JPH03180188A - システインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はシスティンの製造法に関し、更に詳細には耐ア
ルカリ性ヒドロゲナーゼ活性を有する酵素液を用いて、
シスチンからシスティンを高収率で生産する方法に関す
る。

〔従来の技術及び〜発明が解決しようとする課題〕シス
ティ・ンはメルカプト基を有するアミノ酸であり、医薬
、医薬原料、食品添加物、飼料添加物及び化粧品添加物
等多方面に使用され、特に近年はコールドパーマ液の原
料として需要が増加している。

従来、システィンの製造法としては天然物からの抽出法
、有機合成法、発酵法及び酵素法が知られている。天然
物からの抽出法は、毛髪等のシスチンやシスティンの含
有の高い天然物を塩酸で加水分解し、生じたアミノ酸混
液より抽出分離したシスチンを電気還元してシスティン
を得るものである。しかしこの抽出法は電極反応により
他の不純物が生成するため、特に医薬、食品添加物とし
て用いるには適していない。また電気還元には多量の電
力及び電解質を必要とするため高コストになるという難
点があった。有機合成法には実用的なものは開示されて
おらず、これらの方法に代えて発酵法（特開昭５９−２
８４８５号）が提案され・ているが、原料が高価である
こと、システィンの生産量が充分でないこと、菌が生産
する不純物に対する精製が困難であること、菌の管理が
むずかしいこと等の難点がある。また酵素法（特開昭６
３−７７９０号）も提案されているが、システィンの生
産量が低く有効な製造法とはなっていない。

そこで本発明者らは、さきにヒドロゲナーゼ活性を有す
る酵素液の存在下、シスチンに水素を反応させてシステ
ィンを製造する方法（特願昭６３−２４７０５２号）を
開発した。この製造方法によれば、シスチンからシステ
ィンを高収率、高純度に製造することができる。しかし
ながら、この方法は反応速度に難点があり、工業的製法
として必ずしも充分満足し得るものではなかった。

従って、より工業的に有利なシスティンの製造方法の開
発が熱望されていた。

〔課題を解決するための手段〕

上記実情に鑑み本発明者らは、従来のヒドロゲナーゼ活
性を有する酵素液による反応はヒドロゲナーゼを得た微
生物の最適ｐ）ｌ付近で行なうことが好ましいという考
えに拘泥することなく鋭意研究を行なった結果、特定の
微生物から得られる酵素液が当該微生物の最適ｐＨ付近
でないアルカリ性領域でも反応が良好に行なわれること
、更にこの酵素液の存在下、アルカリ領域にてシスチン
に水素を反応させれば工業的に有利にシスティンを製造
できることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は耐アルカリヒドロゲナーゼ活性を有
する酵素液の存在下、アルカリ性領域にてシスチンに水
素を反応させることを特徴とするシスティンの製造法を
提供するものである。

本発明方法の原料であるシスチンはＬ体、Ｄ体又はＤＬ
体のいずれであってもよい。

本発明で使用する酵素液は耐アルカリ性ヒドロゲナーゼ
活性を有するものであれば特に限定されず、耐アルカリ
性ヒドロゲナーゼを溶解させた液でも、耐アルカリ性ヒ
ドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物でもよい。耐
アルカリ性ヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物
としては、例えばクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ）、大腸菌、硫酸還元菌、メタン菌、水素細菌、
アゾトバクタ−（＾ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）等に属する
菌の培養物が挙げられる。かかる培養物としては例えば
、これらの菌を常法に・より培養し、遠心分離機等で集
菌したものを超音波破壊処理し、遠心分離した上澄を用
いるのが好ましい。酵素液の添加量は、シスチンを含む
緩衝液に対するタンパク換算で約０．０１ｗｔ％以上、
特に約０．０５ｗｔ％以上、更に約０．０５〜ｔ　Ｏｗ
ｔ％が好ましい。反応は、反応速度を向上させるため水
素分圧が高い状態で行なうのが好ましい。なお、耐アル
カリ性ヒドロゲナーゼを得た微生物が嫌気性菌である場
合には、気相を嫌気性すなわち酸素を含まない状態にす
る必要がある。

反応温度は、微生物の培養物を用いる場合、該微生物の
最適生育温度の約８時間以内、特に約８時間以内とする
ことが好ましい。例えばクロストリジウム　サーモアセ
チカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ４５〜６５℃、メタノ
サルシナ　パルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　
ｂａｒｋｅｒｉ）ＤＳＭ　８０４を用いた場合は約３２
〜４２℃が好ましい。反応時間はバッチ法で反応させた
場合、通常約８時間以内であるが、他の条件の変更に応
じて適切な反応時間を選択できる。また生産されたシス
ティンを連続的に取り出すことにより、反応を連続して
行なうこともできる。

本発明は反応をアルカリ性領域において行なうことが特
徴であり、これによりシスチンの溶解度を増加させ、反
応を速めることができる。ここでアルカリ性領域とはｐ
Ｈ約８以上である領域をいうが、好ましくはシスチンの
溶解度が充分となるｐＨ約９以上である。反応液のｐＨ
は酵素液が失活しない限り高くすることができるが、通
常約１２以下とすることが好ましい。

本発明においては、補酵素又はメチルビオロゲンを加え
れば、反応が更に促進される。補酵素としては、例えば
Ｆ４２０　［Ｎ−（Ｎ−［０−［５−（８−ヒドロキシ
−５−デアザイソアロキサジン−１０−イル）−２，３
，４−）リヒドロキシー４−ペントキシヒドロキシホス
フィニル］−Ｌ−ラクチル〕−γ−Ｌ−グ、ルタミル〕
−Ｌ−グルタミン酸〕、Ｎ＾０＋〔ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド〕等が用いられる。補酵素またはメ
チルビオロゲンの添加量は、シスチンを含む緩衝液に対
し約０．００５ＪＪｍｏＩｌ／　１以上、特ニ約０．０
１ｐｍｏｌｌ／１以上、更に約０．　Ｏｆμｍｏｌ　／
　１〜２０ｍｍｏｊ！／ｊ！が好ましい。

〔作用及び発明の効果〕

本発明は、次のような特有の効果をもつ産業上利用価値
の高いすぐれたシスティンの製造法である。

（１）蓄電等の天然物として自然界に安価で多数存在す
るシスチンを原料とすることができるので、低コストで
安定的にシスティンを製造することができる。

（２）従来の電気還元法では、多量の電力及び電解液を
必要とし、高コストになっていたが、本発明法ではきわ
めて低コストでシスティンを製造できる。

（３）従来の電気還元法では不可能であった医薬、食品
添加物として利用することのできる高純度のシスティン
を製造できる。

（４）　　シスチンの溶解度の高いアルカリ性において
反応を行なわせることができるため反応装置がきわめて
小型化でき、また生産性を飛躍的に向上させることがで
きる。

〔実施例〕

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが
、これらは単に例示の目的でかかげるものであって、本
発明がこれらに限定されるものではない。

実施例１ グリコースを単一炭素源とする最少培地で６０℃、ｐＨ
７，０の嫌気条件下でクロストリジウム　サーモアセチ
カムＡＴＣＣ３１４９０を４日間バッチ培養した。培養
物から遠心分離により菌体を集菌し、トリス塩酸塩緩衝
液で洗浄後、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼ
１を含む溶液で３７℃、９０分間反応させることにより
菌体を破壊し、遠心分離した上澄を酵素液とした。この
酵素液の製造及び保存はすべて嫌気的に行なった。この
酵素液ヲ、シスチン３　ｍｍｏｊ！　／　１の割合で含
む濃度５０　ｍｍｏｆ　／　Ｉｌ、ｐＨ９のトリス塩酸
塩Ｂ衝液４ｍｔ’に対してタンパク換算で３■の割合で
添加した。

気相をＨ，：Ｎ、＝３　：　１　　（溶量比）のガス３
気圧で封入し、温度５５℃で振とうしながら５時間反応
させた。ガイトンデ（Ｇａｉｔｏｎｄｅ）法を用いてシ
スティンの定量を行なったところシスチンのシスティン
への還元率は５０．２％であった。

比較例１ 酵素液を１２１℃にて１５分間加熱して、酵素活性を失
わせたものを酵素液の代わりに用いたこと以外は、実施
例１と同様にして実施した。この場合シスチンのシステ
ィンへの還元率は０．４％であった。

この結果、この比較例１と比較して、実施例１では酵素
反応によりシスチンからシスティンの還元が行なわれて
いることがわかる。

実施例２ メチルビオロゲンを０．１ｍｍｏ　１　／　１の割合で
添加し、反応時間を変化させたこと以外は実施例１と同
様に実施した。その結果を表１に示す。

表１ 実施例１と比較してメチルビオロゲンを添加することに
より反応が促進されていることがわかる。

参考例１ メタノールを単一炭素源とする最少培地で、３７℃、ｐ
Ｈ６，７の嫌気性条件下でメタノサルシナバルケＩＪ　
　ＤＳＭ　８０４を３日間培養した。培養物から遠心分
離により菌体を集菌し、トリス塩酸塩緩衝液で洗浄後、
冷却下超音波処理して菌体を破壊し、更に遠心分離した
上澄を酵素液とした。この酵素液の製造及び保存はすべ
て嫌気的に行なった。

この酵素液をシスチン３ｆｆｌＩＩＩ０１／１の割合で
含む濃度５０　ｍｍｏｊ！　／　１、ｐＨ７のしリス塩
酸塩緩衝液４ｍｌ！に対してタンパク換算で３■添加し
更にメチルビオロゲンを０．１ｍｍｏｊ！　／　１の割
合で添加した。

気相をＨ，：Ｎ２＝３　：　１　　（容量比）のガスで
３気圧に封入し、温度３７℃で振とうしながら２時間反
応させた。ガイトンデ（Ｇａｉｔｏｎｄｅ）法を用いて
システィンの定量を行なったところ、生産されたシステ
ィン量は１．Ｏｍｍｏ　１　／　Ｉｌ　、還元率は１６
．７％であった。

実施例２と比較して本方法では、１．０ｍｍｏｊ！のシ
スティンを得るために４０倍もの時間が必要であった。

また、本方法では、シスチンの溶解度が充分でなく、反
応液中にシスチン粒子が懸濁している状態であった。

参考例２ シスチン濃度を１　ｍｍｏｊ！　／　ｌ　ｓ反応時間を
６時間とした以外は参考例１と同様に実施したところ、
生産されたシスティン量は、０．９６ｍｍｏｊ！　／　
１、還元率は４８％であった。

実施例３ メタノールを単一炭素源とする最少培地で３０ｔ、ｐＨ
６，７の嫌気条件下でメタノサルシナバシルケ’）　Ｄ
ＳＭ　８０４を３日間培養した。培養物から遠心分離に
より集菌し、トリス塩酸塩緩衝液で洗浄後、冷却下超音
波処理して菌体を破壊し、更に遠心分離した上澄を酵素
液とした。この酵素液の製造保存はすべて嫌気的に行な
った。この酵素液をシスチン１ｍｍｏＩｌの割合で含む
ｐ）１９のトリス塩酸塩緩衝液４−及びシスチンｌ　＠
ｍｏｊ！　／　１の割合で含むｐＨ１０のグリシン水酸
化ナトリウム塩緩衝液４ｍｊ！に対してそれぞれタンパ
ク換算で３■の割合で添加した。気相をＨｓ：Ｎ＊＝３
　：　１　　（容量比）のガスで３気圧に封入し、温度
３７℃で振とうしながら２時間反応させた。生産された
システィン量をガイトンデ法を用いて定量したところ、
両方ともシスティン量２．　Ｏｍｍｏ　１　／　ｊ！　
、還元率１００％であった。参考例２と比較してアルカ
リ領域で反応させることにより反応が促進されているこ
とがわかる。

以 上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、耐アルカリヒドロゲナーゼ活性を有する酵素液の存
   在下、アルカリ性領域にてシスチンに水素を反応させる
   ことを特徴とするシステインの製造法。 ２、耐アルカリヒドロゲナーゼ活性を有する酵素液が、
   ヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物である請求
   項１記載のシステインの製造法。 ３、更に補酵素又はメチルビオロゲンを添加して反応さ
   せることを特徴とする請求項１又は２記載のシステイン
   の製造法。