JPH03183952A - 免疫体固相化体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、検査、診断等に多用されている免疫学的検査
薬における、高感度な免疫体固相化体の製造方法に関す
るものである。特に、本発明は包括固相化による免疫体
固相化体の製造方法の改善に関するものである。尚、本
発明でいう免疫体とは抗体、抗原またはハプテンのこと
である。

〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕血清、尿
等の体液に含まれる生体試料中の微量成分（例えば、ホ
ルモンなど）や薬物の検出及び測定は、臨床上極めて重
要であって、従来、種々の方法によって行われている。

かかる方法のうち代表的には、体液中の被検物質である
抗原（又は抗体）と、これらに対して特異的結合性を有
する抗体（又は抗原）を利用する免疫学的測定法が知ら
れている。なかでも、抗原抗体間の反応の有無やその程
度を知るために、放射性同位元素を用いたラジオイムノ
アッセイ（Ｒ［八）や酵素を標識した抗体や抗原など、
酵素標識免疫体を用いる酵素標識免疫測定法（ＥＩＡ）
が使用されるが、特に近年、酵素標識免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が、その高感度性、測定の安定性、簡易性及び安全
性等の理由から広く用いられている。

これらの方法は、抗原抗体反応が非常に特異的であるこ
と、きわめて鋭敏であることを利用して今まで測定が不
可能であった微量の抗原性のある物質の測定を可能なも
のにした。これらの方法は、最初血中のインシュリンの
測定法として開発されたものであり、その後数年間、そ
れ自身で抗原となりうるポリペプチドホルモンの測定法
として発展してきた。更に、それ自身では抗原となり得
ない小分子の物質でもアルブミンやその他の大きい分子
などと結合させ、その物質と反応する抗体を作ることが
可能となった。現在では、小分子のペプチドホルモンや
甲状腺ホルモン、ステロイドホルモンなどの微量物質の
検出にも利用されている。

かかる免疫測定法には、通常、抗原抗体反応の結果生し
た結合型（Ｂ型）と、結合していない遊離型（Ｆ型）と
の分離、所謂Ｂ／Ｆ分離が必要である。かかるＢ／Ｆ分
離法として、免疫学的方法である二抗体法、電気泳動、
クロマトグラフィー透析などの物理化学的方法、ポリエ
チレングリコル、アルコール、ジオキサンなどを用いる
分配法、イオン交換樹脂、セファデックスなど化学吸着
剤を用いる方法、プラスチック、セファローズ、多孔ガ
ラス片を用いる固相法などが利用される。

特に、この固相法によれば、固相担体の表面に抗体（又
は抗原）を固定化し、この固相化抗体（又は抗原）に測
定すべき抗原（又は抗体）を結合させた後、反応に関与
しなかった抗原（又は抗体）を洗浄除去すれば、担体上
にＢ型の抗原または抗体を固相として分離することがで
きる。

酵素標識免疫測定法（ＥＴＡ）において最もよく用いら
れている所謂ヘテロジニアス非競合法では、上記固相Ｂ
型の抗原（又は抗体）に更に酵素標識抗体（又は抗原）
を作用させた後、Ｂ型標識複合体の活性を測定し、測定
すべき抗原量（又は抗体量）を求める。

従って、抗体又は抗原を担体に固相化する方法は、免疫
測定法において重要な技術の一つであって、例えば、共
有結合法、物理的吸着法等によって、不溶性の担体に免
疫を固定化する方法が既に従来から知られているものの
、尚、多くの問題が存在している。例えば共有結合法で
は、免疫体の結合収率は、通常２０〜８５％程度であっ
て、残りの免疫体は利用されないうえに、共有結合法に
よる結合の過程で免疫体の活性を失活させ、或いは阻害
することも多い。更に共有結合法は、その操作が高度の
技術を要し、且つ煩雑であり再現性も安定していない。

物理的吸着法では、一般に免疫体の固定化率が低く、更
に担体によっては免疫体が担体から遊離する恐れがあり
、反対に異種蛋白質を吸着して、免疫体の反応性を変化
させたりすることもある。

免疫体を高分子重合体や天然高分子で包括固相化する方
法も試みられている。この方法は、操作が比較的簡単で
架橋剤を使わない場合は免疫体の失活も比較的少ない。

種類は少ないが高分子によっては感度も他の固相化方法
と同等以上になる。

特に近年、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）やヒドロキ
ンプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などの親水性
で界面活性剤的性質を有する高分子による包括固相化は
、感度が高くでることがわかってきている。

従って、本願発明は、従来の免疫体固相化方法の中の包
括固相化方法を改善することで、従来のものより高感度
な免疫体固相化体の製造方法を提供することを目的とす
る。

［課題を解決するための手段〕 本願発明者は、上記目的を達成するために種々研究を重
ねてきたところ、免疫体を親水性ポリマによって、担体
上に包括固相化する際に、蛋白質分解物、ポリペプチド
などの２以上のアもノ酸がペプチド結合してなる化合物
（低分子量アミノ酸重合体）、アミノ酸を存在させるこ
とによって、従来の固相化体より高感度に測定が行える
固相化体が得られることを見出して本発明を充放した。

即ち、本発明は免疫体が親水性ポリマーによって担体上
に包括固相化された免疫体固相化体を製造する際に、ア
ミノ酸および２以上のアミノ酸がペプチド結合してなる
化合物（以下、これら化合物を総称して、アミノ酸化合
物ということもある）から選ばれる少なくとも一種の化
合物の存在下に固相化することを特徴とする免疫体固相
化体の製造方法である。

免疫体、親水性ポリマー、低分子量化アミノ酸重合体は
、水溶液に混合−溶解させたあと、水不溶性担体に塗布
または含浸させ、乾燥させる。

本発明において免疫体とは、種々の抗原または抗体を意
味する。抗体としては、例えばＩｇＧ、そのＦ　ａｂ、
　Ｆ　（ａｂ）　２等いずれでもよく、また抗原も特に
限定されるものではなく、例えばインシュリン、上皮細
胞増殖因子（ＥＣＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
、卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）黄体形成ホルモン（
Ｌ　Ｉ−（）　、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、
成長ホルモン（ＧＨ）、乳腺刺激ホルモン（ＰＲＬ）、
カルシトニン（ＣＴ）、胎盤性ゴナト用・ロピン（ＨＣ
Ｃ，）、胎盤性ラクトゲン、グルカゴン、セクレチン、
ガストリンなどのポリペプチド類、プロテアーゼ、ホス
ファターゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素、アルブミン
、ＨＢ　ｓ抗原などのタンパク質又はその複合体、リピ
ドＡなどのリボ多糖、核酸、ウィルス、細菌、細胞自体
などを挙げることができる。

本発明における親水性ポリマーとしては、例えば、メチ
ルセルロース、エチルセルロース、ヘンシルセルロース
、シアノエチルセルロース、ヒじロキシエチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、ア
ミノエチルセルロースなどのセルロースエーテル樹脂、
ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポ
リエチレングリコールなどを挙げることができる。

本発明において、かかる親水性ポリマーが単独にて又は
２種以上の混合物として用いられる。

本発明において、２以上のアミノ酸がペプチド結合して
なる化合物（低分子量アミノ酸重合体）としては、通常
、２〜１００個、好ましくは４〜７０個、更に好ましく
は１５〜５０個のアくノ酸がペプチド結合してなる化合
物が好適であり、分子量として捉えるならば２００〜１
４０００、好ましくは６００〜９６００、さらに好まし
くは、２０００〜６０００程度が好適である。かかるも
のの例としては、例えば蛋白質分解物、オリゴペプチド
、ポリペプチドなどが例示される。

蛋白質分解物は、蛋白質を酸もしくはアルカリによる加
水分解、蛋白分解酵素による分解などに付すことによっ
て得られるものである。蛋白質の種類によって条件は多
少異なるが、その際使用される酸としては塩酸、硫酸、
硝酸などが例示され、好ましくはｐ　Ｈ１，０〜６．０
、特にｐ　Ｈ１，４〜４．５にて、封管中／ｌ〜１１０
°Ｃ１特に６０〜１０５°Ｃ１１〜１００時間、特に２
〜３０時間処理したものが好適である。蛋白質には特に
制限はなく、例えば、カゼイン、アルブミン、ゼラチン
、アクチン、プロタミン類、ヘモグロビン、ミオグロビ
ン、γβ、α−グロブリン、ごオシンなどが例示される
。

オリゴペプチド、ポリペプチドとしては、例えば、Ｌ−
グルク飽ルーＬ−チロシン、グリシルＬ−グルタごルー
Ｌ−チロンン、インシュリン、ベプＩ・ン、ポリーＬ−
リジン（分子ｆｆ１５０００〜１５０００）などが例示
され、−ａに自体既知の化学合成法によって製造される
。

アミノ酸には、特に制限はなく、例えば酸性アミノ酸（
例えば、アスパラギン酸、グルタごン酸など）、塩基性
アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンな
ど）、中性アミノ酸（例えば、グリシン、トレオニン、
アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、１〜リブト
フアン、バリン、ロイシン、チロシンなど）などの他に
、アザトリプトファン、エチオニン、フルオロフェニル
アナリン、チエニルアラニンなどのアミノ酸アナローグ
をも包含する概念である。

本発明において、固相化用担体は、この分野で使用しえ
るものであれば、いずれも好適に使用しえる。例えば水
不溶性の重合体からなる多孔質膜、ガラス繊維フィルタ
ーや、種々の合成繊維からなる不織布、種々の重合体か
らなるビーズなどが用いられる。固相化用担体は、これ
らに限定されるものではないが、上記した中では、比表
面積が大きい多孔質膜や不織布が好ましく用いられる。

特に限定されるものではないが、本発明においては、親
水性ポリマー−免疫体調製液における親水性ポリマーの
濃度は０．１重量％以上であることが好ましい。親水性
ポリマー−免疫体調製液における親水性ポリマーの濃度
が０．１重量％よりも小さいときは、親水性ポリマー−
免疫体調製液を水不溶性の固相化用担体に塗布または含
浸させた後、乾燥させても、固相化された免疫体につい
て、高い保存安定性を得ることが困難である。更に、親
水性ポリマー−免疫体調製液における、親水性ポリマー
の量は、免疫体に対して、重量比で０．５〜２４００倍
量、好ましくは２〜８００倍量の範囲であることが望ま
しい。アミノ酸化合物の使用量は、免曳体に対して、重
量化で０．０１〜５００倍量が好適である。

本発明によれば、例えば上記の免疫体、親水性ポリマー
およびアミノ酸化合物を水性溶媒（例えば、０．１ＭＢ
ＥＳ緩衝水溶液（ｐＨ７，２）など）中で撹拌溶解し、
上記担体上にキャピラリー、ピペツト、定量吐出装置な
どで適官の面積に塗布し、その後望ましくはアルコール
、ブロック剤などの処理を施して、最終的には乾燥する
ことで感度のすぐれた免疫体固相化体を得ることができ
る。

乾燥条件としては、特に限定されるものではないが、通
常、温度４〜４０’Ｃ，湿度４０〜７５％にて１時間乃
至４８時間程度を要して、乾燥するのが好適である。

このようにして、親水性ポリマー−免疫体調製液を乾燥
させた後は、例えば、湿気を透過させ難いアルミニウム
箔や樹脂フィルムにて密封保存すれば、固相化した免疫
体を一層安定に保存することができる。

更に、本発明の製造方法においては、上記親水性ポリマ
ー−免疫体調製液の乾燥は、凍結乾燥によることが好ま
しい。凍結乾燥は、通常の方法によって行えばよい。か
かる凍結乾燥によって、固相化された免疫体を更に安定
に保存することができる。

以上の固相化方法により得られた免疫体固相化体を用い
て免疫学的測定を行う場合は、通常固相化した免疫体の
種類に対応する標識免疫体を混ぜ合わせた溶液を用意し
て、被検液を添加した後、該標識免疫体混合溶液を添加
することによって行われる。

〔実施例〕

以下に実施例、比較例および試験例を示して、本発明に
よる免疫体固相化体の製造方法を説明するが、本発明は
これら実施例により何ら限定され２ るものではない。

実施例１〜１３・比較例１〜５ 種々の蛋白分解物、ポリペプチドもしくはアミノ酸を添
加したことによる影響を調べる目的で、ポリビニルアル
コール（ＰＶＡ）による包括固相化法によって、第１表
に示す抗ＨＣＧ　（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）抗体固
相化体をそれぞれ調製した。

第１表に示すように、種々の蛋白分解物、ポリペプチド
、アミノ酸もしくは蛋白質を各々の濃度にて、抗ＨＣＧ
抗体（ウサギ抗血清）　０．２　ｍｇ／ｍｌ、ＰＶＡ　
（ＰＶＡ２２０、クラレ社製）２．４重量％に対して加
え、０．１ＭＢＢＳ緩衝液（ｐＨ７，２）中にて混合−
溶解して、親水性ポリマー−免疫体調製液を調製した。

これら水溶液２０μｌをそれぞれ１０１０ｍｍＸ７０の
短朋状に切断したガラス繊維濾紙の片端から１５ｍｍの
所に滴下−浸透させた。

該片端部分は、測定時の被検液、試薬液の吸液口となる
。次に、該ガラス繊維濾紙をメタノール中に２３°Ｃで
２時間浸漬し、１５°Ｃにて風乾した後、１．８％牛乳
カゼイン、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液中に４°Ｃ１１５
時間浸漬した。次に０．０５　ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝
液（ｐＨ７，４）に２３’Ｃにて４５分間浸漬した後、
１５°Ｃにて風乾し、これを固相化体とした。

〔試験例１〕 上記方法によって得た固相化体を用いて試験を行った。

ヒト尿から抽出したＨＣＧを、各濃度になるように０．
０５　Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ７，６、牛
血清アルブく７１．０重量％および０．９重量％含有す
る）中に溶解させ、このＨＣＧ水溶液をそれぞれ被検液
とした。

別に、酵素免疫測定法のための試薬を作製した。

Ｂ／Ｆ分離後の洗浄剤は、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０．２
Ｍ塩化ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８，
２）の水溶液に調整した。

基質・発色液反応後の洗浄反応停止液は、０．５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０．２Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，０）の水溶液に調整した。

基質・発色液は、１．２　ｍ　Ｍ　５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルホスフェート、０．１６ｍＭニト
ロブルーテトラゾリウム、１．０　ｍ　Ｍ塩化マグネシ
ウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐ　Ｈ８，８）の水溶
液に調整した。

酵素標識抗体は、抗体としてマウスモノクロナール抗β
ＨＣＧ抗体（オンコジーン・サイエンス社製、ＧＦＯ３
）を、酵素としてアルカリホスファターゼ（子ウシ腸由
来、ヘーリンガー・マンハイム■製）を使用した。抗体
と酵素の結合には、公知の二段階グルタルアルデヒド法
（＾ｖｒａｎｅａｓ、Ｓ。

ａｎｄ　Ｔｅｒｎｙｎｃｋ、Ｔ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　８＋１１７５−１１７９゜１９７１）を若
干修正した方法を用いた。

測定に際しては、被検液、各試薬液を、反応させる順番
にガラスプレート上の各ウェルに一定量入れておく。被
検液は２８０μ忍、標識抗体液１５０μｌ、洗浄液２６
０μｌ、基質・発色液１５０μｌ、反応停止液２４０μ
ｌと、この順番に入れる。そして、上記固相化体に吸液
口からこの順番で液を吸わせる。ただし、標識抗体液吸
液後は１分間、５ 基質・発色液吸液後は２分間の反応時間をもうける。反
応停止液の吸液後は３０秒以内に発色の様子を観察する
。

その結果を第１表に示した。

ことわりがなければ、各添加物は、和光純薬社製を使用
。

（以下余白） ６ ※　感染後１０日以上あとに採取した血清を測定；間近
で凝視しても発色なし。

；極く薄く見えづらい青色。

±　；薄いが容易に視認できる青色。

＋　；比較的強くいかにも色が付いたという感じ。

十十；強く深い紫色。

〔試験例２〕 抗インシュリン抗体の固相化およびこれを用いて試験を
行った。また、ＰＶＡ０代わりにセルロース系の水溶性
高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を用い
た。

抗ヒトインシュリンにワトリ抗血清）を０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，８）にて透析し、遠心分離に不溶物を除
去した後、０．２重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
および０．１重量％ナトリウムアジドを含む０．０３　
Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（７，４）に加えて、抗体タンパ
ク質濃度を８．０■／成に調製した。

この抗ヒトインシュリン溶液２００μ℃を０．５重量％
カサミノ酸または１．０重量％グリシン３．２重量％と
２．８重量％のヒドロキシプロピルメチル９ セルロースを含む上記と同し緩衝液３００μ乏に加え、
よく混和した後、約２０°Ｃで１日間静置した。

後は、試験例１と同様にして固相化および試薬の調整を
して試験を行った。その結果、カサミノ酸もしくはグリ
シンを入れた場合は、入れてないかカゼインを添加した
とき（コントロール及び比較例１〜５）に比べ何れも感
度が上昇した。また、コントロールがインシュリン濃度
０のとき７回測定中２回−′程度の非特異発色を起こし
たのに比べ、カサごノ酸もしくはグリシンを入れた場合
は、同し回数測定を重ねても非特異発色は認められなか
った。

〔発明の効果〕

本発明によれば、親水性ポリマーによって免疫体を包括
固相化する際に、アミノ酸化合物を存在させるという簡
単な操作によって、高感度の免疫体固相化体を製造する
ことができる。

０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 免疫体が親水性ポリマーによって担体上に包括固相化さ
   れた免疫体固相化体を製造する際に、アミノ酸および２
   以上のアミノ酸がペプチド結合してなる化合物から選ば
   れる少なくとも一種の化合物の存在下に固相化すること
   を特徴とする免疫体固相化体の製造方法。