JPH0318872B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルタチオンを著量含有する酵母の
製造法に関するものである。

更に詳細には、本発明は、キヤンデイダ属に属
するグルタチオン生産性酵母であつてエチオニン
および亜硫酸塩を含む培地に生育可能となつた突
然変異株を該菌株の生育至適温度より５℃以上低
い培養温度にて好気的に培養することにより、該
菌体中に著量のグルタチオンを生成蓄積させた酵
母を製造する方法に関するものである。

一般にグルタチオンは酵母及び動物の肝臓など
に広く分布しており、生体内の酸化還元系に関与
しているトリペプチドで、肝機能回復作用や解毒
作用などの重要な役割を果す医薬上極めて有用な
物質である。

本発明の目的は、このグルタチオンを発酵工業
的に有利に製造する方法を提供することにある。

近年、グルタチオンはほとんどが酵母菌体から
の抽出方法により生産されており、酵母菌体中の
グルタチオン含量を高める方法が数多く提案され
ているが、いずれも培養における培養温度は酵母
の至適生育温度で実施されている。

本発明者らは、キヤンデイダ属におけるグルタ
チオンの蓄積量を高めるために鋭意研究を行つた
結果、酵母を培養する際、該菌株の生育至適温度
より５℃以上低い培養温度で培養することにより
グルタチオンの蓄積量を著しく高めることができ
ることを知つたのである。

更に研究を進めたところ、酵母菌株の培養適温
よりかなり低いところにグルタチオン蓄積適温が
あることも知つたのである。

本発明は、これら知見から完成されたもので、
キヤンデイダ属に属するグルタチオン生産性酵母
であつてエチオニンおよび亜硫酸塩を含む培地に
生育可能となつた突然変異株を該菌株の生育至適
温度より５℃以上低い培養温度で培養することに
より、該菌体中に著量のグルタチオンを生成蓄積
せしめることを特徴とするグルタチオン高含有酵
母の製造方法である。

本発明においては、キヤンデイダ属に属し、突
然変異処理によつてエチオニンおよび亜硫酸塩を
含む培地に生育可能となつた菌株（特願昭58−
24815）を使用する。突然変異処理によつてエチ
オニンおよび亜硫酸塩を含む培地に生育可能とな
つた菌株としては、例えばキヤンデイダ・ウチル
スKJS−0571やキヤンデイダ・ウチルスKJS−
0582などが有利に使用される。なおキヤンデイ
ダ・ウチルスKJS−0571およびキヤンデイダ・ウ
チルスKJS−0582は工業技術院微生物工業技術研
究所にFERM Ｐ−6907およびFERM Ｐ−7396
として寄託されている。

培養に用いられる炭素源としては、ブドウ糖、
蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃
液等が用いられ、また窒素源としては、アンモニ
ア、硫安、尿素、硝酸塩などが使用される。さら
に無機塩としては、燐酸、カリウム、マグネシウ
ム源として、過リン酸石灰、燐安、塩化カリ、燐
酸カリ、苛性カリ、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム等が用いられ、さらに微量の亜鉛、銅、
マンガン、鉄イオン等の無機塩も使用される。ビ
タミン、アミノ酸、核酸関連物質は特に必要とし
ないが、勿論これらを添加したりコーンステイー
プリカー、酵母エキス、ペプトン等を加えても差
支えない。PHは3.5〜8.0、特に4.0〜6.0が望まし
い。

培養温度として、グルタチオン生産性菌株の生
育至適温度より５℃以上低い温度であればグルタ
チオンはより多く蓄積されるのである。一般的に
は菌株の至適生育温度より５℃以上低い温度がグ
ルタチオンの蓄積には適している。そして、グル
タチオンの蓄積だけを考慮するならば培養温度は
生育至適温度より６〜12℃低い温度が最も好まし
いものである。

本発明における培養温度は菌株の至適生育温度
より５℃以上低いために、酵母の増殖はおそくな
る傾向にある。従つて、培養温度を低くする場合
は培養時間を長くする必要がある。菌株によつて
もそれぞれ異なるが、一般的には25〜50時間程度
である。

またこの際の培養形式は好気培養であればバツ
チ培養、或は連続培養の何れでもよい。

次に、試験例、実施例及び比較例をあげて説明
する。なお、グルタチオンの定量は、菌体抽出液
についてグリオキサラーゼ法（「メソツド・イ
ン・エンザイモロジー」第１巻540ページ、アカ
デミツクプレス社、1955年版）で行つた。

また本発明の有用性は、以下の実施例に示す
が、これによつて本発明が制限されるものではな
い。

試験例 １ キヤンデイダ・ウチルスKJS−0582株
FERM Ｐ−7396を用い培養温度を18℃〜34℃の
９段階に変化させて、あとの条件は、スケールを
１／１０とした以外は実施例１と同様に試験して各培
養温度における増殖速度及びグルタチオン含有量
を測定した。増殖速度は32℃における対数増殖期
の比増殖速度（0.693／ダブリングタイム）を100
％とし、各培養温度における比増殖速度を相対値
として求めた。またグルタチオン含量は各培養温
度での培養後了後の菌体をそれぞれ集め、実施例
１と同様に処理してグルタチオン含量を求めた。

その結果は第１図に示される通りであるが、
KJS−0582株の場合、生育至適温度が32℃であ
り、グルタチオン蓄積の至適温度は22℃〜24℃で
あることがわかる。

試験例 ２ キヤンデイダ・ウチリスKJS−0571株、
FERM Ｐ−6907を用い、試験例１と同様にして
相対比増殖速度（％）とグルタチオン含有量を求
めた。

その結果は第２図に示される通りであるが、
KJS−0571株の場合、生育至適温度が30〜32℃
で、グルタチオン蓄積の至適温度は22℃であるこ
とがわかる。

実施例 １ キヤンデイダ・ウチルスKJS−0582株、
FERM Ｐ−7396をグルコース２％イーストエキ
ス２％ペプトン１％からなる培地でフラスコ培養
し、これを300容発酵槽に１％植菌した。

培地としては、グルコース３％、硫安0.8％、
リン酸−カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.03
％、硫酸第一鉄10ppm、硫酸亜鉛3ppm、硫酸銅
1ppm、硫酸マンガン10ppmを用いバツチ培養を
行つた。培養条件としては槽内液量200、培養
温度24℃、通気量150pm、撹拌数200rpm、PH
4.5にて行つた。28時間後集菌したところ乾燥時
換算2940ｇの菌体が得られ、菌体中のグルタチオ
ン含量は5.0％（対乾燥菌体比）であつた。この
菌体を加熱抽出し、菌体残渣を遠心分離にてグル
タチオン抽出液を得た。この抽出液に硫酸を
0.5Nになるように添加し、亜酸化銅を加えグル
タチオンを銅塩として析出させた。グルタチオン
銅塩を水洗した後硫化水素を通気し、硫化銅を除
き、減圧濃縮することによりグルタチオンの結晶
120ｇを得た。

得られた結晶は高圧ろ紙電気泳動、高速液体ク
ロマトグラフイーよりグルタチオンであることが
確認され、ヨード法による純度は99.0％であつ
た。

比較例 １ キヤンデイダ・ウチルスKJS−0582株、
FERM Ｐ−7396株を培養温度30℃以外は実施例
１と全く同様に培養し比較培養した。22時間培養
後2950ｇの菌体（乾燥時換算）を得た。この菌体
中のグルタチオン含量は3.7％（対乾燥菌体）で
あつた。実施例１と全く同様の処理により87ｇの
グルタチオンを得た。

実施例 ２ キヤンデイダ・ウチルスKJS−0571株、
FERM Ｐ−6907を実施例１と同様にフラスコ種
母培養し30発酵槽に５％植菌した。

培地としては次の組成のものを用いた。亜硫酸
パルプ廃液（資化性糖として３％）にリン酸−ア
ンモニウム0.15％、塩化カリウム0.06％を添加す
る。培養はドラフトチユーブ付発酵槽で槽内液量
10、培養温度22℃通気量10pm、撹拌数
700rpmで行い、アンモニアを添加してPHコント
ロール及び、培養の窒素源とした。培養42時間後
に遠心分離にて菌体を集菌したところ菌体160ｇ
が得られ菌体中のグルタチオン含量は4.6％（対
乾燥菌体比）であつた。

比較例 ２ キヤンデイダ・ウチルスKJS−0571株を培養温
度30℃以外は実施例２と全く同様に培養し比較培
養した。32時間培養後165ｇの菌体（乾燥時換算）
が得られ、菌体中のグルタチオン含量は3.8％
（対乾燥菌体比）であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は試験例１においてキヤンデイダ・ウチ
リスKJS−0582株の相対比増殖速度（％）とグル
タチオン含量（％）を求めた図で、第２図は試験
例２においてキヤンデイダ・ウチリスKJS−0571
株の相対比増殖速度（％）とグルタチオン含量
（％）を求めた図である。 Ａ……相対比増殖速度（％）、Ｂ……グルタチ
オン含量（％）。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キヤンデイダ属に属するグルタチオン生産性
   酵母であつてエチオニンおよび亜硫酸塩を含む培
   地に生育可能となつた突然変異株を該菌株の生育
   至適温度より５℃以上低い培養温度で培養するこ
   とにより、該菌体中に著量のグルタチオンを生成
   蓄積せしめることを特徴とするグルタチオン高含
   有酵母の製造方法。