JPH0346115B2

JPH0346115B2 -

Info

Publication number: JPH0346115B2
Application number: JP9947782A
Authority: JP
Inventors: Tadao Kobayashi; Takashi Udagawa; Teruya Shirata; Noboru Kurihara; Mitsuyoshi Nakamura; Hiroi Yoshii
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1982-06-10
Filing date: 1982-06-10
Publication date: 1991-07-15
Also published as: JPS58216692A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−含硫アミノ酸、即ちＬ−システイ
ンおよびＬ−シスチンの製造法に関する。従来、Ｌ−システイン（以下、システインと略
す）およびＬ−シスチン（以下、シスチンと略
す）は毛髪等のシステインやシスチンの含量の高
い天然物を鉱酸で加水分解し、生じたアミノ酸混
液よりシスチンとして単離取得し、システインは
このようにして得られたＬ−シスチンを還元して
製造されていた。これに対し、本出願人においては既に、２−ア
ミノ−チアゾリン−４−カルボン酸（以下、
ATCと記す。）を原料とし、微生物の作用を利用
してシステイン又はシスチンを製造する方法（特
開昭51−136619号公報参照）を開発した。この方法に於ては、ATCを含硫アミノ酸に変
換する能力を有する微生物が酵素源として利用さ
れ、この酵素は誘導酵素であるため、酵素誘導剤
として原料のATCが必要とされている。しかし
ながらATCは高価であり、原料の１部を酵素誘
導剤として使用することは経済的でなく、この方
法を工業的に実施し、含硫アミノ酸を安価に製造
するためには、酵素誘導剤として使用するATC
の量を削減し、かつ菌体の酵素活性を高くするこ
とが必要とされていた。そこで本発明者等は培養
液の酸素活性を高める方法を開発することを目的
として種々研究を重ねた結果、ATCの培地への
添加時期を微生物の対数増殖期、特に対数増殖期
の後半にすることによつてATCが大巾に削減で
きること、更に、培養して得られた培養液を30〜
45℃に少くとも１時間以上保持して熟成すること
によりATC水解活性が20〜40％増大することを
発見した。本発明はこの発見に基づいて完成され
たものである。本発明は次の(A)、(B)、(C)及び(D)の各工程を含有
してなる含硫アミノ酸の製造法に関する。 (A) ２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸を
水解してシステイン又はシスチンを生成する能
力を有する微生物を栄養培地で培養し、対数増
殖期にATCを添加して培養する工程 (B) 培養液を30〜45℃に少なくとも１時間以上保
持して熟成する工程 (C) 熟成した培養液に含まれる微生物をATCに
作用せしめてシステイン又はシスチンを生成せ
しめる工程 (D) 生成したシステイン又はシスチンを採取する
工程上記(A)工程に於て使用する微生物は、アクロモ
バクター、アルカリゲネス、バチルス、ブレビバ
クテリウム、エンテロバクター、エルビニア、エ
ツシエリヒア、フラボバクテリウム、ミクロコツ
カス、ミコプラナ、シユードモナス、サルシナあ
るいはセラチアの各属に属し、ATCを水解して
システイン又はシスチンを生成する能力を有する
微生物であり、その他自然界に存在する野生株、
公的な微生物保存機関に保存されている菌株或い
はそれらより人工的に変異誘導した微生物群よ
り、ATCからのシスチン又は（及び）システイ
ン生産能の有無を調べることによつて分離採取さ
れるものも使用できる。より具体的に例示するならば次の如き菌株があ
げられる：サルチナ・ルテアAJ−1217（Sarcina
lutea）ATCC272、アクロモバクター・デルマル
バアAJ−1983（Achremebaeter delmarvae）
FERM−P3483、アルカリゲネス・デニトリフイ
カンスAJ−2553（Alcaligenes denitrificans）
ATCC15173、バチルス・ブレビスAJ−1982
（Bacillus brevis）ATCC8185、ブレビバクテリ
ウム・フラバムAJ−1516（Brevibaeterium
flavum）ATCC13826、エンテロバクター・アエ
ロゲネスAJ−2643（Enterobacter
aerogenesIAM1019）FERM−P2764FERM BP
−321、エルビニア・カロトボラAJ−2753
（Erwinia carotovoraCCM873）FERM−P2766、
シユードモナス・チアゾリノフイラムAJ−3854
（Pseudomonas thiazolinophilum）FERM−
P2810FERM BP−322、シユードモナス・デス
モリチカAJ2368（P.demolytica）FERM−
P2816FERM BP−323、エツシエリヒア・コリ
カAJ−2592（Escherichiacoli IAM1132）FERM
−P2763、ミクロコツカス・ソドネンシスAJ−
1753（Micrococcus sodonensis）ATCC11880、
ミコプラナ・ジモルフアAJ−2809（Mycoplana
dimorpha）ATCC4249、セラチア・マルセツセ
ンスAJ−2698（Serratia marcescens IAM1206）
FERM−P2765、フラボバクテリウム・アシドフ
イクムAJ−2494（Flavobacterium acidoficum）
ATCC8366、プソドモナス・オバリスAJ−2236、
（Pseudomenas ovalis IAM1454）FERM−
P2762FERM BP−1328等が挙げられる。微生物を培養するための培地は炭素源、窒素
源、無機イオン、更に要すれば有機微量栄養素を
適宜含有する培地であり、例えば、炭素源として
グルコース、シユクロース、キシロース、糖蜜等
の糖類、酢酸等の有機酸、エタノール、グリセロ
ール、メタノール等のアルコール類など、窒素源
として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムな
ど、有機栄養源として、酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、コーン・ステイープリカーなど、無機
イオンとして、マグネシウム、鉄、マンガン、カ
リウム、ナトリウム、リン酸などのイオンが適宜
用いられる。微生物の培養法は常法に従つて行えば良く、上
記培地のPHを６〜９とし、20〜40℃で好気的に培
養し、対数増殖期、特に対数増殖期の後半、更に
具体的には後期第１表に示す組成の培地を用いて
30℃で４〜８時間培養した時点、菌体濃度で示せ
ば培養液を1/26に希釈した液の562nｍに於る吸
光度が0.4〜0.7に達した時点で、培養液にATCを
0.05〜0.6％、望ましくは0.05〜0.1％添加し、更
に培養して酵素活性の高い培養液を得る。このよ
うに対数増殖期を選択することによつて酵素誘導
体のATCの量を1/5〜1/10に削減することができ
る。 (B)工程に於ては、上記培養液を30〜45℃の温度
に少くとも1.0時間以上、望ましくは1.0〜3.0時間
保持して培養液の熟成を行う。この熟成期間中は
培養液をゆるやかに撹拌することが望ましく、こ
の熟成工程を導入することにより培養液の酸素活
性は20〜40％増大し、かつ、安定した酵素活性が
得られる。 (C)工程は上記熟成した培養液に含まれる微生物
をATCに作用せしめてシステインはシスチンを
生成せしめる工程であり、この工程に於ては、熟
成した培養液に含まれる微生物を酵素源として使
用する。即ち、熟成した培養液、培養液から分離
した分離菌体、洗滌生菌体、凍結乾燥体、アセト
ン乾燥菌体、物理的、化学的もしくは生化学的に
破壊された菌体、抽出液、粗精製物、精製物、精
製蛋白標晶、または菌体もしくは精製処理物の固
定化物などを酵素源として使用する。原料であるATCは合成法にて供給されるもの
で、Ｄ−体、Ｌ−体、ラセミ体のいずれもが使用
される。基質濃度は、バツチ式、連続式によつて異なる
が、バツチ式では一般に水性媒質中0.1〜30％、
好ましくは0.5〜10％程度で連続式では、これよ
りやや濃度を低下させた方が好ましい。反応は、普通、水性媒質中で15〜60℃、好まし
くは30℃〜50℃附近で、PH＝６〜10、好ましくは
7.0〜9.5附近で行なわれる。反応時間は、静置、
撹拌、流下等の手段あるいは酵素標品の形態、力
価によつて異なつてくるので一様ではないが、バ
ツチ法では通常10分〜72時間程度である。反応が進行すると、反応液中にシステインとシ
スチンが共存するのであるが、通常システインは
空気中の酸素により酸化されてシステンに変化し
易く、時間がたつにつれてシスチンの量が増大す
る。しかしながら、反応条件等の変更によつてシ
ステインとシスチンの濃度比を変えることも可能
である。なお、反応液にヒドロキシルアミンやセ
ミカルバジドを添加することによつてシステイン
及び／またはシスチンの収率を向上することがで
きる。 (D)工法に於るシステイン及びシスチンの採取法
は常法に従つて行えば良く、例えば、通気酸化に
より大部分をシスチンとし、その難溶性を利用し
て晶析する方法によりＬ−シスチンを得ることが
できる。また、システインにする場合は電気還元
による通常の方法で処理して、システインとして
採取することができる。シスチンとシステインの定量は、液体クロマト
グラフイーと微生物定量法によつて行われる。後
者は乳酸菌ロイコノストツク・チトロボラム
ATCC8081を用いる方法であるが、この菌はシス
チンとシステインの双方によつて何等の生育を与
えられるので両アミノ酸の和を定量することにな
り、通常シスチンとして表示される。なお、この
菌はＤ体のシスチン、システインでは生育できな
い。以下、実施例にて説明する。実施例１第１表に示す組成の培地1.0を2.0容のジヤ
ーフアーメンターに張り込み、120℃で15分間加
熱・滅菌した。

【表】これにシユードモナス・デスモリチカ
FERM−P2816FERM BP−323の種培養液50ml
を接種し、30℃にて通気撹拌培養（1/2VVM、
600rpm）を開始した。培養期間中培養液のPHは
6.5にコントロールし、培養開始時、及び一定時
間培養後、培養液にDL−ATCを0.1％添加して
培養を続け、培養開始後12時間で培養を終了し
た。得られた培養液にDL−ATC5.0％、KH₂PO₄
0.1％、FeSO₄・7H₂O 0.03％を添加し、PHを8.0
に調節後、30℃に24時間保持して反応を行つた。
反応終了後各反応液を通気下で激しく撹拌しシス
テインを酸化させてシスチンに変換せしめた。この反応液に6N−NaOH溶を加えてシスチン
を溶解し、CPK−08（強酸性カチオン交換樹脂）
カラムを用いる高速液体クロマトグラフイーにて
シスチンを定量した。その結果を第２表に示す。

【表】第２表に示すように、菌体濃度が0.35〜0.60の
時期、即ち、対数増殖期間中に添加する場合に最
も活性が高いことが確認された。同様の方法で、
培養６時間後にATCを添加し再に４時間通気撹
拌して1.0の培養液を得た。この培養液を５ml
宛に分けて、夫々10℃から60℃の温度に１時間保
持して熟成を行つた。この熟成培養液に下記第３
表に示す基質溶液5.0mlを加えて混合し、30℃に
３時間保持して酸素反応を行つた。

【表】反応終了後、6N−NaOH溶液を5.0ml添加して
良く撹拌し、高速液体クロマトグラフイーにてシ
ステイン及びシスチンの生成量を定量した。その
結果を第４表に示す。

【表】第４表に示すように、熟成温度は30〜45℃の間
が良いことが確認された。同様にして上記培養液を40℃に一定時間保持
し、保持時間と熟成効果との関係を調べた。その
結果を第５表に示す

【表】

【表】第５表に示す結果から保持時間は１〜４時間で
充分の熟成効果が得られることがわかる。実施例２実施例１と同様の方法でシユードモナス・デス
モリチカFERM−P2816FERM BP−323を培養
し、培養６時間培養後、DL−ATCを0.1％添加
して、再に４時間通気撹拌培養を行つた。得られ
た培養液を40℃に３時間保持して熟成を行い、次
いで遠心分離して菌体を集めた。菌体を0.1Mリ
ン酸緩衝液で洗浄しこれを第３表に示す基質溶液
1.0に懸濁液を36℃に24時間保持して反応を行
つた。反応液を通気下で激しく撹拌してシステイ
ンを酸化してシスチン変換せしめ、結晶として析
出せしめた。析出した結晶を濾別し、1N−HC1
に溶解し、6N−NaOHを加えて中和し、シスチ
ンを再結せしめ、8.5ｇのシスチンの結晶を採取
した。この結晶はNMRスペクトル、Ｘ線回析
像、比旋光度のデータからＬ−シスチンと同定さ
れた。尚、旋光度純度は94.5％であつた。実施例３第１表に示す組成の培地を調製し、500ml容振
盪フラスコに50ml宛分注し、120℃にて10分間加
熱した。この培地に下記第６表に示す試験菌株を
１白金耳接種し30℃で24時間振盪培養を行つた。
培養開始時及び対数増殖期（培養開始後8.0時間）
にDL−ATCを0.1％添加し更に6.0時間培養を行
つた。対数増殖期にDL−ATCを添加して得られ
た培養液を２分し、一方については40℃に３時間
保持して熟成を行つた。夫々の培養液5.0mlに第
３表の基質溶液5.0mlを混合し、30℃に4.0時間保
持して反応を行つた。各反応液中にシステイン及
びシスチンを高速液体クロマトグラフイーで定量
した。その結果を第６表に示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１次の(A)、(B)、(C)及び(D)の各工程を含有してな
る含硫アミノ酸の製造方法。 (A) ２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸を
水解してＬ−システイン又はＬ−シスチンを生
成する能力を有する微生物を栄養培地で培養
し、対数増殖期に２−アミノ−チアゾリン−４
−カルボン酸を添加して培養する工程。 (B) (A)工程で得られた培養液を30〜45℃に少なく
とも1.0時間以上保持して熟成する工程。 (C) 熟成培養液に含まれる微生物を２−アミノ−
チアゾリン−４−カルボン酸に作用させてＬ−
システイン又はＬ−シスチンを生成せしめる工
程。 (D) Ｌ−システイン又はＬ−シスチンを採取する
工程。