JPH03183953A - ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト膵臓α−アミラーゼに特異的なモノクロ
ーナル抗体を利用した試料中のヒト膵臓α−アミラーゼ
の測定方法に関するものである。

（従来の技術） α−アミラーゼ（Ｅ、Ｃ，３，２，１，１，）は、１．
４−ｄ−グルコシド結合で結合したオリゴおよび多糖類
を、その１．４−ｄ−グルコシド結合を切断することに
よりマルトースおよびマルト−オリゴ糖類へと加水分解
する酵素である。

本酵素は工業的発酵技術においてのみならず臨床検査に
おいても著しく重要である。特に、ヒト肝臓ｑ−アミラ
ーゼは膵臓から血液中にそのままの形で遊離され、膵臓
疾患で血中ヒト膵臓α−アミラーゼ値が増加することが
知られている。したがって、ヒト膵臓α−アミラーゼを
測定することにより膵臓疾患の病理診断が可能になる。

しかしながら、ヒト血清中にはｐ−（膵臓由来）および
ｓ−（唾液腺由来）の２種のα−アミラーゼアイソザイ
ムが存在することが知られており、膵臓疾患の病理診断
を行うためにはヒトｐ−αアミラーゼをヒト６−α−ア
ミラーゼと分別して定量することが盛挙である。その測
定方法とじては、α−アミラーゼ活性測定法（特開昭６
０−１５５１３４号公報、特開昭６３−２６００号公報
、鈴木直生他　バイオサイエンスとインダストリ゛−Ｖ
ｏ　１．４７　　Ｎｏ、７　（１９８９））　、サンド
イツチＥＩＡ法（特開昭６３−１５８４６３号公報）が
知られている。

前者は、ヒトＳ−α−アミラーゼの酵素活性を特異的に
阻害しかつヒトｐ−α−アミラーゼの酵素活性をほとん
ど阻害しない抗ヒトＳ−α−アミラーゼ・モノクローナ
ル抗体をヒトＳ−およびｐ−α−アミラーゼをともに含
む試料溶液に加えることにより、ヒトＳ−α−アミラー
ゼの酵素活性を試料溶液から除去し、その後試料溶液の
α−アミラーゼ活性を測定することにより試料溶液中の
ヒトｐ−α−アミラーゼを定量するもの□である。

しかし、この方法では用いた抗体がヒトｐ−αアミラー
ゼの酵素活性をも弱く阻害するために正確にヒトｐ−α
−アミラーゼを定量することができない。

後者は、ヒトｐ−α−アミラーゼに特異的でかつヒトＳ
−α−アミラーゼと交差しないモノクローナル抗体を固
相に固定して用い、標識抗体としてヒトｐ−α−アミラ
ーゼとも同等に反応するウサギ抗ヒトＳ−α−アミラー
ゼ・ポリクローナル抗体のＦａｂ−フラグメントまたは
ヒトｐ−αアミラーゼとヒトＳ−α−アミラーゼをほぼ
同等に認識する抗ヒトｐ−α−アミラーゼ・モノクロー
ナル抗体を用いたサンドイッチアッセイによりヒトｐ−
α−アミラーゼを定量するものである。

しかし、この方法では標識抗体としてヒトｐ−α−アミ
ラーゼとヒトＳ−α−アミラーゼをほぼ同等に認識する
抗体を用いているので、ワンステ・ツブサンドイッチア
ッセイによる簡便な測定法が用いられないため、より操
作が多くかつより多くの時間を要するツーステップサン
ドイッチアッセイによる測定法を用いている。

以上のように、上記のいずれの測定法においても簡便か
つ短時間かつ正確にヒトｐ−α−アミラーゼをヒトＳ−
α−アミラーゼと分別して定量することができない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、ヒトｐ−α−アミラーゼに特異的なモ
ノクローナル抗体を用いることによって従来の方法より
もより簡便な操作で短時間に、高精度かつ高感度かつ広
い濃度範囲でヒトｐ−αアミラーゼを免疫学的にｉｆ！
ＩＪ定する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明
に到達した。即ち本発明は、ヒト膵臓α−アミラーゼを
特異的に認識し、ヒト唾液腺α−アミラーゼと交差反応
しないモノクローナル抗体で、Ａ：固定化されている第
１抗体、および、Ｂ：第１抗体とは異なる抗原部位を認
識しかつ標識剤で標識されている第２抗体を用いること
を特徴とするヒト膵臓α−アミラーゼの測定方法である
。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、それ自体公知である方法（Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｃ，Ｍ
ｉ　１ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ。

２５６　４９５、（１９７５））に準じて製造すること
ができる。

本発明では以上の方法により、複数の、ヒトＳ−α−ア
ミラーゼと交差反応しない抗ヒｌ−ｐ−αアミラーゼ・
モノクローナル抗体で、異なる抗原部位を認識するもの
を得た。これらのモノクローナル抗体を使って、ヒトｐ
−α−アミラーゼを定量的に測定てきるサンドイツチ法
による免疫学的測定方法が可能となった。

本発明方法に用いられる抗体もしくは該抗体のＦ（ａｂ
−）２フラグメントを固相に固定化する方法は、公知の
方法を採用でき、固相としては例えば、ポリスチレン、
ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セ
ファロース粒子、ラテックス、アガロース、セルロース
、ポリメタアクリレートなどが使用される。

用いられる試料はなんら限定されず、例えば血清、血漿
、尿などの生体試料でも精製したｐ−α−アミラーゼを
含む試料でもよい。

また抗体の標識化の方法とその検出方法もなんら限定さ
れるものでなく、公知の方法により標識化および検出す
ることができる。標識として酵素を用いる場合、標識物
質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファラーゼ、ウレアーゼ、カ
タラーゼ、β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる
。放射性物質としては、３Ｈ，１２’ＩＴ　または１３
１■等が、蛍光物質を使用する方法としては、例えば、
フルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネート、テ
トラローダミンイソチオシアネート等が常法によりモノ
クローナル抗体に結合される。しかしながら、標識物質
は上記物質に何ら限定されるべきものではない。

サンドイッチ測定法において、試料、第１抗体および第
２抗体の添加順序にはなんら限定はなく、また１ステツ
プサンドイツチ法、２ステツプサンドイツチ法のいずれ
も行うことができる。

遊離の標識された抗体の除去には、例えば通常のイムノ
アッセイで使用されるＢ／Ｆ分離法等の洗浄等を行えば
よい。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のヒトｐ−α−アミラーゼ濃度は血中レベルのヒ
トｐ−α−アミラーゼ濃度を含む広い濃度範囲（約８〜
２０００　ｎ　ｇ／　ｍ　１　）で測定することができ
、（２）ヒトＳ−α−アミラーゼはＯ〜２０００　ｎ　
ｇ　／　ｍ　Ｉの濃度範囲でｓ−ａアミラーゼと交差反
応を示さず、（３）従来法に比べて簡便かつ短時間かつ
正確にヒトｐ−α−アミラーゼをヒトＳ−α−アミラー
ゼと分別して定量することが可能である。このことは、
短時間に多数の検体（試料）を測定するという臨床的な
要望も充分満足させるものである。

（実施例） 以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかしながら
、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではな
い。

実施例１ （モノクローナル抗体の調製） （Ａ）抗原感作動物細胞の調製 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（♀）をヒトｐ−α−アミラーゼで
免疫した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全ア
ジュバントとヒトｐ−α−アミラーゼ８０μｇ／匹とを
乳化させた試料１００μｌを投与した。８週間後に追加
免疫としてヒトｐα−アミラーゼ５０μｇ／匹をフロイ
ントの不完全アジュバントと乳化させたちの１００μｌ
をマウス腹腔に投与した。１週間後最終免疫としてヒト
ｐ−α−アミラーゼ５０μｇ／匹をリン酸緩衝化生理食
塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０，０１％リン酸緩衝液
、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解したちの１００μｌ
を腹腔内に投与した。

３日後この処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。１０
％子牛脂児血清（以下１０％ＦＣ３と省略する）を含む
Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　１０　ｍ　ｌを注射器で吸い取り２７
ゲージの注射針をつけた。肺臓を氷冷しておいたデイツ
シュに入れ、注射針で数か新入をあけた。注射針を差し
込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させた。流出液
をナイロンメツシュで濾過し遠心チューブに入れ、１１
０００ｒｐで１０分間遠心分離して上澄をすてた。細胞
ペレット中の赤血球を０．１５Ｍ塩化アンモニウム溶液
（１ｍＭエチレンジアミン４酢酸−２すＩ・リウム塩（
以下ＥＤＴＡと省略する）を含む０．ＯＩＭ炭酸緩衝ｌ
夜、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し、さらに細胞ペ
レットをＤＭＥＭで２回同様に遠心洗浄して牌細胞とし
た。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製 明髄腫細胞としてはＢａ１ｂ／ｃマウス由来の８−アザ
グアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（以下Ｓ
　Ｐ　２１０と省略する）を使用した。

細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ　／　ｍ　ｌの８
−アザグアニン、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養し
、その後細胞融合日まで１０％ＦＣ８を含むＤＭＥＭを
使用した。細胞融合直前に、５Ｐ２１０は無菌的にＤＭ
ＥＭで１１００Ｏｒｐで１０分間遠心洗浄を２回繰り返
し調製した。

　０ （Ｃ）細胞融合 上記（Ａ）項で調製した肺臓細胞と上記（Ｂ）項で調製
した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１，００Ｏ
ｒ　ｐ　ｍ　、　　１０分）し細胞ペレットを集めた。

遠心チューブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうず
く広げた。その中に３７℃に暖めておいた５０９６ＰＥ
Ｇ　（ＭＥＲＫ社製ポリエチレングリコール、４０００
　）を含むＤＭＥＭ溶液０．５ｍｌを遠心チューブを回
しながら少しずつ滴下した。１分間ゆっくりと遠心チュ
ーブを回転させ混合した後、３０秒に１ｍｌの割合で遠
心チューブを回転しながら３７℃に加温しておいたＤＭ
ＥＭを１０回加え、次にＦｅ２を２ｍｌゆっくりと入れ
、１１０００ｒｐ、１０分間遠心した。

細胞ペレットを１０％ＦＣ３とＩ　Ｘ　１０−’Ｍヒボ
キサンチン、４×１０−７Ｍアミノプテリン、１．６　
Ｘ　１０−’Ｍチミジンを含むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ
培地と省略する）で２回遠心洗浄（１０００ｒｐｉｎ、
１０分間）した。この培養液を９６ウエルプレート（Ｆ
ａ　１ｃｏｎ＃３０４２）１ に５×１０５細胞個／ウェルになるように２００μｌず
つ分注した。３日日ごとにＨＡＴ培地を１００μｍ／ウ
ェル交換した。３週間後からは、ｌＸｌ０−’Ｍヒポキ
サンチン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミジンと１０％ＦＣ８
を含むＤＭＥＭ　（以下ＨＴ培地と省略する）を培地交
換に用いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択 ９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１０日
目前後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒ
トｐ−α−アミラーゼ抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルイムノプレート平底（インターメ・ンド社製
）に、ヒトｐ−α−アミラーゼ５μｇ／ｍ１を５０μｍ
／ウェル分注し、３７℃で１．５時間静置した。ウェル
に残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイー
ン（ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｒ）　）２０を含んだ溶液（以下
ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．２％ウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００
μｍを各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間プロ・ソ
キング２ 処理した。次に各ウェルに上記培養上清を５０μｌずつ
分注し３７℃で１．５時間静置した。これらのウェルを
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）４０
００倍希釈を５０μｍ／ウェルずつ分注し、３７℃で１
．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち
、基質溶液（０，３ｍｇ／ｍｌ　　２．２−アジノジー
（３エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩
及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，１））を各ウェルに５０
μｌ添加した。３０分間室温で放置し、２００ｍＭシュ
ウ酸溶液を５０．μｌを加えて酵素反応を停止させた。

４１５ｎｍでの吸光度を測定し、酵素活性が認められた
ウェルに抗ヒトｐ−α−アミラーゼ抗体を繰生するハイ
ブリドーマが存在することがわかる。以上のようにして
、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得した。

（Ｅ）コンデショニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１３ の冷蔵しておいた０１３４Ｍサッカロース溶液を吸い取
った。Ｂ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウス（♂）をを椎脱臼
させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつけ
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収波を流し込み、１１
０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ペレットに１０％ＦＣ８−ＤＭＥＭを加え攪拌し
プッシュに入れた。３７℃９５％炭酸ガス濃度、９５％
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、０．２２μｍの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。

（Ｆ）クローニング 抗体産生を認めるバイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０ｍ
１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し、
２００μｌ／　４ ウェルずつ９６ウエルイムノプレート（Ｆａｌｃｏｎ＃
３０４２）に分注した。培養１０日目前後から細胞コロ
ニーが認められるウェルについて、上記（Ｄ）項に記載
した固相酵素免疫測定法に準じて抗ヒトｐ−α−アミラ
ーゼ抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに再度クロ
ーニングを繰り返しり１−ハイブリドーマを樹立した。

最終的に１７クローンのハイブリドーマを確立した。こ
れらのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株のうち
、ヒトＳ−α−アミラーゼと交差せず、叉なる抗原部位
を認識する抗体を産生じていた２種のモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株をサンドイッチアッセイに用い
た。（Ｇ）抗ヒトｐ−α−アミラーゼ抗体の精製 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
）を０．５ｍｌ／匹投与した。２週間後、上記（Ｆ）項
で得られた抗ヒトｐ−αアミラーゼ抗体産生ハイブリド
ーマ株のうちヒトＳ−α−アミラーゼと交差しない抗体
を産生ずる　５ ２種のハイプリドーマ株を、マウス腹腔内に各クローン
について２Ｘ１０６細胞個／匹移植した。

１０日目前後に生成した腹水を１８ゲージの注射針を腹
腔に差し込み、１７２０量の０．２Ｍ−ＥＤＴＡをいれ
た遠心チューブに滴下させた。遠心チューブを４０００
ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を集めた。採取した上清
を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがって粗精
製し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過をおこ
ない精製した。メルカプトエタノール還元下での１２％
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で１本の重鎮と１
本の軽鎖の２本のバンドになったことで抗体の純度を確
認した。

（酵素標識法によるヒトｐ−α−アミラーゼの測定） （Ａ）抗ヒトｐ−α−アミラーゼ抗体の固定化：未処理
マイクロタイタープレート（９６ウエル・ヌンクプレー
ト、インターメッド社製）の各ウェルにＯ，１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解した５μｇ　／　
ｍ　１のマウス由来の　６ ヒトＳ−α−アミラーゼと交差しない抗ヒトｐα−アミ
ラーゼモノクローナル抗体（名称Ａとする）の溶液１０
０μｌを加えて、４℃−夜インキユベートした。次に、
各ウェルの溶液を除去し、Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔテ３回洗浄し
た後、０．１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液４００
μｍを各ウェルに加えて、４℃でブロッキング処理しそ
のまま保存した。

ＣＢ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製： ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＩ（８，１）に溶
解したＨＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）に１％１−フルオロ
−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．１ｍ
ｌを加え、室温にて１時間反応させた。その溶液に０．
０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｍｌを添加し３０分
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムをＯ，，１
６Ｍのエチレングリコール１．０ｒｒｉｌを加えて除去
した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
）で透析した。次に、マイクロタイタープレートに　７ 固定化したものとは別のマウス由来のヒトＳ−α−アミ
ラーゼと交差しない抗ヒトｐ−α−アミラーゼ抗体（名
称Ｂとする。モノクローナル抗体Ａとは異なる抗原部位
を認識するもの。）５ｍｇを加えて５〜６時間反応させ
た。水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４℃中で
一夜放置した。

この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するた
め、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で一夜攪拌
しながら透析した。上記反応物をＴ　Ｓ　Ｋ−ゲルＧ−
３０００ＳＷ　（東ソー株式会社製、商品名）を用いて
高速液体クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ標識抗
体とした。

（Ｃ）試料中のヒトｐ−α−アミラーゼの定量二本実施
例中の（Ａ）で記述した方法で作製したマイクロタイタ
ープレートを室温にもどし、ＰＢＳＴ溶演で洗浄した後
、０〜２０００　ｎ　ｇ　／　ｍ　１のヒトｐ−α−ア
ミラーゼの希釈系列液を各ウェルにそれぞれ１０μｌ加
えた。次に本実施例中の（Ｂ）で記述した方法で得たＨ
ＲＰ標識抗体をＰ　８ ＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに１００μｍずつ添加
した。そのまま３７℃で１時間インキュベートした後、
溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、
０．３ｍｇ／ｍｌの２，２−アジノジ−（３−エチルベ
ンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩及び０．０１
％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基質溶液を各ウェルに１
００μｍ添加し、室温で５分間酵素反応させた後、２０
０ｍＭシュウ酸溶液を１００μｍ加えて酵素反応を停止
させた。上記マイクロタイタープレートを各ウェルにつ
いて、波長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度
を自動マイクロタイタープレートリーダー（東ソー株式
会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果、試料
中のヒトｐ−α−アミラーゼ濃度が８〜２０００ｎｇ／
ｍｌの範囲内でヒトｐ−α−アミラーゼ濃度と測定値の
間に直線性が認められ、試料中のヒトｐ−α−アミラー
ゼは８〜２０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で定量できるこ
とが確認された。結果を第１９ 図に示す。一方、試料としてヒトｐ−α−アミラーゼ又
はヒトＳ−α−アミラーゼを用いて同様に測定を行った
結果、０〜２’ＯＯＯｎ　ｇ／ｍ　ｌの濃度範囲でＳ−
α−アミラーゼと交叉反応を示さないことが確認された
結果を第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１における抗体価を反映した呈色反応
の４１５ｎｍでの吸光度を縦軸に、抗原（ヒトｐ−α−
アミラーゼ）の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を横軸にその関係を
示した図である。 第２図は、実施例１における抗体価を反映した呈色反応
の４１５ｎｍでの吸光度を縦軸に、抗原（ヒトｐ−α−
アミラーゼまたはヒトＳ−α−アミラーゼ）の濃度（ｎ
　ｇ／ｍ　ｌ　）を横軸にその関係を・示した図である
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト膵臓α−アミラーゼを特異的に認識し、ヒト
   唾液腺α−アミラーゼと交差反応しないモノクローナル
   抗体で、 Ａ：固定化されている第１抗体 および Ｂ：第１抗体とは異なる抗原部位を認識し、かつ標識剤
   で標識されている第２抗体 を用いることを特徴とするヒト膵臓α−アミラーゼの測
   定方法。