
ダルムシュタット）、α- ヒドロキシ- アミノプロピル
- 基と結合する、グリシジルメタアクリレート、ペンタ
エリスロールジメチルアクリレート及びポリビニルアル
コールの共重合体を有する５０ｍｌカラムを、トリス -
ＨＣｌ- 緩衝液（０．０５Ｍトリス -ＨＣｌ、０．０５
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で平衡する。トリス -ＨＣ
ｌ- 緩衝液中に溶解された比活性１１０Ｕ／ｍｇを有す
る因子ＩＸ１６ｍｇをカラム上に付与する。次いで更に
１０ｍＭ塩化カルシウムが添加された同一緩衝液でカラ
ムを洗滌する。
ダルムシュタット）、α- ヒドロキシ- アミノプロピル
- 基と結合する、グリシジルメタアクリレート、ペンタ
エリスロールジメチルアクリレート及びポリビニルアル
コールの共重合体を有する５０ｍｌカラムを、トリス -
ＨＣｌ- 緩衝液（０．０５Ｍトリス -ＨＣｌ、０．０５
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で平衡する。トリス -ＨＣ
ｌ- 緩衝液中に溶解された比活性１１０Ｕ／ｍｇを有す
る因子ＩＸ１６ｍｇをカラム上に付与する。次いで更に
１０ｍＭ塩化カルシウムが添加された同一緩衝液でカラ
ムを洗滌する。
【００３５】結合された因子ＩＸのフラグメント化のた
めにカルシウムを含有するトリス -ＨＣｌ- 緩衝液中に
溶解されたキモトリプシンでインキュベートする。緩衝
液中のプロテアーゼの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍｌで
ある。カラムをこの緩衝液で移動率１００ｍｌ／ｈで洗
浄し、選択された条件下でフラクトゲルアミノ- ＴＳＫ
- カラムに対する親和性を全く有さない、キモトリプシ
ン及び因子ＩＸの分解生成物から成るタンパク質分画が
１カラム容量を溶離後に得られる。プロテアーゼで汚染
されたこの分画は除かれる。
めにカルシウムを含有するトリス -ＨＣｌ- 緩衝液中に
溶解されたキモトリプシンでインキュベートする。緩衝
液中のプロテアーゼの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍｌで
ある。カラムをこの緩衝液で移動率１００ｍｌ／ｈで洗
浄し、選択された条件下でフラクトゲルアミノ- ＴＳＫ
- カラムに対する親和性を全く有さない、キモトリプシ
ン及び因子ＩＸの分解生成物から成るタンパク質分画が
１カラム容量を溶離後に得られる。プロテアーゼで汚染
されたこの分画は除かれる。
【００３６】トリス -ＨＣｌ- キモトリプシン緩衝液の
２．５カラム容量で洗浄後、プロテアーゼ及びカルシウ
ム不含トリス -ＨＣｌ- 緩衝液でカラムからもはやタン
パク質が溶離されなくなるまで洗滌する。
２．５カラム容量で洗浄後、プロテアーゼ及びカルシウ
ム不含トリス -ＨＣｌ- 緩衝液でカラムからもはやタン
パク質が溶離されなくなるまで洗滌する。
【００３７】別の工程で、マトリックスをトリス -ＨＣ
ｌ- 緩衝液（０．０５Ｍトリス- ＨＣｌ- 、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）でもはやタンパク質が溶離さ
れなくなるまで洗浄する。
ｌ- 緩衝液（０．０５Ｍトリス- ＨＣｌ- 、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）でもはやタンパク質が溶離さ
れなくなるまで洗浄する。
【００３８】有効な因子ＩＸ- 分解生成物の溶離のため
に、トリス -ＨＣｌ- 緩衝液のＮａＣｌ- 濃度を０．５
Ｍに増加する。所望の分画を７０ｍｌの容量で溶離す
る。フラグメントは、もはや因子ＩＸ- 活性を有してい
ない。
に、トリス -ＨＣｌ- 緩衝液のＮａＣｌ- 濃度を０．５
Ｍに増加する。所望の分画を７０ｍｌの容量で溶離す
る。フラグメントは、もはや因子ＩＸ- 活性を有してい
ない。
【００３９】試験管内でフラグメントは因子Ｘ- 活性化
を内皮細胞の存在下に並びにリン脂質の関与下に因子Ｉ
Ｘａを有するプラズマの凝固を阻害する。これに反して
フラグメントはトロンビンが添加されたプラズマ試料の
凝固を阻害しない。
を内皮細胞の存在下に並びにリン脂質の関与下に因子Ｉ
Ｘａを有するプラズマの凝固を阻害する。これに反して
フラグメントはトロンビンが添加されたプラズマ試料の
凝固を阻害しない。
【００４０】因子ＩＸ- フラグメントを７５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで透析し、次いで凍結乾燥する。非還元条件下でフ
ラグメント分画のＳＤＳ- ゲル電気泳動で、約４７００
０及び３４０００ダルトンの分子量を有する、因子ＩＸ
のアミノ末端に対応することができる２つの帯びを調べ
る。
Ｃｌで透析し、次いで凍結乾燥する。非還元条件下でフ
ラグメント分画のＳＤＳ- ゲル電気泳動で、約４７００
０及び３４０００ダルトンの分子量を有する、因子ＩＸ
のアミノ末端に対応することができる２つの帯びを調べ
る。
【００４１】使用された因子ＩＸのタンパク質量に対す
る、有効な因子ＩＸ- 分解生成物の収率は６０％であ
る。 〔例２〕タンパク質分解の間トリプシンによってフラク
トゲルアミノＴＳＫと結合する、天然因子ＩＸから因子
ＩＸ- 分解生成物の製造。
る、有効な因子ＩＸ- 分解生成物の収率は６０％であ
る。 〔例２〕タンパク質分解の間トリプシンによってフラク
トゲルアミノＴＳＫと結合する、天然因子ＩＸから因子
ＩＸ- 分解生成物の製造。
【００４２】１０ｍｇ因子ＩＸを、例１と同様に処理す
るが、キモトリプシンの代わりにトリプシンを０．０５
ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する。還元条件下でＳＤＳ- ゲ
ル電気泳動で、メインバンドが約３３０００ダルトンで
検出される。これは因子ＩＸのアミノ末端に対応するこ
とができる。
るが、キモトリプシンの代わりにトリプシンを０．０５
ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する。還元条件下でＳＤＳ- ゲ
ル電気泳動で、メインバンドが約３３０００ダルトンで
検出される。これは因子ＩＸのアミノ末端に対応するこ
とができる。
【００４３】使用される因子ＩＸ- 量に対して有効な因
子ＩＸ- フラグメントの収率は、この仕込物中で５７％
である。因子ＩＸ- フラグメントは、もはや因子ＩＸ-
活性を有していない。これは試験管内で内皮細胞に対す
る因子Ｘ- 活性及びリン脂質の関与下に因子ＩＸａを含
有するプラズマの凝固を阻害する。トロンビンが添加さ
れた血漿試料の凝固は阻害されない。 〔例３〕因子ＩＸ- 分解生成物を１- アミノ -２- プロ
パノールの使用下に製造。
子ＩＸ- フラグメントの収率は、この仕込物中で５７％
である。因子ＩＸ- フラグメントは、もはや因子ＩＸ-
活性を有していない。これは試験管内で内皮細胞に対す
る因子Ｘ- 活性及びリン脂質の関与下に因子ＩＸａを含
有するプラズマの凝固を阻害する。トロンビンが添加さ
れた血漿試料の凝固は阻害されない。 〔例３〕因子ＩＸ- 分解生成物を１- アミノ -２- プロ
パノールの使用下に製造。
【００４４】トリスＨＣｌ- 緩衝液６０ｍｌ（０．０５
トリス -ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）
中に溶解された比活性１１０Ｕ／ｍｇを有する１６ｍｇ
因子ＩＸに、１０ｍＭ１- アミノ -２- プロパノールを
加える。この溶液を移動率２００ＭＬ／ｈでα- キモト
リプシン- セファロースを有する１５ｍｌカラムを介し
てポンプ送入する。１５分毎に溶液中に残存する因子Ｉ
Ｘ- 活性を一段階テストで測定する。因子ＩＸ- 活性が
もはや溶液中に検出されない場合、タンパク質がもはや
カラムから溶離しなくなるまでカラムを緩衝液で洗滌す
る。
トリス -ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）
中に溶解された比活性１１０Ｕ／ｍｇを有する１６ｍｇ
因子ＩＸに、１０ｍＭ１- アミノ -２- プロパノールを
加える。この溶液を移動率２００ＭＬ／ｈでα- キモト
リプシン- セファロースを有する１５ｍｌカラムを介し
てポンプ送入する。１５分毎に溶液中に残存する因子Ｉ
Ｘ- 活性を一段階テストで測定する。因子ＩＸ- 活性が
もはや溶液中に検出されない場合、タンパク質がもはや
カラムから溶離しなくなるまでカラムを緩衝液で洗滌す
る。
【００４５】因子ＩＸ- 分解生成物を有する溶液の透析
を、トリスＨＣｌ- 緩衝液（０．０５ＭトリスＨＣｌ、
０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）で行う。所望される因子
ＩＸ- フラグメントの精製を２- ヒドロキシル- アミノ
- 基を有するマトリックス（フラクトゲルアミノ- ＴＳ
Ｋ）を用いてクロマトグラフィーを介して行われる。
を、トリスＨＣｌ- 緩衝液（０．０５ＭトリスＨＣｌ、
０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）で行う。所望される因子
ＩＸ- フラグメントの精製を２- ヒドロキシル- アミノ
- 基を有するマトリックス（フラクトゲルアミノ- ＴＳ
Ｋ）を用いてクロマトグラフィーを介して行われる。
【００４６】フラクトゲルアミノ- ＴＳＫを有する５０
ｍｌカラムを、トリスＨＣｌ- 緩衝液（５０ｍＭトリス
- ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）で平衡する。
因子ＩＸ- 分解生成物を有する溶液を、蒸留水１〜２分
で希釈し、移動率３００ｍｌ／ｈでカラムに加える。抗
血栓性有効な因子ＩＸ- 分解生成物はカラムと結合す
る。一方有効でないかつ他の不純物を溶出する。
ｍｌカラムを、トリスＨＣｌ- 緩衝液（５０ｍＭトリス
- ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）で平衡する。
因子ＩＸ- 分解生成物を有する溶液を、蒸留水１〜２分
で希釈し、移動率３００ｍｌ／ｈでカラムに加える。抗
血栓性有効な因子ＩＸ- 分解生成物はカラムと結合す
る。一方有効でないかつ他の不純物を溶出する。
【００４７】トリス -ＨＣｌ- 緩衝液（０．０５Ｍトリ
ス -ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）での洗滌
工程後、抗血栓性有効な因子ＩＸ- 分解生成物を４０〜
６０ｍｌの容量で溶離する。これは例１に記載したのと
同一の性質を有する。その分子量は約５００００ダルト
ンであり、因子ＩＸのアミノ末端に対応することができ
る。
ス -ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）での洗滌
工程後、抗血栓性有効な因子ＩＸ- 分解生成物を４０〜
６０ｍｌの容量で溶離する。これは例１に記載したのと
同一の性質を有する。その分子量は約５００００ダルト
ンであり、因子ＩＸのアミノ末端に対応することができ
る。
【００４８】０．０５Ｍトリス -ＨＣｌ、７５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７で新たに透析した後、因子ＩＸ- フラグ
メントを凍結乾燥する。使用される因子ＩＸのタンパク
質量に対する収率は６３％である。 〔例４〕タンパク質分解の間フラクトゲルアミノＴＳＫ
と結合する活性因子ＩＸから因子ＩＸ- 開裂生成物の製
造。
ａＣｌ、ｐＨ７で新たに透析した後、因子ＩＸ- フラグ
メントを凍結乾燥する。使用される因子ＩＸのタンパク
質量に対する収率は６３％である。 〔例４〕タンパク質分解の間フラクトゲルアミノＴＳＫ
と結合する活性因子ＩＸから因子ＩＸ- 開裂生成物の製
造。
【００４９】ラッセルマムシ毒薬（ＲＶＶ、シグマ社、
ハイデルベルグ）をＣＮＢｒ- 活性化されたセファロー
ス４Ｂと製造業者（ファルマシア、スウェーデン）の指
示に従って結合する。ゲル１ｍｌはＲＶＶ１．５ｍｇを
含有する。比活性１１０Ｕ／ｍｇを有する因子ＩＸ- 溶
液を、もはや活性増加が認められなくなるまで、このカ
ラムを介してポンプ送入する。溶液をトリス -ＨＣｌ-
緩衝液（０．０５Ｍトリス- ＨＣｌ、０．０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．３）で透析する。
ハイデルベルグ）をＣＮＢｒ- 活性化されたセファロー
ス４Ｂと製造業者（ファルマシア、スウェーデン）の指
示に従って結合する。ゲル１ｍｌはＲＶＶ１．５ｍｇを
含有する。比活性１１０Ｕ／ｍｇを有する因子ＩＸ- 溶
液を、もはや活性増加が認められなくなるまで、このカ
ラムを介してポンプ送入する。溶液をトリス -ＨＣｌ-
緩衝液（０．０５Ｍトリス- ＨＣｌ、０．０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．３）で透析する。
【００５０】フラクトゲルアミノ- ＴＳＫを有する３０
ｍｌカラムをトリス -ＨＣｌ- 緩衝液で平衡する。次い
で活性化された因子ＩＸ- 溶液をカラムに付与する。次
いで更に１０ｍＭ塩化カルシウムが添加された同一緩衝
液で洗滌する。
ｍｌカラムをトリス -ＨＣｌ- 緩衝液で平衡する。次い
で活性化された因子ＩＸ- 溶液をカラムに付与する。次
いで更に１０ｍＭ塩化カルシウムが添加された同一緩衝
液で洗滌する。
【００５１】塩化カルシウムを有する緩衝液に、α- キ
モトリプシンを０．０１５ｍｇ／ｍｌの濃度で加え、こ
の溶液を移動率７５ｍｌ／ｈの循環でカラムを介して加
える。１カラム容量の溶離後、α- キモトリプシン及び
因子ＩＸａの分解生成物から成る分画が得られる。これ
はアミノＴＳＫに対する親和性を有さない。
モトリプシンを０．０１５ｍｇ／ｍｌの濃度で加え、こ
の溶液を移動率７５ｍｌ／ｈの循環でカラムを介して加
える。１カラム容量の溶離後、α- キモトリプシン及び
因子ＩＸａの分解生成物から成る分画が得られる。これ
はアミノＴＳＫに対する親和性を有さない。
【００５２】キモトリプシン含有緩衝液３ＷＹ ，容量
で洗浄後、タンパク質がもはやカラムから溶離しなくな
るまでプロテアーゼ不含トリス -ＨＣｌ- 緩衝液で洗滌
する。
で洗浄後、タンパク質がもはやカラムから溶離しなくな
るまでプロテアーゼ不含トリス -ＨＣｌ- 緩衝液で洗滌
する。
【００５３】マトリックスをタンパク質がもはや溶離し
なくなるまで０．０５Ｍトリス- ＨＣｌ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７で洗浄し、次いで０．０５Ｍトリス-
ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７で溶離する。
なくなるまで０．０５Ｍトリス- ＨＣｌ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７で洗浄し、次いで０．０５Ｍトリス-
ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７で溶離する。
【００５４】有効な因子ＩＸａ- フラグメントの収率
は、因子ＩＸａの使用量に対して６０％である。非還元
条件下でのＳＤＳ- ゲル電気泳動は、分子量約３１００
０ダルトンでメインバンドを示し、これは因子ＩＸのア
ミノ末端に対応することができる。
は、因子ＩＸａの使用量に対して６０％である。非還元
条件下でのＳＤＳ- ゲル電気泳動は、分子量約３１００
０ダルトンでメインバンドを示し、これは因子ＩＸのア
ミノ末端に対応することができる。
【００５５】因子ＩＸａ- 分解生成物を７５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで透析し、凍結乾燥する。フラグメントは、もはや
因子ＩＸａ- 活性を有さず、試験管内で因子Ｘ- 活性化
を内皮細胞の存在下に並びにリン脂質の関与下に因子Ｉ
Ｘａを有するプラズマの凝固を阻害する。これに反して
フラグメントはトロンビンが添加されたプラズマ試料の
凝固を阻害しない。
Ｃｌで透析し、凍結乾燥する。フラグメントは、もはや
因子ＩＸａ- 活性を有さず、試験管内で因子Ｘ- 活性化
を内皮細胞の存在下に並びにリン脂質の関与下に因子Ｉ
Ｘａを有するプラズマの凝固を阻害する。これに反して
フラグメントはトロンビンが添加されたプラズマ試料の
凝固を阻害しない。
【００５６】驚くべきことに、生体内で本発明による因
子ＩＸ- フラグメントを用いて因子ＩＸａの投与によっ
て引き起こされる激しい血小板減少を達成することがで
きる。因子ＩＸａは、ウサギに於て血管内血栓症を誘発
する強い凝塊形成物である。 ウサギを用いる動物実験 ５匹の麻酔されたウサギに、耳静脈にカニューレによっ
て因子ＩＸａ０．１２ｍｇ／ｋｇ体重を注射する。
子ＩＸ- フラグメントを用いて因子ＩＸａの投与によっ
て引き起こされる激しい血小板減少を達成することがで
きる。因子ＩＸａは、ウサギに於て血管内血栓症を誘発
する強い凝塊形成物である。 ウサギを用いる動物実験 ５匹の麻酔されたウサギに、耳静脈にカニューレによっ
て因子ＩＸａ０．１２ｍｇ／ｋｇ体重を注射する。
【００５７】別の５匹の動物に、例１から得られた因子
ＩＸ１．８ｍｇ／ｋｇ体重の投与量を、因子ＩＸａの投
与５〜１０分前に注射する。５匹のコントロール動物と
して因子ＩＸａの代わりに０．９％ＮａＣｌ- 溶液０．
２ｍｌ／ｋｇ体重を投与する。
ＩＸ１．８ｍｇ／ｋｇ体重の投与量を、因子ＩＸａの投
与５〜１０分前に注射する。５匹のコントロール動物と
して因子ＩＸａの代わりに０．９％ＮａＣｌ- 溶液０．
２ｍｌ／ｋｇ体重を投与する。
【００５８】全実験時間６０分かけて、動脈性血圧、呼
吸数及び標準- ＥＫＧを記録し、特定の時点に動脈血を
クエン酸チューブ中に採取する。採取された血液中に、
血小板数及び２〜３匹の動物でＡＰＴＴ及びトロンビン
時間を測定する。
吸数及び標準- ＥＫＧを記録し、特定の時点に動脈血を
クエン酸チューブ中に採取する。採取された血液中に、
血小板数及び２〜３匹の動物でＡＰＴＴ及びトロンビン
時間を測定する。
【００５９】実験用動物の調製以外、動物の血管系は何
ら左右されない。したがって血管中で正常の血流が保証
される。コントロール動物グループに於て、実験工程全
体にわたって血小板数の僅かな減少が認められる。これ
は動物の調製及び麻酔でさえ血小板の安定に影響を与え
ることを示す。
ら左右されない。したがって血管中で正常の血流が保証
される。コントロール動物グループに於て、実験工程全
体にわたって血小板数の僅かな減少が認められる。これ
は動物の調製及び麻酔でさえ血小板の安定に影響を与え
ることを示す。
【００６０】しかし因子ＩＸａが投与された動物の場
合、ＮａＣｌ- 溶液が与えられたコントロールグループ
に比して激しい顕著な血小板数の減少が認められる。動
物は播種性血管内凝固の症状（ＤＩＣ）を示す。より著
しい血圧減少並びに呼吸数及びＥＫＧに於ける著しい変
動が生じる。
合、ＮａＣｌ- 溶液が与えられたコントロールグループ
に比して激しい顕著な血小板数の減少が認められる。動
物は播種性血管内凝固の症状（ＤＩＣ）を示す。より著
しい血圧減少並びに呼吸数及びＥＫＧに於ける著しい変
動が生じる。
【００６１】凝固活性に関する極めて明白な証拠は、ク
エン酸チューブ中での２〜３の血液試料の凝固及びＡＰ
ＴＴの短縮又はトロンビン時間の増加である。このこと
はフィブリノーゲンの消費及び血管内にフィブリン血餅
の形成を示す。
エン酸チューブ中での２〜３の血液試料の凝固及びＡＰ
ＴＴの短縮又はトロンビン時間の増加である。このこと
はフィブリノーゲンの消費及び血管内にフィブリン血餅
の形成を示す。
【００６２】因子ＩＸａの投与５〜１０分前に本発明に
よる因子ＩＸ- フラグメントを投与されたウサギは、上
記不相容性反応を示さない。血小板数は、驚くべきこと
にコントロール動物グループの範囲内にとどまる。採取
された血液試料の凝固はすべての場合に観察されなかっ
た。ＡＰＴＴ及びトロンビン時間は比較的一定に保たれ
る。これは凝固活性化が、防護される血管外凝固に影響
することなく、妨げられることを示す。
よる因子ＩＸ- フラグメントを投与されたウサギは、上
記不相容性反応を示さない。血小板数は、驚くべきこと
にコントロール動物グループの範囲内にとどまる。採取
された血液試料の凝固はすべての場合に観察されなかっ
た。ＡＰＴＴ及びトロンビン時間は比較的一定に保たれ
る。これは凝固活性化が、防護される血管外凝固に影響
することなく、妨げられることを示す。
【００６３】因子ＩＸ- フラグメント２ｍｇ／ｋｇの単
一投与量は、不相容性反応を全く示さず、血小板数はコ
ントロール動物グループのレベル以上を保つ。動物及び
その麻酔動物の調製の血小板安定性への影響は、因子Ｉ
Ｘ- フラグメントによって阻止される。
一投与量は、不相容性反応を全く示さず、血小板数はコ
ントロール動物グループのレベル以上を保つ。動物及び
その麻酔動物の調製の血小板安定性への影響は、因子Ｉ
Ｘ- フラグメントによって阻止される。
【００６４】
【発明の効果】本発明による因子ＩＸ- 分解生成物を用
いることによって、生体内で強力な血小板媒介される凝
血活性化を阻害し、同時に血小板を安定化することがで
きる。血管外凝血の予防はこの処理によって何ら影響を
うけない。
いることによって、生体内で強力な血小板媒介される凝
血活性化を阻害し、同時に血小板を安定化することがで
きる。血管外凝血の予防はこの処理によって何ら影響を
うけない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/06 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＢ (71)出願人 595016417 フランク・モルフエルト オーストリア国、1100 ウイーン、ゼネフ エルダー・ガッセ、８ (72)発明者 ウオルフガング・メラー ドイツ連邦共和国、61440 オーバーウル ゼル、グラーフ− フオン− シユタウフ エンベルク− ストラーセ、32 (72)発明者 ロナルト・コティチユケ ドイツ連邦共和国、63303 ドライアイヒ、 クライストストラーセ、23 (72)発明者 フランク・モルフエルト オーストリア国、1100 ウイーン、ゼネフ エルダー・ガッセ、８
Claims (14)
- 【請求項１】 ヒト血液凝固因子ＩＸのタンパク質分解
による分解生成物を主体とする、抗血栓症作用を有する
有効物質に於て、因子ＩＸ- フラグメントは、 ａ）Ｇａｌ- ドメイン及び少なくとも１個のＥＧＦ- 様
ドメインを含有し、 ｂ）因子ＩＸ- 凝固活性を示さず、 ｃ）化学的に変化せず、 ｄ）約１２．０００〜５０．０００Ｄの分子量を有す
る、 ことを特徴とする、上記有効物質。 - 【請求項２】 請求項１記載の有効物質を含有する又は
これから成る、血栓症疾患の予防及び治療のための薬
剤。 - 【請求項３】 因子ＩＸを因子ＩＸがアミノ末端で結合
する担体と結合し、タンパク質分解により分解し、分解
生成物を担体から溶出し、精製し、場合により凍結乾燥
する、請求項１記載の有効物質の製造方法。 - 【請求項４】 固形担体として、アニオン交換体又は因
子ＩＸのアミノ末端に対して親和性を有する親和性担体
を使用する、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 固形担体は、α- ヒドロキシル- アミノ
- プロピル- 基を官能基として有する、請求項３又は４
記載の方法。 - 【請求項６】 固形担体は、α- ヒドロキシル- アミノ
- プロピル- 基を有するグリシジルメタアクリレート、
ペンタエリスロールジメタアクリレート及びポリビニル
アルコールのコポリマーである、請求項３又は４記載の
方法。 - 【請求項７】 因子ＩＸを、保護物質の添加後、溶液の
形でタンパク質分解により分解し、分解生成物を分離
し、精製し、場合により凍結乾燥する、請求項１記載の
方法。 - 【請求項８】 保護物質として低分子アミンを使用す
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 因子ＩＸを溶液の形で１- アミノ -２-
プロパノールの添加下にタンパク質分解により開裂す
る、請求項７又は８記載の方法。 - 【請求項１０】 プロテアーゼを固形担体上に固定す
る、請求項７ないし９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 因子ＩＸをタンパク質分解前に活性化
して因子ＩＸａとする、請求項３ないし１０のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１２】 プロテアーゼはα- キモトリプシンで
ある、請求項３ないし１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 プロテアーゼはトリプシンである、請
求項３ないし１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 出発化合物としてヒト血漿又は因子Ｉ
Ｘ- 含有血漿分画からあるいは細胞培養培地から得られ
た因子ＩＸを使用する、請求項３ないし１３のいずれか
に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4403057A DE4403057C1 (de) | 1994-02-02 | 1994-02-02 | Thrombozytenstabilisierende Faktor IX-Fragmente, deren Herstellung sowie sie enthaltende Arzneimittel |
| DE4403057:6 | 1994-02-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07291999A true JPH07291999A (ja) | 1995-11-07 |
Family
ID=6509222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7015267A Withdrawn JPH07291999A (ja) | 1994-02-02 | 1995-02-01 | 血小板安定化因子ｉｘ−フラグメント、その製造方法及びこれを含有する薬剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0666315A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07291999A (ja) |
| CA (1) | CA2141642A1 (ja) |
| DE (1) | DE4403057C1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4403057C1 (de) * | 1994-02-02 | 1994-12-08 | Biotest Pharma Gmbh | Thrombozytenstabilisierende Faktor IX-Fragmente, deren Herstellung sowie sie enthaltende Arzneimittel |
| US8128963B2 (en) | 1996-09-27 | 2012-03-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating ischemic disorders using carbon monoxide |
| US6315995B1 (en) * | 1996-09-27 | 2001-11-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating an ischemic disorder and improving stroke outcome |
| ATE358492T1 (de) * | 1996-09-27 | 2007-04-15 | Univ Columbia | Behandlung einer ischämischen störung und zur verbesserung des infarktergebnis |
| CA2243230A1 (en) * | 1998-07-15 | 2000-01-15 | Aled Edwards | A device and method for the determination of protein domain boundaries |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK525787A (da) * | 1986-10-09 | 1988-04-10 | Hoffmann La Roche | Polypeptidantagonister |
| DE4403057C1 (de) * | 1994-02-02 | 1994-12-08 | Biotest Pharma Gmbh | Thrombozytenstabilisierende Faktor IX-Fragmente, deren Herstellung sowie sie enthaltende Arzneimittel |
-
1994
- 1994-02-02 DE DE4403057A patent/DE4403057C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-01-25 EP EP95100944A patent/EP0666315A1/de not_active Withdrawn
- 1995-02-01 JP JP7015267A patent/JPH07291999A/ja not_active Withdrawn
- 1995-02-01 CA CA002141642A patent/CA2141642A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0666315A1 (de) | 1995-08-09 |
| CA2141642A1 (en) | 1995-08-03 |
| DE4403057C1 (de) | 1994-12-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020402 |