JPH03175997A - 総ビリルビンの定量法及びそれに用いる試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野１ 本発明はビリルビンを酵素的に定量する方法及び、それ
に用いる定量用試薬に関し、特に血清中等の総ビリルビ
ンの定量方法に関する。

［従来技術］ ビリルビンは胆汁中に最も多く存在する色素で、主とし
て老廃赤血球の崩壊により生成される血色素から作られ
、血清中では主にグルクロン酸と結合した抱合型ビリル
ビン（直接型どりルピン）またはアルブミンと結合した
非抱合型ビリルビン（間接型ビリルビン）として存在す
る。抱合型ビリルビンと非抱合型ビリルビンを合わせた
ものを総ビリルビンと呼んでいる。

抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビンの血清中存在量
から、肝機能障害の分別診断および肝機能障害の程度を
知ることが可能であるため、ビリルビンの定量は臨床的
に極めて重要である。

従来、ビリルビンの定量法としては、ビリルビンとジア
ゾ試薬の反応で生成するアゾビリルビンを比色定量する
方法（金井　泉：臨床検査法提要金属出版　ページ　Ｘ
ｌｌ−２４昭和５３年）などの化学的測定法が主に用い
られている。しかし、これらの方法は、ジアゾ試薬が検
体中に存在するビリルビン以外の生体成分と反応するた
め正確性に欠けるなど問題がある。

一方、酵素を用いたビリルビンの定量法としては、タイ
−ウィング・つらによる菌茸由来のどリルビンオキシタ
ーゼを用いビリルビンを酸化させ、このときの吸光度の
減少を測定し定量する方法（特開昭５６−２７６５６）
や、付属らによるミロセシウム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍ　）の微生物由来のビリルビンオキシダーゼを用い
同様にビリルビンの吸光度の減少を測定し定量する方法
（特開昭５７−１５９４８７　）などが報告されている
。

［発明が解決しようとする課題］ このような酵素を用いたビリルビンの定量法は前記ジア
ゾ試薬を用いる方法に比べ、正確性、分析精度などの点
で優れたものであるが、多量の酵素を必要とするため試
薬の価格が高く、また長い反応時間（１５〜３０分間程
度）が必要であるため測定の自動化が困難であるなどの
問題があった。

一方、上記酵素反応による定量法の改良方法も研究され
ており、例えば、コール酸ナトリウム、サルファ剤等の
反応促進物質をビリルビンオキシダーゼと併用すること
により、ビリルビンの酵素反応性を向上させる（特公昭
６２−３３８８０他）ことが知られている。しかしなが
ら、これらによる反応促進効果は不十分であり、若干の
反応時間の短縮が可能であるものの、自動化に適応する
までには至っていなかった（１０分程度の反応時間が必
要）。

本発明は上記従来技術の実情に鑑み成されたものであり
、酵素反応に基づく総ビリルビンの定量を短時間にかつ
正確に行うことのできる方法及び試薬を提供するもので
ある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、前記の問題点を克服するために、鋭意研
究を行った結果　ビリルビンオキシダーゼに特定のフェ
ノール類または／およびアニリン類を併用することによ
り、酵素反応を著しく促進させることができることを見
出し本発明を完成したのである。

すなわち、本発明は、ビリルビン含有水性検体にビリル
ビンオキシダーゼを作用させ、それにより生ずるビリル
ビンの変化を光学的に測定することにより該検体中の総
ビリルビンを定量する方法において、ビリルビンオキシ
ダーゼによる酵素反応を、一般式（Ｉ）で表わされるフ
ェノール類および一般式（ＩＩ　）で表わされるアニリ
ン類から成る群より選ばれる１種又は２種以上の化合物
により促進させることを特徴とする総ビリルビンの定量
方法、 Ｒ＠　　　　Ｒ４ （式中、Ｒｌ、　Ｒ８はそれぞれ独立に、水素原子、ハ
ロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４
のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す。

但し、Ｒ３がカルボキシル基および水酸基であるものを
除く。） （式中、 Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、 水素原 子、又は炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシアルキ
ル基、スルホアルキル基、ヒドロキシスルホアルキル基
若しくはスルホナミドアルキル基を示す。Ｒ８およびＲ
９はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数
１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシル基
を示す。）及び、上記で示されるフェノール類およびア
ニリン類から成る群より選ばれる１種又は２種以上の化
合物とビリルビンオキシダーゼとを少なくとも組み合わ
せて成るビリルビン含有水性検体中の総ビリルビン比色
定量用試薬である。

本発明によれば、従来知られていた酵素による総ビリル
ビン定量法に比べ、短時間に安定して正確な総ビリルビ
ン（以下、特に記載がなければビリルビンと称す。）量
を測定することができ、測定の自動化を容易に図ること
が可能となる。

一般式（Ｉ）で示されるフェノール類及び一般式（ＩＩ
）で示されるアニリン類はビリルビンオキシダーゼによ
る酵素反応を促進する化合物（以下、酵素反応促進剤と
略称する。）であるが、これらは公知のコール酸ナトリ
ウム等の直接化剤とは異なり、直接型ビリルビンに対し
ても有効な酵素反応促進効果を奏する。その作用機序に
ついては不明であるが、前記フェノール類又はアニリン
類は電子供与体としての性質があり、ビリルビンオキシ
ダーゼの電子伝達系に作用し、その結果、ビリルビンの
酸化反応を促進するものと考えられる。

本発明で用いることのできる酵素反応促進剤は一般式（
Ｉ）および（ＩＩ）で示されるフェノール類およびアニ
リン類であるが、特に、モノまたはジ置換フェノール誘
導体、フェノール、モノまたはジ置換アニリン誘導体及
びアニリンでは良好な効果を得ることができる。これら
の化合物の例としては、以下の表に示すものを挙げるこ
とができる。

フェノール類 表中、 記載がない場合は水素である。

アニリン類 表中、記載が無い場合は水素である。

次に、本発明のビリルビン定量方法について説明する。

本発明において、ビリルビンの定量を行う検体としては
、−Ｍにビリルビンを含有する水性検体であり、例えば
、血清、血漿、胆汁等が挙げられ、これらは必要により
希釈されたり、前処理されていてもよい。

又、用いることのできるビリルビンオキシダーゼとして
はミロセシウム属微生物由来のものの他、アガリカスビ
スポーラス由来のもの等その由来に関係なく、一般にビ
リルビンオキシダーゼとして用いられる酵素であればい
ずれでもよいが、ミロセシウム属微生物由来のものは入
手し易く、取扱い易い。

本発明のビリルビン定量方法は基本的にビリルビン含有
水性検体（以下、単に検体と略称す。）にビリルビンオ
キシダーゼを作用させ、酵素反応促進剤で該オキシダー
ゼで起る酵素反応を促進し、所定時間経過後に吸光度変
化を測定することにより総ビリルビンを定量するという
ものである。これは酵素反応によりビリルビンが酸化を
受はビリベルジンに変化し、吸光特性が変化することに
基づいている。

−ｉ的にビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨは６〜７、
至適温度は４０℃付近であるが、本発明の促進剤を用い
ることにより、ｐＨ５〜１１で顕著な反応促進効果を得
ることができる。一方、検体中のビリルビンはｐＨによ
り吸光特性が変化するため、測定中は反応液のｐＨは一
定に保つことが必要である。このため、一般に酵素反応
によりビリルビンを定量する場合は、緩衝液を用いる。

本発明で用いることのできる緩衝液としてはｐＨが５〜
１１程度のものであればいずれでもよく、例えばトリス
−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いることができる。

すなわち、総ビリルビンを定量するには、直接型及び間
接型ビリルビンの両者を定量しなければならないが、間
接型ビリルビンは低いｐＨ領域（例えばｐＨ４以下）で
はほとんど酵素反応を受けなくなるため、反応液のｐＨ
は５〜１１、好ましくは７〜１０程度に設定しておくと
よい。

本発明において、検体中のビリルビン量を定量するのに
用いる試薬は、基本的に（ｉ）緩衝液（ｉｉ）酵素反応
促進剤（ｉ　ｉ　ｉ）ビリルビンオキシダーゼの３つで
構成される。

上記３つの試薬をどのような手順及び形態で検体に加え
るかは、特に制限はないが、酵素反応促進剤とビリルビ
ンオキシダーゼとが長時間接触すると該促進剤が酵素反
応により酸化され着色したりするため、前記２つの試薬
は検体に投入される前までは分離しておく必要がある。

本発明において上記試薬を用いる態様としては次に示す
ものがある。

（１）検体に、酵素反応促進剤を含有した緩衝液を加え
予備加温後、ビリルビンオキシダーゼ溶液を加える（２
試薬系）。

（２）検体に５緩衝液を加え予備加温後、酵素反応促進
剤溶液とビリルビンオキシダーゼ溶液を同時に加える（
３試薬系）。

特に、自動分析装置によりビリルビンを定量する場合に
は、２試薬系である（１）が好適であり、測定の迅速化
を図ることができる。ここで、酵素反応に要求されるｐ
Ｈ領域は、総ビリルビンの場合、５〜１１であるので緩
衝液にる緩衝作用は反応液（すなわち、すべての必要な
試薬を検体に加えたもの）でも維持されている必要があ
る。このため、酵素反応促進剤又はビリルビンオキシダ
ーゼを緩衝液とは別に加えかつそれらが溶液として量的
に多い場合は、所定のｐＨ領域を維持することができな
くなるので、この場合は、必要により前記成分を適当な
緩衝液に溶解して加えるとよい。いずれにせよ、酵素反
応促進剤は反応系で溶解している必要があり、反応液の
ｐ）Ｉ帯等により適宜選択して用いる。又、ビリルビン
オキシダーゼは水溶液でもよく、緩衝液を用いる場合は
ｐ！１６〜９程度の範囲とするとよい。

総ビリルビンの定量を行う場合の、フェノール類の用量
は、酵素反応の促進効果を奏する量であればよいが、反
応液中の濃度（最終濃度）として通常０．１〜５０ｍＭ
、好ましくは１〜１５ｍＭがよい。アニリン類は同様に
０．００１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭ
がよい。

ビリルビンオキシダーゼの使用量は、基本的に、検体中
に存在するビリルビンの量により異なるが、通常最終濃
度として０．０５〜１．、ＯＵ／ｍ１使用するのが好ま
しい。

上記それぞれの最終濃度は、反応液中での濃度であり、
試薬溶液中の濃度及び試薬溶液の量は特に限定されない
。ビリルビンオキシダーゼは水性溶液に相当量溶解する
ため（例えば１００　Ｕ／ｍ１以上）、溶解性からの制
約はなく、この意味で各試薬溶液の割合は、所望のｐＨ
領域になれば、測定の操作上の便宜により設定すること
ができる。自動分析装置を用いる場合は、前記（１）の
２試薬系を用い、酵素反応促進剤含有緩衝液とビリルビ
ンオキシダーゼ溶液との比は、通常、５：１から１＝１
程度が実用的である。

尚、本発明においては、反応液中に公知の直接化剤等反
応促進剤を加えてもよい。例えば、コール酸ナトリウム
、ドデシル硫酸ナトリウム等を緩衝液に存在させておく
ことができる。これらの反応促進剤を用いる場合は通常
０．１〜１％程度でよい。

上述測定方法の具体的操作としては、前記（１）の２試
薬系の場合、ビリルビン含有水性検体に酵素反応促進剤
含有緩衝液を所定量加え、予備加温後（例えば３７℃、
３分間）、所定量のビリルビンオキシダーゼ溶液を加え
、反応液のｐＨを５〜１１の範囲に保って検体中に存在
していたビリルビンを酵素反応により酸化する。この際
、反応液中のビリルビンの減少を比色定量すれば、結果
的に検体中のビリルビン量を測定することができる。本
発明の方法によればビリルビンオキシダーゼ装入後、１
〜２分間程度で正確な定量が可能となる。

尚、間接型ビリルビンの安定性はｐＨにより異なり低い
ｐＨでは酵素反応を受けにくくなるため、アニリン類、
特にｍ−トルイジン誘導体（前記の表、Ａｔ、Ａ５．Ａ
ＩＯ，Ａ１８）を用い、ｐＨを３．０〜４．０に調節す
ることにより、直接型ビリルビンの分別測定に対しても
、非常に有効な反応促進剤となり得る。

本発明のビリルビン定量用試薬を自動分析装置等に適用
するには、キットとして取扱うと実用上非常に便利であ
る。すなわち、前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わさ
れるフェノール類およびアニリン類から成る群より選ば
れる１種又は２種以上の化合物を少なくとも溶解してい
る緩衝液を第１試薬、ビリルビンオキシダーゼ溶液を第
２試薬としたビリルビン定量用キットを用いると操作を
簡単化することができる。尚、ビリルビンオキシダーゼ
は安定性が比較的低いため、溶液状態で保存することは
好ましくなく、測定の直前に調製するとよい。この場合
の溶液は前述したようにｐＨ６〜９程度の緩衝液か水溶
液でもよい。又、各成分はそれらの最終濃度が前述した
範囲内になるように調整し、かつ緩衝液のｐＨが所定の
範囲内になるようにする。例えば、検体１０〜１００μ
ｔに対して、第１試薬としてフェノール類を０．２〜１
００　ｍＭ又は／及びアニリン類を０．００２〜１００
ｍＭ含有しているｐＨ５〜１１の緩衝液２ｍ１（さらに
コール酸ナトリウム等を含有していてもよい）、第２試
薬としてビリルビンオキシダーゼを０．３〜６Ｕ／ｍｌ
含有している水溶液０．３ｍｌ〜２ｍｌ程度を用いると
よい。ビリルビンオキシダーゼの量は検体中に存在する
ビリルビン量により調整すればよいが、血清等を検体と
する場合には通常、上記範囲内の程度でよい。

尚、比色定量は常法によって行うことができ、例えば、
市販の分光光度計（例えば日立Ｕ−３２００形自記分光
光度計）を用い、波長４００〜４８０ｎｍにて試薬盲検
を対照にして吸光度を測定する。この際、対照として既
知濃度のビリルビン含有血清（以下、標準という）を用
い、同様に吸光度を測定し、さらに検体盲検としてこれ
ら検体血清および標準にビリルビンオキシダーゼを含ま
ない緩衝液を添加したものについて同様に吸光度を測定
し、これらに基づいて下記式よりビリルビン濃度（ｍｇ
／ｄｉ　）を算出すれば、ビリルビンを定量することが
できる。

：検体血清の吸光度（検体盲検） ：検体血清の吸光度（酵素反応した もの） Ａｓｓ　：標準の吸光度（検体盲検） ＡＣ？　：標準の吸光度（酵素反応したもの） 式中、Ａ。

Ａｔ Ｘ　　：標準中のビリルビン濃度（ｍｇ／旧）〔実施例
〕 次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ ビリルビン溶液（メルク社製結晶ビリルビン１５　ｍｇ
／ｄｌ）　５０μｍに２．４−ジクロロフェノール５ｍ
Ｍを含有するＢｒ　１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂ　１ｎｓｏｎの
広域緩衝液（第１試薬：ｐＨ５，６，７，８，９，１０
または１１）２ｍｌを加え３分間予備加温後、これに３
　Ｕ／ｍｌのビリルビンオキシダーゼ水溶液（第２試薬
）０．５ｍｌを加え３７℃で波長４５０ｎｍにおける反
応曲線の測定を行った。また、この際２．４−ジクロロ
フエノールを含まないＢｒ１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏ
ｎの広域緩衝液を用いた場合についても同様に測定を行
い、反応時間を比較した。得られた反応曲線を第１図（
ａ）〜（ｇ）に示す。

２．４−ジクロロフェノールはｐ）１５〜１１において
反応促進効果を示し、特にｐＨ７〜１０において顕著で
あった。

実施例２ 検体血清５０μｍに３．５−ジメチルフェノール５ｍＭ
および０．５％コール酸ナトリウムを含有する０、２ｍ
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（第１試薬：ｐｔ１７．８、ま
たは９）２ｍｌを加え３分間予備加温後、これに３０／
ｍｌビリルビンオキシダーゼ水溶液（第２試薬）０．５
ｍｌを加え３７℃で波長４５０ｎｍにおける反応曲線の
測定を行った。また、この際３．５−ジメチルフエノー
ルを含まない緩衝液についても同様に測定を行い、反応
時間を比較した。得られた反応曲線を第２図（ａ）〜（
Ｃ）に示す。

実施例１と同様の効果が得られた。

実施例３ 検体血清５０μｍにＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン５
ｍＭおよび０．５％コール酸ナトリウムを含有する０、
　２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（第１試薬：ｐ１１７．８
、または９）２ｍｌを加え３分間予備加温後、これに３
０／ｍｌビリルビンオキシダーゼ水溶液（第２試薬）０
．５ｍｌを加えて３７℃で波長４５０ｎｍにおける反応
曲線の測定を行った。また、この際Ｎ−エチル−Ｎ−（
２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメ
チルアニリンを含まない緩衝液についても同様に測定を
行い、反応時間を比較した。得られた反応曲線を第３図
（ａ）〜（ｃ）に示す。実施例１と同様の効果が得られ
た。

実施例４ 下記の第１試薬、第２試薬を用い、標準液および高ビリ
ルビン血清を５段希釈した液を各々検体として測定し、
試薬の直線性を検討した。

（３式薬系且成） 第１試薬：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝剤（ｐｉ４８．５
）５ｍＭ３．５−ジメチルフェノール、 ０．５％コール酸ナトリウム含有。

第２試薬：３Ｕ／ｍｌビリルビンオキシダーゼ水溶液 （測定および結果） 検体１４μ工に第１試薬４００μ■を加え３７℃で５分
間反応させる。５分後に吸光度を測定する（Ａ、）。次
に、該当反応液に第２試薬１００μｌを加え、３７℃で
５分間反応させ、吸光度を測定する（Ａ：）。吸光度差
＝Ａ；　　Ａ；を求め、標準液（ビリルビン既知濃度）
との吸光度差と比較してビリルビン濃度を求めた。なお
、測定には日立７０５形自動分析装置（日立製作所）を
使用し、測定波長は主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎ
ｍの２波長で行った。

その結果第４図に示す如く、約３５ｍｇ／ｄｌまでの直
線性が明かであった。

実施例５ 本発明によるビリルビン定量値と従来法であるジアゾ法
による定量値を比較した。すなわち、検体（血清）１４
μｍに下記第１試薬４００μｍを加え３７℃で５分間反
応させる。５分後に吸光度を測定する（Ａ、）。次に該
当反応液に下記第２試薬１００μｍを加え、３７℃で５
分間反応させ、吸光度を測定する（Ａｌｌ）。吸光度差
＝ＡＢＡｓを求め、標準液（総ビリルビン既知濃度）と
の吸光度差と比較して総ビリルビン濃度を求めた。

なお、測定には日立７０５形自動分析装置（日立製作所
）を使用し、測定波長は主波長４５０ｎｍ、副波長６６
０ｎｍの２波長で行った。

試薬組成 第一試薬　０．１５Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，５） １０ｍＭ３．５−ジメチルフェノール ０．５％　コール酸ナトリウム 第二試薬　２０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，
０） ４　ＩＩ／ｍｌ　　ビリルビンオキシダーゼ結果は下記
及び第５図に示すように、相関係数ｒ　＝　０．９９７
９と極めて高い相関性が認められた。

データ数：Ｎ＝４０ 相関係数：　ｒ　＝　０．９９７９ 平均値；ｘ（酵素法）　＝　３．３７８ｍｇ／ｄｌＹ（
ジアゾ法）　＝　３．０１０ｍｇ／ｄ１回帰式；Ｙ＝Ω
、９６７Ｘ　−０，２５６Ｓ　ｙ　ｘ　＝　０．３７９
０ｔ（計算値）・０．２８３（有意差なし）［発明の効
果］ 以上説明したように、本発明によれば、特定のフェノー
ル類又はアニリン類を用いることによりビリルビンオキ
シダーゼによる酵素反応を促進することが可能となるた
め、肝機能障害の診断に利用できる総ビリルビン量を正
確に、かつ迅速に測定することができ、測定の自動化を
容易に図ることができる。又本発明の各試薬をキットと
することで取扱いが簡単になる等、本発明は実用上非常
に有用なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で行なった総ビリルビン測定結果を吸
光度の変化で示した図であり、（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）
、（ｄ）　　　（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）はそれぞれ緩衝
液のｐ）ｌが５．６．７．８．９．１０．１１のときの
図、第２図は実施例２で行なった総ビリルビン測定結果
を吸光度の変化で示した図であり、（ａ）、（ｂ）、（
Ｃ）はそれぞれ緩衝液のｐＨが７．８．９のときの図、
第３図は実施例３で行なった総ビリルビン測定結果を示
した図であり、（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ緩衝
液のｐＨが７．８．９のときの図、第４図は実施例４で
行なった検体を希釈した際の測定の直線性を示す図、第
５図は実施例５で行なった従来法（ジアゾ法）と本発明
による酵素法との相関を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビリルビン含有水性検体にビリルビンオキシダーゼ
   を作用させ、それにより生ずるビリルビンの変化を光学
   的に測定することにより該検体中の総ビリルビンを定量
   する方法において、ビリルビンオキシダーゼによる酵素
   反応を、一般式（ I ）で表わされるフェノール類およ
   び一般式（II）で表わされるアニリン類から成る群より
   選ばれる１種又は２種以上の化合物により促進させるこ
   とを特徴とする総ビリルビンの定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） （式中、Ｒ＾１〜Ｒ＾５はそれぞれ独立に、水素原子、
   ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜
   ４のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す
   。但し、Ｒ＾３がカルボキシル基および水酸基であるも
   のを除く。） ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（II） （式中、Ｒ＾６およびＲ＾７はそれぞれ独立に、水素原
   子、又は炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシアルキ
   ル基、スルホアルキル基、ヒドロキシスルホアルキル基
   若しくはスルホンアミドアルキル基を示す。Ｒ＾８およ
   びＲ＾９はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、
   炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキ
   シル基を示す。）２、ビリルビン含有水性検体に、前記
   フェノール類およびアニリン類から成る群より選ばれる
   １種又は２種以上の化合物を含有している緩衝液を加え
   、予備加温後、ビリルビンオキシダーゼを加える請求項
   １に記載の定量法。 ３、前記フェノール類がモノ又はジ置換体である請求項
   １に記載の定量方法。 ４、前記アニリン類がモノ又はジ置換体である請求項１
   に記載の定量法。 ５、下記で示されるフェノール類およびアニリン類から
   成る群より選ばれる１種又は２種以上の化合物とビリル
   ビンオキシダーゼとを少なくとも組み合せて成るビリル
   ビン含有水性検体中の総ビリルビン比色定量用試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１〜Ｒ＾５はそれぞれ独立に、水素原子、
   ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜
   ４のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す
   。但し、Ｒ＾３がカルボキシル基および水酸基であるも
   のを除く。） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾６およびＲ＾７はそれぞれ独立に、水素原
   子、又は炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシアルキ
   ル基、スルホアルキル基、ヒドロキシスルホアルキル基
   若しくはスルホンアミドアルキル基を示す。Ｒ＾８およ
   びＲ＾９はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、
   炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキ
   シル基を示す。）