JPS62296A - 過酸化水素の定量方法 - Google Patents

過酸化水素の定量方法

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JPS62296A JP60139350A JP13935085A JPS62296A JP S62296 A JPS62296 A JP S62296A JP 60139350 A JP60139350 A JP 60139350A JP 13935085 A JP13935085 A JP 13935085A JP S62296 A JPS62296 A JP S62296A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は過酸化水素の定量方法及び定量用組成物に関す
る。
従来の技術 従来、過酸化水素を定量する為に使用されている４−ア
ミノアンチピリンとフェノール誘導体またはアニリン誘
導体もしくはその誘導体、あるいはトルイジン誘導体等
を縮合させる発色系は微量成分の定量に際しては特にフ
ェノール誘導体は感度が低く、また後三者はｐＨが７．
０を越えるアルカリ側の条件下では呈色安定性が悪く、
共存物質の影響を受けやすい。
発明が解決しようとする問題点 酵素反応を利用する診断の目的のための生体成分の分析
は、用いる酵素の至適ｐＨがアルカリ側にあるものが多
い。また近年極めて微量な生体成分の分析の重要性は増
加してきているが過酸化水素をアルカリ側で感度良く測
定できる発色系が開発されていない。
問題点を解決するための手段 後述の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩（以
下化合物（１）という）をペルオキシダーゼの存在下に
過酸化水素と反応させて呈色した反応液の可視部におけ
る吸収を測定することによって過酸化水素を極めて感度
良く定量できる。
一般式（Ｉ） 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、Ｒ１は下記
一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基を示す。
（ｎ）　　　　　　　　　　　　　（Ｉ［Ｉ）Ｐ、Ｑ、
Ｚはヒドロキシル、アルキル、スルホ、カルボキシルを
示す。ｎはＯ，ｌ、２又は３を示し、ＰＩｌにおける各
Ｐ、Ｑｈにおける各ＱＳＺｌ。
における各Ｚは同一もしくは異なっていてもよい。
Ｒ２、Ｒ３はヒドロキシル、アミノ又は置換アミノであ
り、同一もしくは異なってもよい。
Ｒ２およびＲ５における置換アミノの置換基としてはア
ルキル、スルホアルキル等が例示される。
上記各定義におけるアルキルとは炭素数１〜５の基を包
含し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等
が例示される。
本発明によれば試料中の過酸化水素と化合物（１）とを
反応させ、生成した色素による反応液の吸収を色素の極
大吸収波長（Ｒ１゜８）で測定することによって過酸化
水素を定量することができる。
本発明方法の原理は試料中の過酸化水素と色原体との反
応はペルオキシダーゼの存在下に化学量論的に進行して
色素を生成し、この色素の生成量は、生成した過酸化水
素の含有量に比例していることに基づいている。
本発明を実施するに際しては一般にｐＨ２〜１１の緩衝
剤例えばリン酸、トリス−Ｈ（Ｊ！　、コハク酸塩、シ
ュウ酸塩、酢酸塩、Ｇｏｏｄ等の０．００５〜２ｍ０１
／１液中に０．１〜１０００１Ｕ／ｍｌのペルオキシダ
ーゼ及び色原体を試料中の過酸化水素等モル以上、通常
１０〜１０００倍モル含有させて試薬液とし、これを過
酸化水素を含有する試料に加えて５〜５０℃、好ましく
は２５〜４０℃で反応させる。反応後の反応液による吸
収を生成色素の極大吸収波長で試薬ブランクを対照とし
て測定し、予め既知量についての試験から求めた検量線
を利用して試料中の過酸化水素を定量する。
反応液中の過酸化水素は０．００１〜１＋ｎｇ／ｍｌと
なるように試薬液又は蒸留水で調整される。
反応系には必要に応じてトリトンＸ　１００等の界面活
性剤が用いられる。
本発明方法は後述の如く過酸化水素を生成する反応系に
関与する反応物質あるいは酵素活性の定量に好適に適用
できる。特に過酸化水素生成系が酵素反応である場合過
酸化水素生成反応と色素生成反応が同一系内で行われる
ことができるので短時間に定量できる。
測定すべき対象が基質である場合にはこれを分解して過
酸化水素を生成するのに必要な酵素を、対象が酵素活性
である場合にはその酵素の基質を色原体と共に試薬液に
加え、この試薬液を試料に加えて反応させ、着色した反
応液の吸収を測定することによって基質又は酵素活性を
測定することができる。
本発明で用いられる代表的色原体が第１表に例示される
。表中の○内の数字は置換基の位置を示す。
Ｍ　　：　　ＣＨ３ Ｅ　　：　　Ｃ２Ｈ。
Ｄ　　：　　ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２５ｏ、Ｈこれらの色原
体を用いた場合の極大吸収波長（λ１．８）及び感度、
試薬ブランクの着色の度合が第２表に示される。
測定は以下の方法で行われた。
１０　Ｕ　／Ｑのペルオキシダーゼ、ｌｆｆ１ｇ／＋ｍ
ｌのトリトンＸ−１００，０，２ｍｇ／ｍｌの化合物（
１）を含有するＧｏｏｃｌの緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）を
調整し、この３ｍｌを２ＯＡＩ２の１０．３３ｍｇ／　
ａ　Ｎ２Ｏ２溶液に加えて反応させ反応液のλ、□にお
けるＯＤを測定する。
色原体として４−アミ／アンチピリンとＮ−エチル−Ｎ
−（３メチルフエニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジア
ミノ（４ＡＡ−ＥＭＡＥ）を用いた場合のＯＤを１００
として相対値を第２表に示す。
試薬ブランクの着色の度合はロイコビンドシェドラーズ
グリーン（ＬＢＧ）を色原体として用いた場合の試薬液
の経時的着色の度合いを対照として示されている。ＡＡ
はＬＢＧを用いたときより着色の度合いが著しく低いも
の。Ａは着色の場合がＬＢＧを用いたときより低いもの
。ＢはＬＢＧを用いたときと着色の度合いが同程度であ
ることを意味する。
感度が高く、試薬ブランクの着色の度合いが低いものほ
ど水素供与体として優れ、微量成分の定量に適している
。
第　　　２　　　表 本発明で用いられる化合物（Ｉ）は染料合成の中間体と
して公知の化合物であり、そのほとんどがミヒラーヒト
ロールとナフタレン誘導体との縮合反応によって合成す
るか、あるいは市販色素を還元することにより得ること
ができる。
本発明方法は反応によってＨ２０□を化学量論的に生成
する反応系における反応物質あるいは酵素活性の測定に
応用できる。
かかる反応系として種々のオキシダーゼを用いる酵素反
応が知られており、本発明方法はオキシダーゼの基質の
定量に好適である。特に至適ｐＨがアルカリ側にある酵
素系には最適である。
かかる基質として尿酸、コレステロール、中性脂肪酸、
遊離脂肪酸、グリセロール、シアル酸。
ピルビン酸、グルコース、無機リン酸、リン脂質。
クレアチン、ポリアミン　等があげられ、酵素活性を測
定する対象の酵素としてモノアミンオキシダーゼ、コリ
ンエステラーゼ等があげられる。
以下にこれらの反応系が図式的に示される。
エノイルＣｏＡ　　＋８２０゜ ＋ＣＯ□ ＋ＣＯ□ ＮＨ３＋ＬＯｚ 十Ｎ１（３＋　８２０２ 本発明で用いられるＨ２Ｄ２定量用組成物はペルオキシ
ダーゼ及び化合物（１）からなる。必要に応じて界面活
性剤、緩衝液を加えあるいは組合せた組成物あるいはキ
ットはＨ２Ｏ２の定量に便利である。
以下に本発明の態様を示す実施例を示す。
実施例１．（尿酸の測定） ５０ｍＭ　Ｇｏｏｄの緩衝液（ｐＨ８，０）　１００ｍ
ｌにウリカーゼ１０単位、ペルオキシダーゼ１０００単
位、トリトンＸ−１００を１００ｍｇ、および色原体と
して■化合物Ｎα１、■化合物Ｎα３、■化合物Ｎｏ、
　１３、■化合物Ｎα１５、■化合物Ｎα２５、■化合
物Ｎα２７、■化合物Ｎα２９、■化合物Ｎα３１、■
化合物Ｎｏ、３７、■化合物Ｎα３９をそれぞれ各１０
ｍｇずつ溶解し、試薬液とする。
試験管に血清ＩＱｍｌと上記試薬液３ｍｌをとり、３７
℃に１０分間放置した後、λ□、における反応液の吸光
度を試薬盲検を対照として測定し、予め作成した検量線
より血清中の尿素濃度を算出する。
比較対照のためにウリカーゼ紫外分光光度法で測定した
値を併せ第３表に示す。
第　　　３　　　表 実施例２．（クレアチンの測定） ０゜ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ’緩衝液（ｐＨ７，５）　
１００ｍｌにペルオキシダーゼ５ｏＯ単位、サルコシン
オーｔ−シダーゼ１０００単位、クレアチナーゼ４５０
０単位、トリトンＸ−１００を２００ｍｇおよび色原体
として■化合物Ｎα１、■化合物Ｎα３、■化合物Ｎα
１３、■化合物Ｎα１５、■化合物Ｎα２５、■化合物
に２１、■化合物Ｎ（１２９、■化合物Ｎｏ、　３１　
、■化合物Ｎα３７、■化合物Ｎα３９をそれぞれ各１
０ｍｇずつを試薬液とする。
試験管に血清５０〃と上記試薬液の３ｍｌをとり、３７
℃に１０分間放置した後、λ、。における反応液の吸光
度を試薬盲検を対照として測定し、予め作成した検量線
より、血清中のクレアチン濃度を算出する。
比較対照のために、予め血清中のクレアチニンとアンモ
ニアを消去した後、クレアチンをクレアチニンに変え、
クレアチニンディミナーゼと、グルタミン酸脱水素酵素
を作用させＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度変化
から測定した結果を併せ、第４表に示す。
第　　　４　　　表 実施例１，２より、検体量が微量であっても、アルカリ
性の条件下で、血中の微量成分を正確に精度よく測定可
能であることがわかる。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素と下記一
    般式（ I ）で表される色原体またはその塩とを反応さ
    せて呈色した反応液の可視部における吸収を測定するこ
    とを特徴とする過酸化水素の定量方法。 一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、Ｒ＿１は下
    記一般式（II）又は（III）で表される基を示す。 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） Ｐ、Ｑ、Ｚはヒドロキシル、アルキル、スルホ、カルボ
    キシルを示す。ｎは０、１、２又は３を示し、Ｐ＿ｎに
    おける各Ｐ、Ｑ＿ｎにおける各Ｑ、Ｚ＿ｎにおける各Ｚ
    は同一もしくは異なっていてもよい。Ｒ＿２、Ｒ＿３は
    ヒドロキシル、アミノ又は置換アミノであり、同一もし
    くは異なってもよい。
  2. （２）（イ）ペルオキシダーゼ （ロ）一般式（ I ）で表される化合物またはその塩 からなる過酸化水素定量用組成物。
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