JPH03180183A - 試験管内遺伝子合成 - Google Patents
試験管内遺伝子合成Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、遺伝子のような二本鎖Ｄ Ｎ Ａ配列の調
製方法に関する。
製方法に関する。
最近のＤＮＡ化学、機器および酵素学上の進歩は、特異
的なりＮＡオリゴヌクレオチド類からの試験管内遺伝子
合成を可能ならしめた。試験管内で台底された遺伝子（
合成遺伝子類〉は、それらのクローン化された天然の相
対物を陵゛駕する数々の利点を有する。それらは、一般
に、イントロン領域を含まないので真核遺伝子より遥か
に簡潔である。また、それらは天然の遺伝子が細胞から
単離されるとき通常存在する大きなりＮＡの非翻訳配列
を含まない。その上、遺伝暗号の縮重に帰因し、アミノ
酸コドンは選ばれたクローニング宿主によって利用され
る最適コドンにマツチするように選択することができ、
より高いレベルの遺伝子および／またはタンパク質の発
現をもたらす。特有のＤＮＡ制限酵素部位を遺伝子中に
設計することができるか、あるいは遺伝子の末端に付加
することができる。後者は、発現ベクターへのその遺伝
子のクローニングを可能にする。前者は、クローニング
後にその遺伝子のスクリーニングを可能にする。試験管
内で台底された遺伝子は、重要な商業上および製薬上の
タンパク質の生産に使用されている。
的なりＮＡオリゴヌクレオチド類からの試験管内遺伝子
合成を可能ならしめた。試験管内で台底された遺伝子（
合成遺伝子類〉は、それらのクローン化された天然の相
対物を陵゛駕する数々の利点を有する。それらは、一般
に、イントロン領域を含まないので真核遺伝子より遥か
に簡潔である。また、それらは天然の遺伝子が細胞から
単離されるとき通常存在する大きなりＮＡの非翻訳配列
を含まない。その上、遺伝暗号の縮重に帰因し、アミノ
酸コドンは選ばれたクローニング宿主によって利用され
る最適コドンにマツチするように選択することができ、
より高いレベルの遺伝子および／またはタンパク質の発
現をもたらす。特有のＤＮＡ制限酵素部位を遺伝子中に
設計することができるか、あるいは遺伝子の末端に付加
することができる。後者は、発現ベクターへのその遺伝
子のクローニングを可能にする。前者は、クローニング
後にその遺伝子のスクリーニングを可能にする。試験管
内で台底された遺伝子は、重要な商業上および製薬上の
タンパク質の生産に使用されている。
合成遺伝子は、「天然の」遺伝子によってコードされた
タンパク質配列と正確にマツチするタンパク質配列をコ
ードするように設計することができ、あるいはその合成
遺伝子は安定性が増強されるような天然のタンパク質を
陵駕する利点を持つ可能性のある変異（変性）タンパク
質をコードすることができる。さらに、合成遺伝子は全
く新規なタンパク質または新規な組み合わせもしくはタ
ンパク質部（領域）をコードするように設計することが
できる。
タンパク質配列と正確にマツチするタンパク質配列をコ
ードするように設計することができ、あるいはその合成
遺伝子は安定性が増強されるような天然のタンパク質を
陵駕する利点を持つ可能性のある変異（変性）タンパク
質をコードすることができる。さらに、合成遺伝子は全
く新規なタンパク質または新規な組み合わせもしくはタ
ンパク質部（領域）をコードするように設計することが
できる。
試験管内化学合成遺伝子に対するいろいろな手段が多種
多様な遺伝子を構築するのに使用されてきた。化学合成
手段の殆どは、遺伝子の両ＤＮＡ鎮を含むオリゴヌクレ
オチド類の調製工程と完全な二本鎖遺伝子を与えるため
最終的にそれらを−緒に結合する工程を伴う。
多様な遺伝子を構築するのに使用されてきた。化学合成
手段の殆どは、遺伝子の両ＤＮＡ鎮を含むオリゴヌクレ
オチド類の調製工程と完全な二本鎖遺伝子を与えるため
最終的にそれらを−緒に結合する工程を伴う。
最も広範に使用されてきた手段は、一連の短い両方の鎖
の化学合成、アニール化し次いで共に結合（連結）した
とき完全な遺伝子を含むようにオリゴヌクレオチド類を
重複代れぞれほぼ４０ヌクレオチドの鎖長で）させるこ
とを含む。課題は、比較的小さな４００塩基対（ｂｐ）
の遺伝子を化学合成するにしても、この手段は、（ａ）
合計８００塩基（４００Ｘ２本鎮〉を合成することが必
要であり、そして（ｂ）それぞれ４０塩基未満の２０種
のオリゴヌクレオチド類を別々に合成し、次いでゲル電
気泳動および／または高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）によって別々に精製する必要があることである
。
の化学合成、アニール化し次いで共に結合（連結）した
とき完全な遺伝子を含むようにオリゴヌクレオチド類を
重複代れぞれほぼ４０ヌクレオチドの鎖長で）させるこ
とを含む。課題は、比較的小さな４００塩基対（ｂｐ）
の遺伝子を化学合成するにしても、この手段は、（ａ）
合計８００塩基（４００Ｘ２本鎮〉を合成することが必
要であり、そして（ｂ）それぞれ４０塩基未満の２０種
のオリゴヌクレオチド類を別々に合成し、次いでゲル電
気泳動および／または高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）によって別々に精製する必要があることである
。
精製後、これらのオリゴヌクレオチド類はリン酸化、混
合、加熱そしてそれらの類縁の相対物とアニール化され
る。この混合物にＤＮＡＩＪガーゼが加えられ、二本鎖
Ｄ Ｎ Ａセグメントに連結されて完全な遺伝子が形成
される。この連結反応は、予期した寸法（すなわち、４
００ｂｐ）の断片が得られたことを確認するためゲル電
気泳動によって特性決定しなければならない。
合、加熱そしてそれらの類縁の相対物とアニール化され
る。この混合物にＤＮＡＩＪガーゼが加えられ、二本鎖
Ｄ Ｎ Ａセグメントに連結されて完全な遺伝子が形成
される。この連結反応は、予期した寸法（すなわち、４
００ｂｐ）の断片が得られたことを確認するためゲル電
気泳動によって特性決定しなければならない。
アニーリング工程および連結工程におけるオリゴヌクレ
オチド混合物の複雑さのため、正確な寸法の一片が得ら
れても新な遺伝子が正しい配列を有することを保証する
ものでない。従って、合成遺伝子はＤＮＡの塩基配列を
決定することによる特性決定のためのプラスミドにクロ
ーニングされる。別の課題は、その配列が正しくない場
合には遺伝子を修復しなければならないか、または面倒
な全処理を再度実施しなければならないことにある。
オチド混合物の複雑さのため、正確な寸法の一片が得ら
れても新な遺伝子が正しい配列を有することを保証する
ものでない。従って、合成遺伝子はＤＮＡの塩基配列を
決定することによる特性決定のためのプラスミドにクロ
ーニングされる。別の課題は、その配列が正しくない場
合には遺伝子を修復しなければならないか、または面倒
な全処理を再度実施しなければならないことにある。
この発明は遺伝子のような二本鎖ＤＮＡ配列を調製する
方法を提供する。この方法は、Ａ）ｉ）限定されたオリ
ゴヌクレオチド鎖長を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド
類とそれらの不完全な配列、または ｉｉ）前記不完全な配列のみ、をそれぞれ含んでなる第
一合成ブロスおよび第二合成ブロスを調製する工程であ
って、かつその第一合成ブロスが標的二本ｍ、１１ Ｄ
Ｎ Ａ配列の上部（ｔｏｐ）鎖を含むＤＮＡオリゴヌ
クレオチド類を含んでおり、そしてその第二合成ブロス
が前記標的ＤＮＡ配列の下部（ｂｏｔｔｏｍ）鎖を含む
ＤＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでいるような前記工
程、 Ｂ〉前記第一合成ブロスと第二合成ブロスを共に混合す
る工程、 Ｃ）Ａ）のＤＮＡオリゴヌクレオチド類の３′末端に相
補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー類を加
える工程、 Ｄ）Ｃ）の混合物にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）処
理を施すことにより、標的二本鎖Ｄ Ｎ Ａ配列の濃度
を指数的に増幅する工程、 Ｅ〉前記標的二本鎖ＤＮＡ配列を単離する工程、Ｆ）フ
ァージの複製開始点を有するクローニングベクターに前
記標的二本鎖ＤＮＡ配列を挿入する工程、 Ｇ）突然変異を確認するために前記標的二本鎖ＤＮＡ配
列の塩基配列を決定する工程、ならびにＨ〉特定部位の
突然変異誘発によってそれぞれの突然変異体を修復する
工程を含んでなる。
方法を提供する。この方法は、Ａ）ｉ）限定されたオリ
ゴヌクレオチド鎖長を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド
類とそれらの不完全な配列、または ｉｉ）前記不完全な配列のみ、をそれぞれ含んでなる第
一合成ブロスおよび第二合成ブロスを調製する工程であ
って、かつその第一合成ブロスが標的二本ｍ、１１ Ｄ
Ｎ Ａ配列の上部（ｔｏｐ）鎖を含むＤＮＡオリゴヌ
クレオチド類を含んでおり、そしてその第二合成ブロス
が前記標的ＤＮＡ配列の下部（ｂｏｔｔｏｍ）鎖を含む
ＤＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでいるような前記工
程、 Ｂ〉前記第一合成ブロスと第二合成ブロスを共に混合す
る工程、 Ｃ）Ａ）のＤＮＡオリゴヌクレオチド類の３′末端に相
補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー類を加
える工程、 Ｄ）Ｃ）の混合物にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）処
理を施すことにより、標的二本鎖Ｄ Ｎ Ａ配列の濃度
を指数的に増幅する工程、 Ｅ〉前記標的二本鎖ＤＮＡ配列を単離する工程、Ｆ）フ
ァージの複製開始点を有するクローニングベクターに前
記標的二本鎖ＤＮＡ配列を挿入する工程、 Ｇ）突然変異を確認するために前記標的二本鎖ＤＮＡ配
列の塩基配列を決定する工程、ならびにＨ〉特定部位の
突然変異誘発によってそれぞれの突然変異体を修復する
工程を含んでなる。
限定された鎖長のオリゴヌクレオチド類の合成中に、そ
の限定された鎖長より短い鎖長を有する数多くのオリゴ
ヌクレオチド類もまた合成される。
の限定された鎖長より短い鎖長を有する数多くのオリゴ
ヌクレオチド類もまた合成される。
この合成が標的二本ｆｌＪ４ （ｄ ｓ） ＤＮＡ配列
の上部線と下部網について実施される場合、ａ）オーバ
ーラツプ（重複）し、ｂ）上部線と下部網の末端ＤＮＡ
配列を有し、かつＣ）目的の鎖長より短い鎖長を有する
ような上部線と下部網を含むこれらのオリゴヌクレオチ
ド類を、本明細書では不完全な配列と定義する。
の上部線と下部網について実施される場合、ａ）オーバ
ーラツプ（重複）し、ｂ）上部線と下部網の末端ＤＮＡ
配列を有し、かつＣ）目的の鎖長より短い鎖長を有する
ような上部線と下部網を含むこれらのオリゴヌクレオチ
ド類を、本明細書では不完全な配列と定義する。
以下、この発明をより具体的に説明する。
本質的にこの発明の方法は、合成遺伝子のような標的二
本！１ Ｄ Ｎ Ａ配列を、合成オリゴヌクレオチド類
ならびにその遺伝子の上部線（５′→３′）および下部
網（３′→５′）に対応するオリゴヌクレオチドの不完
全な配列類のＰＣＲ増幅、次いで適正な突然変異体へ特
定部位の突然変異誘発によって調製することを含んでな
る。この方法は、増幅前に標的ＤＮＡ配列の各末端に隣
接した台底ＤＮＡ配列を包含させることによって単純化
される。このことが特定部位の突然変異誘発およびＤＮ
Ａ配列の分析を実施する目的でファージの複製開始点を
含、むプラスミド〔例えば、Ｆ １ （ＩＧ） ］への
最終的な二本鎖配列（例えば、遺伝子）のクローニング
（挿入）を可能にする。
本！１ Ｄ Ｎ Ａ配列を、合成オリゴヌクレオチド類
ならびにその遺伝子の上部線（５′→３′）および下部
網（３′→５′）に対応するオリゴヌクレオチドの不完
全な配列類のＰＣＲ増幅、次いで適正な突然変異体へ特
定部位の突然変異誘発によって調製することを含んでな
る。この方法は、増幅前に標的ＤＮＡ配列の各末端に隣
接した台底ＤＮＡ配列を包含させることによって単純化
される。このことが特定部位の突然変異誘発およびＤＮ
Ａ配列の分析を実施する目的でファージの複製開始点を
含、むプラスミド〔例えば、Ｆ １ （ＩＧ） ］への
最終的な二本鎖配列（例えば、遺伝子）のクローニング
（挿入）を可能にする。
ＰＣＲ増幅は、前記オリゴヌクレオチド類ならびに相互
に（塩基対）が部分的に重複する上部鎖（５′→３′）
および下部鎖（３′→５′）に対応するオリゴヌクレオ
チドの不完全な配列を含有する粗合成ブロスについて実
施される。このような部分的に重複するＤＮＡ配列は自
動ＤＮＡシンセサイザーから生ずる粗合成ブロス中に副
生酸物として多量存在する。これらの部分的に重複する
ＤＮＡ配列は、本明細書において不完全な配列として定
義されている。例えば（第１図、参照のこと）自動ＤＮ
Ａシンセサイザーによる４００個の塩基遺伝子（ｎ＝４
００）の上部鎮（５′→３′〉の台底は、ｎ個の塩基の
完全なオリゴヌクレオチドならびにｎ−１、ｎ−２、ｎ
−３・・・等の不完全な配列を含む可能性のある粗合成
ブロスをもたらす。
に（塩基対）が部分的に重複する上部鎖（５′→３′）
および下部鎖（３′→５′）に対応するオリゴヌクレオ
チドの不完全な配列を含有する粗合成ブロスについて実
施される。このような部分的に重複するＤＮＡ配列は自
動ＤＮＡシンセサイザーから生ずる粗合成ブロス中に副
生酸物として多量存在する。これらの部分的に重複する
ＤＮＡ配列は、本明細書において不完全な配列として定
義されている。例えば（第１図、参照のこと）自動ＤＮ
Ａシンセサイザーによる４００個の塩基遺伝子（ｎ＝４
００）の上部鎮（５′→３′〉の台底は、ｎ個の塩基の
完全なオリゴヌクレオチドならびにｎ−１、ｎ−２、ｎ
−３・・・等の不完全な配列を含む可能性のある粗合成
ブロスをもたらす。
各塩基の付加反応は、はぼ９８％の収率（カプリング効
率としても知られている〉を有する。各段階におけるカ
プリング効率は１００％未満であるため、ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの完全な鎖長の生成物の最終収率は、合成
ブロス中の総ＤＮＡの１００％未満となるであろう。従
って、合成ブロス中の残余のＤＮＡは不完全な配列が占
める。
率としても知られている〉を有する。各段階におけるカ
プリング効率は１００％未満であるため、ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの完全な鎖長の生成物の最終収率は、合成
ブロス中の総ＤＮＡの１００％未満となるであろう。従
って、合成ブロス中の残余のＤＮＡは不完全な配列が占
める。
実際的には、このような不完全な配列が粗合成ブロスに
おけるＤＮＡ生底物の過半数（モル濃度基準で）を占め
る。さらに、完全な鎖長のＤＮＡ（ｎ）も不完全な配列
（ｎ−１・ｎ−２・ｎ−３など）もすべて共通の３′末
端を有する。これは、自動ＤＮＡシンセサイザーによっ
て開始されるＤＮＡ合或台底初に付加される塩基が所期
の配列の３′末端に存在するからである。以降の塩基付
加は３′→５′方向へ連続的に起こる。連鎖の成長はオ
リゴヌクレオチドの３′末端から連続的に起こる。
おけるＤＮＡ生底物の過半数（モル濃度基準で）を占め
る。さらに、完全な鎖長のＤＮＡ（ｎ）も不完全な配列
（ｎ−１・ｎ−２・ｎ−３など）もすべて共通の３′末
端を有する。これは、自動ＤＮＡシンセサイザーによっ
て開始されるＤＮＡ合或台底初に付加される塩基が所期
の配列の３′末端に存在するからである。以降の塩基付
加は３′→５′方向へ連続的に起こる。連鎖の成長はオ
リゴヌクレオチドの３′末端から連続的に起こる。
従って、最終的な粗合成ブロスは、完全な鎖長のオリゴ
ヌクレオチド（ｎ）は全く含まないかもしくはほんの少
量を含むにすぎない場合があるが、すべて共通する３′
末端を有する不完全な配列（完全な鎖長未満の重複オリ
ゴヌクレオチド類）は含む。これはまた、遺伝子の下部
１ （３’→５′）に対応する完全な鎖長のオリゴヌク
レオチド（ｎ′）の合皮に関する状態でもある。この粗
合成ブロスは複数の３′末端を含んでなる。
ヌクレオチド（ｎ）は全く含まないかもしくはほんの少
量を含むにすぎない場合があるが、すべて共通する３′
末端を有する不完全な配列（完全な鎖長未満の重複オリ
ゴヌクレオチド類）は含む。これはまた、遺伝子の下部
１ （３’→５′）に対応する完全な鎖長のオリゴヌク
レオチド（ｎ′）の合皮に関する状態でもある。この粗
合成ブロスは複数の３′末端を含んでなる。
次に、この発明の方法は前記２種の粗合成ブロスを共に
混合することを必要とする。さらに、上部鎮（ｎ）と不
完全な配列（ｎ−１，ｎ−２・・・）ならびに下部鎮（
ｎ′）と不完全な配列（ｎ′ｌ・ｎ′−２・ｎ′−３・
・・）の共通する３′末端とマツチする２種の短いＤＮ
Ａ配列（プライマー類〉が加えられる（第１図のＰを参
照のこと）。
混合することを必要とする。さらに、上部鎮（ｎ）と不
完全な配列（ｎ−１，ｎ−２・・・）ならびに下部鎮（
ｎ′）と不完全な配列（ｎ′ｌ・ｎ′−２・ｎ′−３・
・・）の共通する３′末端とマツチする２種の短いＤＮ
Ａ配列（プライマー類〉が加えられる（第１図のＰを参
照のこと）。
次に、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する。この発明の方
法は、上部鎮の不完全な配列のＰＣＲ生底物が下部鎮の
不完全な配列のＰＣＲ生成物と重複するという実際的な
利点をもたらす。このような状況が生じる場合には、た
とえ完全な鎖長のオリゴヌクレオチド類がブロス中に全
く存在しなくても完全な標的ＤＮＡ配列の増幅に必要な
情報（塩基配列）のすべてが存在する。ＰＣＨの連続的
な周期が究極的に完全な遺伝子配列を増幅する。
法は、上部鎮の不完全な配列のＰＣＲ生底物が下部鎮の
不完全な配列のＰＣＲ生成物と重複するという実際的な
利点をもたらす。このような状況が生じる場合には、た
とえ完全な鎖長のオリゴヌクレオチド類がブロス中に全
く存在しなくても完全な標的ＤＮＡ配列の増幅に必要な
情報（塩基配列）のすべてが存在する。ＰＣＨの連続的
な周期が究極的に完全な遺伝子配列を増幅する。
実際問題として、ＰＣＲ増幅の最初の３回の周期は、Ｐ
ＣＲ連鎮反応を開始するために非常に長い時間（通常１
分に代え３０分未満〉実施されるのが事実である。
ＣＲ連鎮反応を開始するために非常に長い時間（通常１
分に代え３０分未満〉実施されるのが事実である。
例えば、４００塩基対の二本鎖配列の台底は以下のよう
に実施される。
に実施される。
上部１（ｎ＝４００）ならびに上部鎖の不完全な配列３
９９（ｎ −１） 、 ３９８（ｎ −２）および３９
７（ｎ −３）を含んでなる粗ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド合成ブロスと、下部鎮（ｎ’ ＝４００）ならびに下
部鎮の不完全な配列３９９（ｎ’ −１） 、 ３９８
（ｎ’ −２）および３９７（ｎ’−３）を含んでなる
粗ＤＮＡオリゴヌクレオチド台底ブロスを用意する。こ
れらの２種の台底ブロスを一緒に混合して部分的に重複
している配列をもたらす。例えば、ｎ／２より大−きい
鎖長を有する上部鎮配列は、ＰＣＲ伸長反応を可能にす
る重複に際して十分な相補性を有するような鎖長（Ｌ′
）のｎ’ −Ｌ塩基よりも大きな配列を有する下部鎮と
重複するであろう。今や、ポリメラーゼ連鎖反応を開始
するために上部鎖配列とまた下部鎮配列の３′末端に対
する塩基対である２種のＤＮＡプライマー配列（１５〜
２０塩基配列）を添加してもよい。
９９（ｎ −１） 、 ３９８（ｎ −２）および３９
７（ｎ −３）を含んでなる粗ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド合成ブロスと、下部鎮（ｎ’ ＝４００）ならびに下
部鎮の不完全な配列３９９（ｎ’ −１） 、 ３９８
（ｎ’ −２）および３９７（ｎ’−３）を含んでなる
粗ＤＮＡオリゴヌクレオチド台底ブロスを用意する。こ
れらの２種の台底ブロスを一緒に混合して部分的に重複
している配列をもたらす。例えば、ｎ／２より大−きい
鎖長を有する上部鎮配列は、ＰＣＲ伸長反応を可能にす
る重複に際して十分な相補性を有するような鎖長（Ｌ′
）のｎ’ −Ｌ塩基よりも大きな配列を有する下部鎮と
重複するであろう。今や、ポリメラーゼ連鎖反応を開始
するために上部鎖配列とまた下部鎮配列の３′末端に対
する塩基対である２種のＤＮＡプライマー配列（１５〜
２０塩基配列）を添加してもよい。
実際問題として、ＰＣＲは単一分子の二本鎖ＤＮＡを増
幅しろるので現実に重複するＤＮＡオリゴヌクレオチド
類、（ｎ・・・ｎ−１９９）および（ｎ′・・・ｎ’
−１９９）の量は極端に限定することができる。また、
この発明の方法を実施するのにブロス類は完全な鎖長の
オリゴヌクレオチド類を全く含む必要がない。次に、第
一周期のＰＣＲは次の周期のＰＣＲで使用されうる、上
部鎮と下部鎖に由来するＤＮＡ生底物を提供して完全な
４００ｂｐ遺伝子配列を与えるであろう。
幅しろるので現実に重複するＤＮＡオリゴヌクレオチド
類、（ｎ・・・ｎ−１９９）および（ｎ′・・・ｎ’
−１９９）の量は極端に限定することができる。また、
この発明の方法を実施するのにブロス類は完全な鎖長の
オリゴヌクレオチド類を全く含む必要がない。次に、第
一周期のＰＣＲは次の周期のＰＣＲで使用されうる、上
部鎮と下部鎖に由来するＤＮＡ生底物を提供して完全な
４００ｂｐ遺伝子配列を与えるであろう。
制限酵素開裂部位に対応する都合のよいＤＮＡ配列が前
記遺伝子配列中に構築され、そしてまたＰＣＨによって
その遺伝子と共に増幅される。このような部位は増幅さ
れた遺伝子をプラスミドに直接挿入することも考慮に入
れられている。このプラスミドはファージの復製開始点
を含む。これはＰＣＲ生戒生成都合のよいＤＮＡ配列分
析を可能にする。このことはまた、オリゴヌクレオチド
合成中またはＰＣＲ増幅増幅段心中ずるいずれかの突然
変異を修復するために都合のよい特定部位の突然変異誘
発をも考慮に入れている。
記遺伝子配列中に構築され、そしてまたＰＣＨによって
その遺伝子と共に増幅される。このような部位は増幅さ
れた遺伝子をプラスミドに直接挿入することも考慮に入
れられている。このプラスミドはファージの復製開始点
を含む。これはＰＣＲ生戒生成都合のよいＤＮＡ配列分
析を可能にする。このことはまた、オリゴヌクレオチド
合成中またはＰＣＲ増幅増幅段心中ずるいずれかの突然
変異を修復するために都合のよい特定部位の突然変異誘
発をも考慮に入れている。
４００塩基対より大きな二本鎖ＤＮＡ配列（例えば、遺
伝子〉もまた、この方法によって直接、あるいは逐次的
にこの方法を実施することによって間接的に都合よく合
成される。例えば、非常に大きなりＮＡ配列の合成は、
工程Ａ−Ｈに従って一系列（−組〉の大きな配列部分を
最初に作製することによって実施されるであろう。次に
、これらの部分を酵素ＤＮＡ！Ｊガーゼによって連結（
結合〉して完全な鎖長の配列を与えることができる。ま
た、これらの部分を配列中で相互に重複するように設計
することもできる。次に、完全な大きさの配列をＰＣＨ
によって増幅してもよい。
伝子〉もまた、この方法によって直接、あるいは逐次的
にこの方法を実施することによって間接的に都合よく合
成される。例えば、非常に大きなりＮＡ配列の合成は、
工程Ａ−Ｈに従って一系列（−組〉の大きな配列部分を
最初に作製することによって実施されるであろう。次に
、これらの部分を酵素ＤＮＡ！Ｊガーゼによって連結（
結合〉して完全な鎖長の配列を与えることができる。ま
た、これらの部分を配列中で相互に重複するように設計
することもできる。次に、完全な大きさの配列をＰＣＨ
によって増幅してもよい。
従って、４００ｂｐより大きな標的二本！ＪＩ Ｄ Ｎ
Ａ配列は次のように調製される： Ａ）ｉ）限定されたオリゴヌクレオチド鎖長を有するＤ
ＮＡオリゴヌクレオチド類とそれらの不完全な配列、ま
たは ｉｉ）前記不完全な配列のみ、をそれぞれ含んでなる第
一台底ブロスおよび第二合成ブロスを調製する工程であ
って、かつ ａ）それぞれ通し番号が付いた系列の前記第一ブロスが
前記標的二本鎖Ｄ Ｎ Ａ配列の上部鎮の限定された部
位に等価なりＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでおり、 ｂ）それぞれ通し番号が付いた系列の前記第二ブロスが
前記標的二本鎖ＤＮＡ配列の限定された部位に等価なり
ＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでおり、そして ｃ）全系列が一緒になって完全な標的二本鎖ＤＮＡ配列
に等価となるような前記工程、Ｂ）それらの系列の各番
号が付いた第一台底ブロスと第二合成ブロスを一緒にし
て個々に混合する工程、 Ｃ）各混合物における前記ＤＮＡオリゴヌクレオチド類
の３′末端に対して相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオ
チドプライマー類を前記系列の各混合物に加える工程、 Ｄ）各混合物にポリメラーゼ連鎖反応処理を施すことに
より各混合物中で標的二本！ＪＩ Ｄ Ｎ Ａ配列等価
物の濃度を指数的に増幅する工程、Ｅ）それぞれの系列
の各混合物から標的二本鎖ＤＮＡ配列等借物を単離する
工程、 Ｆ）ファージ複製開始点を有するクローニングベクター
に前記等価物をそれぞれクローニングする工程、 Ｇ）いずれの突然変異体か確認するために各等価物の塩
基配列を決定する工程、 Ｈ〉特定部位の突然変異誘発によっていずれかの突然変
異体を修復する工程、 ■）クローニングベクターから前記系列の各等傷物を取
り出す工程、ならびに Ｊ〉全系列の等傷物を一緒に連結して４００個を越える
塩基対を有する標的二本鎖ＤＮＡ配列を形成する工程。
Ａ配列は次のように調製される： Ａ）ｉ）限定されたオリゴヌクレオチド鎖長を有するＤ
ＮＡオリゴヌクレオチド類とそれらの不完全な配列、ま
たは ｉｉ）前記不完全な配列のみ、をそれぞれ含んでなる第
一台底ブロスおよび第二合成ブロスを調製する工程であ
って、かつ ａ）それぞれ通し番号が付いた系列の前記第一ブロスが
前記標的二本鎖Ｄ Ｎ Ａ配列の上部鎮の限定された部
位に等価なりＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでおり、 ｂ）それぞれ通し番号が付いた系列の前記第二ブロスが
前記標的二本鎖ＤＮＡ配列の限定された部位に等価なり
ＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでおり、そして ｃ）全系列が一緒になって完全な標的二本鎖ＤＮＡ配列
に等価となるような前記工程、Ｂ）それらの系列の各番
号が付いた第一台底ブロスと第二合成ブロスを一緒にし
て個々に混合する工程、 Ｃ）各混合物における前記ＤＮＡオリゴヌクレオチド類
の３′末端に対して相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオ
チドプライマー類を前記系列の各混合物に加える工程、 Ｄ）各混合物にポリメラーゼ連鎖反応処理を施すことに
より各混合物中で標的二本！ＪＩ Ｄ Ｎ Ａ配列等価
物の濃度を指数的に増幅する工程、Ｅ）それぞれの系列
の各混合物から標的二本鎖ＤＮＡ配列等借物を単離する
工程、 Ｆ）ファージ複製開始点を有するクローニングベクター
に前記等価物をそれぞれクローニングする工程、 Ｇ）いずれの突然変異体か確認するために各等価物の塩
基配列を決定する工程、 Ｈ〉特定部位の突然変異誘発によっていずれかの突然変
異体を修復する工程、 ■）クローニングベクターから前記系列の各等傷物を取
り出す工程、ならびに Ｊ〉全系列の等傷物を一緒に連結して４００個を越える
塩基対を有する標的二本鎖ＤＮＡ配列を形成する工程。
標的ｄｓ ＤＮＡ配列とそれらの不完全な配列を含んで
なるオリゴならびに適切に組み合わされたフラグメント
を増幅するのに使用されるプライマー類は、従来技術ま
たは自動化された態様の例えば亜リン酸トリエステル、
リン酸トリエステルおよびリン酸ジエステル法などの適
当ないずれかの方法を使用して調製することができる。
なるオリゴならびに適切に組み合わされたフラグメント
を増幅するのに使用されるプライマー類は、従来技術ま
たは自動化された態様の例えば亜リン酸トリエステル、
リン酸トリエステルおよびリン酸ジエステル法などの適
当ないずれかの方法を使用して調製することができる。
これらの自動化された方法の一つではジエチルホスホラ
ミシト類が出発原料として使用される。それらは、Ｌ；
Ｊ。
ミシト類が出発原料として使用される。それらは、Ｌ；
Ｊ。
Ｍｃ Ｂｒ１ｄｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ、 ２４：２５（１９８３）、米国特許第４
．４５８．０６６号明細書およびＢｅａｕｃａｇｅら、
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）
、２２ ： １８５９〜１８６２に記載されるように合
成してもよい。変性固体支持体によるオリゴの合成方法
はまた、米国特許第４、４５８．０６６号明細書にも記
載されている。
ｔｅｒｓ、 ２４：２５（１９８３）、米国特許第４
．４５８．０６６号明細書およびＢｅａｕｃａｇｅら、
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）
、２２ ： １８５９〜１８６２に記載されるように合
成してもよい。変性固体支持体によるオリゴの合成方法
はまた、米国特許第４、４５８．０６６号明細書にも記
載されている。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
少量の大きなオリゴヌクレオチド類は、米国特許第４．
６８３．１９５号および同４．６８３．２０２号明細書
に記載されるポリメラーゼ連鎖反応の変法を用いて増幅
される。この反応はプライマー類と重合剤を使用する。
６８３．１９５号および同４．６８３．２０２号明細書
に記載されるポリメラーゼ連鎖反応の変法を用いて増幅
される。この反応はプライマー類と重合剤を使用する。
このＰＣＲ技法は、概念的に、核酸を増幅するための非
常に単純な方法である。それはポリメラーゼ連鎖反応に
よって生ずる多数のＤＮＡ分子が各周期後に２倍となる
点で天然のＤＮＡ複製工程をある程度模倣しており、あ
る意味で生体内ＤＮＡ複製に類似する。
常に単純な方法である。それはポリメラーゼ連鎖反応に
よって生ずる多数のＤＮＡ分子が各周期後に２倍となる
点で天然のＤＮＡ複製工程をある程度模倣しており、あ
る意味で生体内ＤＮＡ複製に類似する。
この方法は、一系列の３工程の反復に基づくものであり
、幾分相違しそして制御された温度条件下で全体が連続
的に行われる。これらの工程は、変性、アニーリングお
よびプライマーエクステンションである。
、幾分相違しそして制御された温度条件下で全体が連続
的に行われる。これらの工程は、変性、アニーリングお
よびプライマーエクステンションである。
本明細書で使用する「ブライマー」の語は、サーマス・
アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
）を初めとするＤＮＡポリメラーゼのような重合剤がそ
のブライマーがアニール化されるヌクレオチド配列（鋳
型）に相補的であるヌクレオチド類を付加することがで
きる末端を提供するようなオリゴヌクレオチド配列をい
う。この付加は、適当な温度とｐＨにおいてデオキシリ
ポヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で起こる
。ブライマーは、−本鎮または一本鎖と二本鎖オリゴヌ
クレオチド類の混合物である。ブライマーは重合剤の存
在下でエクステンション（伸長）生成物の合成を誘発す
るために十分な長さでなければならない。これらのプラ
イマー類の正確な長さは、温度およびブライマーの起源
を初めとする多くの要因により左右されるであろう。例
えば、標的配列の複雑さに応じて、典型的には、オリゴ
プライマーはＩＳ〜２５またはそれ以上のヌクレオチド
類を含むが、それはより少ないヌクレオチド類を含んで
もよい。−鰻に、短いプライマー分子は鋳型と十分安定
なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必
要とする。
アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
）を初めとするＤＮＡポリメラーゼのような重合剤がそ
のブライマーがアニール化されるヌクレオチド配列（鋳
型）に相補的であるヌクレオチド類を付加することがで
きる末端を提供するようなオリゴヌクレオチド配列をい
う。この付加は、適当な温度とｐＨにおいてデオキシリ
ポヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で起こる
。ブライマーは、−本鎮または一本鎖と二本鎖オリゴヌ
クレオチド類の混合物である。ブライマーは重合剤の存
在下でエクステンション（伸長）生成物の合成を誘発す
るために十分な長さでなければならない。これらのプラ
イマー類の正確な長さは、温度およびブライマーの起源
を初めとする多くの要因により左右されるであろう。例
えば、標的配列の複雑さに応じて、典型的には、オリゴ
プライマーはＩＳ〜２５またはそれ以上のヌクレオチド
類を含むが、それはより少ないヌクレオチド類を含んで
もよい。−鰻に、短いプライマー分子は鋳型と十分安定
なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必
要とする。
これらのブライマーは、それらの鋳型と「実質的」に相
補的となるように選ばれる。このことは、これらのブラ
イマーがそれらの鋳型とハイブリダイゼーションするの
に十分相補的であることを意味する。従って、プライマ
ー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要がない。例え
ば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、プライマ
ー配列の残余部がその鎖に相補的であればブライマーの
５′末端に付着するかも知れない。また、より長い配列
の非相補的な塩基はプライマー中に散在してもよく、そ
のプライマー配列がその場所でハイブリダイゼーション
するように増幅せしめられる鎮の配列と十分な相補性を
有し、それによって他のブライマーのエクステンション
生成物の合成用鋳型を形成するように提供されうる。
補的となるように選ばれる。このことは、これらのブラ
イマーがそれらの鋳型とハイブリダイゼーションするの
に十分相補的であることを意味する。従って、プライマ
ー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要がない。例え
ば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、プライマ
ー配列の残余部がその鎖に相補的であればブライマーの
５′末端に付着するかも知れない。また、より長い配列
の非相補的な塩基はプライマー中に散在してもよく、そ
のプライマー配列がその場所でハイブリダイゼーション
するように増幅せしめられる鎮の配列と十分な相補性を
有し、それによって他のブライマーのエクステンション
生成物の合成用鋳型を形成するように提供されうる。
プライマー類は、遺伝子が調製されるオリゴフラグメン
トを調製するのに使用されるのと同一の方法を用いて調
製される。
トを調製するのに使用されるのと同一の方法を用いて調
製される。
変性
所期の二本鎖ＤＮＡ配列の単離後、それらを鋳型として
それぞれ個々に使用することができるように各鎖を分離
することが必要である。これらの鎖の分離は、独立した
工程かまたはプライマーエクステンション生成物の合成
と同時に起こすことができる。この鎖の分離は、物理的
、化学的または酵素的手段を初めとするいずれか適当な
変性方法で行うことができる。
それぞれ個々に使用することができるように各鎖を分離
することが必要である。これらの鎖の分離は、独立した
工程かまたはプライマーエクステンション生成物の合成
と同時に起こすことができる。この鎖の分離は、物理的
、化学的または酵素的手段を初めとするいずれか適当な
変性方法で行うことができる。
これらの鎖の物理的分離方法の一つとしては、核酸が完
全く〉９９％）に変性されるまでそれを加熱することが
挙げられる。典型的な加熱変性としては、１〜１０分間
の時間内の８０℃〜１０５℃の温度範囲を挙げることが
できる。標準的な分離はまた、へりカーゼのような既知
の酵素に属する酵素によって誘導してもよい。ヘリカー
ゼにより核酸鎖を分離するのに適する反応条件は、自刃
Ｕ徂■肪Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａ
ｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇ 、 Ｖｏ。
全く〉９９％）に変性されるまでそれを加熱することが
挙げられる。典型的な加熱変性としては、１〜１０分間
の時間内の８０℃〜１０５℃の温度範囲を挙げることが
できる。標準的な分離はまた、へりカーゼのような既知
の酵素に属する酵素によって誘導してもよい。ヘリカー
ゼにより核酸鎖を分離するのに適する反応条件は、自刃
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ＸＬＩＩＩ″ＤＮＡ ： Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”（Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ ：Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ。
ｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”（Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ ：Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ。
１９７８）、 Ｂ、Ｋｕｈｎ ら、”ＤＮＡ Ｈｅ
１ｉｃａｓｅ”、６３〜６７ページ、ならびにＣ，Ｒａ
ｄｄｉｎｇによるＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ
、 １６ ：４０５〜４３７ページ（１９８２）！！説
に記載されている。
１ｉｃａｓｅ”、６３〜６７ページ、ならびにＣ，Ｒａ
ｄｄｉｎｇによるＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ
、 １６ ：４０５〜４３７ページ（１９８２）！！説
に記載されている。
一度解離した二本の鎖は、温度がアニーリングするのに
十分低くなるまで溶液中でばらばらのまま残存するであ
ろう。
十分低くなるまで溶液中でばらばらのまま残存するであ
ろう。
ブライマーエクステンションのアニーリング核酸または
核酸類の相補的鎮が分離された場合、これらの鎖は追加
の核酸鎖の合成用鋳型として使用される用意が整う。
核酸類の相補的鎮が分離された場合、これらの鎖は追加
の核酸鎖の合成用鋳型として使用される用意が整う。
これらのエフテンションプライマーは、増幅せしめる鋳
型のフランキング領域部位にアニールする合成オリゴの
対となる。対となる各プライマーは一種のＤＮＡ鎮のみ
にアニールしうるであろう。
型のフランキング領域部位にアニールする合成オリゴの
対となる。対となる各プライマーは一種のＤＮＡ鎮のみ
にアニールしうるであろう。
これらのプライマーの配列は、増幅せしめる境界領域に
おけるＤＮＡ鋳型の配列によって決定される。これらの
プライマーは逆向きの鎖にアニールするので、それらが
相互に向い合ったそれらの３′末端を有するものとみな
すことができる。典型的には、これらのプライマーは各
種の配列を有し相互に相補的でない。
おけるＤＮＡ鋳型の配列によって決定される。これらの
プライマーは逆向きの鎖にアニールするので、それらが
相互に向い合ったそれらの３′末端を有するものとみな
すことができる。典型的には、これらのプライマーは各
種の配列を有し相互に相補的でない。
一般的に、これらのプライマーはＤＮＡ鋳型に対して大
過剰存在する。これが温度が低い場合に、プライマー類
のアニーリング部位における２種のＤＮＡ鎮の再会合を
通じてプライマーと鋳型の複合体形成に役立つ。
過剰存在する。これが温度が低い場合に、プライマー類
のアニーリング部位における２種のＤＮＡ鎮の再会合を
通じてプライマーと鋳型の複合体形成に役立つ。
プライマーエクステンション（増幅〉
この方法の第三の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによって
促進されるプライマーの（５′→３′）エクステンショ
ン（伸長）である。このエクステンション工程が行われ
る条件は、使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類に直接
左右される。この処理を介してエクステンションプライ
マー類は増幅生成物中に組み入れられるであろう。
促進されるプライマーの（５′→３′）エクステンショ
ン（伸長）である。このエクステンション工程が行われ
る条件は、使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類に直接
左右される。この処理を介してエクステンションプライ
マー類は増幅生成物中に組み入れられるであろう。
ＰＣＲ技法では、典型的な一連の段階（すなわち、変性
、アニーリング、エクステンション）が−周期と称され
ている。米国特許第４．６８３．１９５号および同４．
６８３．２０２号明細書で教示されるように、この技法
はＤＮＡの長い断片について実施される。
、アニーリング、エクステンション）が−周期と称され
ている。米国特許第４．６８３．１９５号および同４．
６８３．２０２号明細書で教示されるように、この技法
はＤＮＡの長い断片について実施される。
目的の増幅生成物は「短鎖生成物」と称されており、こ
のものがエクステンションプライマー類の５′末端間を
占める領域として限定されている。
のものがエクステンションプライマー類の５′末端間を
占める領域として限定されている。
プライマー類は十分に限定された配列を有するので、そ
れぞれのプライマー配列に対応する短鎖生成物は個別の
末端を有するであろう。周期の数が増加するに従い、短
鎖生成物は急にエクステンションプライマー類がアニー
ルしうる主な鋳型となってくるであろう。理論上、短鎖
生成物の量は各周期後に２倍になり、指数的な蓄積をも
たらすであろう。
れぞれのプライマー配列に対応する短鎖生成物は個別の
末端を有するであろう。周期の数が増加するに従い、短
鎖生成物は急にエクステンションプライマー類がアニー
ルしうる主な鋳型となってくるであろう。理論上、短鎖
生成物の量は各周期後に２倍になり、指数的な蓄積をも
たらすであろう。
実際のブライマーエクステンションと増幅は次のように
実施される。合成混合物にデオキシリボヌクレオシド三
リン酸（ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ）が適当重加えられ、得られた溶液が１〜１０
分、好ましくは１〜４分間９０℃〜１００℃に加熱され
る。この加熱期間後に溶液を２０℃〜５５℃まで冷却し
、このことがプライマーのハイブリダイゼーションにと
って好ましい。重合剤はこの冷却混合物に加えられる。
実施される。合成混合物にデオキシリボヌクレオシド三
リン酸（ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ）が適当重加えられ、得られた溶液が１〜１０
分、好ましくは１〜４分間９０℃〜１００℃に加熱され
る。この加熱期間後に溶液を２０℃〜５５℃まで冷却し
、このことがプライマーのハイブリダイゼーションにと
って好ましい。重合剤はこの冷却混合物に加えられる。
この反応は当該技術分野で既知の条件下で起こすことが
できる。この合成反応は、重合剤の作用効率が失われる
こととなる温度未満の室温で起こすことができる。従っ
て、例えば、重合剤としてＤＮＡポリメラーゼＩが使用
される場合には、−船釣に温度は４５℃未満である。
できる。この合成反応は、重合剤の作用効率が失われる
こととなる温度未満の室温で起こすことができる。従っ
て、例えば、重合剤としてＤＮＡポリメラーゼＩが使用
される場合には、−船釣に温度は４５℃未満である。
重合剤は、酵素を初めとするプライマーエクステンショ
ン生成物の台底を遂行する機能を有しうるどのような化
合物または系であってもよい。この目的に適する酵素と
しては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵素および耐熱性酵素を初めとする各核酸鎖
に相補的であるプライマーエクステンション生成物を形
式するのに適する状態にヌクレオチド類の組み合わせを
促進しろる他の酵素類が挙げられる。サーマス・アクア
ティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ） ポ
リメラーゼのような耐熱性重合剤（ＤＮＡポリメラーゼ
）は、６５℃〜７５℃までの高温で使用される。
ン生成物の台底を遂行する機能を有しうるどのような化
合物または系であってもよい。この目的に適する酵素と
しては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵素および耐熱性酵素を初めとする各核酸鎖
に相補的であるプライマーエクステンション生成物を形
式するのに適する状態にヌクレオチド類の組み合わせを
促進しろる他の酵素類が挙げられる。サーマス・アクア
ティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ） ポ
リメラーゼのような耐熱性重合剤（ＤＮＡポリメラーゼ
）は、６５℃〜７５℃までの高温で使用される。
一般に、この合成は鋳型鎮に沿って各プライマーの３′
末端で開始して合成が停止するまで５′方向に進む。
末端で開始して合成が停止するまで５′方向に進む。
しかしながら、前述したのと同様な方法を用いて５′末
端で開始しもう一つの方向に進む剤が存在するかも知れ
ない。
端で開始しもう一つの方向に進む剤が存在するかも知れ
ない。
新に合成された鎖とその鋳型は、この発明の方法の次の
工程で使用される二本鎖分子を形成する。
工程で使用される二本鎖分子を形成する。
この方法の次の工程は、再度一連の３つの段階（変性、
アニーリングおよびプライマーエクステンション）の反
復適用を伴う。
アニーリングおよびプライマーエクステンション）の反
復適用を伴う。
新な核酸は、−本鎖分子で台底される。前述の条件下で
進められる反応にとって必要な場合には、さらなる誘発
剤、ヌクレオチド数およびプライマー類を加えてもよい
。また、合成がオリゴプライマー類一端で開始し、−本
鎖の鋳型に沿って進行して追加の核酸を生成するであろ
う。この工程後、エクステンション生成物の半分は、２
種のプライマーによって結合された特異的な核酸配列か
らなるであろう。
進められる反応にとって必要な場合には、さらなる誘発
剤、ヌクレオチド数およびプライマー類を加えてもよい
。また、合成がオリゴプライマー類一端で開始し、−本
鎖の鋳型に沿って進行して追加の核酸を生成するであろ
う。この工程後、エクステンション生成物の半分は、２
種のプライマーによって結合された特異的な核酸配列か
らなるであろう。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、各段階後に新な試
薬を添加する逐次的な形式で実施することができる。ま
た、それは最初にすべての試薬を加えて同時に行うか、
あるいは与えられた数の段階後に新鮮な試薬を加える一
部逐次的にそして一部同時に行うこともできる。
薬を添加する逐次的な形式で実施することができる。ま
た、それは最初にすべての試薬を加えて同時に行うか、
あるいは与えられた数の段階後に新鮮な試薬を加える一
部逐次的にそして一部同時に行うこともできる。
熱安定性重合剤の場合に、重合剤を不活化しうる加熱の
ような鎮の分離方法が使用されるときは、毎回の鎖分離
工程後に重合剤を補給することが必要である。
ような鎮の分離方法が使用されるときは、毎回の鎖分離
工程後に重合剤を補給することが必要である。
ヘリカーゼのような酵素手段を初めとする数々の精製成
分が鎖の分離工程に使用される場合には同時方法が有用
であるかも知れない。同時方法では、反応混合物は所期
の配列を含有する核酸鎖に加え、（１〉鎖を分離する酵
素（例えば、ヘリカーゼ）、（２）鎖を分離する酵素の
ための適当なエネルギー源、例えばＡＴＰ、（３）前記
４種のデオキシリボヌクレオチド類、（４）過剰モル濃
度のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（５）重合剤
を含めてもよい。
分が鎖の分離工程に使用される場合には同時方法が有用
であるかも知れない。同時方法では、反応混合物は所期
の配列を含有する核酸鎖に加え、（１〉鎖を分離する酵
素（例えば、ヘリカーゼ）、（２）鎖を分離する酵素の
ための適当なエネルギー源、例えばＡＴＰ、（３）前記
４種のデオキシリボヌクレオチド類、（４）過剰モル濃
度のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（５）重合剤
を含めてもよい。
同時方法で変性に加熱が使用される場合には、前記で触
れた耐熱性ポリメラーゼのような熱安定性重合剤が使用
されるであろう５この発明の方法の各工程は、最初にす
べての試薬類が存在するにもかかわらず連続的に起こる
であろう。必要に応じて追加の原料を加えてもよい。所
定量の特異的核酸配列を生成するために適当な長さの時
間が経過した後、いずれか既知の方法で酵素を不活化す
るかまたは反応成分を分離することによって反応を停止
してもよい。
れた耐熱性ポリメラーゼのような熱安定性重合剤が使用
されるであろう５この発明の方法の各工程は、最初にす
べての試薬類が存在するにもかかわらず連続的に起こる
であろう。必要に応じて追加の原料を加えてもよい。所
定量の特異的核酸配列を生成するために適当な長さの時
間が経過した後、いずれか既知の方法で酵素を不活化す
るかまたは反応成分を分離することによって反応を停止
してもよい。
ＰＣＲで増幅された合成ＤＮＡ配列は、一般に突然変異
を含む。ＰＣＲで使用されるサーマス・アクアティカス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ） は、重合さ
れた９、 ０００個の塩基当たり１個の割合で単一塩基
除および挿入〉は、４１．０００個当たり１個の割合で
生ずる。４００ｂｐのｄｓ ＤＮＡ配列の一合成では、
ＰＣＲの１１周期（１周期当たり８００個のヌクレオチ
ド類が合成される）当たりほぼ１塩基の置換突然変異が
起こる。ＤＮＡ標的配列を与える増幅には一般にＰＣＨ
のほぼ３０周期が必要である。従って、４００ｂｐ遺伝
子の合成によって約２〜３個の塩基置換突然変異とほぼ
１フレームシフト突然変異が生する可能性がある。この
状況は、突然変異の発生（増幅）が初期のＰＣＲ段階で
起こるので幾分さらに複雑（有害）になる。
を含む。ＰＣＲで使用されるサーマス・アクアティカス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ） は、重合さ
れた９、 ０００個の塩基当たり１個の割合で単一塩基
除および挿入〉は、４１．０００個当たり１個の割合で
生ずる。４００ｂｐのｄｓ ＤＮＡ配列の一合成では、
ＰＣＲの１１周期（１周期当たり８００個のヌクレオチ
ド類が合成される）当たりほぼ１塩基の置換突然変異が
起こる。ＤＮＡ標的配列を与える増幅には一般にＰＣＨ
のほぼ３０周期が必要である。従って、４００ｂｐ遺伝
子の合成によって約２〜３個の塩基置換突然変異とほぼ
１フレームシフト突然変異が生する可能性がある。この
状況は、突然変異の発生（増幅）が初期のＰＣＲ段階で
起こるので幾分さらに複雑（有害）になる。
ＰＣＲから生ずるこれらの突然変異は、−本鎮Ｄ Ｎ
Ａ、（ｓｓＤＮＡ）のファージ複製開始点を含有するプ
ラスミドに容易に連結するための制限端を有する標的ｄ
ｓ ＤＮＡを設計することによって簡単に修復すること
ができる。これがＤＮＡ塩基配列決定による突然変異体
の特性決定を可能にし、特定部位の突然変異誘発による
修復を可能にする。
Ａ、（ｓｓＤＮＡ）のファージ複製開始点を含有するプ
ラスミドに容易に連結するための制限端を有する標的ｄ
ｓ ＤＮＡを設計することによって簡単に修復すること
ができる。これがＤＮＡ塩基配列決定による突然変異体
の特性決定を可能にし、特定部位の突然変異誘発による
修復を可能にする。
従って、この方法は、（１〉突然変異体を含む可能性の
あるｄｓ ＤＮＡ配列を与える標的ｄｓ ＤＮＡ配列の
対向する上部鎮と下部鎮に相当する長鎖オリゴヌクレオ
チド類のＰＣＲ増幅、（２）Ｆｌ（ＩＧ）のようなファ
ージ複製開始点を含有するプラスミドへのこのｄｓ Ｄ
ＮＡ配列のクローニング、ならびに（３）正しい二本鎖
ＤＮＡ配列を与えるための特定部分の突然変異誘発によ
る突然変異体の固定、を包含する。
あるｄｓ ＤＮＡ配列を与える標的ｄｓ ＤＮＡ配列の
対向する上部鎮と下部鎮に相当する長鎖オリゴヌクレオ
チド類のＰＣＲ増幅、（２）Ｆｌ（ＩＧ）のようなファ
ージ複製開始点を含有するプラスミドへのこのｄｓ Ｄ
ＮＡ配列のクローニング、ならびに（３）正しい二本鎖
ＤＮＡ配列を与えるための特定部分の突然変異誘発によ
る突然変異体の固定、を包含する。
特定部位の突然変異誘発は、この発明の方法の工程Ｅ〉
で遺伝子が挿入されたプラスミドについて実施される塩
基配列決定によって明らかにされるいずれかの突然変異
体の修復のために使用される。この突然変異誘発は次の
ように実施された。
で遺伝子が挿入されたプラスミドについて実施される塩
基配列決定によって明らかにされるいずれかの突然変異
体の修復のために使用される。この突然変異誘発は次の
ように実施された。
１ ） ｉ ） ｄＵＴＰａｇｅとウラシル塩基グＴ
）Ｊシ５−ゼが欠失し、かつ ｉｉ） Ｆ’要素を含む、大腸菌株への前記プラスミド
の導入、 ２〉 ｆ１ヘルパーファージを用い１）で得られた大腸
菌を感染してｆ１ファージ遺伝子間領域とウラシル塩基
（ｓｓＰ）を含有する１）のプラスミドの一本鎖ＤＮＡ
転換体の形成、 ３〉感染された大腸菌によって分泌されるウラシルおよ
びｆ１ファージ遺伝子間領域（ｆｌ （ＩＧ） ）を含
有する一本鎖プラスミド（ｓｓＰ）の単離、４）突然変
異を伴うプラスミドのＤＮＡ配列に相補的であるＤＮＡ
配列を有する突然変異誘発オリゴヌクレオチド（オリゴ
〉 ｉ）の各突然変異部位へのアニーリング、 ５）ＤＮＡポリメラーゼならびにｄＡＴＰ 、 ｄＴＴ
Ｐ 。
）Ｊシ５−ゼが欠失し、かつ ｉｉ） Ｆ’要素を含む、大腸菌株への前記プラスミド
の導入、 ２〉 ｆ１ヘルパーファージを用い１）で得られた大腸
菌を感染してｆ１ファージ遺伝子間領域とウラシル塩基
（ｓｓＰ）を含有する１）のプラスミドの一本鎖ＤＮＡ
転換体の形成、 ３〉感染された大腸菌によって分泌されるウラシルおよ
びｆ１ファージ遺伝子間領域（ｆｌ （ＩＧ） ）を含
有する一本鎖プラスミド（ｓｓＰ）の単離、４）突然変
異を伴うプラスミドのＤＮＡ配列に相補的であるＤＮＡ
配列を有する突然変異誘発オリゴヌクレオチド（オリゴ
〉 ｉ）の各突然変異部位へのアニーリング、 ５）ＤＮＡポリメラーゼならびにｄＡＴＰ 、 ｄＴＴ
Ｐ 。
ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰによる４）のプラスミドを処理
し、４）のプラスミドに相補的な第二のＤＮＡ鎮を合成
して二本鎖プラスミドの形成をもたらす工程、６）５）
のプラスミドで野生型大腸菌を感染することによる修復
された遺伝子配列を担う一本鎖プラスミドの形式、なら
びに ７〉前記工程５）に記載するような通常のクローニング
技法を用いる二本鎮形に６）の−本鎮プラスミドを転換
する工程。
し、４）のプラスミドに相補的な第二のＤＮＡ鎮を合成
して二本鎖プラスミドの形成をもたらす工程、６）５）
のプラスミドで野生型大腸菌を感染することによる修復
された遺伝子配列を担う一本鎖プラスミドの形式、なら
びに ７〉前記工程５）に記載するような通常のクローニング
技法を用いる二本鎮形に６）の−本鎮プラスミドを転換
する工程。
この発明の方法の具体例： ＨＩＶ−Ｉ ＲＥ！Ｖ遺伝
子の設計と合成 ＨＩＶ−１単離Ｂｌ（１０由来の天然ＲＥＶ遺伝子（形
式上、ＡＲＴまたはＴＲ３）のヌクレオチド配列と新に
設計した合成ＲＥＶ遺伝子のヌクレオチド配列を第２図
に示す。天然遺伝子から合成遺伝子に変化するすべての
コドンは中抜きのタイプで示す。代替コドンの使用によ
って遺伝子中に特異的な制限部位（ＳａｃＩ 、Ｋｐｎ
Ｉ 、 ａｓｓ）ＩＩＩ 、ＢｃｏＲＶ、Ｓａｌ Ｉ
。
子の設計と合成 ＨＩＶ−１単離Ｂｌ（１０由来の天然ＲＥＶ遺伝子（形
式上、ＡＲＴまたはＴＲ３）のヌクレオチド配列と新に
設計した合成ＲＥＶ遺伝子のヌクレオチド配列を第２図
に示す。天然遺伝子から合成遺伝子に変化するすべての
コドンは中抜きのタイプで示す。代替コドンの使用によ
って遺伝子中に特異的な制限部位（ＳａｃＩ 、Ｋｐｎ
Ｉ 、 ａｓｓ）ＩＩＩ 、ＢｃｏＲＶ、Ｓａｌ Ｉ
。
Ｂａｇ Ｉ 、 ＢｓｐＭＩＩ ・ＢｇＩＩおよびＮａ
ｒＩ）を組み入れた。他の代替コドンはタンパク質発現
の目的上大腸菌にとって好ましいコドンとマツチするよ
うに選んだ。遺伝暗号を使用する天然または合Ｊｌｉｌ
ＥＲＥＶ遺伝子のいずれかの翻訳は正確に同一のタンパ
ク質配列を示す。
ｒＩ）を組み入れた。他の代替コドンはタンパク質発現
の目的上大腸菌にとって好ましいコドンとマツチするよ
うに選んだ。遺伝暗号を使用する天然または合Ｊｌｉｌ
ＥＲＥＶ遺伝子のいずれかの翻訳は正確に同一のタンパ
ク質配列を示す。
合成ＲＥＶ遺伝子は、この遺伝子の５′末端と３′末端
の側面にエキストラ配列が並ぶように設計した。このよ
うなエキストラ配列は５′末端に制限酵素部位Ｂａｎ旧
と３′末端に制限酵素部位Ｂｃｏ Ｒ１を含めた。これ
らの部位は、ＰＣＲ増幅遺伝子がファージ複製開始点Ｃ
ｆｌ （ＩＧ） ）を含有するｐＫＨ７またはＭ１３ｒ
ｎｐ９のようなプラスミド中に簡単にクローン化されう
るように前記遺伝子内に設計された。ファージ複製開始
点を含んでなるすべてのベクターは特定部位の突然変異
誘発による修復に有用であろう。これらの制限部位はま
た、遺伝子の特性決定（ＤＮＡ塩基配列決定による）お
よびタンパク質発現のために使用されるプラスミド中に
遺伝子をクローニングするのにも有用である。
の側面にエキストラ配列が並ぶように設計した。このよ
うなエキストラ配列は５′末端に制限酵素部位Ｂａｎ旧
と３′末端に制限酵素部位Ｂｃｏ Ｒ１を含めた。これ
らの部位は、ＰＣＲ増幅遺伝子がファージ複製開始点Ｃ
ｆｌ （ＩＧ） ）を含有するｐＫＨ７またはＭ１３ｒ
ｎｐ９のようなプラスミド中に簡単にクローン化されう
るように前記遺伝子内に設計された。ファージ複製開始
点を含んでなるすべてのベクターは特定部位の突然変異
誘発による修復に有用であろう。これらの制限部位はま
た、遺伝子の特性決定（ＤＮＡ塩基配列決定による）お
よびタンパク質発現のために使用されるプラスミド中に
遺伝子をクローニングするのにも有用である。
ＲＥＶ遺伝子の合或は次のように実施された。
制限部位Ｒａｍ旧とＢｃｏＲｌを含有する５′および３
′フランキング配列（示していない〉を含む完全なＲＥ
Ｖ遺伝子の上部鎮と下部線の両方は、０．２マイクロモ
ルＤＮＡカラムを使用するＢｉｏ ５ｅａｒｃｈ自動Ｄ
ＮＡシンセサイザーによって標準的な試薬と標準的な技
法で台底された。
′フランキング配列（示していない〉を含む完全なＲＥ
Ｖ遺伝子の上部鎮と下部線の両方は、０．２マイクロモ
ルＤＮＡカラムを使用するＢｉｏ ５ｅａｒｃｈ自動Ｄ
ＮＡシンセサイザーによって標準的な試薬と標準的な技
法で台底された。
ＤＮＡ合或台底は標準的な技法で測定したところ添加塩
基当たり９８％以上であった。それは、各全鎖長３９３
ｍｅｒ （上部鎮と下部線の両方）の約６ナノモルが作
製されたものと推定された。各鎮の３′末端に相補的な
りＮＡ合合成ライマー類（２０ｍｅｒ）もまた台底され
た。
基当たり９８％以上であった。それは、各全鎖長３９３
ｍｅｒ （上部鎮と下部線の両方）の約６ナノモルが作
製されたものと推定された。各鎮の３′末端に相補的な
りＮＡ合合成ライマー類（２０ｍｅｒ）もまた台底され
た。
これらの粗合成ブロスはゲル濾過クロマトグラフィーに
よって脱塩された。この工程後、前記粗ＤＮＡ台底生底
物は純水１．５−中に存在した。２種の３９３ｍａｒ配
列（上部鎖と下部線）およびそれらの不完全な配列を含
有する前記ＤＮＡ溶液の各々のアリコート（１０１１１
）を、２種のＤＮＡ合戊台底イマー（１０Ｊｆｌ）なら
びに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ （ｐ）１８．４） 、
２．５ｆｎＭ ＭｇＣｊ！２．５０ｍＭ ＫＣＩおよび
１．０ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、
ｄＧＴＰ 、 ｄＴＴＰ）およびｔａｑポリメラーゼ
１０単位と共に、総量１００ｄとなるようにマイクロチ
ューブ中で一緒に混合した。
よって脱塩された。この工程後、前記粗ＤＮＡ台底生底
物は純水１．５−中に存在した。２種の３９３ｍａｒ配
列（上部鎖と下部線）およびそれらの不完全な配列を含
有する前記ＤＮＡ溶液の各々のアリコート（１０１１１
）を、２種のＤＮＡ合戊台底イマー（１０Ｊｆｌ）なら
びに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ （ｐ）１８．４） 、
２．５ｆｎＭ ＭｇＣｊ！２．５０ｍＭ ＫＣＩおよび
１．０ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、
ｄＧＴＰ 、 ｄＴＴＰ）およびｔａｑポリメラーゼ
１０単位と共に、総量１００ｄとなるようにマイクロチ
ューブ中で一緒に混合した。
このマイクロチューブを７０℃におけるプログラマブル
加熱ブロック中に置いた。次に、この試料を１分間７０
℃〜９５℃で加熱してＤＮＡを変性し、５５℃でアニー
ル化し、このＤＮＡのｔａｑポリメラーゼで促進された
ポリメリゼーションのために最初の３周期を２０分間７
０℃で加熱工程を続けた。この手順をさらに３２ ＰＣ
Ｒ周期反復した。このＰＣＲ反応混合物のアリコー）
（１０ｉ１１）を第二のマイクロチューブに入れ、前述
のように緩衝組成物とｔａｑポリメラーゼを加えた。こ
の混合物についてさらに３０周期ＰＣＲを実施した。
加熱ブロック中に置いた。次に、この試料を１分間７０
℃〜９５℃で加熱してＤＮＡを変性し、５５℃でアニー
ル化し、このＤＮＡのｔａｑポリメラーゼで促進された
ポリメリゼーションのために最初の３周期を２０分間７
０℃で加熱工程を続けた。この手順をさらに３２ ＰＣ
Ｒ周期反復した。このＰＣＲ反応混合物のアリコー）
（１０ｉ１１）を第二のマイクロチューブに入れ、前述
のように緩衝組成物とｔａｑポリメラーゼを加えた。こ
の混合物についてさらに３０周期ＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ反応混合物約１０４を１％アガロ
ースゲルによりＤＮＡ電気泳動することにより特性決定
したところ、約４００ｂｐのＤＮＡバンドが観察された
。従って、残りのＰＣＲ反応混合物を６０分間−２０℃
において９５％エタノール２．５倍容量で処理した。得
られた沈殿ＤＮＡを１０．０００ Ｘｇで遠心すること
によって集めた。このＤＮＡを緩衝液に溶解し、１％ア
ガロースゲルによる分取りＮＡ電気泳動によって分離し
た。４００ｂｐのＤＮＡバンドをエチジウムプロミド染
色によって可視化した。可視化されたＤＮＡバンドの前
面のゲ・ルを鋭利なかみそりの刃でスライスした。ＤＥ
ＡＲセルロースＤＮＡパインディング紙の小片を前記ゲ
ルのスライス中に挿入した。ＤＮＡ電気泳動は４００ｂ
ｐのすべてがその紙に結合するまで続けた。
ースゲルによりＤＮＡ電気泳動することにより特性決定
したところ、約４００ｂｐのＤＮＡバンドが観察された
。従って、残りのＰＣＲ反応混合物を６０分間−２０℃
において９５％エタノール２．５倍容量で処理した。得
られた沈殿ＤＮＡを１０．０００ Ｘｇで遠心すること
によって集めた。このＤＮＡを緩衝液に溶解し、１％ア
ガロースゲルによる分取りＮＡ電気泳動によって分離し
た。４００ｂｐのＤＮＡバンドをエチジウムプロミド染
色によって可視化した。可視化されたＤＮＡバンドの前
面のゲ・ルを鋭利なかみそりの刃でスライスした。ＤＥ
ＡＲセルロースＤＮＡパインディング紙の小片を前記ゲ
ルのスライス中に挿入した。ＤＮＡ電気泳動は４００ｂ
ｐのすべてがその紙に結合するまで続けた。
次に、６５℃で２ＭＮａＣｆで処理することによって紙
からＤＮＡを溶離した。ｎ−ブタノールで抽出すること
によってＤＮＡからエチジウムプロミドを除去した。こ
のＤＮＡを前記のように沈殿させ、次いで遠心して集め
た。ＤＮＡペレットを水中７５％エタノールで洗浄した
。精製した４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、０．５
ｆｆのプラスミドｐＫＨ？ 。
からＤＮＡを溶離した。ｎ−ブタノールで抽出すること
によってＤＮＡからエチジウムプロミドを除去した。こ
のＤＮＡを前記のように沈殿させ、次いで遠心して集め
た。ＤＮＡペレットを水中７５％エタノールで洗浄した
。精製した４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、０．５
ｆｆのプラスミドｐＫＨ？ 。
ＢａｍＨＩ （１０単位）およびｌ１ｉｃｏＲ１（１０
単位〉含有の制限酵素緩衝液１０４’に再溶解し、そし
て３７℃で６０分間消化を行った。この溶液を、フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／２
４／ １ ）で−度抽出した。次に、ｐＫＨ？ （第１
図）を含有するＤＮＡを前記のように沈殿させた。この
ＤＮＡをＤＮＡ！ｊガーゼ４００単位を含有する緩衝液
で溶解した。連結を５時間１３℃で行った。この連結混
合物を使用して大腸菌７８１株をトランスフェクション
した。トランスフェクシントをＸＧＡＬプレート上で白
色コロニーとして選抜された。プラスミドは常法のミニ
プレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）手順によって数個のコロニ
ーから調製し、次いでＰｕｖ ＩＩによって消化した。
単位〉含有の制限酵素緩衝液１０４’に再溶解し、そし
て３７℃で６０分間消化を行った。この溶液を、フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／２
４／ １ ）で−度抽出した。次に、ｐＫＨ？ （第１
図）を含有するＤＮＡを前記のように沈殿させた。この
ＤＮＡをＤＮＡ！ｊガーゼ４００単位を含有する緩衝液
で溶解した。連結を５時間１３℃で行った。この連結混
合物を使用して大腸菌７８１株をトランスフェクション
した。トランスフェクシントをＸＧＡＬプレート上で白
色コロニーとして選抜された。プラスミドは常法のミニ
プレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）手順によって数個のコロニ
ーから調製し、次いでＰｕｖ ＩＩによって消化した。
プラスミドｐＫＨ７は、３００ｂｐ離れた２つのＰｕｖ
ＩＩ部位を含む。ｐＫＨ７はまた細菌複製開始点とフ
ァージ複製開始点をも含む。これらの２つの部位の間で
４００ｂｐのＲＥＶ遺伝子の挿入が起こるので、挿入部
を含有するプラスミドはＰｕｖ ＩＩ消化後に７００ｂ
ｐ（３００ｂｐの挿入）のより大きなフラグメントを与
える。Ｐｕｖ ＩＩ消化の１８個のプラスミドは、１％
アガロースゲルで分離し、次いで１８個中１１個のプラ
スミドは７００ｂｐのフラグメントを与えた。
ＩＩ部位を含む。ｐＫＨ７はまた細菌複製開始点とフ
ァージ複製開始点をも含む。これらの２つの部位の間で
４００ｂｐのＲＥＶ遺伝子の挿入が起こるので、挿入部
を含有するプラスミドはＰｕｖ ＩＩ消化後に７００ｂ
ｐ（３００ｂｐの挿入）のより大きなフラグメントを与
える。Ｐｕｖ ＩＩ消化の１８個のプラスミドは、１％
アガロースゲルで分離し、次いで１８個中１１個のプラ
スミドは７００ｂｐのフラグメントを与えた。
７０ＱｈｐのＰｕｖ Ｉｔフラグメントを含有するこれ
らの８個のプラスミドをさらにＳａｃ Ｉ 、ＢｃｏＲ
ＶおよびＢｇｌＩ［で消化した。これらの酵素はＲＥＶ
遺伝子を含有するプラスミドを切断するだけであろう。
らの８個のプラスミドをさらにＳａｃ Ｉ 、ＢｃｏＲ
ＶおよびＢｇｌＩ［で消化した。これらの酵素はＲＥＶ
遺伝子を含有するプラスミドを切断するだけであろう。
ＢｃｏＲＶとＢｇｌ Ｉｆは一度切断されるだけである
。従って、各々の切断はプラスミドを線状化するにちが
いない。Ｓａｃ Ｉはこの遺伝子の開始点と終止点付近
で切断し、３５０ｂｐのフラグメントを与えねばならな
い。これらのプラスミドの制限消化物を１％アガロース
ゲルで分離した。７００ｂｐのＰｕｖ ＩＩフラグメン
ト含有プラスミドは、ａ）ＢｃｏＲＶとＢｇｌ■で線状
化され、ｔ））Ｓａｃｌによって３５０ｂｐのフラグメ
ントを与えた。
。従って、各々の切断はプラスミドを線状化するにちが
いない。Ｓａｃ Ｉはこの遺伝子の開始点と終止点付近
で切断し、３５０ｂｐのフラグメントを与えねばならな
い。これらのプラスミドの制限消化物を１％アガロース
ゲルで分離した。７００ｂｐのＰｕｖ ＩＩフラグメン
ト含有プラスミドは、ａ）ＢｃｏＲＶとＢｇｌ■で線状
化され、ｔ））Ｓａｃｌによって３５０ｂｐのフラグメ
ントを与えた。
このＲＥＶ挿入挿入画方ともＤＮＡ塩基配列決定によっ
て分析した。この結果、ＲＥＶ遺伝子が完全に合成され
たことが確認された。しかしながら、ヌクレオチド配列
中に数個の塩基の置換する突然変異体が観察された。こ
れらの突然変異体は、残基１０３におけるＣ→Ｔの塩基
置換、残基１８１におけるＴ−Ｃの塩基置換、残基１８
６のＴ塩基の欠損（フレームシフト）および残基２３５
におけるＧ塩基の挿入（フレームシフト）を含む。
て分析した。この結果、ＲＥＶ遺伝子が完全に合成され
たことが確認された。しかしながら、ヌクレオチド配列
中に数個の塩基の置換する突然変異体が観察された。こ
れらの突然変異体は、残基１０３におけるＣ→Ｔの塩基
置換、残基１８１におけるＴ−Ｃの塩基置換、残基１８
６のＴ塩基の欠損（フレームシフト）および残基２３５
におけるＧ塩基の挿入（フレームシフト）を含む。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、１０３位の突然変異周辺
の２０塩基（残基９１〜１１０）に対応して合成された
。プラスミドｐＲＢＶ１ はデオキシウラシルを含有す
る一本鎮鋳型として単離された。特定部位の突然変異誘
発は、１０３位の突然変異を修復するために試験管内で
実施された。他の突然変異も特定部位の突然変異誘発に
よって同様に修復された。
の２０塩基（残基９１〜１１０）に対応して合成された
。プラスミドｐＲＢＶ１ はデオキシウラシルを含有す
る一本鎮鋳型として単離された。特定部位の突然変異誘
発は、１０３位の突然変異を修復するために試験管内で
実施された。他の突然変異も特定部位の突然変異誘発に
よって同様に修復された。
突然変異誘発を実施した後のＤＮＡ塩基配列決定は最終
的なＲＥＶ配列が修復されたことが確認された。
的なＲＥＶ配列が修復されたことが確認された。
この発明の方法によって数々の利点が提供される。
より少ないオリゴヌクレオチド類が合成に必要であるに
すぎない。４００ｂｐのｄｓ ＤＮＡについて遺伝子の
各鎖に対応する２つの長いオリゴヌクレオチド類と２つ
の短い合成ブライマー類が合成に必要とされるにすぎな
い。それらは、脱塩後の粗合成ブロスから直接使用され
る。
すぎない。４００ｂｐのｄｓ ＤＮＡについて遺伝子の
各鎖に対応する２つの長いオリゴヌクレオチド類と２つ
の短い合成ブライマー類が合成に必要とされるにすぎな
い。それらは、脱塩後の粗合成ブロスから直接使用され
る。
標的ｄｓ ＤＮＡ配列は、発現を増強するのに好ましい
アミノ酸コドンならびにクローニングおよびＤＮＡ塩基
配列決定による特性決定のために都合のよい制限部位を
含ませることができる。
アミノ酸コドンならびにクローニングおよびＤＮＡ塩基
配列決定による特性決定のために都合のよい制限部位を
含ませることができる。
標的ｄｓ ＤＮＡは、はんの数時間で完全に増幅するこ
とができる。
とができる。
構築のエラーは、ファージ複製開始点を含有するプラス
ミド中に標的ｄｓ ＤＮＡ配列を挿入した後、突然変異
を誘発することによって修復することができる。
ミド中に標的ｄｓ ＤＮＡ配列を挿入した後、突然変異
を誘発することによって修復することができる。
遺伝子は、合成遺伝子産物（タンパク質）が宿主細胞に
毒性を有する場合には、生ずる可能性のある問題を避け
るためにプラスミド遺伝子発現系を有する翻訳枠外で構
成することができる。この遺伝子は後に突然変異誘発に
よって枠（フレーム）内に入れることができる。
毒性を有する場合には、生ずる可能性のある問題を避け
るためにプラスミド遺伝子発現系を有する翻訳枠外で構
成することができる。この遺伝子は後に突然変異誘発に
よって枠（フレーム）内に入れることができる。
遺伝子は新規なキメラ遺伝子を作出する第二遺伝子と枠
内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）遺伝子との融合物として直接合
成することができる。
内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）遺伝子との融合物として直接合
成することができる。
合成遺伝子はサブクローニング工程を必要とすることな
く特定部位の突然変異誘発によって直接変異することが
でき、タンパク質の構造、機能研究をより簡便に行うこ
とを可能にする。
く特定部位の突然変異誘発によって直接変異することが
でき、タンパク質の構造、機能研究をより簡便に行うこ
とを可能にする。
タンパク質の機能領域またはタンパク質ドメインに対応
する遺伝子部分および遺伝子のエクソン領域が都合よく
合成される。
する遺伝子部分および遺伝子のエクソン領域が都合よく
合成される。
生化学、酵素、製薬学、ワクチン、診断試薬または農業
で使用することができるタンパク質をコードする遺伝子
または遺伝子もしくはキメラ遺伝子部分が都合よく合成
される。
で使用することができるタンパク質をコードする遺伝子
または遺伝子もしくはキメラ遺伝子部分が都合よく合成
される。
第１図は、二本鎖ＤＮＡ配列の構築を行う上でどのよう
にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されるかを略
図的に示す。 第２図は、この発明の方法を具体的に説明するのに使用
された天然および合成旧Ｖ−Ｉ ＲＥＶ遺伝子のＤＮＡ
配列を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １ ・３ −４ 。 −５−一二一一 下Ｓ＊ ４（不完全な配列） ２ □ ・事 上部鎖 ５゛□３゜ 先金な合成遺伝子 ＧＣＴ ＴＣＣ （ｉＧＴ ＴＣＡ Ｓ・ｅｌ ＣＴＧ ＾＾＾ ００丁 ＧＴＴ
ＧＡＧ ＣＴＣＣＴＣＡＡＧ ＧＣＡ ＧＴＣＴ
Ｇ ＡＧＡ ＣＴＣ ＾＾＾ ＡＴＣＡＡＧ ＴＴＣＣＴＧ ＴＡＣＣＡＧ ＴＣＣＣＣＧ Ｃ
ＣＧ ＣＣＧ ＾＾ＣＴＴＴ ＣＴＣＴＡＴ
ＣＡＡ ＡＧＣＡＡＣＣＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣＡ
ＡＴＫｏｎｌ
Ｂｓ５ＨＶ Ｉ＋＾ＧＧ
ＧＡＡ １５０ＡＧＡ Ａ
ＧＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｇ
ＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＧＡεｃｏＲＶ ＣＡＣＡＴＡ ＴＣＣＣＧＴ ＣＴＧＣＡ
Ｇ ＡＴＣＣＡＴ ＴＣＧ ＡＴＴ ＡＧＴ
ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＴＣＣＴＴＳｅｌｌ
εＢ＋ＧＴＴ ＣＣＧ
ＣＴＡ ＣＣＧ ＣＴ：
Ｇ ＧＡＡ ２４０ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＴＴ
ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＣＣＧ ＣＴＴ
ＧＡＧ ＡＧＡＣＴＧ ＣＴＧ
ＧＡＡ ＧＧＣＣ
ＴＴ ＡＣＴ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＧＴ Ａ
ＡＣＧＡＧ ＧＡＴ ＴＧＴ ＧＧＡｓｏｕ １ ＴＣＣＧＣＡ ＡＣＴ ＧＧＣＧＴＴ Ｇ
ＧＣＴＣＡ ＣＣＧＡＣＴ ＴＣＴ ＧＧＧ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＧＡ
ＡＧＣＣＣＴｇ１ｍｌ ＣＡＧ ＡＴＣＧＴＴ ＴＣＡ ＣＣＧ
ＡＣＴ ＡＴＣＣＴＧＣＡＡ ＡＴＡ ＴＴ
Ｇ ＧＴＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＣ
Ａ ＡＴＡ ＴＴＧＮａｒ＋ ＧＡＡ ＧＧＣＧＣＣ３６１ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＡＡ
ＧＡＡ ＴＡＧＦＩＧ。 手 続 補 正 書（方式） 事件の表示 平成２年特許願第１７０３４１号 ２゜ 発明の名称 試験管内遺伝子合成 ３゜ 補正をする者 事件との関係
にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されるかを略
図的に示す。 第２図は、この発明の方法を具体的に説明するのに使用
された天然および合成旧Ｖ−Ｉ ＲＥＶ遺伝子のＤＮＡ
配列を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １ ・３ −４ 。 −５−一二一一 下Ｓ＊ ４（不完全な配列） ２ □ ・事 上部鎖 ５゛□３゜ 先金な合成遺伝子 ＧＣＴ ＴＣＣ （ｉＧＴ ＴＣＡ Ｓ・ｅｌ ＣＴＧ ＾＾＾ ００丁 ＧＴＴ
ＧＡＧ ＣＴＣＣＴＣＡＡＧ ＧＣＡ ＧＴＣＴ
Ｇ ＡＧＡ ＣＴＣ ＾＾＾ ＡＴＣＡＡＧ ＴＴＣＣＴＧ ＴＡＣＣＡＧ ＴＣＣＣＣＧ Ｃ
ＣＧ ＣＣＧ ＾＾ＣＴＴＴ ＣＴＣＴＡＴ
ＣＡＡ ＡＧＣＡＡＣＣＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣＡ
ＡＴＫｏｎｌ
Ｂｓ５ＨＶ Ｉ＋＾ＧＧ
ＧＡＡ １５０ＡＧＡ Ａ
ＧＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｇ
ＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＧＡεｃｏＲＶ ＣＡＣＡＴＡ ＴＣＣＣＧＴ ＣＴＧＣＡ
Ｇ ＡＴＣＣＡＴ ＴＣＧ ＡＴＴ ＡＧＴ
ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＴＣＣＴＴＳｅｌｌ
εＢ＋ＧＴＴ ＣＣＧ
ＣＴＡ ＣＣＧ ＣＴ：
Ｇ ＧＡＡ ２４０ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＴＴ
ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＣＣＧ ＣＴＴ
ＧＡＧ ＡＧＡＣＴＧ ＣＴＧ
ＧＡＡ ＧＧＣＣ
ＴＴ ＡＣＴ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＧＴ Ａ
ＡＣＧＡＧ ＧＡＴ ＴＧＴ ＧＧＡｓｏｕ １ ＴＣＣＧＣＡ ＡＣＴ ＧＧＣＧＴＴ Ｇ
ＧＣＴＣＡ ＣＣＧＡＣＴ ＴＣＴ ＧＧＧ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＧＡ
ＡＧＣＣＣＴｇ１ｍｌ ＣＡＧ ＡＴＣＧＴＴ ＴＣＡ ＣＣＧ
ＡＣＴ ＡＴＣＣＴＧＣＡＡ ＡＴＡ ＴＴ
Ｇ ＧＴＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＣ
Ａ ＡＴＡ ＴＴＧＮａｒ＋ ＧＡＡ ＧＧＣＧＣＣ３６１ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＡＡ
ＧＡＡ ＴＡＧＦＩＧ。 手 続 補 正 書（方式） 事件の表示 平成２年特許願第１７０３４１号 ２゜ 発明の名称 試験管内遺伝子合成 ３゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の各工程を含んでなる標的二本鎖ＤＮＡ配列の調
製方法： Ａ）ｉ）限定されたオリゴヌクレオチド鎖長を有するＤ
ＮＡオリゴヌクレオチド類とそれらの不完全な配列、ま
たは ｉｉ）前記不完全な配列のみ、をそれぞれ含んでなる第
一合成ブロスおよび第二合成ブロスを調製する工程であ
って、かつその第一合成ブロスが標的二本鎖ＤＮＡ配列
の上部鎖を含むＤＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでお
り、そしてその第二合成ブロスが前記標的ＤＮＡ配列の
下部鎖を含むＤＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでいる
ような前記工程、 Ｂ）前記第一合成ブロスと第二合成ブロスを共に混合す
る工程、 Ｃ）Ａ）のＤＮＡオリゴヌクレオチド類の３′末端に相
補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー類を加
える工程、 Ｄ）Ｃ）の混合物にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）処
理を施すことにより、標的二本鎖ＤＮＡ配列の濃度を指
数的に増幅する工程、 Ｅ）前記標的二本鎖ＤＮＡ配列を単離する工程、Ｆ）フ
ァージの複製開始点を有するクローニングベクターに前
記標的二本鎖ＤＮＡ配列をクローニングする工程、 Ｇ）突然変異を確認するために前記標的二本鎖ＤＮＡ配
列の塩基配列を決定する工程、ならびにＨ）特定部位の
突然変異誘発によってそれぞれの突然変異体を修復する
工程。 ２、次の各工程を含んでなる４００個を越える塩基対を
有する標的二本鎖ＤＮＡ配列の調製方法：Ａ）ｉ）限定
されたオリゴヌクレオチド鎖長を有するＤＮＡオリゴヌ
クレオチド類とそれらの不完全な配列、または ｉｉ）前記不完全な配列のみ、をそれぞれ含んでなる第
一合成ブロスおよび第二合成ブロスを調製する工程であ
って、かつ ａ）それぞれ通し番号が付いた系列の前記第一ブロスが
前記標的二本鎖ＤＮＡ配列の上部鎖の限定された部位に
等価なりＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでおり、 ｂ）それぞれ通し番号が付いた系列の前記第二ブロスが
前記標的二本鎖ＤＮＡ配列の限定された部位に等価なり
ＮＡオリゴヌクレオチド類を含んでおり、そして ｃ）全系列が一緒になって完全な標的二本鎖ＤＮＡ配列
に等価となるような前記工程、 Ｂ）それらの系列の各番号が付いた第一合成ブロスと第
二合成ブロスを一緒にして個々に混合する工程、 Ｃ）各混合物における前記ＤＮＡオリゴヌクレオチド類
の３′末端に対して相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオ
チドプライマー類を前記系列の各混合物に加える工程、 Ｄ）各混合物にポリメラーゼ連鎖反応処理を施すことに
より各混合物中で標的二本鎖ＤＮＡ配列等価物の濃度を
指数的に増幅する工程、 Ｅ）それぞれの系列の各混合物から標的二本鎖ＤＮＡ配
列等価物を単離する工程、 Ｆ）ファージ複製開始点を有するクローニングベクター
に前記等価物をそれぞれクローニングする工程、 Ｇ）どのような突然変異体か確認するために各等価物の
塩基配列を決定する工程、 Ｈ）特定部位の突然変異誘発によっていずれかの突然変
異体を修復する工程、 Ｉ）クローニングベクターから前記系列の各等価物を取
り出す工程、ならびに Ｊ）全系列の等価物を一緒に連結して４００個を越える
塩基対を有する標的二本鎖ＤＮＡ配列を形成する工程。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37356089A | 1989-06-30 | 1989-06-30 | |
| US373560 | 1989-06-30 | ||
| US38705489A | 1989-07-28 | 1989-07-28 | |
| US387054 | 1989-07-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03180183A true JPH03180183A (ja) | 1991-08-06 |
| JPH0675506B2 JPH0675506B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=27006227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2170341A Expired - Lifetime JPH0675506B2 (ja) | 1989-06-30 | 1990-06-29 | 試験管内遺伝子合成 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0406937A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0675506B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1084889A (zh) * | 1993-05-19 | 1994-04-06 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 天花粉蛋白合成基因 |
| US6479262B1 (en) | 2000-05-16 | 2002-11-12 | Hercules, Incorporated | Solid phase enzymatic assembly of polynucleotides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE429825B (sv) * | 1982-05-28 | 1983-10-03 | Lars Billing | Spikmatningsanordning |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5132215A (en) * | 1988-09-15 | 1992-07-21 | Eastman Kodak Company | Method of making double-stranded dna sequences |
-
1990
- 1990-06-23 EP EP19900201671 patent/EP0406937A3/en not_active Withdrawn
- 1990-06-29 JP JP2170341A patent/JPH0675506B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0406937A2 (en) | 1991-01-09 |
| JPH0675506B2 (ja) | 1994-09-28 |
| EP0406937A3 (en) | 1992-01-22 |
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