JPH03183483A - ポリペプチド、組換ｄｎａ、微生物、ポリペプチドの製法、群特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体の製法、及びエンテロウイルス感染の群特異的免疫学的検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ポリペプチド、組換ＤＮＡ、微生物、ポリペ
プチドの製法、エンテロウィルス群特異的ポリクローナ
ル抗体の製法及びエンテロウィルス感染の群特異的免疫
学的検出法に関する。

従来の技術 臨床学的実地においてウィルス感染の血清診断学は中心
的な役割をはたしているが、しばし１７、 ば人のウィルス性心筋炎の原因となるエンテロウィルス
での感染の場合、７０種を越える異なる血清型の多くの
心臓に作用するエンテロウィルスのためにいまだに解決
していない問題がある。エンテロウィルスはまず呼吸管
又は胃腸管に感染し、そこで増殖し、次いでウィルス血
症の場合、種々の目的臓器例えば、心臓、膵臓、中枢神
経又は背髄に感染する。これらのウィルスの例はポリオ
ウィルス、エコーウィルス及びコクサラキーウィルスで
ある。そのようなウィルスでの感染による典型的な疾患
は心筋炎、膵炎及び髄膜炎である。エンテロウィルスは
ＲＮＡ−ウィルスの群に属する。

まさに、多くのウィルス性心臓疾患の頻度を考慮に入れ
ると、エンテロウィルスの群は非常に大きな臨床上の意
義を有する。ウィルス性心臓疾患の原因としてのウィル
ス感染の証明又はエンテロウィルス感染に関する疑いが
ある場合の予防検査は従来著しく困難であった。従来公
知の方法によるウィルス性心臓疾患又は他の疾患に関す
る臨床上の疑いの特異的診断及び確認は著しく困難であ
る。このためには個々の血清型の精製したウィルス粒子
に対して製造された高度免疫血清を使用した。こうして
高度免疫血清が生産されたその該当するウィルスを検出
することだけが可能であった。しかしながら、すでに前
記のように７０種類を越える心臓に作用するエンテロウ
ィルスの血清型が存在するのでこれにより包括的な病原
体検出は可能ではない。一連の種々のエンテロウィルス
間の抗原交差反応は記載されたにもかかわらず、従来エ
ンテロウィルス群特異的血清診断学は個別の血清型間及
び内の抗原異原性により著しく不十分であるかもしくは
不可能であった。更に、従来エンテロウィルスＲＮＡ−
ポリメラーゼに対する抗体の検出のための可能性は全く
なかった。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題はエンテロウィルスのすべての群
にとって特異的であり、患者の血液又は血清中のこれら
のウィルス並びに抗体の存在または不存在をこれに基づ
いて決定することのできる、群特異的検出法に関する必
要条件をつくることである。

課題を解決するための手段 この課題は本発明によるポリペプチド、すなわち次の配
列： ＨＧＣＤ工ｘＩＪＬＣＱ　ＣＴ？Ｇｖ′ＹＦＣＡＳ　Ｋ
ＮＫＨＹＰＩＳＦｌｃ　ＧＰＧＩ、ＶＥＶＱＥＳ　Ｅ’
ＹＹＰＲＲＹＱＳＨＶＬＬＡＡＧＦＳＥＰ　ＧＤＣＧＧ
ＩＬＲＣＥ　ＨＧＶ’ｌＧＩＶＴＭＧ　ＧＥＧＶＶＧＦ
ＡＤＸ　ＩＤＬＬＷＬＲ：ＤＤＧＥＨＥＹＥＥＦ工ＲＫ
ＸＲ５ＶＰＶＧＲＣＬＴＬＦＡＪ’５ＴＬＲＲＫＷＬＤ
ＳＦもしくは、請求項２〜４にアミノ酸３〜４４８（Ｖ
Ｐ４／２／３）、アミノ酸５１６〜９５２（ＶＰ　ｌ）
又はアミノ酸１７６９〜２１２９（ポリメラーゼ）の部
分配列が記載されている有利なポリペプチドにより解決
する。本発明による有利なポリペプチドは別個の、バク
テリア脅威ウィルス性構造蛋白質（ｖｐ４／２／３もし
くはＶＰＩ）並びにコクサラキーウィルスＢ３のＲＮＡ
−依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼである。

特にウィルス性構造蛋白質ＶＰ４／２／３及びｖｐｌ、
更にポリメラーゼがエンテロウィルスのすべての群に特
異的である抗体の形成に導くということが確認されたこ
とは意外であった。明らかにエンテロウィルスの７０を
越えル血清型すべてに共通している抗原特性を有するポ
リペプチドを見い出すことが、本発明によりはじめて達
せられた。

本発明による他の有利な実施態様は本発明によるポリペ
プチド上に存在する抗原決定基を少なくとも１つ有する
ポリペプチドである。

本発明のもう１つの課題は請求項１〜５の１項による本
発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列を好適な
発現ベクター中に組込んで含有する組換ＤＮＡである。

この際、発現ベクターとしては宿主細胞中での発現に好
適なすべての分子、例えばプラスミド、コスミド、７ア
ージゲノムをその二重鎖（ＲＦ）−型等で使用すること
ができる。この際、正しいベクター分子の選択はこの際
発現のために使用すべき宿主細胞の選択に依存し、専門
家には十分に知られている。

有利な実施態様においては、組換ＤＮＡは次の配列を有
する： ０１ ＵＣ１７ＡＡＵＡＣＡＧ　ＡＣＮＪＧＧＴｊＧＣＡ　Ａ
ＡＧＡＧＵＣＵＡＵυＧＡＧＣＵＡＧＵＵ　ＧＧＵＡＧ
ＵＣＣＵＣ５１ ＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＡＵＧＣＣＧＣＵＡＡ　Ｔ）ＣＣ
ＩＩＡＡＣＵＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡ　ｃｃｃｔｒｃ
ａａａｃｃ８０１ ＣＣＡＵＣＣＧＣＣＡ　ＩＦＧＣＣＧＣＡＡＵＡ　ＵＧ
ＡＣＧＵＣＡＣＡ　ＣＣＡＧＡＧＡＵＧＡ　ＧＧＡＵＡ
ＣＣＵＧＧ１８５１ υＧＡＧＧＵＧＡＡＡ　ＡＡＣｔ７ＵＧ＾υＧＧ　ＡＡ
ＡＵＡＧＣＵＧＡ　＃ＧＡＣＩ７ＣＡ　Ｇｔ７ＵＧｔｌ
ＣＣＣＡＧ２０１ ＵＡＣＡＣＵＣＩＪＧＣＣＡＡＵＡＣＣ；Ａ（：Ａ　Ａ
ＧＧＣＡＡＡＣＡＡ　ＣＧＵＧＡＡＣＵＵＣＣＡＡＣＣ
ＣＡＧＣＧ２５１ （：ＡＧＵＴＪＡＣＣＡＣＵＡＣＵＡＧＧＣＡＡ　ＡＧ
ＣＡＵＣＡＣＴＪＡ　ＣＡＡＵＧＡＣＡＡＡ　ｔｒＡｃ
ｃｃｃｃｃｃａ８５１ ＡＣＵＣＣＡＵＣｍｒ　ＡＧＡＱＡＡＡＵＣＵ　ＣＵＡ
ＡＡＡＧＣＣＵ　ＵＡＧＵｔｒＡＡＧＡＵ　ＡＡＵＡＵ
ＣＡＧＣＣ５５１ ＧＧＣＣにＵＧＧＵＧ　ＡＵＴＪＡＵＧＧＡＣＧ　ＡＵ
Ｃｔ７ＡＵｌｌ；ＣＣＡ　ＧＡＡυＣＣＩＪＧＡυＧＧ
ＧＡＡＡＧＡＣＧ６０１ ＴＪＣＴＪＣＣｌｎＪＧＵｔＪ　ＣＩＪＧＣＣＡＡＡＵ
Ｇ　Ｇｔ７ＵＵＣＣＡＧＷ　ｔｉＡＧＡｔＴｔ几ｒＵＧ
υＡＣＣＡＣＣＣＡＵ（：９０１ ＵＧＡＵＧＡＧＣＡＡ　ＧＧＵＧＡＡＡＵＡＧ　ＡＡＩ
Ｊｔ＋’ＵＡＵＵＧＡ　ＧＡＧＣＵＣＡＡＡＧ　にＡＣ
ＧＣＣＧＧＧυ９５１ ＵＵＣＣＡＧＵＣＡｔＪ　ＣＭＣＡＣＡＣＣＡ　Ａ（ｉ
ｔＪＡＡＡＡｃＡＡ　ＡＧＵＵＧＧＡＧＣＣＵ＾ＧυＧ
ＴＪＩ几ｍｃ３５１ ＣＧＡＡＣＣＡＧＡＵ　ＭΩ力ＵＡＣＡＧυＡＧＧＧＧ
ＵＡＡＡ　ＵＵＣＵＣＣＧＣＡυＵＣＩＩ；ＧｔＸ；Ｃ
１ｌ；Ｇ特に有利な組換ＤＮＡは前記配列のヌクレオチ
ド５３２〜２０４１．ヌクレオチド２２８９〜３６００
又はヌクレオチド６０５９〜７１３０の部分配列を本発
明により含有する。

本発明のもう１つの課題は本発明による組換ＤＮＡを含
有する微生物である。特に有利であるのは形質転換大腸
菌株ＶＰ４／２／３　（ＤＳＯＩ Ｍ５５５８）、ＶＰＩ及び３Ｄ　　である。

本発明のもう１つの課題は本発明によるポリペプチドの
製法であり、この方法においてはポリペプチドを形質転
換した微生物の１つから破砕することにより得るか、又
は本発明による組換ＤＮＡを好適な宿主細胞中に装入し
、培地から、場合により細胞の破砕により獲得する。特
に、真核細胞中のポリペプチドの発現において細胞破砕
は多くの場合必要ない、それというのも細胞からの表現
生成物は培地中に放出され、これにより単離が容易にさ
れる。

本発明のもう１つの課題は本発明によるポリペプチド１
種又は複数種、有利にポリペプチドＶＰ４／２／３、Ｖ
ＰＩ又はポリメラーゼ（７）１つを使用してエンテロウ
ィルスに対する群特異的ポリクローナル又はモノクロー
ナル抗体を製造することである。しかしながら、このた
めには相応する抗原決定基少なくとも１つが不完全なポ
リペプチド上に存在するかぎり、かならずしも完全なポ
リペプチドを使用する必要はないエンテロウィルスのす
べての群のウィルスによる感染を特異的に検出するため
の可能性は、本発明のもう１つの課題により、すなわち
被検患者の血液又は血清中のエンテロウィルスもしくは
抗体の群特異的免疫学的検出により可能にされ、ここで
は自体公知の免疫学的テスト、有利にエリザ法中に本発
明によるポリペプチドの少なくとも１つを抗原として又
はこのポリペプチドに対して形成された抗体を使用する
。本発明による群特異的検出法においては専門家に知ら
れている、患者の血液又は血清中に抗原又は抗体を検出
するすべての免疫学的テスト法を使用可能である。血液
又は血清中の抗原の検出の際には本発明によるポリペプ
チドに対する抗体を使用する、次いでこの抗体は血液又
は血清中に存在する抗原を結合する。患者の血液又は血
清中の抗体の検出のためにはこのポリペプチド自体並び
にこのポリペプチドで生じた抗体を使用することができ
る。標識した抗原又は抗体を介しての検出及び例えば壁
結合抗体、抗原等を用いるテストの実際の実施は自体公
知法により実施される。

本発明により、７０種の血清型を越えるエンテロウィル
スすべてｌこ特異的な抗原決定基を含有する本発明によ
るポリペプチドの発見によりはじめてエンテロウィルス
のすべての群に対する群特異的検出を行うことが可能と
なった。

このことはエンテロウィルス感染に対する臨床的疑い、
例えば心筋炎、筋炎、髄膜炎、脳炎、膵臓炎又はポスト
ウィルス性疲労症候群の疑いを有する患者の迅速で確実
な血清診断を可能とする。

実施例 次に実施例と図面により本発明の詳細な説明する。

例　　ｌ ポリペプチドの製造 コクサラキーウィルスＢ３　（ＣＶＢ３）の発現のため
に形質転換大腸菌株ＶＰ４／２／３、０Ｉ ＶＰＩ、３Ｄ　　　を使用した。新鮮なＩ夜培地各１０
０１ｆｌを選択ＬＢ−培地（アンピシリン１００μｇ／
Ｊ１１２を追加したＬＢ−培地）３５０．ｄ中に接種し
、６２０ｎｍで光学密度１．２〜２゜０まで増殖させた
。その後、５６℃の温培地４５０ｄを常に振盪しながら
ゆっくりと添加したこの発現温度に１時間保持した。引
き続き、バクテリアを３５００９　（４０分、４℃）で
ペレットにした。このペレットをバクテリアの溶解のた
めにＰ　Ｂ　Ｓ−ＣＮａＣＱ　Ｏ，１３７ｍａ＋ｏｌ／
Ｑ、ＫＣｌ２３　＋ｍｍｏｌ／　ＱＳＮａ２ＨＰＯ４６
ｍ＋ａｏｌ／　（１，ＫＨ２ＰＯ４Ｉ　ｍ＋ａｏｌ／（
２）　、ＰＨ７，２／　１％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナ
トリウム）中に再懸濁し、ｌＯ分間沸騰水浴中で加熱し
た。このようにして得られた透明で、蛋白質を含有する
溶液をポリアクリルアミドゲル上に直接担持することが
できた。エリザ法への使用のためにはこのＳＤＳ濃度は
高すぎるので、ＳＤＳをＫＣＱの２倍モル過剰で沈澱し
　に　。

例　　２ Ａ）ゲル電気泳動法による組換蛋白質の単離バクテリア
細胞溶解物質を蛋白質の分離のために垂直のポリアクリ
ルアミドゲル（５％の集合ゲル／１３％の分離ゲル）上
に担持し、電場で分離する（　１１６ｍｍ　Ｉ　ｉ著、
１９７０午、Ｎａｔｕｒｅ第２２７巻、第６８０〜６８
５頁）。電気泳動後この蛋白質帯域をコーマシー・ブル
ーで染色することにより可視とし、引き続き別個のウィ
ルス蛋白質を分取単離した。このためには相応する帯域
をゲルから切断し、この蛋白質をアクリルアミドから電
場中で溶離する（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等著、１９８
３午、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、第９１巻、第２２７
〜２３６頁）。得られた蛋白質試料の純度は、分析用垂
直ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置中での蛋白質決
定（Ｗ、５ｃｈａｆｆｎｅｒ及びＣ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ
ｎｌｌｌ　９７３年、Ａ　ｒａｐｉｄ、５ｅｎｓｉｔ−
ｉｖｅ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆ
ｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｄｉｌｕｔｅ　５ｏｌｕｔｏｉ
ｎ、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、第５６巻、第５０２〜５１４頁）に
より調べる。

Ｂ）親和性クロマトグラフィーによるウィルス性抗原の
単離及び精製 エリザ法における非特異的反応を最小にするために、ウ
ィルス性抗原を使用する前に親和性カラムを介して精製
した。このためには、ポリクローナル抗血清、（ａＶＰ
ｌ又はａ　Ｖ　Ｐ　４　／　２／３又はａ　３　ＤＰ０
’）をブロムシアン活性化セファロースに結合した。感
染したベロ細胞（Ｖｅｒ−ｏｚｅｌｌｅｎ）の溶解物Ｃ
ＶＢ３　（コクッサキーウィルスＢ３）中に含有される
ウィルス抗原を結合緩衝液（２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、ｐ
Ｈ８，０）中に取り込み。流ｉ０．０５ｍ／分で相応す
るカラムを介して分離した。引き続き、吸着したｏｔ 高［（ＶＰＩ又１ｉＶＰ４／２／３又は３Ｄ　　　）を
同じ流速及び溶離緩衝液（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２
，７）で結合した抗体から分離し、０．５Ｍ炭酸塩緩衝
液を有するエッペンドル７容器中に捕獲した。試料の安
定化のために、これを引き続きＰＤ−１０カラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）を介してＰＢＳ−中に変換緩衝した。

例　　３ ヒドロキシル燐灰石カラムを通す組換蛋白質の精製 免疫化のために使用される蛋白質試料は高すぎる濃度で
界面活性剤、例えばＳＤＳ又はＮＰ４０を含有すべきで
はない。それというのも、これにより実験動物は死亡す
ることがあるためである。従って、試料からヒドロキシ
ル燐灰石カラム（Ｇ、Ｂｅｒｎａｄｉ著、Ｍｅｔｈ、Ｅ
ｎｚｙａ＋ｏ１．、第２２巻、１９７１午、第３２５〜
３３９頁）を用いてこれらの界面活性剤を十分に除去し
た。蛋白質のマトリックスへの結合は０．Ｏ１ｍｏｌ／
１２燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）中で行われ
た。第２工程においては、カラムの４〜５倍容量の前記
緩衝液をカラム上に添加し、界面活性剤を洗出した。次
いで、最後の工程においては、蛋白質を０　、５　ｍｏ
ｌ／　Ｑ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）で溶離し
た。

例　　４ モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清の生成 Ｂａ１ｂ／ｃ−マウス モノクローナル抗体の生成のために生後約６週間の雌Ｂ
ａ１ｂ／ｃ−マウスを次の免疫化法によりＣＶＢ３で感
染したベロ細胞−溶解物で免疫化した。

ｌ　　　−次 ２１　　　更新 ３５　　　更新 ５０　　　更新 ５Ｉ　　　ブースター ５２　　　ブースター ５３　　　ブースター １５０μ９　　　　＊ ５０μ？ ５０μ？ ５０、ｕ９ ２０μｍ ２０μ？ ２０ｐ’ｉ ＊ ＊ ＣＦ　Ａ　＝　完全７０イントアジユバンスＩＦＡ＝不
完全７０イントアジユバンスＰＢＳ−燐酸塩緩衝液塩溶
液 個々の免疫工程において相当する蛋白質量をそのつどの
添加物中に乳化し、室温で２時間恒温保持し、その後マ
ウスに腹腔内注射した。免疫応答を調べるために、第１
及び第２更新の後マウス血液を尻尾の静脈から取り出し
、組換ＣＶＢ３−蛋白質（ＶＰＩ又はＶＰ４／２／３又
ＯＩ は３Ｄ　　　）に対する血清の抗体力価をエリザ法（例
５Ａ参照）により測定した。

前記方法により免疫化したマウスの免疫グロブリン生産
牌臓とマウス骨髄腫永久細胞列Ｘ６３／Ａｇ８．６５３
との融合をＧ、に６ｈｌｅｒ及びＣ９Ｍ１ｌｓｔｅｉｎ
により記載された方法により実施した（　Ｎａｔｕｒｅ
、第２５６巻、第４９５〜４９７頁）。次いで融合によ
り生じた細胞クローンだけが生存することを確実にする
ＨＡＴ−培地による１４日間の選択を行った。このよう
にして得られた細胞クローンを“限界希釈”により２回
サブクローン化した。ＣＶＢ　３−蛋白質に対する特異
的抗体を生産する細胞クローンを更に培養し、１週間に
１度培地を２／３まで取り出し、新しい培地で変えた。

取り出した細胞上澄を７００９で５分間遠心分離し、透
明な上澄を一２０℃で凍結した。この上澄中にはモノク
ローナル抗体約５〜２０μ９／−が含有されており、こ
れを１：１０に希釈してエリザ法に使用することができ
る。

家　　兎 ポリクローナル抗血清の製造のために３匹の異なる、そ
れぞれ生後６ケ月の雌のニューシーラント家兎を大腸菌
中で発現し、精製したＣＶＢ３−蛋白質（ＶＰＩ又はＶ
Ｐ４／２／３又はｏｔ ３Ｄ　　　）で次の方法により免疫にする：ｌ　　　−
次　　１５０μ９　　本 １３　　　更新　　　７５μ９　　　　　　　＊３６　
　　更新　　　７５μ９　　　　　　　＊６４　　　更
新　　　７５μ９　　　　　　　　　　　＊３ケ月毎に
ＰＢＳ−中の蛋白質７５μ９で更新各更新の前に家兎の
耳静脈から血液５ｄを採血し、その都度抗−ＣＶＢ３−
ｆ白質−抗体力価をエリザ法で測定した。１次免疫後６
４日で、抗体力価は４週間の間隔で家兎の耳静脈から血
液２０ｄを採決することができる程上昇した。室温で血
液凝固が行われた後、血清は３００りで１０分間遠心距
離することにより得られ、引き続き分割し、−２０’Ｏ
で保存した。

例５ エリザ法（Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｌｉｎｋｅｄ　ｂ＋ｍｕｒ
＋ｏ　５ｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ） エリザ法においては抗原−抗体−相互作用が測定される
。この原理は、抗原が固相に結合して提供され、次いで
抗体力価もしく血清中の抗体の存在が測定されるか、又
は抗体が固相に結合して提供され、こうして血清中の抗
原の濃度が測定される、ということである。

−船釣に２つのエリザ型、すなわち基質（抗原又は抗体
）が直接固相に結合している直接エリザ法（第１図参照
）及びサンドウィッチエリザ法（第２図参照）の間に差
をつける。この原理においては抗原が抗体に結合して空
間的に自由に、かつ自然の形で存在する。このことはテ
ストシステムの著しい感度上昇に導＜　（Ｍｏｕｄａｌ
ａ１等著、１９８４午、Ｊ　、　Ｊｍａ＋ｕｎｏ１．Ｍ
ｅｔｈ　、、第６８巻、第３５〜４３頁）。

溶剤： 積層緩衝剤：ｌＱＯｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６ 飽和溶液：　ＰＢＳ−中の０．５％ＢＳＡ　（牛血清ア
ルブミン） 洗浄液：　ｌ　、５　ＭＮａＣＱ ２０％ツウィーン２０ 基質溶液： ａ）１０％ジェタノールアミン緩衝液：１Ｍジェタノー
ルアミン　　　　　９７１２ＭｇＣ１２２Ｘ　６　Ｈ２
Ｏ１００Ｑ をｌ　Ｍ　ＨＣＱ′１′ｐ　Ｈ９，８に調節Ｈ２０−２
回蒸留　　　　　　　全１０００ｄｂ）ＰＮＰＰ（＋）
−ニトロ−フェニル−ホスフェート）をジェタノールア
ミン緩衝液中に１　ｎ／ｌｌｌの濃度で溶かす 終止溶液：３ＭＮａ０Ｈ Ａ）直接エリザ法 人血清中のエンテロウィルス抗体の検出（第１図） 感染したベロ細胞溶解物から得られ、かつ精製したウィ
ルス抗原（ＶＰＩ又はＶＰ４／２／ｏｔ ３又は３Ｄ　　　）の１種（例２Ｂ参照）を積層緩衝液
中に３００ｎ９／１００μＱ／窪（プラスチックマイク
ロ力価プレートの窪）の濃度に希釈し、かつ４℃に恒温
保持した。洗浄液で１回洗浄しＩ；。グラスチック表面
の遊離の結合位を飽和するために飽和溶液／窪２００μ
Ｑを室温で１時間恒温保持した。洗浄溶液で２回洗浄し
た後、検査すべき患者血清を１：１０希釈（ＰＢＳ−中
）で１００μＱの容量において３７℃で２時間恒温保持
した。洗浄溶液で３回洗浄を行った。ＣＶＢ−抗原に結
合した人抗体の検出のために抗人免疫グロブリン複合体
をアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ−複合体）と１００
μＱの容量で３７℃１時間恒温保持を行った。

洗浄液で３回洗浄した後、ＰＮＰＰ−基質溶液１００μ
αを３７°Ｃで暗所３０〜６０分間恒温保持し、引き続
き酵素反応を終止溶液１００μＱを加えて終止させ、吸
光を光学密度４０５ｎｍ（ＯＤ４ｏ５ｎＩＩ＋）で測定
した。

人血清中のエンテロウィルス抗原の検出（第１図） すべての洗浄工程を前記の方法と同様に行った。患者血
清を積層緩衝液中に１ｎｔｏで希釈し、４℃で１８時間
恒温保持した。プラスチック表面の遊離結合位を飽和す
るために、室温で２時間飽和溶液／窪２００μａを恒温
保持した。恒温保持をＰＢＳ−中へのエンテロウィルス
特異的ポリクローナル抗血清（ａＶＰｌ又はａ０ｌ ｖｐ４／２／３又はａ　３　Ｄ　　　）ｌ　：５００希
釈で３７°Ｃで２時間行った。抗原−抗体−複合体を容
量１００ｐ１２でＡＰ−複合体抗一家兎一免疫−グロブ
リンと１時間恒温保持することにより検出した。ＰＮＰ
Ｐ−基質溶液１００μａを３７°Ｃで暗所、３０〜６０
分間恒温保持し、終止溶液１００μＱを添加することに
より酵素反応を終止し、ＯＤ　４０５ｎｍにおける吸光
を測定した。

Ｂ）サンドウィッチエリザ法（第２図）第１の成分とし
ては親和性−精製ポリクロ−プル及びエンテロウィルス
特異的抗血清（ａＶ０Ｉ ＰＩ又はＶＰ４／２／３又は３Ｄ　　　）の１つを３０
０ｒ＋９／１００．ｕ＜１／窪の濃度でプラスチック表
面に結合した（４°Ｏ′ｔｌ′１８時間）。洗浄液で２
回洗浄した後、感染したベロ細胞溶解物からの相応する
精製抗原（例２Ｂ参照）（ＶＰＩ又はａ　Ｖ　Ｐ　４　
／　２　／　３又は３ＤＰ０１）を３００ｎ９／１００
μｍ／窪の濃度で３７°Ｃで３時間予め装入した。その
後、２回の洗浄工程の後ＰＢＳ中に１：１０で希釈した
患者血清を３７℃で１時間恒温保持した。３回洗浄した
後、ポリクローナル抗体（固相成分）、抗原及び人抗体
からなる“免疫サンドウィッチ”をＡＰ−複合体抗人免
疫グロブリンで、この相応する複合体溶液を１時間恒温
保持することにより検出した。基質反応の前に再度３回
洗浄し、基質溶液１００μａを添加し、３７℃で暗所３
０〜６０分間恒温保持した後、終止溶液１００μａで酵
素反応を中断した。最後にＯＤ　４ｏ５ｎｍでの吸光を
再度測定した。

例　　６ 免疫プロット（ウェスターン−プロット）ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド−ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離
した、親和性クロマトグラフィーにより精製したウィル
ス抗［（ＶＰＩ又はｖｐ４／２／３又は３　ＤＰＯＩ）
を電気プロット法（半乾燥）を用いてニトロセルロース
上に移し換えた。この抗原の検出は特異的な抗体反応及
びこれに続く酵素呈色反応（Ｔｏｖｂｉｎ等著、１９７
９年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、第７
６巻、第４３５０〜４３５４頁）、により行われ、これ
により（患者血清からの）入坑体は特異的に特徴づけら
れる。

溶液： 溶液Ｉ： ２５ｍＭｔ−リ　　ス　／ＨＣｆｆ、　　　　ｐ　　Ｈ
８，０７６ｍ　Ｍ　ＮａＣＱ ０．５％ゼラチン ２．５％　ＢＳＡ ０．００３％　ＮＰ４０ ５０ｍＭｌ−リ　　ス　／　　ＨＣｌ２゜１５　ｍ　Ｍ
　ＮａＣＱ ０．２５％ゼラチン ０．１％　ＢＳＡ 溶液■： ｐ　　Ｈ８，０ ０，０２５％　　ＮＰ４０ 抗体溶液：５０ｍＭ）リス／ＨＣＱ、　ｐ　Ｈ８，０１
５ｍ　Ｍ　ＮａＣＱ ０．２５％ゼラチン ３．０％　ＢＳＡ ０．０２５％　ＮＰ４０ 基質溶液：　１００ｍＭ　トリス／ＨＣｌ２．　ｐ　Ｈ
９，５１００ｍＭ　ＮａＣＱ ５　ｍ　Ｍ　Ｍ９０Ｑ２ ４００７７Ｍ　　ＮＢＴ、７０％ジメチルホルムアミド
中 ４００μＭ　　ＢＣＩＰ、１００％ジメチルホルムアミ
ド中 ＮＢＴ＝ニトロ・ブルー・テトラゾリウムＢＣＩＰ−５
−ブロム−４−クロル−３−インドリル−ホス７エート ウィルス抗原ｖｐｏ　ｉ又はＶＰ４／２／３、ｏｔ ３Ｄ　　の５ＤＳ−ＰＡＧＥを行つｔ；後、半乾燥装置
のカソード上にポリアクリルアミドゲルをニトロセルロ
ースフィルター（ＮＣ−フィルター）と共にそれぞれ３
層のワットマン（Ｗｈａｔ＋ｓ−ａｎ）３−ＭＭ−フィ
ルターペーパー間にサンドウィッチとして担持させた。

上方のグラファイトプレート（＝アノード）を上に載置
し、１５０ｍＡの一定の電流強度で９０分以上実施した
。

免疫反応の前準備として、ＮＣのなお遊離の蛋白質結合
位を溶液Ｉ中で１０分間の振盪を２回実施することによ
り飽和にした。患者の血清を抗体溶液中に１：２０で希
釈し、１時間前記フィルターと共に恒温保持した。結合
していないか、又は非特異的に結合した抗体を除去する
ために、ＮＣを１５分間溶液■中で３回振盪した。第２
の抗体、すなわち１　：　５００に抗体溶液中に希釈し
たＡＰ−抗一人一免疫グロブリンー複合体を同様にＮＧ
−フィルターと共に１時間恒温保持した。これを溶液■
中でそれぞれ１５分間３回洗浄しＩ；。呈色反応の前に
フィルターを３ＭＭ−ワットマン紙の間で乾燥した。引
き続き、基質溶液中でのＮＣの恒温保持を５〜Ｉ５分間
行い、その後酵素反応を蒸留水でフィルターを６回洗浄
することにより中止した。すべての恒温保持工程を室温
で実施した。ウェスターンプロット法により入坑血清を
特徴づけることにより、正しい分子量を有する相応する
蛋白質が抗血清から実際に認識されることが示された。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図はエンテロウィルス特異的抗原検出用
もしくは抗体検出用直接エリザ法の構成を示す図であり
、第２図はエンテロウィルス特異的抗体検出用サンドウ
ィッチ法の構成を示す図である。 Ｆｉｇ、１ Ｆｉｇ、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります。】 を特徴とするポリペプチド。 ２、次に記載する請求項１の配列の部分配列（ＶＰ４／
   ２／３） 【遺伝子配列があります。】 を含有することを特徴とするポリペプチド。 ３、次に記載する請求項１の配列の部分配列（ＶＰＩ）
   ： 【遺伝子配列があります。】 を含有することを特徴とするポリペプチド。 ４、次に記載する請求項１の配列の部分配列（３Ｄ−Ｐ
   ｏｌ） 【遺伝子配列があります。】 を含有することを特徴とするポリペプチド。 ５、請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペ
   プチド上に含有される抗原決定基を少なくとも１つ有す
   ることを特徴とするポリペプチド。 ６、請求項１から５までのいずれか１項に記載のポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中に結合
   して含有することを特徴とする組換ＤＮＡ。 ７、次の配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 を含有する請求項６記載の組換ＤＮＡ。 ８、請求項７の配列のヌクレオチド５３２〜２０４１： 【遺伝子配列があります。】 を含有する請求項６記載の組換ＤＮＡ。 ９、請求項７の配列のヌクレオチド２２８９〜３６００
   ： 【遺伝子配列があります。】 を含有する請求項６記載の組換ＤＮＡ。 １０、請求項７の配列のヌクレオチド６０５９〜７１３
   ０： 【遺伝子配列があります。】 を含有する請求項６記載の組換ＤＮＡ。 １１、請求項６から１０までのいずれか１項による組換
   ＤＮＡを含有することを特徴とする微生物。 １２、大腸菌ＶＰ４／２／３、ＤＳＭ５５５８。 １３、大腸菌ＶＰ１．、ＤＳＭ５５２５。 １４、大腸薗３Ｄ＾Ｐ＾Ｏ＾１、ＤＳＭ５５２４。 １５、請求項１から５までのいずれか１項記載のポリペ
   プチドを製造するために、請求項１１から１４までのい
   ずれか１項記載の微生物から、細胞を破砕することによ
   りポリペプチドを獲得するか、又は請求項６から１０ま
   でのいずれか１項記載の組換ＤＮＡを好適な宿主細胞に
   装入し、場合により細胞の砿砕後、培地からポリペプチ
   ドを獲得することを特徴とするポリペプチドの製法。 １６、請求項１から５までのいずれか１項記載の有利に
   請求項２から４までのいずれか１項記載のポリペプチド
   を使用することを特徴とするエンテロウィルスに対する
   群特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体の製法
   。 １７、患者の血液又は血清を検査することによりエンテ
   ロウィルス感染を群特異的に免疫学的に検出する方法に
   おいて、自体公知の免疫学的テストに抗原として請求項
   １から５までのいずれか１項記載のポリペプチドの少な
   くとも１種をエンテロウィルスに対する抗体の検出のた
   めに、または請求項１６により製造された抗体をウィル
   ス特異的抗原の検出ために使用することを特徴とするエ
   ンテロウィルス感染の群特異的免疫学的検出法。