JPS5960260A

JPS5960260A - 酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPS5960260A
Application number: JP17218382A
Authority: JP
Inventors: Eiji Ando; 英治安藤; Tsuneo Haniyu; 羽生　恒男; Kentaro Yoda; 依田　賢太郎
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1982-09-29
Filing date: 1982-09-29
Publication date: 1984-04-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は酵素免疫測定法に関するものであり、その目的
は画素免疫測定法の操作を簡略化し標準曲線の逆Ｖ字型
を回ＩＨｔすることにある。

従来より生体内の微力１成分の測定に非常に特異的かつ
鋭敏な抗原抗体反応を利用する方法が数多く開発され、
臨床検査分野において非常に多く利用されている。その
中でも、放射免疫？Ｉｕｌ＋定法（以下ＲＩ　Ａと略す
）、酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと略す）は、１ａｌｌ
＋定感度が非常に高く、定量性に優れているため広い応
用範囲を有しており、測定可能な物質も、ペグチド、ホ
ルモン、免疫グロブリン等の高分子物質からステロイド
、薬物等の低分子物質まで多種多様にわたっている。し
かじなからＲＩ　Ａはラジオアイソトープを使用するた
め、被爆、その取扱い管理、廃棄等、種々の問題をかか
えている。そのためＩＬ　Ｉ　Ａに代わる測足法として
、標識物質としてのラジオアイソトープを使用ぜず、酵
素を標識物質とするＥＩＡが近年脚光をあびてきた。Ｅ
　Ｉ　Ａの測定原理は競合法及びサンドイツチ法と呼ば
れる二種類の測定原理が広く用イラれている。以下サン
ドインチ法についてｎ９明する。

１ず、サンドイツチ法の測定原理の概要を図面によって
説明する。第１図に示すように、測定物質（以下、抗原
と呼ぶ）ａとその抗原に対する抗体を不溶化した不溶化
抗体ｂ’に反応させる。両者ν」、抗＋＋５を抗体反応
を生じ、ネ゛す合体Ｃを形成する（第１反応）。この？
ニア合体ｃｆ反応混合液よシ分離し、測定抗原に対する
抗体にｒ）γ素全結合させた酵素標識抗体（１の−＞ｊ
憂１１と反応させる（第２反応）。ｊｉｊ：素イ４＋！
識抗体は杓合体Ｃに結合するが、複合体Ｃの結合ス１ヒ
を越えたｆｊｉの１：ン素標識抗体は遊離状態で存在す
る。次に前期複合体に結合した標識抗体ｄ１と遊１ｉ、
ＩＵ状態のｒｉｊＱ素（：“１ｖ識抗体ｄ２を分離し、
いずれかのｌ′ｉ、素活４ツＦを測定する。同時に既知
濃度の標準物質を用いて同様Ｋ（パｆ１作して４！１１
準曲Ｉｖｉ！を作成し、これによって未知の抗原量を求
める。

上記ザンドイノチ法は測定しうる抗原量の変化が酵素標
識抗体の活性の変化箕に対応するので広い範囲にわたる
抗原の測定が可能である。しかしながら測定法は、第１
反応、第２反応、酵素反応という三段階のＪ・■作が必
要で非常に煩雑であるという欠点を有している。そこで
これらの欠点を改良したＥ　ｉ　Ａが４！ｆｌ；−；」
昭５３−４７５１８号公報、５３−４７５１９号公報に
おいて報告されている。それによると、第１反応終了後
、抗原抗体反応複合物を混合液よシ分離せず、標識抗体
を加えるという方法と、測定物質、同相化抗体、イ＝識
抗体を同時に作用させ、次いで固相上の酵素活性を測定
する方法とが記載されている。これらの方法は、分Ｓ操
作が１回で済み、操作が簡略になったＥ　Ｉ　Ａの改良
法である。

しかしながら、この改良法においては、抗原１．ｔの増
加に従って標準曲線が逆Ｖ字型を示す事が報告されマい
る。この場合、抗原量が非常に多い場合には、見かけ上
実際の抗原量よりも非常に低い抗原量として検出してし
まい、擬隘性を示してしまうか、あるいは検体を希釈し
て再測定しなければならず、測定の二度手間になり操作
を簡便化するための改良法としては意味がない、特に測
定物質（抗原）、不溶化抗体、酢素神識抗体金同時に反
応させ、抗原抗体複合物に結合した酵素標識抗体または
、遊離状態の酵素標識抗体の酵素活性を測定するＥ　Ｉ
　Ａでは、一般には特開昭５３　４７５１９号公報にも
示されている様に抗原ｈ１が増加すると第２図１３に示
す如く、逆Ｖ字型の標準曲線が得られる。

本発明者らはこのオ・口準曲綜の逆Ｖ字型を７９子決す
るため種々？ｉＪＦ究した結果、庶くべきことに血清蛋
白質全主体とする媒ａ中にポリアルキレングリコールの
有効ｉ１１を添加し、反応を行うと標準曲線の逆Ｖ字型
を回避できることを見い出し本発明に到Ｐ；？シた。

すなわち不発り−１は側５ピ物質に、この物質に特異的
に結合する抗体全不溶化した不溶化抗体および抗体に酵
素を結合させた酵素標識抗体を作用させ、側だ物質にｉ
’、！ｊ合した７、ｑ、％素（；ヤ識抗体または結合し
なかった？４チ素４：ｌ識抗体の酵素活性を測定するこ
とにより、１ｌｌｌ！定物質の′１１１を測定する酵素
免疫測定法において、血清３（ｙ白質およびポリアルキ
レングリコールの存在下に不溶化抗体全作用させること
を特徴とする酵素免１−′ヒ測定法である。

本発明ではＩ＝；　Ｉ　Ａ　Ｋおける操作の煩雑性及び
標準曲線逆Ｖ字型（抗原量が異常に高い場合には低値を
示してし甘う）という欠点を有しない。

不発ツＪの酵素免疫法は測定物７りに、この物質に特異
的に結合する抗体を不溶化した不溶化抗体および抗体に
酵素を結合させた酵素標識抗体を作用させ、測定物質に
結合した酵素標識抗体または結合しなかった酵素標識抗
体の酵素活性を測定することにより、測定物質の９’ｆ
　ｆ　１ｌｌｌ定する方法である。

反応形態としては下記のものがあげられる。

（Ａ）　　測定物質に不溶化抗体を作用させ、次いで標
識抗体を作用させる。

０３）　　測定物質に標識抗体を作用させ、次いで不溶
化抗体を作用させる。

（０測定物質、不溶化抗体および標識抗体の三者を同時
に反応させる。

物に三者を同時に反応させる（Ｑの方法が好せしい。

本発明では（５）測定物質と不溶化抗体、（至）測定物
質−（・ツ識抗体結合体と不溶化４＋’ｉ体、（Ｑ測定
物質、不溶化抗体および標識抗体を血清蛋白質およびポ
リアルキレングリコール存在下で行なう。

本発明のポリアルキレングリコールとしてはボリエチレ
ングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ子トラ
メチレングリコールなどがある。

木兄ψＩにおいて用いるポリアルキレングリコールの平
均分子（１１は１．、ＯＯＯ〜２０，０００、好寸しく
け４．０００〜６．０００のものである。添加量として
は、約１〜１０５ｎ　ｆｆ　対’：（：　ｆｉ４：　（
Ｗ／　Ｖ　）　％　、好ましくは３〜６　！Ｒ（ｉ：対
答ｔｉｔＣＷ／Ｖ　）％である。１重量対容量（Ｗ／〜
′）チ未満であると、本発明の目的が達成されない。１
０重量対対答Ｌｉ゛（Ｗ／Ｖ　’）％を越える添加は血
ｒ／ｉ　；）（白りｔの沈ン讃ヲ引き起こし、好ましい
ものではない。又、血清道イ白質としては、牛血清、牛
アルブ］ン、ヤギ血ｆｉ！、ウマ梅漬、家兎血清等多種
挙げられる。添加１１トとしては約１〜３０容量チ、好
ましくは５〜１０容量係である。１容斯チ未満であると
本発明の［」的が達成されない。まだ３０容−ｒａ：％
を越えると正確な測定ができない。

本発明全実施例により具体的に説明する。

実施例１　ヒトイムノグロブリンＥの測定ａ）ヒトイノ
、ノブロブリンＩｉｉ　（以下■Ｌ？Ｅと略す）稗準溶
液の調整Ｉ、Ｅ高値のヒト血清（ヘキスト社製）’１ＷＨＯのＩ
　ｙ　Ｅ　［準品７５１５ｏ２を用いて、−元放射状免
疫拡散法により濃度を検定し、家兎血清で、２５．５０
．１００．２００．４００．８００．１，６００．３．
２００．６、４００．９，６００　Ｕ／ｍｌのｆＡ度に
調製した。

ｂ）抗１，１弓抗体の製造ヒトＩｙＥ’ｆｆｉフロイントの完全アジ該バンドとと
もに家兎に免疫した。得ら１．た抗血清ヲ３３％　’Ｌ
Ｗ酸ナトリウムで塩析しイムノグロブリン画分ｔ　４４
）た。このイムノグロブリン画分をヒトＩ。

Ｇ、ＴＭ、Ｉ、Ａ、、　Ｉ、Ｄを結合させたセファロ−
？ス４１３カラムに通し、素通りしたＩ、ｈｉＫ特異的な
Ｉ、（＃画分金得、抗ヒ）Ｉ、ＩＪ抗体とした。

Ｃ）抗Ｉ、Ｅ抗体−酵素結合物の製造５■の西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略
す。東洋紡績株式会社製グレード１−Ｃ）　’ｆｆ１ｌ
−の０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、Ｑ、１
ｍ７！の１％２．４ジニトロフルオロベンゼンを加えて
室温で１８ｅｊ間攪拌した。この溶液ＫＯ，０６Ａ４過
ヨウ素酸ナトリウム溶液１ｍｅを加え３０分間室温で］
１゛ノ拌後、１．０ｒｎＩ！の０．１６　Ｍエチレング
リコール（′１才液を加え、室τ、情で１時間攪拌し体
ｋＯ，ｏＩ　Ｍ炭ｎ２！ｌＪｊＭ　（ｐｌ−１９，５）
　Ｉｃ　１０　Ｗ／ｍｌ　（Ｄ濃度に溶解しだ抗ＩｙＥ
抗体溶液０．５−を加え、室温で３時間（１〕拌後５■
の水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温でネらＶｃ１時
間反応させた。反りス（′！Ｊ２（ＩＱで分画鞘製して
抗Ｉ、Ｅ抗体ＨＲＰ結合物（」ソ下標ｉｉｉ’＆抗体と
呼ぶ）を得た。

ｄ）　　抗１　ｙ　Ｅ　ｂ″［体ポリスチレンボール結
合物のｊＦＪ　造直径０．６３５ｃｌｎのポリスチレン
ポールを前記ｂ）で製造した抗Ｉ　、　Ｅ抗体全ＰＢＳ
Ｋｌグ／−の濃度に７６解した抗体溶液中に４°Ｃ２４
時間浸′ｍ後、抗体ｆｒＩ液を除去し、］、’　Ｉ−３
８で４回洗浄した。これに１容量ヴ牛アルブミンを含む
Ｐ　ＴＪ　Ｓ　金加え保存し、抗１ｙＪ’＝抗体ポリス
チレンボール結合物（以下抗体Ａｉ’ｆ合ボールと略す
）を得た。

ｅ）　　ｘｙＥの測定前記ａ）で調２整した各険度のＩ　、　Ｅ溶液の５０ｐ
Ｌを試験管にとり抗体結合ボールを加え、さらに下記の
緩衡剤で適当な吸光度が得られるように希釈したＰ、ｑ
　Ｒ？＆抗体’ｆｆ’ｏ、５ｍｅ、加え３７”Ｃｌ２Ｏ
分反応させた。

Ａ：（本発明法）３重Ｊ肛対容量（Ｗ／Ｖ）係ポリエチ
レングリコール＃６，０ＯＯＣ半井什学社製）、５容お
：％ぼ兎血清含有Ｐ　ＨＳ　ｐＨ７，２１３：５容１．
（チ坂兎血清含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｐＨ７，２Ｃ：３Ｍ引゛
対対答チ（Ｗ／Ｖ　）％ＰＥＧ＃６，０００含有１）　
ＲＳ　ｐｉ−＋　７．２反応終了りさ、反応混合物をアスピレータ−で吸引除去
し、蒸留水１　ｍｅで３回洗浄し、これに０−フェニレ
ンジアミン３００１ｑ／ｄｌと２．０％過酸化水素水１
　ｍｅ／ｄｌとを含む０．１Ｍクエン酸−０，２Ｍリン
酸２プトリウム緩衡液ｐＩ−（５，０の基タノｆ溶液０
．５ｍｌを加え、室温、ＩＩｌ′ｆ所で６０分間反応さ
せた。ＩＮ硫酸２　ｍｌで反応全停止させ４９２ｎｍで
の吸光度を測定した、このときの伸率曲線を第２図に示
した。

７’６　Ｎ’Ｊ剤Ｉ＋　−１）　ｆはｉ−ｉ＋；　２　
図ＶＣ示ｔ　如＜　通Ｖ　字Ｘ’２　ノイ・”′ζζ凹
曲線イ（ＪらＪｌ、た。本発明法のｌ）　Ｅ　Ｇを含む
緩１１１・■剤Ａでは緩衡剤ＩＪ−Ｄの場合のような逆
Ｖ字型の４へ゛（準曲腺はｊ！ＩらｆＬず、（１ミキ陰
性を示す場合もなくｔＶ＋作は非常Ｖｃ１７！１単であ
った５、次に本発明のＰ　Ｅ　Ｇ含有緩衡剤Ａ全用いて
作製した神準曲め！ｆ：オリ用した正常人およびアトピ
ー性アレルギー患者血清中のＩ、Ｅ測定例を述べる。測
定（テヘ体５０μｔ４・そｎ４’れ試験管にとり、これ
にｄ）で製造した抗体結合ビーズを加え、さらにＣ）で
製造した（・、＋ｉ識抗体を本発明法のＰ　ＩＪ　Ｇ含
有緩衡剤Ａで仲偲曲線をやＩるときと同じ割合で希釈し
たものを０．５ｍｌ加え３７°Ｃで１２０分間反応させ
た。以下標準面イＩ泉作製の場合と同様に操作し、４９
２ｎｍ［おける吸光度を測＞〆した。第２図Ａの標準曲
線を利用して各々の測定１６２体の示す吸光度よりＩ、
Ｅ量をｔ’Ｊ出した。＋（ｊ、果を第１表に示した。参
考のため、ｆｆｉ、ｉｔ　２図Ｈの４．１準曲線を利用
した場合も示す。

第１表実施例２実施例１においてＰＥＧ−＃１０００　（牛丼化学社製
）について同様の実験全行なった。ＰＥＧ＃１０００は
１０重量対容量（Ｗ／Ｖ）％濃Ｕ！とじた。結果は第３
図に示した。ＰＥＧを含まない緩衡剤Ｂの場合は逆Ｖ字
型の４４：ｉ識曲線が得られたがＰＥ’Ｃ７ｉ含む本発
明性緩衝剤への場合は逆Ｖ字型イ翠準曲腺は得られず、
ｊヅ！作も簡単であった。

実施例３　インスリンの測定ａ）インスリン伸率溶液の調整ブタインスリン（シグマ社製）’ｅＷＩ−ＩＱの標準品
６６／／３０４ｆｔ用い、ラジオイムノアッセイ−で検
定し、■ｑＩ）牛アルブミンを含む生理食塩水で５０．
１００．２００．５００．１，０００．２，０００．５
，０００ｉｏ、ｏｏｏ、２０，０００”％ｇの濃度に調
整した、１））　　抗インスリン抗体の製造５りのブタインスリン（シグマ社製）、３７のＩｆ　ｐ
ｅｒｔｕ！１ｓｉｓ　ｖａｃｃｉｎｅ　（リリー社製）
にｐＨ２，，３の０．３％’Ｖ％フェノール７　ｍｌを
加えフロイントの完全アジ〜バンド１０ｍｅと混合し、
モルモツトに１週問おきに投与した。最終投与の１週間
後にに′１１動脈より探面してモルモット抗インスリン
血χ１１１　ｋ　イ４）だ。この抗血ｆ：（ｋ硫酸ナト
リウムで２回ＪＭ：ｉ析し、グロブリン分画全分取し、
抗インスリン抗体とした。

Ｃ）抗インスリン抗体、酵素結合物の製造法抗インスリ
ン抗体を０．ＯＩＭ炭酸緩衡液（ｐｉｉ９．５　）　Ｋ
　１０　ｍｆ／ｌｄ　の濃度に調整した抗インスリン抗
体溶液０．５ｄｉ用い、実施例１−Ｃ）で示す方法でペ
ルオキシダーゼ抗インスリン抗体結合物を作製した。

ｄ）　　抗インスリン抗体ポリスチレンボール結合物の
製造前記ｂ）で製造した抗インスリン抗体金用い実施例１−
ｄ）で示す方法で抗インスリン抗体ポリスチレンボール
結合物を作製した。

ｅ）インスリンの測定前記ａ）で調整した各濃度のインスリン標準陪液の１０
０１ノｔを試験管にとシ、抗体結合ボールを加えさらに
下記の緩衝剤で希釈したＷ識抗体を０５ゴ加え３７°Ｃ
ｌ２Ｏ分反応させた。

Ｅ：（本発明法）２チＰ　Ｅ　Ｇ＃　２０，０００　（
牛丼化学）含有０．０３　Ｍ　Ｐ　ＨＳ　ｐｉ−１７，
２Ｆ：（対照）　０．０３　Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｐＨ７，
２以下実ノフイハ例１−ｅ）で示す方法で、（１′ｐ準
インスリ／ン・測定し１１り光度を得た。この時の標準
曲線を第４図に示した。

緩衡剤１・〕では第４回に示す如く逆Ｖ字型の標準曲線
が得らｊｔだが、ｌ）　Ｅ　Ｇを含む本発明法の緩衝剤
Ｆでは逆Ｖ字型の（４：ｌ（準曲線は得られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は−リンドイソチ法の測定原理を示す。図中、ａ
　ｉ、ｉ　）ノ”：、原、Ｉ）　Ｉｔよ不溶化抗体、Ｃ
は抗原抗体複合物、（ｊｌは結合型標識抗体、ｄ２は遊
離型酵素標識抗体を示す第２図はＩ　、　Ｊｒ、の（・１ζ準曲線を示し、Ａは
本発明法で得らオ］、たＩ、］うの標準曲線（ＰＥＧ＃
２，０００）、ＢはＰＥＧなしの」１ツ合、Ｃは家兎血
清なしの場合、ＤはＰ　Ｅ　Ｇおよび家兎血清なしの場
合の標準曲線を示す。第３図は［、Ｅの標準曲線を示し、Ａは不発肌性でイ（
ＩられたＴ、ｌ弓の標準曲線（ＰＥＧ＃１，０００　）
、Ｂは対照のＸｙＥ悸準曲線を示す。第４図はインスリンの標準曲線を示し、Ｅは本発明法で
得られたインスリンの標準曲線（ＰＥＧ＃２０．０００
）、）゛は対照のインスリン（傳準曲線を示す。特許出航人　東洋紡績株式会社手　　続　　補　　正　　書昭和５７年ＬＱ月２・を日１４　　事件の表示昭和５７年特許願第１７２１８３号２　発明の名利、酵素免疫４１１１定法８、　補正をする者事件との関係　　特許出願人大阪市北区堂島浜二丁目２番８号明細書の発明の詳細な説明の欄「前期」を「前記」に訂正する。（２）同第９百第３．５．９行目第１Ｏ頁第４，１７行ｌ」第１１頁第１，２〜３，３，６．１１行目第１３頁第１
，３行目第１４頁第３，１６６行目１５頁第４，５行目「緩衝」を１級衝」に訂正する。（３）同第１３頁第２行目「標識」を「標ｒい」に訂正する。（４）同第１３頁第８行目「ラジオイムノアッセイ−」を「ラジオイムノアッセイ
」に訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

測定物質に、この物質に特異的に結合する抗体を不溶化
した不溶化抗体および抗体に酵素を結合させたｔｌ）’
　２標ａ１に抗体を作用させ、測定物質に結合しだｒＦ
１素標識抗体または結合しなかった酵素標識抗体の酵素
活性を測定することによシ、測定物質の−Ｉ１１を測定
する「１デ素免疫測定法において、血清蛋白質およびポ
リアルキレングリコールの存在下に不溶化抗体全作用さ
せることを特徴とする酵素免疫測定法。