JPH05506573A

JPH05506573A - ＨＩＶ―１糖タンパクに反応性を有するＩｇＧ―１ヒトモノクローナル抗体およびその使用方法

Info

Publication number: JPH05506573A
Application number: JP91506108A
Authority: JP
Inventors: ポスナー、マーシャル・アール
Original assignee: ロジャー・ウイリアムズ・ジェネラル・ホスピタル
Priority date: 1990-02-26
Filing date: 1991-02-26
Publication date: 1993-09-30
Also published as: DE69131686T2; DE69131686D1; ATE185351T1; US6228361B1; EP0517815A4; WO1991013148A1; US5215913A; EP0517815A1; EP0517815B1; CA2076961A1; CA2076961C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ＨＩＶ−１糖タンパクに反応性を有するＩｇＧ−１ヒトモノクローナル抗体およびその使用方法この出願は、１９８７年１１月３０日に出願された米国特許出願第１２６、５９４号の一部継続出願であり、その内容は参考としてここに組み込まれている。ここに開示される発明は、米国保健福祉省、国立衛生研究所、国立癌研究所の認可番号ＲＯＩ　ＣＡ　３Ｂ６Ｂ？および国立衛生研究所の認可番号ＲＯＩ−ＡＩ　２６９２６の下での研究においてなされたものである。この発明において、合衆国政府は一定の権利を有する。〔発明の背景〕この出願を通して、種々の刊行物をアラビア数字で参照する。これらの参照文献についての完全な引用は、請求の範囲の直前である明細書の最後に見出すことができる。これらの刊行物の開示は、この発明が属する技術の状況をより完全に記すために、そのまま参考としてこの出願に組み込まれる。最初は、所定の特異性を有するネズミのモノクローナル抗体を分泌するネズミのハイブリドーマの構築が開示された（１）ので、ヒトモノクローナル抗体のルーチン生産は関心の的であった。ネズミのモノクローナル抗体は、生物学的プロセスの研究に有益な道具を提供するが、明らかに大きな制限が存在する。第１に、これらの抗体によって認識される抗原の数が限られていることである（５０）。例えば、ＨＬＡおよびＤＲ抗原の多形決定基に対する抗体は同定することが困難であった（５１）。さらに、特定のヒト癌関連抗原を同定することも不可能であった（５１−５７）。第２に、糖尿病のような疾患における自己免疫現象の病因は、ヒト自己抗体が定義されることを必要とすることである（５８）。最後に、ネズミのモノクローナル抗体を用いる治療は、治療のためにネズミのモノクローナル抗体を受ける患者によって抗ネズミ抗体が形成されるために制限されることである（５９−６２）。したがって、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト異常増殖（９−１４）　、自己免疫疾患（２−８）　、および感染症（１６−２０１の研究に多くの道具を提供するであろうし、これらおよび他の病気の潜在的な治療および診断薬として働くであろう。現在のところ、抗体産生ヒトＢ細胞のエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）形質転換、ミエローマ血清タンパクの選択、およびネズミおよびヒト両者のミエローマ細胞株もしくは類似体と抗体産生細胞との融合が、ヒトモノクローナル抗体を得るための唯一の実用的な方法として機能してきた。しかしながら、これらの方法は、有用なネズミモノクローナル抗体のルーチン生産を形成していた１つ以上の特徴を欠いている。何人かの探索者によって抗体の源としてミエローマ血清タンパクが用いられているが、この方法は、希にしか存在しない患者の大規模なスクリーニングに依存している。制限された抗原特異性のほかに、再現性および連続生産の欠如がこの方法の適用性を限定している。抗原産生Ｂ細胞のＥＢＶウィルス形質転換は、文献に報告されたヒトモノクローナル抗体の主要な源を提供している。抗体生産の技術としてのＥＢＶ形質転換に関連する多くの本質的および方法論的問題が存在する。最初にしてかつ主要なものは、これらの細胞株によるモノクローナル抗体生産の不安定性である（２１）。それらはクローニング効率に非常に乏しく、かつ抗体分泌が不安定なため、わずか数種のヒトモノクローナル抗体分泌細胞株のみが維持され、かつ続く研究における使用に十分な量の抗体を産生じているにすぎない（３，１１）。さらに、ＥＢＶ形質転換の低頻度および特異性の欠如は、抗体分泌Ｂ細胞の回収および形質転換を強化するように計画された選別法を必要としている（２Ｌ　２９．３０）。ミエローマ細胞株および類似体と抗体産生細胞との融合によるヒトモノクローナル抗体の開発は、２つの主要な因子によって遅れている。それは、１）適当なヒト融合パートナ−の欠如および２）十分に利用し得ない抗原特異的ヒトＢ細胞である。現在利用可能なヒト融合パートナ−は、モノクローナル抗体産生に必要な重要な特性、すなわち、効率的な融合、細胞株および融合により得られるハイブリッドの制御しやすいクローン化能力（ｃｌｏｏａｂｉｌｉ１７　）　、並びにハイブリッドによる大量の抗体の連続的な分泌を欠如している。ネズミ融合パートナ−の重要な特徴であるこれらの特性なくしては、多くの抗原に対するヒトモノクローナル抗体を得ることは非常に困難であろう。ヒトミエローマもしくはリンパ芽球様細胞株が融合に用いられているが、これらは、しばしば、融合効率が低いか、増殖およびクローニングに劣るが、もしくは得られたハイブリッドによる分泌が不安定であるがのいずれがである（　６．２３．３］−３３）。例えば、ネズミのミエローマ細胞株であるＮＳＩは、Ｉ／　１０．０００の効率でマウス牌細胞と融合する（６６）　、　ＬｉＣ＋ｏｎ　ＨＭＹ−２，５ＫＯＯ７、ＵＣ７２９−６マたは０Ｍ１５１］０とヒト細胞との比較融合効率は、１１５Ｈ，１１１１１）ないしＩ／１．０００．０００　テある（６．３３．６７．６８）。加えて、ＵＣ７２９−６およびＬＴＲ２２８の誘導体を含むこれらの細胞のいくつかは、正常末梢血単核球（ＰＢＭ）とは十分に融合しない。ヒト生体系においては、プログラムされた免疫を受ける個人においてさえも、抗体産生Ｂ細胞が比較的希少であるがゆえに、高融合効率は特に重要である。破傷風菌で最適に免疫されたボランティアにおいては、１０．０００個の循環Ｂ細胞のうちのわずかに１個が抗破傷風菌抗体を分泌する（３８）。Ｂ細胞は循環ＰＢＭの１０％未満しか存在しないので、単一の抗体分泌ハイブリッドを得るためには多数を必要とする。ルーチン培養において、ヒト融合パートナ−としてのヒトミエローマ細胞株、マウスミエローマ細胞株およびヒトリンパ芽球様細胞株の直接比較は、一般に、安定性に乏しいＩ／１０５−１０６細胞オーダーの融合効率および１１００ｎないし１０μｇ／ｍｌの分泌を示している（６．２３．３１）。融合パートナ−として用いられる、現在利用可能なヒトおよびネズミの細胞株の代わりとして、多くの探索者がヒトモノクローナル抗体産生に優れるミエローマ類似体の構築を試みている。ネズミのハイブリダイゼーション実験は、未分化の特性を有するＢ細胞とより分化した特性を有するＢ細胞との融合が、ハイブリッドにおけるそれらの分化した特性を促進する結果となることを示している（４３．４４）。このため、Ｌａｒｋｏｖらおよびその他の者は、未分化のＢ細胞をミエローマ細胞株と融合することにより、特に本来の免疫グロブリン産生もしくは分泌を含む、より分化したＢ細胞表現型特性の出現を促進することが可能であった（４３−４６）。ヒト融合パートナ−において望ましい特性を保持するヒトミエローマ類似体を構築する試みにおいて、ハイブリダイゼーションのための細胞を適切に選択することが、一連の構築されたミエローマ類似体を系統的に改善するという理論が立てられた（２５．２６）。これらのヒトミエローマ類似体は、非分泌ヒトミエローマ細胞株と分化の選択された段階にある種々のヒト細胞との融合により構築された。これらの研究においては、融合効率は高く、かつ増殖特性には優れていたが、モノクローナル免疫グロブリンの安定した分泌は、既に分泌することが述べられている確立された悪性ヒト細胞株との融合から得られたのみである。抗体分泌は、クローン化ハイブリドーマによって急速に失われた。一連の構築されたヒトミエローマ類似体の基礎としての非分泌弁とミエローマ細胞株の選択が、続いて産生ずるヒトミエローマ類似体およびハイブリドーマの安定な抗体産生を支援する能力に強い影響を与えることはあり得る。ヒトミエローマ細胞とヒト細胞との融合により形成された類似体の代わりに、ネズミの細胞とヒト細胞との融合によりヘテロバイブリドーマが構築されている（３４−３７）。本発明者を含めて何人かの探索者が、ネズミのミエローマと種々のヒト細胞との融合によりヒト−マウスミエローマ類似体を構築シている。融合に用いられるネズミのミエローマは、主ニ、Ｐｏｔｔ！ｒにより開発され、ＩＩｏ＋１ｂｘｌａおよびＥｓｒＢｓによりイン−ビトロ増殖に関連しかつ適合されたＭＯＰＣ２１細胞株（２７，２８，３９）に由来する。この細胞株およびそれらの誘導体は、ネズミのモノクローナル抗体の生産において、融合パートナ−として、所定の手順で用いられている。ＴｃａｇらはＭＯＰＣ２１とヒト細胞株５ＫＯＯ７とを融合させ（３４）　、Ｏｓ＋ｂｕｇおよびＰｕｒｓｃｈはそれをヒトＢリンパ球と融合させ（３７）、およびＦｏｕｎｇらは正常末梢血リンパ球をネズミのミエローマハイブリッドであるＳＦ３の誘導体と融合させた（３５）。Ｃｘｒｒｏｌｌらは、これら多数のヒト−マウスミエローマ類似体を、融合効率、免疫グロブリン産生および安定性について比較した（３６）。ＮＳＩとヒトＢリンパ細胞との融合により構築された、ヘテロハイブリドーマであるに６　Ｈ６／Ｂ５が、他のヒ有し、かつハイブリドーマの６０％が免疫グロブリンを分泌する。ハイブリドーマによる免疫グロブリン分泌は、２−３μｇ７ｍｌである。この努力にもかかわらず、はとんどのヘテロハイブリドーマ類似体は、ネズミのミエローマ細胞株と比較した場合に、分泌が不安定であり（２５，２６）、もしくは融合効率に劣ることが判明している。末梢血中には特定のヒト抗体−産生細胞は希であるので、より高い融合効率がヒト融合パートナ−の望ましい特徴である（３８）。この発明は、ＨＭＭＡ２．１ｌＴＧ１０と称する新規のヒト−マウスミエローマ類似体、その構築方法およびヒトモノクローナル抗体産生へのこのヒト−マウスミエローマ類似体の所定の手順による使用方法を提供する。ＨＭＭＡ　２．１１　ＴＧ１０Ｈ胞株は、正常ＰＢＭおよびＥＢＶ形質転換ＰＢＭとの非常に高い融合効率を有する。それは容易にクローニングを行なうことができ、一度クローンを作製すると、大量のヒトモノクローナル抗体を安定に分泌する。ヒト免疫不全ウィルス１　（ＨＩ　Ｖ−１）　ｇ染は、新たな、かつ非常に深刻な健康の脅威を意味する。この国において、進化する流行病が多くの危険群に広がり、今や、アフリカおよび他の地理学上の地域において新しい関連ウィルスが出現している（６９−７３）。ＨＩ　Ｖ−１に感染した患者は、明白な免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）　、Ａ　ＩＤＳ関連コンプレックス（ＡＲＣ）、脳疾患、およびＡＩＤＳ関連悪性疾患を含む、種々の直接に関連する病気を発病する。ＨＩＩＩ感染のこれらの併発症は、大部分病気の進行中に起こる進行性で深い免疫抑制に由来し、脳のような特定の臓器に対する、関連し、可能性があり、直接的なウィルスの影響であると考えられる（６９−７３）。現在のところ、ＨＩ　Ｖ− １に感染したどの患者が、徐々に重篤となり、かつ病的なこれらの疾患の併発症を発症するのか、および何故に全てではなく何人かの個人がこの進行を受けるのかは知られていない。Ｔ細胞の破壊に介在されるウィルスの発現としての、細胞性免疫の深刻な低下がこのプロセスに含まれるように感じられる。正常Ｔ４　／Ｔｇ比の逆転、ＣＤ４抗原を有するリンパ球の減少、および感染した個体におけるリンパ球減少は、ＡＩＤＳの進行に強く相関する（７４．７５）。１４９２３球の優先的な感染、感染Ｔ４細胞のシンシチウム形成および壊死、およびＣＤ４に対するいくつかの抗体のＨＩＶ−１による細胞の感染を阻止する能力は、この疾患の発病におけるＴ細胞およびＣＤ４複合体の集団に関連する（７２．７６− ７９）。この疾患における免疫低下の研究は、免疫応答の細胞性の武器（ｅ＜ｌ１ｕｌｉｒ　！＋１１１）に集中しているが、液性免疫系もまたＨＩＶ−１によって深い影響を受ける。ＨＩＶ−１に感染した患者は、Ｋｅ７ｈ’ｏｌｅ　ＬｉｍｐｓｊヘモシアニンおよびＢＷ肝炎ワクチンのような強力な免疫原を用いた免疫に対する反応が消えてしまう。逆説的ではあるが、恐らく慢性、非特異的Ｂ細胞の刺激の結果として、患者はまた、ガンマグロブリン過剰の血清を有している。証拠の断片のいくつかがこの論争を裏付けている。感染した個体から単離したＢ細胞は、ＨＩ　Ｖ−１に対する抗体を含む特異的な抗体の他に、自発的に免疫グロブリンを分泌するようである（８０−８２）。これらの循環Ｂ細胞はまた、細胞表面多形変化に基づいて活性化するようである（８３）。加えて、ＨＩＶ−１感染患者からの循環Ｂ細胞は、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の自発的な成長は正常なものに見られるよりも高いにもかかられす、外来的に加えられたエプスタイン・バーウィルス（Ｅ　Ｂ　Ｖ）によっては形質転換しにくいようである（８２）。ＥＢＶ形質転換は非活性Ｂ細胞に優先的に起こるので、これらのデータは循環Ｂ細胞が慢性的に活性化しているという意見を裏付けている（８４）。併せて考えると、これらの研究は、ＨＩＶ−１感染においては、液性免疫応答の改変が種として起こることを示している。疾患のイン・ビボ制御におけるＨＩＶ−１に対する液性免疫応答の重要性は、議論の的である。危険群の疫学的研究は、ＨＩＶ−１ウイルスのｇ　ｐ　１２０エンベロープタンパクに反応性を有し、かつ感染アッセイにおいてウィルスを中和し得る血清抗体の存在が疾患の進行の欠如に相関することを示唆している。頻繁な輸血により感染したサラセミア患者および治癒し得る悪性疾患の治療中に感染した患者のある期間にわたる研究は、中和抗体がＡＩＤＳの進展阻止においである役割を果たすという意見を裏付けている（８５．８７）。これらの抗体が、ＨＩ　Ｖ−Ｉ感染の発現であるカポジ肉腫の阻止においては役割を担っていないことを示差する反証もまた存在する（８８．８９）。少なくとも１つの報告は、逆転写酵素活性をブロック可能な血清抗体もまた疾患の進行の連続した欠如に相関することを示唆している（９０）。この疾患のイン・ビボ制御において、中和抗体および逆転写酵素活性を阻害する抗体の存在が重要であり得るにもかかわらず、それらはＨＩＶ−１感染の副現象をも現わし、それらの存在の有無はさらなる免疫抑制の直接的な原因とは無関係である（９１）。代わりに、いくつかの疫学的研究が、ウィルスの結合および中和において、含まれるエピトープが単離体全体にわたってしばしば保護されることを示唆しているにもかかわらず、ウィルスエンベロープタンパクにおける遺伝子変化もしくは浮動が液性免疫制御から免れることを可能にする（９２−９５）。制御から免れる第３の機構には、ＣＤ４　リンパ球集団を破壊することによる、抗体合成の調節低下につながる液性免疫系の異常調節（ｄ７ｕｅｇ１１ａｌｉｏ口）が含まれる（７４．８２）。このプロセスには、抗イデイオタイプ抗体の産生を含めることも可能であることが推測される（９６．９７）。この抗イデイオタイプ抗体のいくつかはＴ細胞に結合可能であり、免疫抑制にさらに寄与する。このため、ＨＩＶ−１に対する液性免疫応答に関する試験的な、推測による、および矛盾するデータであるにもかかわらず、ＨＩＶ−１に対する抗体応答と疾患の進行との関係が理解されることが非常に重要である。というのも、感染の途中で、この応答が有意に変化する現実的な見込みが残っているからである。ＣＤ４複合体もしくはＨＩ　Ｖ−１エンベロープタンパクのいずれかに反応性を有するネズミモノクローナル抗体は、イン・ビトロ系におけるＨＩＶ−１の感染能を阻害することが可能である（７７−７９）。これらのモノクローナル抗体は、イディオタイプ応答、ＣＤ４付着、およびＨＩＶ−１関連タンパクの抗原結合部位の研究に用いられる。例えば、ＣＤ４結合ネズミモノクローナルに反応性を有する、ネズミモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ポリクローナルウサギ抗イデイオタイプではない）は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパクと反応し、細胞性感染を阻害する（７９）。これらの抗体の多くの明らかな有用性および研究への利用可能性にもかかわらず、ヒト液性免疫応答に含まれる正確な決定基は知られないままである。ＨＩＶ− １１染に対するヒト液性応答およびこの応答の調節の両者を研究するためには、現在利用可能なネズミモノクローナル抗体のヒト等個物を得ることが重要である。ＨＩ　Ｖ−１に対するヒトモノクローナル抗体は、一連の均質な試薬を提供する。この試薬は、このウィルスに対する免疫応答に含まれる正確なエピトープの決定、液性免疫応答におけるイディオタイプ制限、および抗イデイオタイプ調節の潜在的に重要な衝撃において有用である。さらに、ヒトモノクローナル抗体は、疾患の評価および治療において、有用な診断および治療薬として働く。ヒトモノクローナル抗体がネズミモノクローナル抗体を凌駕する治療上の利点には、この抗体に対する直接免疫の可能性が減少することが含まれる（９８）。加えて、正常Ｔ細胞の集団に結合する抗イデイオタイプ抗体は、一般に、ヒト免疫応答の研究に有用であることを立証している。〔発明の概要〕本発明は、［ＩＭＭ＾２．　ＩＩＴＧｌｏと命名されたヒト−マウスミエローマ類縁体を提供する。これはＩＩＢ　９５８３の受付は番号で、アメリカンψタイブーカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。本発明はまた、ヒト−マウスミエローマ類縁体と抗体産生細胞との細胞融合によって製造されたモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに関する。本発明の他の態様によれば、ヒト−マウスミエローマ類縁体をヒト抗体産生細胞と融合させることを具備したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法が提供される。また、病原体関連または腫瘍関連の疾病を有する対象を治療するための治療方法であって、前記モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによって産生される前記疾病に対して特異的なモノクローナル抗体を、対象に対して投与することを具備した方法が提供される。本発明は、ＨＢ　１０３６３の受付は番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、且つＦ　１０５と命名されたハイブリドーマと、これによって産生されるヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、このモノクローナル抗体に向けられた抗イデオタイブ抗体と、その使用方法に関する。本発明はまた、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）上のエピトープに向けられ、ヒト細胞に対するＨＩＶの結合を阻害することができ、且つヒト細胞のＨＩＶによる感染を防止することができるヒトモノクローナル抗体を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１　：　ＨＭＭＡ　２．　ＩＩＴＧ１０セルライン（ＩＡ）；二つの抗体分泌ハイブリドーマＦ３Ｄｌ、２Ｆ６　（ＩＢ）；およびＦ５Ｂ６Ａ６　（ＩＣ）から作製したのクロモソームブレバレーションの代表的な光学顕微鏡写真。図２　：　Ｉｇｌｏｏ　（７％）　Ｉ：稀釈された正常血清、　ｌ：１００　（８５％）に稀釈されたＨＩＶ感染、の者ＨＩＶ２４からの血清；およびＦ１０５モノクローナル抗体（５４％）と比較した、Ｆ　１０５ヒトモノクローナル抗体の間接蛍光免疫測定の結果を示している。図３・ＩＴ−１１９細胞へのウィルスの結合に対するヒトモノクローナル抗体Ｆの効果を示している。図４　：　Ｆ　１０５ヒトモノクローナル抗体がＨＩＶ−１の感染性を阻害することを示している。〔発明の詳細な説明〕本発明は、１１Ｍ１．ｌＡ　２．　ＩＩＴＧｌｏと命名されたヒト−マウスミエローマ類縁体を提供する。これは、特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従って、ＢＢ　９５８３の受付は番号で、アメリカ合衆国２０Ｂ５２メイランド州ロツクウイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。本発明のヒト−マウスミエローマ類縁体は、ヒトーネズミハイブリノド核型および細胞表面発現型を有し、ＭＯＰＣ２１由来のマウスミエローマ細胞とヒトｆｌ ′髄単核細胞との融合によって製造される。このマウスミエローマ細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．．６５３と命名されたマウスミエローマセルライン、即ちＭＯＰＣ２＋セルラインの突然変異誘導体である非分泌系ネズミーミエローマ細胞に属する。上記ヒト骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）はＩｇＡ／に！ｐｐ！ミエローマをもったヒトから得られる。このヒトドナーはかなりの化学療法剤で治療されており、吸引によってＢＭＭＣを得る前に、尿毒症および貧血を呈している。ＢＭＭＣおよびマウスミエローマの融合によって得られる前記類縁体は、チオグアニン（特に６−チオグアニン）およびウアバインの存在下に増殖され、従ってウアバイン及びチオグアニンに対して抵抗性である。また、こうして得られた類縁体はヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンの混合物に対して感受性である。本発明の他の側面によれば、上記ヒト−マウスミエローマ類縁体とヒト抗体産生細胞との融合によって製造される、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが提供される。好ましい態様において、この抗体産生細胞はヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭ）、ポークライード刺激されたマイトジェン（ＰＭＷ）のようなマイトジェン刺激されたＰＢＭ、またはフィトヘマグルチニン刺激されたＰ　ＢＭ　（Ｐ　ＨＡ　（ｓｌ　）　、或イハーＸ−ブスタインーバールウイルで形質転換されたＢ細胞である。上記のヒト−マウスミエローマ類縁体は、ヒトＰＢＭ、マイトジェン刺激されたＰＢＭおよびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞と融合されたとき、２５．０００の融合された細胞のうちから得られる抗体分泌ハイブリドーマの成長が１より大きいような平均融合効率を有する。本発明の特に有用な抗体産生ハイブリドーマは、ヒト骨髄単球性白血病、ヒト急性リンパ芽細胞性白血病、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）またはヒト結腸癌に対して特異的なモノクローナル抗体を産生ずるようなハイブリドーマである。本発明は更に、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）上のエピトープに向けられ、ヒト細胞に対するＨＩＶの結合を阻害することができ、且つヒト細胞のＨＩＶによる感染を防止することかできるヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明の一つの態様において、このヒトモノクロ−カル抗体によって認；されるエピトープは、Ｆ２Ｏ３と命名されたモノクローナル抗体によって認識されるエピトープである。本発明はまた、ヒトモノクローナル抗体Ｆ１０５を提供する。モノクローナル抗体Ｆ１０５は、これもＦ’＋０５と命名されたハイブリドーマによって産生される。ハイブリドーマＦ　１０５は、特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従って、ＩＩ８１０３６３の受付は番号で、アメリカ合衆国２０８５２メイランド州ロツクウイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。モノクローナル抗体Ｆ１０５は、検出可能なマーカーでラベルされ得る。本発明の実施に有用な検出マーカーは当該技術分野の当業者に周知であり、又これらに限定されるものではないが、放射性アイソトープ、染料、またはパーオキシダーゼやアルカリホスファターゼのような酵素であり得る。加えて、ヒトモノクローナル抗体Ｆ　１０５は細胞障害剤と結合され得る。本発明はまた、このヒトモノクローナル抗体Ｆ１０５に向けられた抗イデオタイブ抗体に関する。この抗イデオタイプ抗体もまた、検出マーカーでラベルされ得る。適切な検出マーカーは当該技術分野の当業者に周知であり、又これらに限定されるものではないが、放射性アイソトープ、染料、またはパーオキシダーゼやアルカリホスファターゼのような酵素であり得る。ヒトモノクローナル抗体Ｆ１０５に対する上記の抗イデオタイプ抗体は、Ｆ１０５抗体を動物に注射したときに産生される。次いで、動物は注射されたＦ　１０５抗体のイデオタイブ決定基に対する抗体を産生ずるであろう（１００）。或いは、ヒトモノクローナル抗体Ｆ１０５に対する抗イデオタイブ抗体は、動物のリンパ細胞を抗体産生に有効な量の抗原Ｆ１０５と接触させることと：得られたリンパ細胞を回収することと；回収されたリンパ細胞をミエローマ細胞と融合して夫々がモノクローナル抗体を産生ずる一連のハイブリドーマ細胞を製造することと、Ｆｌ（１５ヒトモノクロ−カル抗体に結合できるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を同定するために、この一連のハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることと；こうして同定されたハイブリドーマ細胞を培養し、該細胞によって産生された抗イデオタイブ抗体を分離回収することによって製造される。上記二つの方法の何れかにおいて、抗イデオタイブ抗体の製造に用いられ得る動物には、ヒト、霊長類、マウス、ラットまたは兎が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明はまた、ヒト−マウス類縁体を抗体産生細胞、特に上記に挙げた抗体産生細胞と融合させることを具備したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法、および該ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗体に関する。本発明の他の態様は、病原体関連または腫瘍関連の疾病を有する対象を治療するための治療方法であって、対象に対して、前記モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによって産生される前記疾病に特異的なモノクローナル抗体を投与することを具備し、前記モノクローナル抗体は前記疾病を治癒しまたはその症状を軽減することができる方法を提供する。好ましくは、前記病原体関連または腫瘍関連の疾病は、骨髄性白血病、急性リンパ芽細胞性白血病、結腸癌、後天的免疫不全症候群またはヒト免疫不全ウィルス感染である。また、本発明のヒト−マウスミエローマ類縁体およびこれから製造されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、これら疾病を研究するための研究手段および診断手段としても有用である。本発明は更に、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）のヒト細胞への結合を阻害する方法、およびＨＩＶによるヒト細胞の感染を防止する方法に関する。この方法は、ＨＩＶに対して、ＨＩＶ上のエピトープに対するヒトモノクローナル抗体に接触させることを具備する。該モノクローナル抗体の量は、ＨＩＶのヒト細胞への結合を阻害し且つＨＩＶによるヒト細胞の感染を防止するために有効な量である。サンプル中において、ＨＩＶを検出する方法もまた開示される。この方法は、適切なサンプルに対してモノクローナル抗体Ｆ１０５を接触させ、該モノクローナル抗体とサンプル中に存在するＨＩＶとの間の抗原抗体複合体を形成することと、こうして形成された複合体の存在を検出することにより、サンプル中におけるＨＩＶの存在を検出することとを具備する。一つの態様において、ヒトモノクローナル抗体Ｆ１０５は検出マーカーでラベルされる。この方法において有用な適切なサンプルは、血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、口腔粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液および漿液のような、ヒト検体からの生物学的液体であるが、これに限定されるものではない。抗ＨＩＶ抗体を検出する方法もまた、本発明によって提供される。この方法は、適切なサンプルを上記の抗イオドタイプ抗体と接触させて、抗イオドタイブ抗体とサンプル中の抗ＨＩＶ抗体との間の抗イオドタイブ抗体−抗ＨＩＶ抗体複合体を形成することと、こうして形成された複合体を検出することにより、サンプル中における抗ＨＩＶ抗体の存在を検出することとを具備する。一つの態様において、この抗イオドタイブ抗体は検出マーカーでラベルされる。この方法において有用な適切なサンプルは、血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、口腔粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液および漿液のような、ヒト検体からの生物学的液体であるが、これに限定されるものではない。ＨＩＶ感染を防止するのに充分な墓の上記のヒト抗イオドタイプ抗体と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に対するワクチンもまた提供される。史に、本発明はヒトモノクローナル抗体Ｆ　１０５の可変領域をコードするＤＮＡシーケンスを提供する。このＤＮＡシーケンスは、まずＦ２Ｏ３の重鎖および軽鎖をコードするｍＲＮＡを単離し、精製することによって単離される。次いで、これら精製されたｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡコピーが作製され、これによって可変領域をコードするＤＮＡシーケンスが提供される。以下に記載する実験の詳細、結果および考察のセクションにおいて本発明を更に例示する。これらのセクションは本発明の理解を補助するために記載されるもので、如何なる意味でも後記の請求の範囲に記載される本発明を限定する意図はなく、そのように限定的に解釈されてはならない。叉ＩＪと１遡細胞培養細胞系及び確立されたハイブリドーマを、ヌクレオシドのない、次の添加剤を有するアルファ＝ＭＥＭ中で成長させた：１ｍＭピルビン酸ナトリウム、　２ｍＭ１−グルタミン、１％（Ｖ／Ｖ）非必須アミノ酸、　１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清（高クローン化効率及び成長促進：ギブコ（ＧｒＢＣＯ（グランドアイランド、ＮＹ）０．２２％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウム、及び５０μｇｍ／ｍｌ　ゲンタマイシン、他の全ての細胞培養

【瓢　２０％ウシ胎児血清を含有する同じ培地で行なった。他の添加剤（戴　指摘通り、含められた。５％Ｃ○２／空気（ｖ　／　ｖ　）混合物で通気した後、フラスコ中で成長している培養物を密封し、３７℃に維持した。必要に応じて、開始後通気を繰り返し行なった。マイクロタイタープレートまたはマルチウェル中の培養物を加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートした。細胞系非分泌性マウスミエローマ細胞系（３９）であるＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞系をヒト−マウス融合用に用いた（Ａ、Ｒ，フラケルトン博士により供給）、Ｂ９５−８マーモセツト細砲系（４０）を細胞形質転換用のＥＢＶの給源として用いた（Ｈ，ラザラス博士より供給）。ボランティア及び患者細胞ＰＢＭ及び８ＭＭＣ＋１　それぞ札　静脈穿刺または骨髄吸引により、防腐薬を含まないヘパリン（オニール、ジョーンズ及びフェルトマン；　セントルイス、ＭＯ）中に得、前に記載した通り（２５、２６）、密度勾配分離により汚染細胞がら分離した。すぐさま使用しない場合（Ｌ　細胞は、　１０％ジメチルスルホキシドを含有する培地中に再懸濁した後液体窒素中で凍結保存により貯蔵した。ボランティアからのＰＢＭは、種々の時間間隔で破傷風トキソイドにより免疫化した後得た。細胞融合融合（Ｌ　カルシウム又はマグネシウムを含まないパラフサリーンＧ　（ＰＳＧ／ＷＯ）中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００　（ＪＴベーカーケミカル社、フィリップスバーブ、ＮＪ）の４６％（ｗ／ｖ）溶液を用いて行なフた（２５）、ＰＥＧを１２１’Ｃで１５分間オートクレーブ処理し、３７℃に加温したＰＳＧ／ＷＯとすぐに混合した。無菌１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０に調節し、４ｍｌアリコツトをガラスバイアル中４℃で光がら保護して無菌的に保存した。　ミエローマまたはミエローマ類似体を２：　１の比で他の親細胞と融合させた。融合すべき細胞をプールし、５０ｍ１ポリプロピレン遠心チユーブ中でＰＳＧ／ＷＯで２回洗浄した。最終洗浄後、　Ｐ　Ｓ　Ｇ／Ｗ○をデカントし、細胞ペレットを残りのＰＳＧ／ＷＯ中に再懸濁し、予め３７℃に加温した１、５ｍ　ｌのＰＥＧ溶液を、頻繁に穏やかにかき混ぜながら、ペレットにゆっくりと滴下した。細胞を１分間インキュベートし、暖かいＰ　Ｓ　Ｇ／Ｗ○ を、頻繁に穏やかにかき混ぜながら、ベレットに滴下した。最初の１．０ｍｌを１分がけて加え、第２、第３を各々３０秒かけて加えた。ついで、全部で２０ｍ１を遠心チューブに加えた。細胞を４００ＸＧで１０分間遠心し、ＰＥＧ溶液をデカントし、細胞を、ヒボキサンチン（１×１０−４Ｍ）、アミノプテリン（４Ｘ１０−７Ｍ）及びチミジン（１，６ｘｌＯ−’Ｍ）（ＨＡＴ）（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を含む培地中に再懸濁させた。融合細胞を９６ウエルマイクロタイタープレート中に分配した。限界希釈のために、　１００μｌの培地中の設定した数の細胞を、全てのウェルが１００μｌの培地を含んでいるところのマイクロタイタープレートの第１列（１２ウエル）に置き、容量の半分を１の列から次の列へと順次移し、連続した倍数希釈を得た。融合効率（Ｌ　前に記載した通り計算した（２５）、全ての実験において、各ウェルに播種した細胞の数は、仮定的１／１融合効率を仮定したときの潜在的ハイブリッドの最高数に基づいた。各ウェル中の最終容量は２００ないし２５０μｌであった１選んだ実験において、正常または形質転換細胞の成長を防止するために、融合から２４時間後にＨＴを含む５０μｌ中の１０μＭウアバインを加えて各ウェル中に２μＭウアバイン濃度を得た。　２μＭウアバインの濃度をウェル中で１週間維持し、しかる後通常の栄養補給を行なった。４ないし７目間隔で１００ないし１５０μＩの培地を取り除き、ヒボキサンチン（２Ｘ１０−４Ｍ）及びチミジン（３，２Ｘ　Ｉ　Ｏ−５Ｍ）を含む培地の等容量で置き換えることによって融合物に栄養補給した。増殖のための選別後、細胞を、ＨＴを含む培地中、　２４ウエルマルチウエルに移し、フラスコ中で一度継代するまでＨＴ中に維持した。ハイブリドーマを８丁を含有する培地中に再懸濁することによってクローン化し、平均で１細胞／１００μｌ／ウエルが得られるようにマイクロタイタープレート中に分配した、クローン化細胞を、ＨＴを含まない培地により１週間間隔で栄養補給した。インビトロ　化　びＥＢＶノ免疫化したボランティアからのＰＢＭを、前に記載（２５）した通りに準備した、　２０％ＦＢＳ及び種々の濃度の破傷風トキソイド（ウエイスラバラトリエーズ、フィラデルフィア、ＰＡにより供給）を含有する培地２．０ｍｌ中、２４ウエルマルチウエルに移した。対照として、添加副を含まないか、　ｌ：１０００の最終濃度まで希釈したＰＷＭ（ギブ１　グランドアイランド、ＮＹ）を含むウェルを準備した。細胞＋ｉ　まず、培養開始から４日後に、　１８ｍ　ｌの培地を除去し同量の新鮮な培地を加えることにより、その後＋１　４ないし１０日目間隔培地を除去し新鮮な培地を加えることによって栄養補給した。ＥＢＶ形質転換は、培養物からＩ　ｍ　ｌの培地を除去し、　ミラーら（４０）の方法を行なった後集めたＢ９５−８細胞系からのストック上澄の１；５希釈液１ｍｌを加えることによって開始した。ＥＢＶを添加したウェルをモニターし。連続する細胞成長及び形質転換が明らかになるまで週毎に栄養補給した。成長している培養物を２５ｃｍ”フラスコに移し、融合、継続する培養及び凍結保存のために増殖させた。ＩｇＧ−１ヒト単一クロ一ン抗体上口陽性ＨＩ　Ｖ−１感染の患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭ）を単離し、オリゴクローン性培養中エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）により形質転換させた。ＨＩＶ−１感染ＨＴ−８９細胞に対するＩｇＧ細胞表面反応性抗体の産生について試験した９１５の形質転換体の１つが陽性であることがわかった。このＥＢＶ形質転換体を増殖させ、ヒト融合パートナ−８ＭＭＡ２．１１　ＴＧ／○と融合させた。スクリーンした３８４のハイブリドーマの内、　１５（４％）が抗体を産生じていた。　２のハイブリドーマを、　ＩｇＧヒト単一クローン抗体を産生ずる試験したクローンの８０％以上をもってクローン化した。　Ｆ１０５ヒト単一クローン抗体はＩｇＧ−１免疫グロブリンである。抗体の検出及び免疫グロブリン分泌試験ウェルからの上澄またはバルク培養物を、前に記載した（２５、２６）ように、マイクロエリザを用いて免疫グロブリン分泌について試験した。簡単に述べると、試験ウェル（イミュロン２；　ダイナチク、アレクサンドリア、ＶＡ）をヤギ抗ヒト免疫グロブリン（Ｉ　ｇＭ、　ＩｇＧ、及びＩｇＡ）（カッペルラバラドリーズ、コクランビル、　ＦＡ）により３０μｇｍ／ｍｌでコートし、少なくとも２時間インキュベートした１次にプレートを２．５％ＦＢＳ　（ｖ／ｖ）を含むＰＳＧ　（ＰＳＧ２．５％）により最小の２時間ブロックし、０．０５％ツイーン”２０（ｖ／ｖ）を含む食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−ツイーン）で２＠、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｍの試験上澄を加えた。ウェルを２時間インキュペ−トし、上記のように洗浄し、　ＰＳＧ２．５％中１：　３０００に希釈したペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン（ＩｇＭ、　ＩｇＧ及びＩｇＡ）または特異的ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ（タボ社、バーリンガム、ＣＡ）７５μｌを加え、　２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−ツイーンで３回、ＰＢＳで３回洗浄した凌　クエン酸緩衝液中の０−フェニレンジアミン１００μｍを加えた０色変化を観察することにより５〜４５分でプレートを読み取り、陰性から４＋まで点数を付けた。マイクロエリザプレート（ファルコンマイクロテストＩＩＩアッセイブレート：　ペクトンディッキンソン、オクスカード、ＣＡ）を破傷風トキソイド溶液１００μｌにより０．５μｇｍ／ｍｌでコートした（２５）以外は同様の検定法で破傷風トキソイドに対する抗体を検出した。細胞表面免疫蛍光法前に記載（２５）した直接及び間接免疫蛍光方法の両者を用いて細胞表面表現型を決定した９間接法において、　ＩｇＭ。ＩｇＧ、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、ベーター２−マイクログロブリンまたはＩａに特異的なマウス単一クローン抗体を供給された陰性対照（コールタ−、ハイアリ−１ＦＬ）とともに用いた。上記単一クローン抗体の結合を決定するためにフルオレセイン複合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（タボ、バーリンガム、ＣＡ）を用いた。直接法において、フルオレセイン複合ヤギ抗ヒトＴｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ（タボ社）を陰性対照としてのフルオレセイン複合ヤギ抗マウス免疫グロブリンとともに用いた。細胞蛍光（戴　エビックスＣ細胞選別機（コールタ−、ハイアリ−１ＦＬ）を用いて決定した。Ｆ１０５間接免疫蛍光法抗原結合及び感染性を決定する方法は以下の通りである。まず、ＨＴ−８９細胞をＤＥＡＥにさらすことができ、あるいは、この工程は省略できる。ウィル人　培地で希釈したウィルスまたはＦ１０５上澄で希釈し３７ ℃で３０分間インキュベートしたウィルスを０．５ｍｌ／１０’細胞で非感染ＨＴ−Ｈ９と混合し、これら細胞とともに３７℃で２時間インキュベートする。　３７℃のインキュベーションの完了に続き、細胞を無菌培地で一度洗浄し、ＰＳＧ中に再懸濁し、百方細胞／試料に分ける（感染性についてよ　レギュラー培地中での継続した成長のために試料をどける）、ついで、細胞を１１０００Ｘで５分間遠心し、上澄を除去し、個々の試料を正常血清もしくは１：　２００希釈ＨＩＶ十血清または未希釈Ｆ１０５上澄と混合する１次に、細胞を４℃で３０分インキユベートシた後、ＰＳＧで洗浄（洗浄当り３〜４ｍ１）した、　ｌ：ｌＯＯに希釈したフルオレセイン標識（Ｆ　（ＡＢ’　）　２＞ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を各試料に加えた（１００μ！／試料）。ついで、試料を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄する×１．細胞ベレットを１　／　２　ｍ　ｌのＰＢＳ及び０．５％ホルムアルデヒド中に再懸濁し、冷所で３０分間インキュベートし、こうして細胞選別機での分析のための用意ができた。感染性について顛　細胞を培養し、表面ウィルス抗原の表現について４．７及び１１日目に試験した。基本の免疫蛍光検定は、上に述べた通りであり、陽性血清、またはＨＩＶ３Ｂで感染されたＨＴ−Ｈ９細胞の表面上のＦ２Ｏ３のいずれかを利用してＨＩＶ抗原を検出するものである。抗体または免疫グロブリン分泌の定量クローン化された成長するハイプリドーマ細胞を含有するフラスコから使用済み培地を３〜４日間隔で集め、４００ｇで３０分間遠心し、プールし、４℃で保存した。　５０％（■／Ｖ）で飽和硫酸アンモニウム溶液を用いた沈澱により免疫グロブリンを５〜２０倍に濃縮した。いくつかの実験でζユＣ３０Ａメンプランコーン（アミコン社、デンバー、ＭＡ）上での遠心により抗体をさらに濃縮した。ＰＢＳ中の濃縮抗体１０マイクロリツトルを供給された（アクラアッセイ、　 ■ＣＮファーマシューティカルズ９　リシル、ＩＬ）対照標準を有する放射状免疫拡散プレートのウェルに加えた。このプレートを２４〜４８時間後に評価した。免疫グロブリンの量り標準との比較により決定した。染色体分析前に記載した方法（４１）を用い、沈澱後、核型を研究した。東］１■上とトーマウスミエローマ類似体の構成Ｉ　ｇＡ／カッパミエローマを有する患者がら骨儲単核細胞を得、凍結保存した。吸引の前に、患者は多くの化学療法剤で重度に治療されており、尿毒症性であり、貧血性であった。血清中には、８ｇｍ／ｄｌの単一クローンＩｇＡ免疫グロブリンが存在していた。液体窒素凍結保存がら回収した後、２５Ｘ１０’骨髄単核細胞を５０Ｘ１０６マウスミエローマ細胞と融合させ、０．２５Ｘ１０Ｇ融合細胞／ウェルでマイクロタイターウェルに播種した。融合後ウアバインをウェル中に加えた。　３週間後、　９６ウエルの内、　６ウエルがハイブリッド成長を示し、４ウエルをマルチウェル中に移しさらに成長させた後免疫グロブリン分泌について検定した。　３ウエルが免疫グロブリンを分泌するものであることが見いだされた。免疫グロブリン分泌…　融合後８週間で徐々に失われた。初期の分泌の質及び持続性を基に、　１つのバイプリドーマを選び、　クローン化した。このハイプリドーマからの、　ＨＭＭＡ２．１１及び２．１２と表示された２つのクローンをさらなる評価のために選ん札　これら誘導体細胞系を、４０μｇｍ　／　ｍ　ｌの６−チオグアニンの濃度にさらされた細胞の成長がさらされていない細胞培養のそれと等しくなるまで、増加する濃度の６−チオグアニンの存在下で成長させた。ついで、細胞系を、５０μｍウアバインの濃度で正常成長が観察されるまで、増加する濃度のウアバインの存在下で成長させた。得られた細胞系は、ＨＡＴに感受性であった。融合効率（データ示さず）を基準として、　１つが他のものより優れていることが見いだされ　これをさらに評価した。この選定された変異株をＨＭＭＡ２．１１ＴＧ／○と名付け、受託番号ＨＢ９５８３の下にＡＴＣＣに寄託した。細胞系ＨＭＭＡ２．ＩＩＴＧ１０ｉ１　２０〜２６時間の倍加時間を有する。これｉＬ　エリザによって検出可能な、　ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ免疫グロブリンのいずれをも分泌しない。この細胞系のハイブリッド誘導は、染色体分析（図ＩＡ）によって証明されており、　これは、細胞当り７７〜８９　（平均８５）の染色体中に混合マウス及びヒト核型を示した。　ＨＭＭＡ、　２．１．　ｌ　Ｔ　Ｇ／Ｑ系の細胞表面表現型は、細胞系のハイブリッド性質を確証している（表Ｉ）、８ＭＭＡ２．ＩＩＴＧ／○細胞は、　Ｉａを欠いているが、ベーター２−マイクログロブリンを保持していることが見いだされた５　表面１ｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧは、カッパ及びラムダ軽鎖と同様に存在しない９元のＢＭＭＣの表面表現型は、強＜ＩｇＡ陽性で、わずかにＩｇＭ及びＩａ陽性であるが、　ＩｇＧでは陰性である。これらデータは、この８ＭＭＡ２．１１　ＴＧ１０細胞系が、マウスミエローマＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３とヒトミエローマ含有骨髄からの細胞との融合から得られたマウス−ヒトハイブリッドであることを示している。表　Ｉ８ＭＭＡ２．１１　ＴＧ／○及びドナー骨髄単核細胞の細胞表面表現型の免疫蛍光分析ヒト単一クローン抗体及び免疫グロブリンの産生ＨＭＭＡ２．１１　ＴＧ１０細胞系及び正常ボランティアからの新鮮なＰＢＭを用いて融合を行なった１表ＩＩに示したように、ＰＢＭ、及びＰＷＭ刺激ＰＢＭとの融合は、ハイブリッドの比較的高い回収率をもたらした。８ＭＭＡ３．６の融合は、ＰＷＭで刺激されたＰＢＭを用いて４日間行い、０．１×１０’細胞／ウエルからの限界希釈でマイクロタイターに播種した。３〜４週間で、４３のウェルがハイブリッド成長に陽性であった。計算した融合効率は、　１／２００５０細胞であった。３３個が免疫グロブリンを分泌した。２つのＩｇＧ分泌ハイブリドーマ及びＩｇＭ分泌ハイブリドーマを、　２５０００．１５６２及び７８１細胞／ウエルの低希釈率で播種されたウェルからクローン化した。これらハイブリドーマから単離されたクローンのわずか４０％が免疫グロブリンを分泌することが見いだされた。これらデータは、ＰＷＭ刺激ＰＢＭとの融合後初めの４〜６週間の間で分泌が不安定であり得ることを示唆している。クローンＨＭＭＡ３．６ハイブリドーマは、４ケ月後の培養停止まで、免疫グロブリンを分泌し続けた。表　ＩＩ８ＭＭＡ２．１１ＴＧ○細胞系との　ムａ：融合Ｆ４、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ、及びＦアは他の細胞系と行なった。ｂ：　ＰＷＭ−ホークライードマイトジェン刺ＷＬ　ＥＢＶ＋ＥＢＶ形質転換、ＴＥＴインビトロ免疫イＥ、、１．ＩＩ−ボランティア細胞源Ｃ：融合細胞数／得られたハイブリッドｄ：Ｉｇ−免疫グロブリン、Ａｂ−抗破傷風抗体ｅ：　４５の内３５がＩｇＭに陽生　及び別の４３の内１】がＩｇｃ免疫グロブリン分泌に陽性ｆ：表ＩＩＩ参照単−クローン抗体を分泌するハイプリドーマは　適切に免疫化された個体からさらなる刺激または選定を行なわずに直接得ることができた。破傷風トキソイドで免疫化されたボランティアからのＰＢＭを免疫化後７日目に得、８ＭＭＡ２．ＩＩＴＧｌｏと２：１の比率で融合させた。融合細胞の限界希釈を０．２Ｘ１０’ 細胞／ウエルから始めて実施し、７００００融合細胞／ウェルを有するさらに３つのマイクロタイタープレートを開始した。　この融合をＦ５と称する。得られた融合効率３社　表ＩＩに示すように、　１／１６０００融合細胞であり、７００００細胞の密度で播種された全てのウェルはハイブリッド成長に陽性であった。全体のＦ５融合の内、３つのウェルが抗破傷風ＩｇＭ抗体を分泌することが見いだされ。その２つをクローン化した。ウェルの５０％以上が抗破傷風ＩｇＧ抗体を含んでいた（データ示さず）が、いずれもマルチウェルに移したときに回収されず、この単一実験ではクローン化しなかった。インビボ免疫化後遅い日時で単一クローン抗体を得ることができることを立証するために、４ないし９週間前には破傷風トキソイドで免疫化したドナーからのＰＢＭを用いてインビボ免疫化を行なった。ＰＢＭ細胞を２４ウエルプレートのウェル中に１．８〜２．５　Ｘ　１０＆細胞／ウエルで置き、破傷風トキソイドを１μｇｍ／ｍｌないし０．１ｎｇ／ｍｌまで添加した。３つの異なる個体を用いた６つの実験において、さらなる刺激を行なうことなく抗破傷風抗体分泌が達成され、培養開始後８〜１２日目にエリザにより検出された。ＰＷＭ対照棗　分泌に対し陽性であったが、非刺激対照ζＬ　陰性であった（データ示さず）、異なる実験において種々の濃度の破傷風トキソイドを有するウェル中で抗破傷風抗体が出現した。５０〜１１００ｎ及び１〜５　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌの範囲内で破傷風トキソイドにより刺激された複製ウェルは全ての検定において陽性であった。５つの実験において、培養後様々な時期に全ての培養ウェルにＥＢＶを添加した。増加する細胞数及びフラスコ中での増殖能力によって決定された形質転換が、ＥＢＶを受けた全てのウェル中でインビトロ免疫後８、１２または１５５日目見られた。ウェルの４０％以下が形質転換されたなら１８８日目たは２１１日目成長を示した。形質転換細胞による抗破傷風抗体分泌＋１　初めに抗破傷風抗体に陽性であり後に形質転換された全てのウェルにおいて、　１２２日目び１５５日目検出された。インビトロ免疫化後に陰性であることが見いだされたウェルは、　１２及び１５５日目ＥＢＶ形質形質転換後２遇３ＩｇＭであり、抗体分泌ウェルのわずか約２０％がＩｇＧクラスの抗体を分泌していた。２つの個体からの、　３つのインビトロ免疫化からの抗破傷風抗体を分泌する６つの別の多クローン性ＥＢＶ形質転換細胞系を融合のために選んだ．一般に、多クローン性ＥＢＶ形質転換細胞系を７．５〜１０×１０６細胞が得られるように増殖させ、　５Ｘ１０＆を８ＭＭＡ２．１　１　ＴＧ／○細胞系と融合させた０表ＩＩにおいて融合効率が示されている場合は、限界希釈を行なった、指摘されている場合は、残りの細胞を１５０００細胞／ウエルでさらなるマイクロタイタイ−に分配した．　ウアバインを２４時間後に融合に添加した．ノ翫イブリドーマの生成は、融合後２１〜２８日目に抗体分泌Ｃ二つし＼ての初期試験時に決定した．８ＭＭＡ２，１１ＴＧ／○とＥＢＶ形質転換細胞系との平均融合効率は、　ｌ／１６６００細胞であった．　１５０００融合細胞／ウェルで播種されたウェルの７２％が成長するハイブリッドを有していた。抗破傷風抗体を当初において分泌する雑種細胞を回収し４〜６回の融合でクロニーングした。融合Ｆ１１およびＦ１２はＩｇＧおよびＩｇＭ抗破傷風抗体を分泌するＥＢＶ転換細胞ラインを用いて行われた。雑種細胞を分泌するクローン化抗破傷風抗体をＦ３、Ｆ８、ＦＩＯ１Ｆｉｌ融合から回収することができた。クローン化された５つの別々の雑種細胞のうち、３つがＩｇＭ抗破傷風抗体を分泌し、ＦＩＬ融合からの２つがＩｇＧ抗破傷風抗体を分泌した。１つの融合Ｆ９（データは示されていない。限られた稀釈が汚染により失われた）は回収不可能な抗体分泌雑種となった。ＥＢＶ転換細胞ラインは融合ののちに冷凍保存されたが、融合の追加は行われなかった。ＥＢＶ転換細胞ラインとの融合における免疫グロブリン分泌雑種細胞の頻度を判定するため、Ｆ９、Ｆ１２融合からの雑種細胞をＩｇＧおよびＩｇＭ分泌について試験した。Ｆ９融合においては、テストされた３２の雑種細胞のうち、２８からのＩｇＭ分泌が認められ、１つはＩｇＧを分泌した（９１％全分泌体）。Ｆ１２融合においては、４５の雑種細胞のうち、３５からのＩｇＭ分泌が認められ（７８％）、さらに４５の雑種細胞のうち、１１からのＩｇＧ分泌が認められた（２４％）。これらの融合からの免疫グロブリン分泌クローンの回収はなされなかった。各融合からの雑種細胞のクロニーング効率を表ＩＩに示すが、平均３１％であった。クロニーングは融合後４〜６週間行われた。前述のように、クローンを収容しているウェルの可なりの区分は抗体分泌に対し陰性であった。抗体分泌に陰性なりローンが免疫グロブリンを分泌している可能性をテストするため、Ｆ１１１００２つの雑種細胞からのクローンをＩｇＧおよびＩｇＭ分泌について試験した。表ＩＩＩから明らかなように、ＨＭＭＡ３．６融合とは対照的に抗体分泌の欠乏は免疫グロブリン分泌の損失の結果によるものではない。なぜならば、クローンの９０％がＩｇＧまたはＩｇＭ、またはこの双方を分泌した。クローンの大部分による非特異的免疫グロブリン分泌は第１次培養における多重雑種細胞の存在または特異性の突然変異的損失によるものと思われる。クローン化された個体群におけるＩｇＧおよびＩｇＭ分泌の双方の分泌は、同じウェルに２つの細胞を接種したものと統計的に一致した。表ＩＩＩ励合ＦＩＬからの第１クローンによる免疫グロブリンおよび抗破傷風抗体分泌陽性クローン数＊・・４８０ウエル中、０．２細胞／ウエルの割合でクローニングされた細胞表現型および染色体分析抗体および免疫グロブリン分泌雑種細胞の雑種誘導を実証するため、親細胞ラインおよび雑種細胞の表面表現型について研究をおこない、その結果を表Ｉおよび表ＩＶに示した。ＥＢＶ転換Ｂ細胞ラインはこれらのライン（４２）に関連する系列および分化の特徴を有する典型的細胞表面抗原を有していた。分析時において、少なくとも２つのこれらの細胞ラインは、カッパおよびラム夕陽性細胞の存在により示されるように多クローン性のものであった。対照的に、クローン化された雑種はＩａ抗原に欠け、ベーター２−マイクログロブリンが可変的に現われていた。幾つかのクローン化された雑種細胞からの細胞は、モノクローン性１ｇＧおよびＩｇＭおよび対応する単一軽鎖イツタイブをそれらの表面に有し、他方、クローン化雑種細胞を生成する幾つかのＩｇＧ抗体は欠落または減少した表面ＩｇＧ表徴を有していた。興味深いことに、１つはＩｇＡ重鎮に対し陽性であった。６つのクローン化雑種細胞研究からの２つものからの染色体試料を図ＩＢおよび図ＩＣに示す。ヒトおよびマウスの双方の染色体はこの試料に明らかに存在している。ＨＭＭＡ２゜１１ＴＧ１０細胞ラインで７７〜８９（平均８５）の染色体／細胞を有するものとは対照的に、これらのクローン化雑種細胞は９４〜１１４（平均１０４）の染色体／細胞を有していた。！ｉ１Ｖ雑ｐＡａＦａおよびＥ［ｌＶ転１１１穐胞株の縄胞表面表現型の免疫蛍光分析坑涼　ＥＢＶ転換細胞株　クローニングされた雑種細胞株Ｂ−２−Ｍ　＋＋＋　＋＋＋　÷÷◆　＋＋＋　Ｕ　Ｕ◆　＋÷　÷÷奢　＋１１ヒトＩＩＭ　ｊ　ＮＤ　ＮＤ　＋＋＋　０４　４０　−　−　ＮＤａ　〜−く２０％、＋−２０〜く５０％、＋＋−５Ｑ〜く７５％、＋＋＋−７５〜１００％ｂ：ＮＤ−不実施抗体分泌の童、期間および安定性抗体分泌を実験室に日常的に保存されている培養から判定した。クローン化雑種細胞ラインの培養からの使用済み媒体を３ないし４日の間隔で集め、プールした。細胞は０．１×１０６ないし０．５Ｘ１０６細胞／ｍ１程度成育させた。上澄液を１０〜２０倍にａＭし、量を放射状免疫拡散により判定した。すべての濃度のものをＥＬ　Ｉ　ＳＡによる破傷風トキソイドとの反応性についてテストし、濃縮しない使用済み媒体の場合の１　：１５００の滴定濃度と比較して、１：４０゜０００以上の滴定濃度で反応性ををすることが見出された。これらの条件下で雑種細胞は８〜４２μｇｍ／ｍｌのＩｇＭ（平均２２μｇｍ／ｍｌ）と、２１−２４μｇｍ／ｍ１のＩｇＧ（平均２２μｇｍ／ｍｌ）とを生成させた。表Ｖ雑種細胞およびサブクローンによる抗体の分泌ａ：　ＨＭＭＡ３．６１１９＝２４ｕｇｍ／ｍｌ　ＩｇＧによる分泌ｂ：　不実施ｃ：　１細胞／ウエルでクローン化したときの抗体に対し陽性のウェルの％クローン化雑種細胞は最初のクローニングの後、５〜１０か月の間、モノクローン性抗体およびモノクローン性免疫グロブリンを分泌しつづけた。現時点のおいて、連続的になされた培養で抗体または免疫グロブリン分泌を失ったものはない。抗体分泌雑種の再クローニングにより分泌の広い範囲の安定性が明らかになった。クローン化雑種細胞を最初のクローニングの後、４〜１２週間再週間−クローニング破傷風抗体分泌についてテストした。表Ｖから明らかなように、新たなりローンの４〜１００％はテスト時に抗体を分泌した。Ｆ１０５モノクａ−ン性抗体間接免疫蛍光が図２に示されている。図２Ａは正常血清（１：１００に稀釈）のＨＩＶ３Ｂ感染ＨＴ−Ｈ９細胞との反応性を示している。約７％は陰性の結果として考える。図２Ｂは患者ＨＩＶ２４　（１：　１００に稀釈）からの血清の反応性を示している。細胞の８５％はこの血清との反応性を示した。図２０は幾つかの非クローン化１０５雑種細胞の１つについての結果を表している。Ｆ’１０５上澄液はこれらの細胞の５４％をラベリングした。ＩｇＧ特異性Ｆ　（ＡＢ− ）　２ヤギ抗ヒトＦＩＴＣを使用したため、これはＩｇＧ抗体を表している。Ｆ２Ｏ３はドツトプロットＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいてＨＴ−Ｈ９／ＨＩＶ３Ｂ感染細胞の上澄液からのｆ（ＩＶウィルスと反応する。Ｆ２Ｏ３は市販のウェスタンプロットキットにおいてはではＨＩＶ−１蛋白とは反応しない。表ＶｌはＦ２Ｏ３がＨＩＶによるＤＥＡＥ活性化ＨＴ−Ｈ９細胞の結合および感染を阻止することを示している。Ｆ１０５抗原は感染性ウィルスに対しての急速接触後においてＨＴ−Ｈ９細胞上に検出されなかったが、後感染の数日以内に検出された。表Ｖ１ −　−　１−ＩＴ−４１９ＮＳ　２＋±１３　２＋１１１Ｖ２４　＋９±ｌＩ２３Ｆ１０５　Ｉ＋±９　１６＋　−ＨＴ−Ｈ９ＮＳ　２０＋１２　２１ＨＩＶ２４　５０＋ＩＯ９３Ｆ１０５　１１＋１０　７９＋　十　ＨＴ−Ｈ９ＮＳ　２５＋Ｉ６　２８ＨＩＶ２４　２６±１２３３Ｆ１０５　１２±１２　２１ −　−　ＨＩＶ３ＢＮＳ　１２＋１２ＨＩＶ２４　８５±１９Ｆ２Ｏ３６３±２８＊・・・この結果は反応を生じさせるためヤギー抗−ヒトＩｇＧＦ　（ＡＢ−）２　Ｆ　ＩＴＣラベル血清を用い、蛍光細胞力たりの百分率で表している。ＨＴ　−Ｈ９細胞をＤＥＡＥの接触させ、ついで媒体、ウィルス、抗体と混合したウィルスと接触させた。この接触は０゜５〜２時間行い、ついでＮＳまたはＨＩＶ２４血清（に５０）、またはＦ１０５上澄液（純）との反応性をテストした。ＨＩｖ３Ｂも同時にテストした。ＩＢは実験１にさらし、実験１ののち４日後にテストした細胞での結果を表している。これらの実験はバックグラウンドを減少させるため、新たな血清、マウス１ｇブロッキングを用い、より短い培養時間で再び行われた。実験の第２のシリーズの結果を下記表Ｖｌｌに示す。これにはＦ２Ｏ３がＨＴ− Ｈ９細胞に対するＨＩＶ−１の結合を抑制することが示されている。表Ｖｌ！Ｆ２Ｏ３によるＨｆＶ−１のＨＴ−Ｈ９細胞への結合の抑制’１ＫＪｋ玉　Ｆ工旦Σ　細胞　ＡＢ／５ＥＲＡ　ＩＦ（１）”　ＩＦ（２）　ＩＦ（３）　ＩＰ（４）−−ＨＴ−Ｈ９ＮＳ　１０±３−−４ＨＩＶＰＳ　Ｉ（１±２−一３Ｆ１０５　９±３−−３＋　−ＨＴ−Ｈ９ＮＳ　７±２　４　１０　７旧ＶＰＳ　４１±２　５　１３　４２Ｆ１０５　７±２″　４　〜　２６＋　＋）ｌＴ−８９ＮＳ　？±！　４．　１３　５ＨＩＶＰＳ　９＋２　．４　１０　１８Ｆ１０５　−　−　−　９ −　−ＨＴ−Ｈ９ＮＳ　ｇ＋２　１４　７　７−旧Ｖ３．　ＨＩＶＰＳ　５５± ２３　５９　５９　６７Ｆ１０５　４２±１９　５４　４３　４８＊・・・ＩＦ（１）＋ウィルスの結合ののちの直後ＩＦ０ウィルス上澄液およびＦ２Ｏ３または媒体を１・１の割合で混合し、３０分間培養し、ついで細胞に２時間添加した。これらの数値は３〜４回の実験の平均値を標準偏差とともに示したものである。Ｆ　（２）　、ＩＦ　（３）およびＩＦ（４）は感染後それぞれ３〜４日、６〜７日、１０〜１１日目に行われた細胞検定を表し、それぞれ２回の実験の平均値である。本＊・・・Ｆ２Ｏ３はウィルスの結合の直後において陰性である（他のデータ参照のこと）。ＨＩＶＰＳおよびＮＳはそれぞれＨＩＶ陽性患者および正常なボランテアからの血清である。血清は１　：　２００の稀釈で用いられた。ヒトモノクローン性抗体Ｆ１０５はＨＩＶ−１ウィルス粒子上にて立体配座的に判定されたエピトープと反応し、ウィルスの結合および感染を防止する（図３および４参照）。考察本発明はヒトモノクローン性抗体を製造するため、ヒト−マウス骨髄腫類似体を構築する方法を提供するものである。このヒト−マウス骨髄腫類似体は、ＩｇＡ骨髄腫を有する患者からの骨髄単核細胞およびマウス骨髄腫細胞ラインＭＯＰＣ２１（３９）の非分泌突然変異体Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３の融合により構築される。非分泌クローン化突然変異型雑種細胞ＨＭＭＡ２．ＩＩＴＧｌｏは６−チオグアニンおよびウアバインに対し耐性を有し、ＨＡＴに対し敏感である。細胞ラインＨＭＭＡ２．１１．ＴＧ１０は、末梢血液単核細胞、ホークライードミトゲン（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ　Ｍｉｔｏｇｅｎ）Φ１１激末梢血液単核細胞およびＥＢＶ転換Ｂ細胞ラインとの高い融合効率を釘する。第２世代難種細胞のクローニング効率は高く、フィーダー細胞の存在を必要としない。５つの融合分泌抗破傷風モノクローン性抗体から７つの別々の雑種細胞をクローニングした。これらの内の５つはＩｇＭｐＪのもので、２つはＩｇＧ種のものであった。抗体および免疫グロブリン分泌は安定であり、分泌は再クローニングなしに５〜１０か月維持された。双方の種類の抗体の分泌は通常の培養において８μｇｍ／ｍ１以上であり、４２μｇｍ／ｍ＋の大きさにも達した。染色体分析の結果、ＨＭＭＡ２．ＩＩＴＧ１０細胞および後の第２世代の雑種細胞の双方において、雑種核型が認められた。本発明において、細胞ラインＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３が、マウスの融合パートナ−として用いられた。なぜならば、これがＭＯＰＣ２１の非生産性誘導体であり、マウスモノクローン性抗体（３９）の製造において検定済み効能の細胞ラインであるからである。ヒト融合パートナ−としては最も分化された細胞が多骨髄腫を有する患者からの骨髄細胞に見出せるものと考えた。さらに、類似体が免疫グロブリンを分泌するならば、より望ましいＩｇＧおよびＩｇＭ抗体から容易に区別し得るようにＩｇＡ骨髄腫が選ばれた。当初の融合が、他のヒト−マウス融合研究者のものと一致する結果を与える一方、得られた非分泌雑種細胞ラインはマウスおよびヒト親細胞の双方の表現型特徴を有し、ヒトＢ細胞とより容易に融合した。さらに、ヒト免疫グロブリンおよび得られた第２世代難種による抗体の分泌はマウス骨髄腫細胞ラインおよび雑種（４３）により見られるものと一致した。したがって、マウス骨髄腫細胞ラインの骨髄腫を有する患者からのヒト細胞との融合は、マウスモノクローン性抗体法で見られるものと同様のヒト融合特性を有するヒト−マウス骨髄腫類似体をもたらした。マウスモノクローン性抗体法の第２の重要な特徴は、プログラムされた免疫化ののち抗体生産Ｂ細胞を容易に多数得ることにあるので、ＨＭＭＡ２．１１ＴＧ１０細胞ラインが適当に免疫化されたトーナーからのＰＢＭ細胞と融合することができ、抗体分泌雑種細胞を容易に生じさせ、この抗体分泌雑種細胞が特別の選択技術（４７）を要することなくクローン化された分泌細胞ラインとして回収可能とすることは重要である。それにも拘らず、興味ある特定の抗原に対する抗体を多く得ることは容易ではない。なぜならば生体免疫化は過去において遠く非最適時に生じ、または生じる見込みのないものであったからである。したがって、抗体分泌Ｂ細胞個体群を融合（２１）のために刺激し、拡張し得ることは重要なことである。生体外免疫化は特に破傷風（４８）、ウィルス性抗原（１５，２１）、および寄生菌（４９）に応答する第２次免疫の生産に効果的に用いられている。多くの多クローン性抗体分泌ＥＢＶ転換Ｂ細胞ラインが末梢血液、排出リンパ節、および生体外免疫化Ｂ細胞（２１）の転換により得られている。上記実験データはＥＢＶ転換を通常の方法で生体外で免疫化することでき、抗体生成り細胞を拡張し、これを後にＨＭＭＡ２．ＩＩＴＧ１０細胞ラインと融合し、クローン化可能な抗体生成雑種を回収しうることを実証している。すなわち、入手可能な既知の抗体を分泌するＥＢＶ転換Ｂリンパ芽球様細胞ライン、最適に免疫化されたボランテアまたは患者がらのＰＢＭ、刺激ＰＢＭ、または生体外免疫化およびＥＢＶ転換細胞を用いて融合を行うことができる。また、ここに開示したデータは、ヒト−マウス骨髄腫類似体、ＨＭＭＡ２．１１ＴＧ／Ｃ１ｆニドモノクロ一ン性抗体の生産のためのすぐれた融合パートナ−であることを示している。抗体生産雑種細胞はＢ細胞と融合ののち、末梢血液およびＥＢＶ転換多クローン性細胞ラインから直接回収することができる。この細胞ラインはヒトの多くの病気の研究にとって貴重である。Ｃ参照文献〕１、　Ｋｏｈｌ＠ｒ、Ｇ、、に１ｌｓｔｓｉｎ、Ｃ，、ｌり７５．　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｏｆＰｕｇｓ＋ｄ　Ｃａ１ｌ曝　Ｓ＠ｃｒ＠ｔｉｎｇ　ＪＬｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　Ｐｒ・ｄ＠ｆＬｎ・ｄ　＃ｐａｃｉｆｉｃｉｔｙ。Ｎａｔｕｒｅ、ツ：４９５゜２、　５ｔ＠１ｎｉｔｚ、　Ｍ、、　Ｚｚａｋ、　Ｇ、、　Ｃｏｈａｎ、　Ｓ、、　！ｅｈｒｅｎｆ＊ユｄ、　Ｍ、。Ｆｌｅｃｈｎｅｒ、ｒ、、１９Ｊｉｏ、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｐｒｏｅｌｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＲｈｅｕｍａｔｏｉｄ　Ｆａｃｔｏｒ　ｂｙ　ｕＶ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｌｙｒｎｐｈｏｃｙｔａｍ、１９ｊｌｏ。Ｎａｔｕｒｅ、ｚ見ｚ：４４コ− 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−４８１４゜１０１、’Ｃ１ａｖｅｌａｎｄ、Ｗ、Ｌ、ａｔ　ａｌ、、１９８コｐ　Ｎａｔｕｒｅ、ｌＱコニ５６−５７゜図ＩＡ図２０要約書本発明はＨＭＭＡ　２．　＋ＩＴＧ１０と命名され、ＤＢ　９５８３の受付は番号でアメリカン−タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたヒト−マウスミエローマ類縁体を提供する。また、本発明はＦ　１０５と命名され、ＨＢ　Ｉｔ］３６３の受付は番号でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマを提供する。本発明はまた、上記ヒト−マウスミエローマ類縁体と抗体産生細胞との融合によって製造されたモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに関する。本発明の他の態様においては、ヒト−マウスミエローマ類縁体をヒト抗体産生細胞と融合させることを具備したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法が提供される。また、病原体関連または腫瘍関連の疾病を有する対象を治療するための治療方法であって、前記モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによって産生され且つ前記疾病に対して特異的なモノクローナル抗体を、対象に対して投与することを具備した方法が提供される。加えて、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）のヒト細胞への結合を阻害する方法、およびヒト免疫不全ウィルス（ｆ（Ｉ　Ｖ）によるヒト細胞の感染を防止する方法、並びに該ウィルス又はその抗原を検出する方法が開示される。補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年８月２６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＢ９５８３の受付け番号でＡＴＣＣに寄託されたヒト−マウスミエローマ類縁体。
２．請求の範囲第１項のヒト−マウスミエローマ類縁体とヒト抗体産生細胞との融合により製造された、ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
３．請求の範囲第２項に記載のハイブリドーマであって、前記ヒト抗体産生細胞が、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭ）、マイトジェン刺激されたＰＢＭ、またはエプスタイン−バールウイルで形質転換されたＢ細胞であるハイブリドーマ。
４．請求の範囲第２項に記載のハイブリドーマであって、前記ヒトモノクローナル抗体が、ヒト骨髄単球性白血病、ヒト急性リンパ芽細胞性白血病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒト結腸癌に対して特異的なものであるハイブリドーマ。
５．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）上のエピトープに向けられ、ヒト細胞に対するＨＩＶの結合を阻害することができ、またはヒト細胞のＨＩＶによる感染を防止することができるヒトモノクローナル抗体。
６．請求の範囲第５項に記載のヒトモノクローナル抗体であって、前記エピトープがＦ１０５と命名されたモノクローナル抗体によって認識されるエピトープであるヒトモノクローナル抗体。
７．ＨＢ１０３６３の受付け番号でＡＴＣＣに寄託され、Ｆ１０５と命名されたハイブリドーマ。
８．請求の範囲第７項のハイブリドーマによって産生され、Ｆ１０５と命名されたヒトモノクローナル抗体。
９．請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体であって、検出マーカーでラベルされたヒトモノクローナル抗体。
１０．請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体であって、細胞傷害剤と結合されたヒトモノクローナル抗体。
１１．請求の範囲第５抗のモノクローナル抗体に対する抗イオドタイプ抗体。
１２．請求の範囲第１１項に記載の抗イオドタイプ抗体であって、検出マーカーでラベルされた抗イオドタイプ抗体。
１３．ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造する方法であって、請求の範囲第１項のヒト−マウスミエローマ類縁体をヒト抗体産生細胞と融合させることを具備した方法。
１４．請求の範囲第１３項に記載の方法であって、前記ヒト抗体産生細胞が、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭ）、マイトジェン刺激されたＰＢＭ、またはエプスタイン−バールウイルで形質転換されたＢ細胞である方法。
１５．請求の範囲第１３項に記載の方法であって、前記ヒトモノクローナル抗体が、ヒト骨髄単球性白血病、ヒト急性リンパ芽細胞性白血病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒト結腸癌に対して特異的なものである方法。
１６．請求の範囲第１３項に記載の方法によって製造された、ヒトモノクロナル抗体を産生するハイブリドーマ。
１７．病原体関連または腫瘍関連の疾病を有する対象を治療するための治療方法であって、対象に対して、前記疾病に特異的であり且つ請求の範囲第２項の前記モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の治療的有効量を投与することを具備し、前記モノクローナル抗体が前記疾病を治癒しまたはその症状を軽減することができる方法。
１８．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記病原体関連または腫瘍関連の疾病は、骨髄性白血病、急性リンパ芽細胞性白血病、結腸癌、後天的免疫不全症候群またはヒト免疫不全ウイルス感染である方法。
１９．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のヒト細胞への結合を阻害する方法であって、ＨＩＶに対して、ＨＩＶのヒト細胞への結合を阻害するために有効な量の請求の範囲第５項のモノクローナル抗体を接触させることを具備する方法。
２０．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるヒト細胞の感染を防止する方法であって、ＨＩＶに対して、ＨＩＶによるヒト細胞の感染を防止するために有効な量の請求の範囲第５項のモノクローナル抗体を接触させることを具備する方法。
２１．サンプル中において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の存在を検出する方法であって、適切なサンプルに対して請求の範囲第８項のモノクローナル抗体を接触させ、該モノクローナル抗体とサンプル中に存在するＨＩＶとの間の抗原抗体複合体を形成することと、こうして形成された複合体の存在を検出することにより、サンプル中におけるＨＩＶの存在を検出することとを具備する方法。
２２．サンプル中において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の存在を検出する方法であって、適切なサンプルに対して請求の範囲第９項のモノクローナル抗体を接触させ、該モノクローナル抗体とサンプル中に存在するＨＩＶとの間の抗原抗体複合体を形成することと、こうして形成された複合体の存在を検出することにより、サンプル中におけるＨＩＶの存在を検出することとを具備する方法。
２３．サンプル中において、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体の存在を検出する方法であって、適切なサンプルを請求の範囲第１１項の抗イデオタイプ抗体と接触させ、該抗イオドタイプ抗体とサンプル中の抗ＨＩＶ抗体との間の抗イオドタイプ抗体−抗ＨＩＶ抗体複合体を形成することと、こうして形成された複合体を検出することにより、サンプル中における抗ＨＩＶ抗体の存在を検出することとを具備する方法。
２４．サンプル中において、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体の存在を検出する方法であって、適切なサンプルを請求の範囲第１２項の抗イデオタイプ抗体と接触させ、該尻イオドタイプ抗体とサンプル中の抗ＨＩＶ抗体との間の抗イオドタイプ抗体−抗ＨＩＶ抗体複合体を形成することと、こうして形成された複合体を検出することにより、サンプル中における坑ＨＩＶ抗体の存在を検出することとを具備する方法。
２５．請求の範囲第２１項に記載の方法であって、前記適切なサンプルがヒト検体からの生物学的液体である方法。
２６．請求の範囲第２２項に記載の方法であって、前記適切なサンプルがヒト検体からの生物学的液体である方法。
２７．請求の範囲第２３項に記載の方法であって、前記適切なサンプルがヒト検体からの生物学的液体である方法。
２８．請求の範囲第２４項に記載の方法であって、前記適切なサンプルがヒト検体からの生物学的液体である方法。
２９．請求の範囲第２５項に記載の方法であって、前記適切なサンプルがヒト検体からの生物学的液体である方法。
３０．請求の範囲第２５項に記載の方法であって、前記生物学的液体が血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液または漿液である方法。
３１．請求の範囲第２６項に記載の方法であって、前記生物学的液体が血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液または漿液である方法。
３２．請求の範囲第２７項に記載の方法であって、前記生物学的液体が血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液または漿液である方法。
３３．請求の範囲第２８項に記載の方法であって、前記生物学的液体が血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液または漿液である方法。
３４．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、前記生物学的液体が血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜放出液、腟粘膜放出液、肛門粘膜放出液または漿液である方法。
３５．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するワクチンであって、ＨＩＶ感染を防止するのに充分な量の請求の範囲第１１項のヒト抗イオドタイプ抗体と、薬剤的に許容され得る担体とを含有するワクチン。
３６．ヒトモノクローナル抗体Ｆ１０５の可変領域をコードするＤＮＡシーケンス。