JPS6358560B2 - - Google Patents

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JPS6358560B2
JPS6358560B2 JP58024815A JP2481583A JPS6358560B2 JP S6358560 B2 JPS6358560 B2 JP S6358560B2 JP 58024815 A JP58024815 A JP 58024815A JP 2481583 A JP2481583 A JP 2481583A JP S6358560 B2 JPS6358560 B2 JP S6358560B2
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glutathione
sulfite
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ethionine
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JP58024815A
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JPS59151894A (ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルタチオンを著量含有する酵母の
製造法に関するものである。
更に詳細には、本発明は、突然変異処理によ
り、エチオニン及び亜硫酸塩を同時に含む培地に
生育可能となつたキヤンデイダ属酵母の変異株を
好気的に培養することにより、該菌体中に著量の
グルタチオンを生成蓄積させた酵母を製造する方
法に関するものである。
一般にグルタチオンは酵母及び動物の肝臓など
に広く分布しており、生体内の酸化還元系に関与
しているトリペプタイドで、肝機能回復作用や解
毒作用などの重要な役割を果す医薬上極めて有用
な物質である。
本発明の目的は、このグルタチオンを発酵工業
的に有利に製造する方法を提供することにある。
近年、グルタチオンはほとんどが酵母菌体から
の抽出法により生産されており、酵母菌体中のグ
ルタチオン含量を高める方法が数多く提案され、
試みられてきている。
しかしながら、いずれの方法によつてもグルタ
チオンの蓄積量は限られ、工業的に特にすぐれた
方法といえるものはなかつた。
本発明者等は、先に、メチオニンアナログ耐性
を獲得したキヤンデイダ属酵母の変異株を培養す
ることによつて著量のグルタチオンを含有する酵
母を得ることに成功した(特公昭56−46826号)
のであるが、更に、グルタチオンの蓄積量を増大
させるために、鋭意研究を行つた結果、本発明に
おいてより蓄積量の高い酵母を製造することがで
きたのである。
本発明者等は、菌体内のグルタチオンの含量を
高めるためには、グルタチオンの構成アミノ酸の
一つであるL−システインの菌体内濃度を高める
ことが必要であると考えた。そして、L−システ
インの菌体内濃度を高めるには、L−システイン
の生合成中間体である亜硫酸の菌体内濃度を高め
ると同時に、L−システインの他の生合成中間体
であるメチオニンの菌体内濃度を高める必要があ
り、そのためには、亜硫酸耐性とメチオニンアナ
ログであるエチオニン耐性を併有する変異株を取
得するのが先決であるとの想定のもとに、キヤン
デイダ属酵母の変異処理を行い、亜硫酸耐性とエ
チオニン耐性を併有する変異株を得、これを培養
した結果、著量のグルタチオンが蓄積されること
を見出し本発明を完成するに至つた。
突然変異処理により、エチオニンおよび亜硫酸
塩を同時に含む培地に生育可能となつたキヤンデ
イダ属酵母の変異株を好気的に培養して、該菌体
中に著量のグルタチオンを生成蓄積せしめること
を特徴とするグルタチオン高含有酵母の製造法で
ある。
本発明に使用する亜硫酸耐性とエチオニン耐性
を併有する変異株によるグルタチオンの蓄積はき
わめてすぐれており、亜硫酸単独耐性変異株又は
エチオニン単独耐性変異株のグルタチオン蓄積量
に比較しても顕著にすぐれたものである。
また亜硫酸はバクテリアに対し強い抗菌活性を
有することから、亜硫酸耐性を併有する変異株を
用いることによつて、培地中の亜硫酸濃度を高し
て培養を雑菌の汚染から防ぐことができるのであ
る。
本発明のエチオニン及び亜硫酸塩を同時に含む
培地に生育可能となつたキヤンデイダ属変異株は
キヤンデイダ・ウチリスの周知株及び本発明者等
が先に発明したメチオニンアナログ耐性変異株
(特公昭56−46826)、例えばキヤンデイダ・ウチ
リスER061、FBRM−PNo.3510等を紫外線、X
線、ニトロリグニジン等により突然変異処理し変
異させた菌を、エチオニン及び亜硫酸塩をそれぞ
れ最低阻止濃度以上に含んだ培地で培養し、生育
した菌を分離し、合成培地で生育のよい菌を選択
することにより得られる。この際使用されるエチ
オニンはD型、L型、DL−型のいずれでもよく、
また亜硫酸塩としては亜硫酸ナトリウム、亜硫酸
カリウム、亜硫酸等が用いられる。
本発明において得られた高グルタチオン含有変
異株の一例としてはキヤンデイダ・ウチルス
IAM4264を変異処理するとにより得られたキヤ
ンデイダ・ウチルスKJS−0571株があり本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−
6907として寄託されている。
本発明で用いる亜硫酸耐性とエチオニン耐性を
併有するキヤンデイダ属酵母の変異株は菌学的性
質において同じ性質を示しており、次に示され
る。
1 エチオニン及び亜硫酸塩を含む培地で生育す
る。
2 一般培地でよく生育し、著量のグルタチオン
を生成蓄積することができる。
3 YM寒天培地上で全縁、半レンズ状隆起、表
面滑らかで鈍い光沢、クリーム色で軟質のコロ
ニーを形成する。
4 グルコースーイーストエキスーペプトン水中
で混濁、沈澱あり、菌膜と菌環の形成は認めら
れない。
5 ダルモー平板状で仮性菌糸を形成する。
6 酢酸ソーダ寒天斜面、麦芽エキス寒天斜面、
V8ジユース寒天斜面、コーンミール寒天斜面
の培養で子嚢胞子の形成は認められない。
7 グルコース、シユークロース、ラフイノース
を発酵し、ガラクトース、マルトース、トレハ
ロース、ラクトースを発酵しない。
8 グルコース、シユークロース、マルトース、
セロビオース、トレハロース、ラフイノース、
メレジトース、キシロース、エタノール、マン
ニトール、乳酸、クエン酸、KNO3を同化す
る。
9 ビタミンフリー培地での生育良好。
本発明を実施するには、前述の方法で得られた
変異株を、菌体内グルタチオンの生成、蓄積を増
大せしめる物質を何んら添加することなく、炭素
源、窒素源及び無機塩等を含む培地で好気的に培
養すればよい。
この際の培養形式としては、バツチ培養、或は
連続培養の何れでもよい。
本発明の酵母を培養する際の炭素源としては、
ブドウ糖、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫
酸、パルプ廃液等が用いられ、またその窒素源と
しては、アンモニア、硫安、尿素、硝酸塩などが
使用される。さらに無機塩としては、燐酸、カリ
ウム、マグネシウム源として、過リン酸石灰、燐
安、塩化カリ、燐酸カリ、苛性カリ、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム等が用いられ、さらに
微量の亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩
も使用される。ビタミン、アミノ酸、核酸関連物
質等は特に必要としないが、勿論これらを添加し
たりコーンステイープリカー、酵母エキス、ペプ
トン等を加えても差支えない。培養温度は酵母の
生育可能温度であれば良く、例えば40℃以下、特
に30℃以下で行われ、PHは3.5〜8.0、特に4.0〜
6.0が望ましい。
次に実施例をあげて説明する。
なおグルタチオンの定量は、菌体抽出液につい
てグリオキサラーゼ法(「メソツド・イン・エン
ザイモロジー」第1巻第540ページ、アカデミツ
クプレス社、1955年版)で行つた。
また本発明の有用性は、以下の実施例に示す
が、これによつて本発明が制限されるものではな
い。
実施例 1 キヤンデイダ・ウチルスIAM4264の突然変異
でエチオニンおよび亜硫酸塩含有培地に生育可能
となつたキヤンデイダ・ウチルスKJS−0571株、
FERMP−6907をグルコース2%、イーストエキ
ス2%、ペプトン1%からなる培地でフラスコ種
母培養し、これを300容発酵槽に1%植菌した。
培地としては、グルコース3%、硫安0.8%、
リン酸一カリウム0.2%、硫酸マグネシウム0.03
%、硫酸第一鉄10ppm、硫酸亜鉛3ppm、硫酸銅
1ppm、硫酸マンガン10ppmを用いバツチ培養を
行つた。培養条件としては槽内液量200、培養
温度30℃、通気量150pm、撹拌数200rpm、PH
4.5にて行つた。24時間培養後集菌したところ乾
燥時換算2950gの菌体が得られ、菌体中のグルタ
チオン含量は4.0%(対乾燥菌体比)であつた。
この菌体を加熱抽出し、菌体残渣を遠心分離にて
除きグルタチオン抽出液を得た。この抽出液に硫
酸を0.5Nになるように添加し、亜酸化銅を加え
グルタチオンを銅塩として析出させた。グルタチ
オン銅塩を水洗した後硫化水素を通気し、硫化銅
を除き、減圧濃縮することによりグルタチオンの
結晶95.0gを得た。得られた結晶は高圧ろ紙電気
泳動、高速液体クロマトグラフイーよりグルタチ
オンであることが確認され、ヨード法による純度
は99.0%であつた。
実施例 2 突然変異株キヤンデイダ・ウチルスKJS−0571
株、FERMP−6907を実施例1と同様にフラスコ
種母培養し30発酵槽に5%植菌した。
培地としては次の組成のものを用いた。亜硫酸
パルプ廃液(資化性糖として3%)にリン酸−ア
ンモニウム0.15%、塩化カリウム0.06%を添加す
る。培養はドラフトチユーブ付発酵槽で槽内液量
10、培養温度30℃、通気量10pm、撹拌数
700rpmで行い、アンモニアを注加してPHコント
ロール及び、培養の窒素源とした。培養32時間後
に遠心分離にて菌体を集菌したところ菌体165g
(乾燥時換算)が得られ、菌体中のグルタチオン
含量は3.8%(対乾燥菌体比)であつた。
比較例 1 実施例1と全く同様に親株のキヤンデイダ・ウ
チリスIAM4264株を培養して比較した結果3050
gの乾燥菌体を得た。この乾燥菌体中のグルタチ
オン含量は0.52%(対乾燥菌体比)であつた。実
施例1と全く同様の処理により8.1gのグルタチ
オンを得た。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 突然変異処理により、エチオニンおよび亜硫
    酸塩を同時に含む培地に生育可能となつたキヤン
    デイダ属酵母の変異株を好気的に培養して、該菌
    体中に著量のグルタチオンを生成蓄積せしめるこ
    とを特徴とするグルタチオン高含有酵母の製造
    法。
JP58024815A 1983-02-18 1983-02-18 グルタチオン高含有酵母の製造法 Granted JPS59151894A (ja)

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JPS59151894A JPS59151894A (ja) 1984-08-30
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