JPH03183477A - ハイブリドーマ - Google Patents
ハイブリドーマInfo
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- JPH03183477A JPH03183477A JP1322118A JP32211889A JPH03183477A JP H03183477 A JPH03183477 A JP H03183477A JP 1322118 A JP1322118 A JP 1322118A JP 32211889 A JP32211889 A JP 32211889A JP H03183477 A JPH03183477 A JP H03183477A
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- Japan
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- human
- hybridoma
- fusion
- myeloma cell
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は、ヒト型モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマを高頻度に作製し得る新規親細胞株、（ヒト・
マウス）へテロハイブリドーマに関するものである。
リドーマを高頻度に作製し得る新規親細胞株、（ヒト・
マウス）へテロハイブリドーマに関するものである。
「従来の技術」
抗体を、予防、治療または診断を目的としてヒトに投与
する場合、ヒト型モノクローナル抗体は、マウスモノク
ローナル抗体に比べ抗原性に関する問題が少ないと考え
られており、臨床治療上利用範囲が非常に大きい。
する場合、ヒト型モノクローナル抗体は、マウスモノク
ローナル抗体に比べ抗原性に関する問題が少ないと考え
られており、臨床治療上利用範囲が非常に大きい。
ところで、ヒト型モノクローナル抗体の作製は、マウス
の場合と比べて、融合効率が悪い、抗体産生の安定性が
悪い、抗体を大量に得ることが困難である。免疫された
リンパ球が自由に得られない、ＩｇＧタイプの抗体を得
ることが難しいなどの不利な点があった。
の場合と比べて、融合効率が悪い、抗体産生の安定性が
悪い、抗体を大量に得ることが困難である。免疫された
リンパ球が自由に得られない、ＩｇＧタイプの抗体を得
ることが難しいなどの不利な点があった。
これらを克服するために、ヒトの親細胞株を改良する方
法、例えば（ヒト・マウス）へテロミエローマを親細胞
として用いる方法［プロシーディング オブ ナショナ
ル アカデミ−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ８０゜７３０８
、 ｆ１９８３＋等］、又はマウスミエローマを親細
胞として用いる方法［ジャーナル オブ クリニカル
インベステイゲーション（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
法、例えば（ヒト・マウス）へテロミエローマを親細胞
として用いる方法［プロシーディング オブ ナショナ
ル アカデミ−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ８０゜７３０８
、 ｆ１９８３＋等］、又はマウスミエローマを親細
胞として用いる方法［ジャーナル オブ クリニカル
インベステイゲーション（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
Ｉｎｖｅｓｔ、１７０．１３０６． １１９８２１等］
などが考えられている６その他に、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で抗原刺激することにより特異抗体産生バイプリドーマ
を効率よく得る方法［ヨーロピアン ジャーナル オブ
イミュノロジー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１４．２３． ｆ１９８４１等］、又は向リンパ性ウ
ィルスであるエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）で
抗体産生細胞を形質転換する方法［サイエンス（５ｃｉ
ｅｎｃｅｌ １９９゜１４３９、 ｆ１９７８１等］
、更にはＥＢＶ形質転換細胞を親細胞と融合する方法［
プロシーディング 才ブ ナショナル アカデミ−才ブ
サイエンスｆＰｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡＩ ７９．６６５１． １１９８２１等
］などが試みられている。
などが考えられている６その他に、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で抗原刺激することにより特異抗体産生バイプリドーマ
を効率よく得る方法［ヨーロピアン ジャーナル オブ
イミュノロジー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１４．２３． ｆ１９８４１等］、又は向リンパ性ウ
ィルスであるエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）で
抗体産生細胞を形質転換する方法［サイエンス（５ｃｉ
ｅｎｃｅｌ １９９゜１４３９、 ｆ１９７８１等］
、更にはＥＢＶ形質転換細胞を親細胞と融合する方法［
プロシーディング 才ブ ナショナル アカデミ−才ブ
サイエンスｆＰｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡＩ ７９．６６５１． １１９８２１等
］などが試みられている。
「発明が解決しようとする課題」
このようにヒト型モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマを高頻度に作製し得る親細胞株を得る試みが種
々なされているが、現在までのところ、以下の諸条件を
満足する親細胞株は得られていない、すなわち、親細胞
株に求められる諸条件とは、ａ、ヒトリンパ球との融合
効率が高い、ｂ、自身では抗体を産生じない、Ｃ９得ら
れたハイブリドーマがヒト型モノクローナル抗体、特に
ＩｇＧタイプの抗体を安定に産生するｄ、得られたハイ
ブリドーマの抗体産生量が多い、ｅ、得られたハイブリ
ドーマが無血清培地中でも充分に増殖する。ｆ、得られ
たハイブリドーマのクローニング効率がよい、などであ
る。
リドーマを高頻度に作製し得る親細胞株を得る試みが種
々なされているが、現在までのところ、以下の諸条件を
満足する親細胞株は得られていない、すなわち、親細胞
株に求められる諸条件とは、ａ、ヒトリンパ球との融合
効率が高い、ｂ、自身では抗体を産生じない、Ｃ９得ら
れたハイブリドーマがヒト型モノクローナル抗体、特に
ＩｇＧタイプの抗体を安定に産生するｄ、得られたハイ
ブリドーマの抗体産生量が多い、ｅ、得られたハイブリ
ドーマが無血清培地中でも充分に増殖する。ｆ、得られ
たハイブリドーマのクローニング効率がよい、などであ
る。
したがって１本発明の目的は、ヒト型モノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマを作製する親細胞株として
上記のような諸条件を満足する新規な親細胞株を提供す
ることにある。
体を産生ずるハイブリドーマを作製する親細胞株として
上記のような諸条件を満足する新規な親細胞株を提供す
ることにある。
「課題を解決するための手段」
本発明者らは、ヒトミエローマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６
とマウスミエローマ細胞株ＦＯをポリエチレングリコー
ルを用いて細胞融合を行い、得られたヘテロハイブリド
ーマを８−アザグアニン耐性化して、ヒトリンパ球との
融合効率が高い親細胞株ＲＦを樹立した。更にこのＲＦ
を限界希釈法又は寒天法によりクローニングを繰り返し
、最も増殖能のよいクローンをＲＦ−５１と命名した。
とマウスミエローマ細胞株ＦＯをポリエチレングリコー
ルを用いて細胞融合を行い、得られたヘテロハイブリド
ーマを８−アザグアニン耐性化して、ヒトリンパ球との
融合効率が高い親細胞株ＲＦを樹立した。更にこのＲＦ
を限界希釈法又は寒天法によりクローニングを繰り返し
、最も増殖能のよいクローンをＲＦ−５１と命名した。
そして、この細胞株がヒト型モノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマを作製する親細胞株として要求され
る上記諸条件を満足し得ることを確認し、本発明を完成
するに至った。
ずるハイブリドーマを作製する親細胞株として要求され
る上記諸条件を満足し得ることを確認し、本発明を完成
するに至った。
すなわち、本発明は、ヒトミエローマ細胞株（ＲＰＭＩ
８２２６）とマウスミエローマ細胞株（ＦＯｌとを細胞
融合させた後、８−アザグアニン耐性化し、更にクロー
ニングを繰り返して得られ、以下の性質を有することを
特徴とするハイブリドーマを提供するものである。
８２２６）とマウスミエローマ細胞株（ＦＯｌとを細胞
融合させた後、８−アザグアニン耐性化し、更にクロー
ニングを繰り返して得られ、以下の性質を有することを
特徴とするハイブリドーマを提供するものである。
ａ、ヒトリンパ球との融合効率が高い。
ｂ、自身では抗体を産生じない。
Ｃ，ヒトリンパ球と融合して得られたバイプリドーマは
抗体、特にＩｇＧ抗体を安定に産生する。
抗体、特にＩｇＧ抗体を安定に産生する。
ｄ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマの
抗体産生量が多い。
抗体産生量が多い。
ｅ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマは
、無血清培地中でも充分に増殖し抗体を産生する ｆ、ヒトリンパ球と融合して得られたバイプリドーマの
クローニング効率が高い。
、無血清培地中でも充分に増殖し抗体を産生する ｆ、ヒトリンパ球と融合して得られたバイプリドーマの
クローニング効率が高い。
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明において、ヒトミエローマ細胞株は、ＲＰＭＩ８
２２６を用い、マウスミエローマ細胞株としては、抗体
非産生で融合効率の高いマウス親細胞株ＦＯを用いた。
２２６を用い、マウスミエローマ細胞株としては、抗体
非産生で融合効率の高いマウス親細胞株ＦＯを用いた。
なお、これらの細胞は市販されており、容易に入手可能
である。ＲＰＭＩ８２２６は、ヒボキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン（以下ＨＡＴと記す）を加えた培地
で培養可能だがウアバインを加えた培地中では増殖でき
ない、ＦＯは逆に、ＨＡＴ添加培地中では増殖できない
が、ウアバインを添加した培地中でも増殖できる。これ
らの細胞株をポリエチレングリコールを用いた公知の方
法で融合させ、ＨＡＴ及びウアバインを加えた選択培地
にて培養を行い、ＨＡＴ・ウアバイン耐性の（ヒト・マ
ウス）へテロハイブリドーマを得た０次いで、８−アザ
グアニンの濃度を徐々に高くした培地で順次培養するこ
とにより、８−アザグアニン耐性にし、ＨＡＴ感受性の
へテロハイブリドーマＲＦを得た。このヘテロハイブリ
ドーマを限界希釈法又は軟寒天法によりクローン化して
、最も増殖能のよい（ヒト・マウス）ヘテロハイブリド
ーマＲＦ−５ｌを樹立した。このＲＦ−５ｌは、ヒトリ
ンパ球との融合効率が高く、シかもＲＦ−３ｌを用いて
作製したハイブリドーマはクローニング効率がよく抗体
産生も安定していることが確認された。また、ＲＦ−５
１及びＲＦ−５１を用いて作製したバイブリドーマは無
血清培地中でも培養可能である。
である。ＲＰＭＩ８２２６は、ヒボキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン（以下ＨＡＴと記す）を加えた培地
で培養可能だがウアバインを加えた培地中では増殖でき
ない、ＦＯは逆に、ＨＡＴ添加培地中では増殖できない
が、ウアバインを添加した培地中でも増殖できる。これ
らの細胞株をポリエチレングリコールを用いた公知の方
法で融合させ、ＨＡＴ及びウアバインを加えた選択培地
にて培養を行い、ＨＡＴ・ウアバイン耐性の（ヒト・マ
ウス）へテロハイブリドーマを得た０次いで、８−アザ
グアニンの濃度を徐々に高くした培地で順次培養するこ
とにより、８−アザグアニン耐性にし、ＨＡＴ感受性の
へテロハイブリドーマＲＦを得た。このヘテロハイブリ
ドーマを限界希釈法又は軟寒天法によりクローン化して
、最も増殖能のよい（ヒト・マウス）ヘテロハイブリド
ーマＲＦ−５ｌを樹立した。このＲＦ−５ｌは、ヒトリ
ンパ球との融合効率が高く、シかもＲＦ−３ｌを用いて
作製したハイブリドーマはクローニング効率がよく抗体
産生も安定していることが確認された。また、ＲＦ−５
１及びＲＦ−５１を用いて作製したバイブリドーマは無
血清培地中でも培養可能である。
したがって、ＲＦ−３ｌを用いて作製したハイブリドー
マが産生するＩｇＧタイプのヒト型モノクローナル抗体
は、プロティン−へカラムを用いた常法の手段により容
易に精製できる。
マが産生するＩｇＧタイプのヒト型モノクローナル抗体
は、プロティン−へカラムを用いた常法の手段により容
易に精製できる。
「作用及び効果」
本発明により樹立したＲＦ−５ｌは、親細胞株として融
合効率が高く、得られたハイブリドーマは抗体産生が安
定で、しかも無血清培地で培養可能である。この親細胞
株を用いることにより、ヒトに投与可能なヒト型モノク
ローナル抗体の生産及び精製が比較的容易にでき、その
有用性は非常に大きい。
合効率が高く、得られたハイブリドーマは抗体産生が安
定で、しかも無血清培地で培養可能である。この親細胞
株を用いることにより、ヒトに投与可能なヒト型モノク
ローナル抗体の生産及び精製が比較的容易にでき、その
有用性は非常に大きい。
「実施例」
（１）８−アザグアニン耐性（ヒト・マウス）ヘテロハ
イブリドーマの作製 ヒトミエローマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６及びマウスミエ
ローマ細胞株ＦＯはそれぞれ１５％の非動化牛胎児血清
（以下ＦＣ５と記す）を含むＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ Ｉ
６４０、ダルベツコＭＥＭ。
イブリドーマの作製 ヒトミエローマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６及びマウスミエ
ローマ細胞株ＦＯはそれぞれ１５％の非動化牛胎児血清
（以下ＦＣ５と記す）を含むＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ Ｉ
６４０、ダルベツコＭＥＭ。
ハムＦ１２培地を２：ｌ：１で混合した培地）にて培養
した。これらの細胞はＲＤＦ培地で２回洗浄後、ｌ：１
の割合で混合し、再度遠心する。遠心後、細胞ベレット
をよく分散し、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール
を１分間にわたって滴下した。更に１分間３７℃で反応
後、５分間で１０ｍ１のＲＤＦ培地を加えた。
した。これらの細胞はＲＤＦ培地で２回洗浄後、ｌ：１
の割合で混合し、再度遠心する。遠心後、細胞ベレット
をよく分散し、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール
を１分間にわたって滴下した。更に１分間３７℃で反応
後、５分間で１０ｍ１のＲＤＦ培地を加えた。
これを遠心した後、１５％ＦＣ５培地を含むＲＤＦ培地
に懸濁し、９６ウエルマイクロプレートにｌウェル当た
り４ＸｌＯ’個の細胞が含まれるように分注した。翌日
、ＨＡＴ培地（０，１ｍＭヒボキサンチン、１６℃Ｍチ
ミジン及び０．４μＭアミノプテリン添加１５％ＦＣ５
／ＲＤＦ培地）にウアバインｌＯｕＭを添加したＨＡＴ
・ウアバイン培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ□の条件
下で培養した。２−３日間隔でＨＡＴ・ウアバイン培地
を交換した。約１週間後にヘテロハイブリドーマの増殖
が確認され、その中で最ら増殖のよいクローンを選択し
、更に２週間ＨＡＴ・ウアバイン培地で培養を続けた。
に懸濁し、９６ウエルマイクロプレートにｌウェル当た
り４ＸｌＯ’個の細胞が含まれるように分注した。翌日
、ＨＡＴ培地（０，１ｍＭヒボキサンチン、１６℃Ｍチ
ミジン及び０．４μＭアミノプテリン添加１５％ＦＣ５
／ＲＤＦ培地）にウアバインｌＯｕＭを添加したＨＡＴ
・ウアバイン培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ□の条件
下で培養した。２−３日間隔でＨＡＴ・ウアバイン培地
を交換した。約１週間後にヘテロハイブリドーマの増殖
が確認され、その中で最ら増殖のよいクローンを選択し
、更に２週間ＨＡＴ・ウアバイン培地で培養を続けた。
その後１週間１５％ＦＣ５を含むＲＤＦ培地で培養した
後、５μｇ ／ ｍ ｌの８−アザグアニンを加えた１
５％ＦＣ５含有ＲＤＦ培地で培養を始めた。８−アザグ
アニンの濃度を１０．２０゜５０．１１００ｕ／ｍｌに
順次高めた１５％ＦＣ５含有ＲＤＦ培地でそれぞれ１週
間培養を行い、８−アザグアニン耐性ヘテロハイブリド
ーマＲＦを樹立した。
後、５μｇ ／ ｍ ｌの８−アザグアニンを加えた１
５％ＦＣ５含有ＲＤＦ培地で培養を始めた。８−アザグ
アニンの濃度を１０．２０゜５０．１１００ｕ／ｍｌに
順次高めた１５％ＦＣ５含有ＲＤＦ培地でそれぞれ１週
間培養を行い、８−アザグアニン耐性ヘテロハイブリド
ーマＲＦを樹立した。
この樹立細胞を限界希釈法又は軟寒天法でクローニング
を行い、最も増殖のよいクローンをＲＦ−３ｌと命名し
た。
を行い、最も増殖のよいクローンをＲＦ−３ｌと命名し
た。
ＲＦ−３ｌをＨＡＴ培地で培養したところ約５日で死滅
し、ＲＦ−３ｌのＨＡＴ感受性が確認された。ＲＦ−５
ｌのＤＮＡを分離し、ヒトＤＮＡに特異的なａｌｕ遺伝
子の存在を確かめたところ、ＲＦ−３ｌのＤＮＡ中にヒ
トＤＮＡが約ｌＯ％含まれていることが確認された。ま
た、ＲＦ−５ｌは外見上マウスミエローマＦＯと同一で
あり、しかちマウスミエローマ細胞株来の性質である１
０℃Ｍのウアバインに耐性であることから、ＲＦ−３ｌ
はヒト・マウスのへテロハイブリドーマであることが明
らかとなった。また、ＲＦ−５１はヒト及びマウス免疫
グロブリンを分泌していないことら確認した。
し、ＲＦ−３ｌのＨＡＴ感受性が確認された。ＲＦ−５
ｌのＤＮＡを分離し、ヒトＤＮＡに特異的なａｌｕ遺伝
子の存在を確かめたところ、ＲＦ−３ｌのＤＮＡ中にヒ
トＤＮＡが約ｌＯ％含まれていることが確認された。ま
た、ＲＦ−５ｌは外見上マウスミエローマＦＯと同一で
あり、しかちマウスミエローマ細胞株来の性質である１
０℃Ｍのウアバインに耐性であることから、ＲＦ−３ｌ
はヒト・マウスのへテロハイブリドーマであることが明
らかとなった。また、ＲＦ−５１はヒト及びマウス免疫
グロブリンを分泌していないことら確認した。
（２）融合効率の検討
ヒトリンパ球は、ヒト末梢血からフィコールバックを用
いた比重遠心法により分離し、ＲＤＦ培地で２回洗浄後
、同じ＜ ＲＤＦ培地で洗浄したＲＦ−３ｌと２：ｌの
割合で混合する８遠心後、細胞ベレットをよく分散し、
１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを１分間にわた
って滴下した。更に１分間３７℃で反応後、５分間でｌ
０ｔｌのＲＤＦ培地を加えた。これを遠心した後、１５
％ＦＣ５を含むＲＤＦ培地に懸濁し、９６ウエルマイク
ロプレートに１ウエル当たり２ＸｌＯ’個の親細胞が含
まれるように分注した。翌日、ＨＡＴ培地に交換し３７
℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。２−３日間層でＨ
ＡＴ培地を交換した。
いた比重遠心法により分離し、ＲＤＦ培地で２回洗浄後
、同じ＜ ＲＤＦ培地で洗浄したＲＦ−３ｌと２：ｌの
割合で混合する８遠心後、細胞ベレットをよく分散し、
１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを１分間にわた
って滴下した。更に１分間３７℃で反応後、５分間でｌ
０ｔｌのＲＤＦ培地を加えた。これを遠心した後、１５
％ＦＣ５を含むＲＤＦ培地に懸濁し、９６ウエルマイク
ロプレートに１ウエル当たり２ＸｌＯ’個の親細胞が含
まれるように分注した。翌日、ＨＡＴ培地に交換し３７
℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。２−３日間層でＨ
ＡＴ培地を交換した。
以上の条件でハイブリドーマが増殖してきたウェルの数
を数え、融合効率を計算した。結果を第１表に示した８
この融合効率は、マウスのモノクローナル抗体を作製す
る際のマウス親細胞の融合効率に匹敵する。
を数え、融合効率を計算した。結果を第１表に示した８
この融合効率は、マウスのモノクローナル抗体を作製す
る際のマウス親細胞の融合効率に匹敵する。
第１表（ヒト末梢血リンパ球を用いた場合の融合効率）
（３）ＲＦ−５ｌの培養上清中の抗体濃度測定ＲＦ−Ｓ
ｌを１５％ＦＣ３を含むＲＤＦ培地中で培養し、培養
上清中の抗体濃度を測定した。測定は酵素免疫測定法（
ＥＩＡ法）により行なった。この結果を第２表に示す。
（３）ＲＦ−５ｌの培養上清中の抗体濃度測定ＲＦ−Ｓ
ｌを１５％ＦＣ３を含むＲＤＦ培地中で培養し、培養
上清中の抗体濃度を測定した。測定は酵素免疫測定法（
ＥＩＡ法）により行なった。この結果を第２表に示す。
第２表（ＲＦ−５ｌ培養土清中の抗体濃度）第２表に示
されるように、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、マウスＩｇＧ
、マウスＩｇＭ及びヒトカッパ鎖、ヒトラムダ鎖と６に
測定限界以下であり、ＲＦ−Ｓｌは自身では抗体を産生
じないことが明らかとなった。
されるように、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、マウスＩｇＧ
、マウスＩｇＭ及びヒトカッパ鎖、ヒトラムダ鎖と６に
測定限界以下であり、ＲＦ−Ｓｌは自身では抗体を産生
じないことが明らかとなった。
（４）ＲＦ−５ｌを用いて作製したハイブリドーマの抗
体産生の安定性 前記（２）における第１表の実験６で得られたハイブリ
ドーマＧ６を１５％ＦＣ５を含むＲＤＦ培地で培養し、
ハイブリドーマＧ６の抗体産生の安定性を検討した。す
なわち、ハイブリドーマＧ６を、０箇月、４箇月、７箇
月培養した後、ｌＸｌ０’個／＋ａｌの密度で培養を開
始し、５日目の培養上清中に含まれるＩｇＧ濃度を測定
した。
体産生の安定性 前記（２）における第１表の実験６で得られたハイブリ
ドーマＧ６を１５％ＦＣ５を含むＲＤＦ培地で培養し、
ハイブリドーマＧ６の抗体産生の安定性を検討した。す
なわち、ハイブリドーマＧ６を、０箇月、４箇月、７箇
月培養した後、ｌＸｌ０’個／＋ａｌの密度で培養を開
始し、５日目の培養上清中に含まれるＩｇＧ濃度を測定
した。
この結果を第３表に示す。
第３表（ＲＦ−５ｌを用いて作製したハイブリドーマの
抗体産生の安定性） 第３表から明らかなように、７箇月培養した後でも抗体
産生量はほとんど変化なく安定していることが確認され
た。
抗体産生の安定性） 第３表から明らかなように、７箇月培養した後でも抗体
産生量はほとんど変化なく安定していることが確認され
た。
（５）ＲＦ−５ｌを用いて作製したハイプリド−マのク
ローニング効率 前記（２）の実験で得られた各種ハイブリドーマを用い
てクローニング効率を測定した。すなわち、１５％ＦＣ
５を含むＲＤＦ培地にハイブリドーマを懸濁し、９６ウ
エルプレートに１ウエル当たり１０個、３個、１個、０
．３個の割合で細胞をまき込み、２週間後に細胞が増殖
してきたウェル数を数えた。この結果を第４表に示す。
ローニング効率 前記（２）の実験で得られた各種ハイブリドーマを用い
てクローニング効率を測定した。すなわち、１５％ＦＣ
５を含むＲＤＦ培地にハイブリドーマを懸濁し、９６ウ
エルプレートに１ウエル当たり１０個、３個、１個、０
．３個の割合で細胞をまき込み、２週間後に細胞が増殖
してきたウェル数を数えた。この結果を第４表に示す。
第４表（ＲＦ−３ｌを用いて作製したハイブリドーマの
クローニング効率） （表中のクローニング効率は、「細胞が増殖してきたウ
ェル数」／「細胞をまき込んだウェル数」を表わしてい
る。） このように、第４表に示されるクローニング効率は、マ
ウスのハイブリドーマの場合に匹敵するものである。
クローニング効率） （表中のクローニング効率は、「細胞が増殖してきたウ
ェル数」／「細胞をまき込んだウェル数」を表わしてい
る。） このように、第４表に示されるクローニング効率は、マ
ウスのハイブリドーマの場合に匹敵するものである。
（６）無血清培地での培養
ＲＦ−５ｌ及び前記（２）における第１表の実験６で得
られたハイブリドーマＧ６を用いて無血清培養を行った
。無血清培地としてはインシュリン５μｇ／ｍ１．
トランスフェリン３５μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２
０μＭ、セレニウム２．５ ｎＭ （以下ＩＴＥＳと記
す）を添加したＲＤＦ培地を用いた。それぞれの細胞を
、ｌＸｌ０’個／ｍｌの密度でＩＴＥＳ −ＲＤＦ培地
に懸濁し、３５ｍｍのデイツシュで培養した。そして、
２４時間経過すル毎に、ＲＦ−５ｌについては細胞密度
、ハイブリドーマＧ６については細胞密度とＩｇＧタイ
プの抗体産生量を測定した。なお、抗体産生量は酵素免
疫測定法（Ｅ Ｉ Ａ法）により測定した。この結果を
第１図に示す０図中、折れ線グラフ−・−はＲＦ−５ｌ
の細胞密度を表わし、折れ線グラフ−０−はハイブリド
ーマＧ６の細胞密度を表わし、棒線グラフはＩｇＧ濃度
を表わしている。
られたハイブリドーマＧ６を用いて無血清培養を行った
。無血清培地としてはインシュリン５μｇ／ｍ１．
トランスフェリン３５μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２
０μＭ、セレニウム２．５ ｎＭ （以下ＩＴＥＳと記
す）を添加したＲＤＦ培地を用いた。それぞれの細胞を
、ｌＸｌ０’個／ｍｌの密度でＩＴＥＳ −ＲＤＦ培地
に懸濁し、３５ｍｍのデイツシュで培養した。そして、
２４時間経過すル毎に、ＲＦ−５ｌについては細胞密度
、ハイブリドーマＧ６については細胞密度とＩｇＧタイ
プの抗体産生量を測定した。なお、抗体産生量は酵素免
疫測定法（Ｅ Ｉ Ａ法）により測定した。この結果を
第１図に示す０図中、折れ線グラフ−・−はＲＦ−５ｌ
の細胞密度を表わし、折れ線グラフ−０−はハイブリド
ーマＧ６の細胞密度を表わし、棒線グラフはＩｇＧ濃度
を表わしている。
このように、ＲＦ−５Ｉ及びバイブリドーマＧ６ともに
無血清培地中で充分に増殖し、抗体産生量も多いことが
明らかとなった。
無血清培地中で充分に増殖し、抗体産生量も多いことが
明らかとなった。
第１図は（ヒト・マウス）へテロハイブリドーマＲＦ−
５１と、このＲＦ−５ｔを用いて作製したハイブリドー
マＧ６を、無血清培地で培養したときの培養時間と細胞
密度との関係、並びにハイブリドーマＧ６の培養時間と
抗体産生量との関係を表わしている。
５１と、このＲＦ−５ｔを用いて作製したハイブリドー
マＧ６を、無血清培地で培養したときの培養時間と細胞
密度との関係、並びにハイブリドーマＧ６の培養時間と
抗体産生量との関係を表わしている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ヒトミエローマ細胞株（ＲＰＭＩ８２２６）とマウスミ
エローマ細胞株（ＦＯ）とを細胞融合させた後、８−ア
ザグアニン耐性化し、更にクローニングを繰り返して得
られ、以下の性質を有することを特徴とするハイブリド
ーマ。 ａ、ヒトリンパ球との融合効率が高い。 ｂ、自身では抗体を産生しない。 ｃ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマは
抗体、特にＩｇＧ抗体を安定に産 生する。 ｄ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマの
抗体産生量が多い。 ｅ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマは
、無血清培地中でも充分に増殖し 抗体を産生する。 ｆ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマの
クローニング効率が高い。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1322118A JP3043023B2 (ja) | 1989-12-12 | 1989-12-12 | ハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1322118A JP3043023B2 (ja) | 1989-12-12 | 1989-12-12 | ハイブリドーマ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03183477A true JPH03183477A (ja) | 1991-08-09 |
| JP3043023B2 JP3043023B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=18140124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1322118A Expired - Fee Related JP3043023B2 (ja) | 1989-12-12 | 1989-12-12 | ハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3043023B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0671471A4 (en) * | 1992-11-28 | 1996-09-11 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | MANUFACTURING PROCESS OF FOREIGN PROTEIN. |
| CN111087469A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-05-01 | 南京泰奥德生物科技有限公司 | 一种全人源单克隆抗体的制备方法 |
-
1989
- 1989-12-12 JP JP1322118A patent/JP3043023B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0671471A4 (en) * | 1992-11-28 | 1996-09-11 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | MANUFACTURING PROCESS OF FOREIGN PROTEIN. |
| CN111087469A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-05-01 | 南京泰奥德生物科技有限公司 | 一种全人源单克隆抗体的制备方法 |
| CN111087469B (zh) * | 2019-12-18 | 2024-03-26 | 南京泰奥德生物科技有限公司 | 一种全人源单克隆抗体的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3043023B2 (ja) | 2000-05-22 |
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