JPH03189560A - 磁性マーカー粒子を用いた免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫学的凝集反応によって、サンプル中に存在
する抗原または抗体を＆［１１定するための方法に関す
る。

〔従来の技術〕

免疫学的な凝集反応に基づき、サンプル中に存在する抗
原または抗体を検出するための方法として、粒子凝集法
が従来から知られている。この方法では、被ｍ１１定物
質と特異的に結合する抗体または抗原が表面に固定化さ
れている特定のマーカー粒子を用いる。このマーカー粒
子を測定容器内のサンプルに混合し、サンプル中に含ま
れる抗原または抗体との間で免疫反応を行わせた後、測
定容器の所定の壁面（例えば底面）に集める。こうして
容器壁面に集められたマーカー粒子は、サンプル中の被
測定物質との間で免疫反応が生じた場合と生じなかった
場合とで分布パターンが異なる。

従って、容器壁面に集められたマーカー粒子の分布パタ
ーンから、陽性または陰性を判定することができる。

これとは別に、Ｗｌｅｎｅｒ、Ａ、Ｓ、及びＨｅｒｍａ
ｎ、Ｍ、Ｈ。

により混合凝集法が報告されている（Ｊ、Ｉ■ｕｎｏ１
．。

３６．２５５（１９３９））　　この方法はその後発展
され、血液型の判定が可能とされるまでに確立されてい
る（　ＣｏｏＩｌｂｓ、Ｒ，Ｒ，Ａ、及びＢｅｄｆｏｒ
ｄ、Ｄ、、ＶｏｘＳａｎｇ、。

５．１１１（１９５５）　　；　Ｃｏｏｉｂｓ、Ｒ，Ｒ
，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ。

ｉ、４６１（１９５Ｂ）　）。各種血液型の判定に応用
したものとして、例えばＵＳＰ　４，６０８，２４６号
、ＵＳＰ４．２７５．０５３号及びＵＳＰ　４，３２８
．１８３号が挙げられる。

また、被測定物質と特異的に結合する抗体等を、反応容
器の内壁に予め固定しておく方法も知られている（　Ｍ
ＰＨＡ法）。この方法では、被測定物質に特異的に結合
する物質（抗体等）を反応容器の内壁に予め固定化して
おく。そして、この抗体等に被測定物質を特異的に結合
させた後、マーカー粒子を添加する。このマーカー粒子
は、容器内壁に結合された被測定物質と反応して凝集パ
ターンを形成する。Ｍ　Ｐ　ＨＡ法は、例えばＵＳＰ　
４，２９７，１０４号等に記載されている。

ところで、上記従来の粒子凝集法、混合凝集法およびＭ
ＰＩＩＡ法では、サンプル中に含まれるマーカ粒子以外
の沈降性粒子が沈降するため、判定精度が低下する。従
って、良好な判定を行なうためには、この自然沈降性粒
子を除去するために、サンプルを洗浄する等の操作を必
要とする。

また、上記従来の粒子凝集法および混合凝集法の多くは
、所定の容器内で免疫反応を行った後、自然沈降によっ
てマーカー粒子を容器底面に集める方法を用いている。

従って、マーカー粒子、特に未反応の粒子が底面に一様
に沈降してパターンを形成するまでには多大の時間を要
する問題がある。例えば、本件出願人であるオリンパス
光学株式会社が販売している抗血小板抗体検出のための
「抗１ｇＧセルキット（商品名）」では、判定までに４
〜６時間を要している。

単に沈降速度を早めるだけならば、マーカー粒子の比重
や粒径を大きくすればよい。しかし、マーカー粒子の比
重および粒径は、該粒子の沈降パターンが荒くならない
範囲で選択しなければならないから、この方法で測定時
間を大幅に短縮することは望めない。

一方、既述のＵＳＰ　４，２９７，１０４号には、マー
カー粒子として用いた赤血球の沈降パターンが形成され
るまでに要する時間を短縮するために、遠心を用いた方
法が開示されている。この方法では、対称軸を有する測
定容器の底面およびマーカー粒子に用いる赤血球の表面
に、抗体（ＩｇＧ）を固定化する。そして、測定容器中
でサンプル中の抗原と赤血球表面の抗体とを予め反応さ
せた後、赤血球表面及び容器壁面の抗体に対する抗１ｇ
Ｇ抗体を添加する。次いで、第一の遠心処理を行うこと
により、添加した抗１ｇＧを介してマーカー粒子である
赤血球を容器壁面に付着させる。遠心を一旦停止した後
、第二の遠心処理を行うことにより、サンプル中の抗原
と反応していない赤血球を容器の底面に集めて沈降パタ
ーンを形成する。

上記の遠心による方法は、免疫反応による凝集およびマ
ーカー粒子の沈降を促進させる上で有効である。しかし
、遠心を行なうことに起因して、次のような欠点がある
。

第一に、サンプリングから反応、判定、廃棄等を実施す
る一連の作業において、測定容器のハンドリングを円滑
に行うのが困難なことである。特に、遠心を行う際には
測定容器の対称軸を遠心力の作用する方向に精密に一致
させなければならず、これはさほど容易ではない。

第二の欠点は、異なる項目に関する分析が困難なことで
ある。即ち、異なった項目に関する分析では沈降条件を
変える必要があるが、同一の遠心処理において、夫々の
サンプル毎に遠心の程度やタイミングを複数設定するこ
とは困難である。従って、分析項目ごとに異なった条件
を設定して遠心処理を行なうか、または分析項目毎に異
なった条件を設定した複数の遠心機を用いなければなら
ない。

第三の欠点は、分析プロセスを自動化する場合、遠心機
を用いていることから装置が大型にならざるを得ないこ
とである。

上記の問題に加えて、従来のＭ　Ｐ　）！　Ａ法では反
応容器の汎用性に乏しいという問題がある。即ち、容器
内壁に予め固定化すべき物質、即ち被測定物質に特異的
に結合する物質は被測定物質の種類に応じて異なるから
、測定対象物質の種類に応じて多数の反応容器を反応容
器を準備しなければならないい。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記事情に鑑みてなわれたもので、その第一の
課題は、粒子凝集法による免疫学的測定法を改良し、特
に比重または粒径の大きいマーカー粒子を用いることな
く、また遠心処理を行うことなく、凝集反応の判定に要
する時間を短縮することである。

本発明の第二の課題は、被測定物質以外の沈降性物質を
含むサンプルについても、この沈降性物質に邪魔される
ことなく、高精度の測定を行なうことができる免疫学的
測定法を提供することである。

本発明の第三の課題は、彼ａｐ＋定物質の種類が異なっ
ても、同じ反応容器を用いて測定を行うことが可能な免
疫学的７ｊｌ１１定法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明による免疫学的測定方法は、次の八つの工程を具
備している。

第一の工程では、被測定物質に特異的に結合する物質を
磁性粒子に固定化した磁性マーカー粒子の懸濁液を、被
測定物質との結合部位以外の部位で前記磁性粒子に結合
できる磁性粒子捕捉物質が内壁に固定化されている粒子
凝集判定容器内に注入する。

第二の工程では、磁界を印加して前記磁性マーカー粒子
を沈降させ、沈降した磁性マーカー粒子の磁性粒子と前
記磁性粒子捕捉物質との結合により、前記磁性マーカー
粒子を前記粒子凝集判定容器の内壁に捕捉する。

第三の工程では、捕捉されなかった前記磁性マカー粒子
を容器内から除去する。

第四の工程では、サンプル溶液を粒子凝集判定容器内へ
注入して反応させ、容器内壁に捕捉されている前記磁性
マーカー粒子に被測定物質を結合させる。

第五の工程では、磁性マーカー粒子に結合されなかった
物質を前記粒子凝集判定容器から除去する。

第六の工程では、前記磁性マーカー粒子の懸濁液を粒子
凝集判定容器内へ注入する。

第七の工程では、磁界を印加して磁性マーカー粒子の沈
降を促進させる。

第への工程では、粒子凝集判定容器の内壁に沈降した磁
性マーカー粒子の凝集パターンに基づいて、サンプル溶
液中に含まれる被測定物質を測定する。

本発明においては、上記第一の段階において、前記磁性
マーカー粒子の懸濁液と共に前記サンプル溶液を同時に
注入しても良い。この場合、上記第二の工程〜第六の工
程は不要である。

本発明の方法では、マーカー粒子として磁性体を含有す
る磁性粒子を用いる。そして、適切な磁石を利用して、
この磁性マーカー粒子の沈降速度を増大させる。これに
より、従来の粒子凝集法に比較して著しく短時間でマー
カー粒子の沈降パターンが形成され、判定に要する時間
を短縮することができる。

また、磁性マーカー粒子の沈降のみを選択的に促進でき
るから、他の沈降性粒子が沈降する前に、磁性マーカー
粒子の沈降パターンを形成できる。

従って、被１ｌｌＪ定物質以外の自然沈降性粒子を予め
除去しなくても、高感度の測定を行なうことができる。

加えて、本発明の方法において、粒子凝集判定容器の内
壁に予め固定化しておく磁性粒子捕捉物質は、磁性マー
カー粒子を構成する磁性粒子と結合できればよい。即ち
、この磁性粒子捕捉物質は、被１ｌｌＪ定物質に対して
特異的に結合する必要はない。

従って、本発明に用いる粒子凝集判定容器は汎用性が高
く、広範囲の被測定物質の測定に用いることができる。

以下、本発明の方法を詳細に説明する。

本発明において測定すべき物質は、例えばウィルス、細
菌もしくは種々の蛋白質等の抗原物質、及びこれら抗原
物質に対する抗体等である。これら被７ｆｌｌＪ定物質
は可溶性物質であってもよく、また不溶性物質であって
もよい。

本発明で用いる磁性マーカー粒子は、測定すべき物質に
特異的に結合する物質（以下、感作物質という）、例え
ば特定の抗体または抗原を、磁性体を含有する公知の磁
性粒子の表面に固定化することにより調製する。磁性粒
子としては、市販のｒＤＹＮＡＢＥＡｓ　Ｍ−４５０Ｊ
　　（ＤＹＮＡＩ、社製の商品名）　磁性ラテックスビ
ーズｒ　ｅｓｔａｐｏｒ　Ｊ（ＰＨ０ＮＥ−ＰＯＵＬＥ
ＮＣ社製の商品名）を用いることができる。また、特開
昭５９−１９５１１３号に開示された磁性体を含むゼラ
チン粒子を用いてもよい。更に、鉄粉等の強磁性体を取
り込ませた赤血球等の細胞を用いてもよい。これら磁性
粒子の表面に前記感作物質（特定の抗体または抗原）を
固定化する方法としては、種々の公知の方法を用いるこ
とができる。

本発明で用いる粒子凝集判定容器は、その内壁に、前記
感作物質以外の部位で前記磁性粒子と結合できる磁性粒
子捕捉物質が予め固定化されている点を除き、とくに限
定されない。しかし、磁性マーカー粒子が容器壁・面に
沿って所定方向に移動するとき、該磁性マーカー粒子を
所定の領域に収束させるような傾斜壁面、例えば半球状
または円錐状の壁面を有するものを用いるのが好ましい
。

このような傾斜壁面は容器の側面にあってもよいか、底
面にあるのか好ましい。好ましい粒子凝集判定容器とし
ては、例えば半球状または円錐状の底面を有する試験管
またはマイクロプレートの内壁に、前記捕捉物質を固定
化したものが挙げられる。

磁性粒子捕捉物質としては、前記感作物質以外の部位で
、前記磁性粒子と結合できるものを用いる。

この磁性粒子捕捉物質と磁性粒子との結合には、種々の
態様が可能である。両者が直接結合する場合を第１図に
示す。同図において、１は粒子凝集判定容器である。該
容器の底面には、磁性粒子捕捉物質２が固定化されてい
る。この容器内に、測定物質と特異的に結合する感作物
質３のみを磁性粒子４の表面に固定化された磁性マーカ
ー粒子５が導入される。この場合、捕捉物質２は磁性粒
子４の表面に直接に結合できるものでなければならない
。その結合の様式は特異的な結合であってもよく、非特
異的結合であってもよい。特異的結合を達成する捕捉物
質２としては、感作物質３とは反応せず、磁性粒子４と
特異的に反応する抗原、抗体またはレクチン等の物質が
挙げられる。一方、非特異的結合を達成する捕捉物質２
としては、例えば静電結合によって磁性粒子４に結合す
るポリエチレンイミン又はポリＬ−リジン等が挙げられ
る。また、疎水結合、配位結合または磁力によって非特
異的に結合する物質、或いは反応性の広い抗体およびレ
クチン等を用いても、磁性粒子４との間の非特異的結合
が達成される。こうして磁性粒子４が捕捉物質２に直接
結合され、容器１の底面に固定される結果、磁性粒子４
に予め固定化されていた感作物質３はフリーの状態で露
出したまま残る。

第２図は、捕捉物質２がリンク物質６を介して磁性粒子
４に結合する別の態様を示している。この場合には、測
定物質と特異的に結合する感作物質３に加えて、捕捉物
質２と結合するリンク物質６が磁性粒子４の表面に予め
固定化される。このような磁性粒子マーカーを容器１内
に導入すると、捕捉物質２がリンク物質６を介して磁性
粒子４に結合することにより、磁性マーカー粒子５が容
器内壁に固定される。従って、感作物質３はフリーの状
態で露出したまま残る。なお、リンク物質６と捕捉物質
２との結合は、既述したと同様、特異的結合であっても
非特異的結合であってもよい。

この第２図の態様は、磁性粒子４に直接結合できる捕捉
物質２が存在しない場合に特に有用である。

第２図の態様において、捕捉物質２とリンク物質２との
間の特異的結合を用いる例としては、次の場合が挙げら
れる。即ち、粒子凝集判定容器１の内壁には、捕捉物質
２としてＢＳＡ抗体を予め固定化しておく一方、磁性粒
子４にはリンク物質６としてＢＳＡを固定化しておけば
よい。磁性粒子４に感作物質３を結合するときは、多く
の場合にＢＳＡによるブロッキングが行われる。従って
、この例では特別な操作を行わなくてもリンク物質３と
してＢＳＡを固定化できる利点が得られる。

同様の例として、プロティンＡ−１ｇＧ、ゼラチン−ゼ
ラチン抗体、レクチン−糖のような抗原−抗体反応を利
用することができる。

次に、第３図〜第９図を参照し、第１図の態様に従って
本発明による測定方法を行なうための手順を説明する。

まず、第３図に示すように、内壁に捕捉物質２が固定化
されている粒子凝集判定容器１を準備する。この容器１
内に、感作物質３を予め磁性粒子４の表面に固定化した
磁性マーカー粒子５の懸濁液を添加する。

次に、第４図に示したように、容器１の底面に磁石１０
を配置する。こうして測定容器の底面に磁石１０を配置
すると、磁性マーカー粒子５は磁石１０に引き寄せられ
、自然沈降よりも速い速度で沈降する。沈降した磁性マ
ーカー粒子５は、磁性粒子４と捕捉物質２との結合によ
り容器内壁に固定化される。従って、図示のように感作
物質３はフリーの状態で露出したまま残る。

次に、容７４１を洗浄して未結合で残存している磁性マ
ーカー粒子５を除去した後、第５図に示したように、被
測定物質７を含むサンプル溶液を添加し、反応させる。

第６図に示されるように、被測定物質７は容器底面に固
定化されている磁性マーカー粒子の感作物質４と特異的
に結合する。

次に、第７図に示したように、二次磁性マーカー粒子５
′を添加する。この二次磁性マーカー粒子５′としては
、先に添加した磁性粒子５と同じものを用いることがで
きる。また、感作物質３が先に用いた磁性マーカー粒子
５と同じであれば、異なる磁性粒子を用いた磁性マーカ
ー粒子を用いてもよい。

次に、第８図に示すように、容器１の底面に磁石１０を
配置する。これにより、二次磁性マーカー粒子５′は磁
石１０に引き寄せられ、自然沈降よりも速い速度で沈降
する。沈降した二次磁性マーカー粒子５′は、その感作
物質３と被測定物質７との結合により、容器内壁に固定
される。その結果、第９図に示したように、二次磁性マ
ーカ粒子５′は容器１の底面に一様に広がった陽性分布
パターンを形成する。換言すれば、第９図のような陽性
分布パターンによって、サンプル中における被測定物質
の存在を検出することが可能である。

一方、サンプル中に被測定物質７が存在しない場合には
、第７図の段階、即ち、二次磁性マーカー粒子５′を添
加したときに、容器１の内壁には被測定物質７が存在し
ない。従って、第１０図に示したように磁石１０を作用
させて二次磁性粒子マーカー５′を沈降させると、二次
磁性マーカ粒子５′は球状壁面に沿って下方に移動し、
図示のように球状壁面の最も低い部分に集まる。その結
果、第１１図に示したように、磁性マーカー粒子５は球
状壁面の中央部に収束した陰性分布パターンを形成する
。従って、第１１図のような陰性分布パターンが形成さ
れた事実から、サンプル中に被測定物質が存在しないこ
とを検出することが可能である。

上述したように、本発明によれば沈降した二次磁性マー
カー粒子５−の分布パターンを肉眼で観察し、或いは光
学測定機で測定することにより、被測定物質の存在の有
無を判定し、また該物質の定量を行うことができる。

なお別の方法として、第１２図に示したように、捕捉物
質２を固定化した容器１内に、磁性マーカ粒子５および
サンプルを同時に添加した後、磁石１０で沈降を促進さ
せてもよい。この場合にも、サンプル中に被測定物質７
が含まれていれば、第８図に示したのと同じ形の結合が
形成され、磁性粒子らは第９図に示したのと同じ陽性分
布パターンを形成する。即ち、まず容器内壁に磁性マー
カー粒子５の第−層が結合して固定化される。続いて、
該第−層の上に、非測定物質７を介して磁性マーカー粒
子５の第二層および第三層が固定化されることにより、
陽性パターンが形成される。

方、サンプル中に被測定物質７が存在しなければ、磁性
マーカー粒子の第に層および第三層が形成されないから
、第１１図と同じ陰性分布パターンが形成される。

また、第２図で説明した態様を採用する場合にも、上記
と同様の手順で測定を行なうことができる。

以上のように、本発明では粒子凝集法において磁性マー
カー粒子を用い、且つ磁石を作用させて磁性マーカー粒
子の沈降を促進させる。従って、マーカー粒子の比重や
粒径を大きしたり、或いは遠心処理を行わなくても、磁
性粒子の沈降パターンを形成するための時間を大幅に短
縮することができる。従って、沈降パターンが荒くなる
ことなく、また遠心処理を用いる場合のような欠点を伴
うことなく、測定時間を顕著に短縮することができる。

また、第３図〜第９図の手順に従えば、被測定物質７が
磁性マーカー粒子５に結合された第６図の段階で、容器
を洗浄する。従って、全血または乳び血清等のように、
被ｉ’１ｌｌｌ定物質以外の沈降性物質または不溶性物
質を含むサンプルに対しても効果的に適用することがで
きる。即ち、被測定物質以外の沈降性物質または不溶性
物質を予め分離し、サンプルを精製することなく、良好
な測定結果を得ることができる。

第１０図で説明した手順を用いる場合でも、本発明では
磁性マーカー粒子５の沈降のみを選択的に促進できるか
ら、サンプル中に含まれる被測定物質以外の沈降性物質
または不溶性物質に妨害されることなく測定を行うこと
が可能である。即ち、これら被測定物質以外の物質の沈
降が開始される前、または開始した初期に磁石を作用さ
せることによって、被測定物質以外の物質が沈殿する前
に、磁性マーカー粒子５の沈降パターンを形成すること
ができる。同様に、サンプルが高粘度の溶液であったり
、磁性マーカー粒子５よりも比重の高い溶液である場合
にも、磁性マーカー粒子５の沈降を選択的に促進して良
好な測定を行なうことができる。

更に、本発明では磁石の作用によって磁性マーカー粒子
５を強制的に移動させるから、上記被測定物質以外の物
質の沈降方向とは別の方向に磁性マーカー粒子５を移動
させることができる。例えば測定容器に試験管を用いる
場合、その側壁に磁石を配置することによって、被測定
物質以外の物質は自然沈降によって底面に沈降させ、磁
性マーカー粒子５は側壁に集めることも可能である。こ
の方法によっても、被測定物質以外の物質の影響を受け
ずに磁性マーカー粒子５の分布パターンを形成すること
ができる。

上記のように、被測定物質以外の物質の沈降による妨害
を受けずに測定を行なうことができるため、本発明の方
法は全血または乳び血清等のように、被測定物質以外の
沈降性物質または不溶性物質を含むサンプルに対しても
効果的に適用することができる。即ち、被測定物質以外
の沈降性物質または不溶性物質を予め分離し、サンプル
を精製することなく、良好な測定結果を得ることができ
る。

更に、本発明の方法では、粒子凝集判定容器１の内壁に
固定化しておく捕捉物質２が被測定物質７に対する特異
性を有することを必要としない。

従って、複数の被測定物質に対して共通して使用でき、
従来のＭ　Ｐ　ＩＩ　Ａ法のように反応容器の汎用性に
乏しいという問題はない。

加えて、本発明の方法は、非磁性マーカー粒子を用いた
従来の測定と同時に行なうことが可能である。例えば、
マイクロプレートの幾つかのウェルでは磁性マーカー粒
子を用いた測定を行なうと同時に、他の幾つかのウェル
では非磁性マーカ粒子を用いた測定を行なうことができ
る。即ち、幾つかのウェルで磁性マーカー粒子の沈降を
促進させるために磁石を作用させても、他の幾つかのウ
ェルにおける非磁性マーカー粒子には同等影響しない。

これは、多項目の測定を同時に行なうのに有利である。

本発明に用いる磁石は特に限定されず、永久磁石であっ
ても電磁石であってもよい。磁石の強さは、測定対象物
質等に応じて適宜選択する。また、磁石の形状は円板状
のものの外、どのような形状を有するものであってもよ
い。

〔実施例〕

以下、実施例従って本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ ＜ＡＬＵ字底マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製の「Ｍａ
ｘｉｓｏｒｐＪ　、カタログ番号４６９２Ｂ４）を準備
した。

一方、ポリエチレンイミン（半井化学薬品社製）を生理
食塩水（０，９％ＮａＣＩ　）で稀釈し、１．０％のポ
リエチレンイミン溶液を調製した。このポリエチレンイ
ミンを前記マイクロプレートの各ウェル内に５０μΩづ
つ分注し、室温で３０分間インキユベートシた。その後
、２００μｇ／ウェルの生理食塩水を用いて５回洗浄し
、室温で乾燥することによってポリエチレンイミンのコ
ーティング層を有するマイクロプレートを得た。このポ
リエチレンイミンコーティング層は、既述した磁性粒子
捕捉物質２として作用する。

＜Ｂ＞磁性体を含むゼラチンビーズ（粒径−５μｍ）に
抗ヒトＩｇＧ　（ＣＰＬ社製、カタログ番号３１８６７
　）を感作することにより、感作ビーズを調製した。こ
の感作ビーズは、既述の磁性マーカー粒子５として作用
する。

＜Ｃ＞上記で作成した０、５％濃度の感作ビーズ懸濁液
を、５０μｇ／ウェルづつ上記のポリエチレンイミンコ
ーティング層を有するマイクロプレートに分注した。磁
石を３分間作用させることにより、感作ビーズを底面方
向に吸引して沈降させた後、２００μｇ／ウェルの生理
食塩水を用いて２回洗浄する。これによって、第４図に
示した状態で、感作ビーズをウェルの底面に一様に固相
化させることができた。

＜Ｄ＞ヒトＩｇＧ　（ＩＣＮ社製）をＰＢＳ　（リン酸
緩衝生理食塩液）で稀釈し、０．１〜０．０１ｕｇ　／
　ｍ１６度の陽性サンプル溶液を調製した。この陽性サ
ンプル溶液を、２５μｊｌｌ／ウエルづつ、くＣ〉で処
理されたマイクロプレートに分注した。また、ＰＢＳを
陰性サンプルとして用い、これを２５μｇ／ウェルづつ
分注した。

３７℃で１０分間インキュベートした後、　２００μｐ
／ウエルの生理食塩水を用いて６回洗浄した。

次に、再び＜Ｂ＞で調製した０、５％濃度の感作ビーズ
懸濁液を２５μｇ／ウェルづつ分注した。これを磁石上
に３分間載置し、感作ビーズを沈降させて分布パターン
を形成させた。その結果、陽性サンプルを注入したウェ
ルでは第９図のような陽性パターンが得られ、また陰性
サンプルを注入したウェルでは第１１図のような陰性パ
ターンが得られた。この結果によって、本発明によりヒ
トＩｇＧの免疫学的測定が可能であることが明らかにな
った。

なお、この実施例において、くＣ〉で感作ビーズを添加
してから判定までに要した時間は、洗浄時間を除いて約
１６分であった。

実施例２ 洗浄を伴わないヒトＩｇＧの検出 ＜Ａ＞実施例１に記載したと略同じ手順により、内壁を
ポリエチレンイミンでコーティングしたマイクロプレー
トを調製した。但し、ポリエチレンイミン溶液の濃度は
０．Ｃ１１％とした。また、生理食塩水での洗浄回数は
３回とした。

＜Ｂ＞実施例１で調製したと同じ感作ビーズの０．５％
溶液と、ヒトＩｇＧを含む陽性サンプルと、ヒトＩｇＧ
を含まない陰性サンプルとを用い、次のようにしてヒト
ＩｇＧの検定を行った。

まず、感作ビーズ懸濁液を５０Ｍｇ／ウェルづつと、陽
性サンプルを２５μρ／ウエルづつとを、上記で調製し
たマイクロプレートの同じウェル中に分注した。また、
感作ビーズ懸濁液を５０μρ／ウエルづつと、陰性サン
プルの２５μΩ／ウエルづつとを、上記マイクロプレー
トの同じウェル中に分注した。各ウェル中に分注された
二つの成分を軽く混和させた後、３７℃で１０分間イン
キュベートした。

各ウェルを磁石上に載置し、沈降を促進させて分布パタ
ーンを形成させた。その結果、陽性サンプルを注入した
ウェルでは第９図のような陽性パターンが得られ、また
陰性サンプルを注入したウェルでは第１１図のような陰
性パターンが得られた。この結果は、感作ビーズとサン
プルとを同時に添加し、洗浄を行わなくても本発明の測
定方法が実施可能であることを示している。

なお、この実施例では約１３分間でパターンの判定が可
能で、実施例１に比べて測定時間を３分間短縮すること
ができた。

実施例３ ＜ＡＬＵ字底マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製のｒ　Ｍ
ａｘｉｓｏｒｐＪ　、カタログ番号４８９２６４）を準
備した。

一方、抗ＢＳＡ抗体、（抗つシ血清アルブミン抗体二Ｂ
ＥＴ社製）をｐ＋＋−９，５のＯ，０１Ｍ炭酸バッファ
ーで稀釈し、１０Ｍｇ／ｎ＋Ｉ濃度の溶液を調製した。

この抗ＢＳＡ抗体溶液を前記マイクロプレートの各ウェ
ル内に５０μΩづつ分注し、室温で６０分間インキュベ
ートした。その後、ｐＨ−７，０の　０．０１Ｍ　ＰＢ
Ｓを用い、２００μｇ／ウェルの量で５回洗浄し、室温
で乾燥することによって、内壁に抗ＢＳＡ抗体が固定化
されたマイクロプレートを得た。この抗ＢＳＡ抗体は、
既述した磁性粒子捕捉物質２として作用する。

＜Ｂ＞磁性体を含むゼラチンビーズ（粒径−５μｍ）に
抗ヒトＩｇＧ　（ＣＰＬ社製、カタログ番号３１８６７
　）を１．ｃｚｇ／ｍｌで感作し、且つＢＳＡでブロッ
キング処理することにより、感作ビーズを調製した。二
〇感作ビーズは、既述の磁性マーカー粒子５として作用
する。０．２％ＢＳＡを含む０．０１Ｍクエン酸−０，
０２Ｍリン酸の等張緩耐液（ｐＨ−６）を用い、上記感
作ビーズの懸濁液を調製した。

＜Ｃ＞ヒトＩｇＧ　（ＩＣＮ社製）をＰＢＳで稀釈し、
０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ濃度の陽性サンプル溶液を
調製した。また、ＰＢＳ自体をそのまま陰性サンプルと
した。この陽性サンプルおよび陰性サンプルを用い、次
のようにしてヒトＩｇＧの検定を行った。

まず、感作ビーズ懸濁液を３０Ｍｇ／ウェルづつと、陽
性サンプルを２５μｇ／ウェルづつとを、上記で調製し
たマイクロプレートの同じウェル中に分注した。また、
感作ビーズ懸濁液３０μΩ／ウエルづつと、陰性サンプ
ル２５μｇ／ウェルづつとを、上記マイクロプレートの
同じウェル中に分注した。

３７℃で１０分間インキュベートした後、各ウェルを磁
石上に載置し、沈降を促進させて分布パターンを形成さ
せた。その結果、陽性サンプルを注入したウェルでは第
９図のような陽性パターンが得られ、陰性サンプルを注
入したウェルでは第１１図のような陰性パターンが得ら
れた。

この実施例におけるパターン形成の機構は、次の通りで
ある。即ち、感作ビーズはその表面に存在するブロッキ
ングＢＳＡ（！：、ウェル壁面の抗ＢＳＡ抗体との結合
によってウェル壁面に固定化される。また、余分な抗Ｂ
ＳＡ抗体はビーズ懸濁液中に含まれるＢＳＡで中和され
るため、ウェル壁面はＢＳＡでブロッキングされた状態
となる。

そして、この固定化された感作ビーズの上で、更にヒト
ＩｇＧと他の感作ビーズとが反応し、陽性パターンまた
は陰性パターンが形成される。

なお、この実施例においても実施例２と同様、約１３分
間と短時間でパターンの判定が可能であった。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明によれば磁性マーカー粒子
の沈降を磁石で促進する方法を用いることにより、自然
沈降の場合よりも迅速で、しかも遠心力で沈降させる場
合よりも簡単に免疫学的測定を行うことができる。また
、従来の粒子混合凝集法よりも粒子同志の接触機会が多
くなるため、高感度で且つ迅速に安定した分布パターン
を形成できる。加えて、目的とする非測定物質に応じて
容器内壁に固定化する捕捉物質を変える必要がないため
、同一の判定容器で種々の検定項目の測定を行うことが
できる等、顕著な効果を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いる粒子凝集判定容器および磁性マ
ーカー粒子の一例を示す図であり、第２図は他の例を示
す図、第３図〜第１１図は本発明の一実施例になる免疫
学的測定方法を実施するための手順を説明するための図
、第１２図は本発明の他の実施例になる測定方法を説明
するための図である。 １・・・粒子凝集判定容器、２・・・磁性粒子捕捉物質
、３・・・感作物質、４・・・磁性粒子、５・・・磁性
マーカー粒子、６・・・リンク物質、７・・・非測定物
質、１０・・・磁石

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）被測定物質に特異的に結合する物質を磁性粒子に
   固定化した磁性マーカー粒子の懸濁液を、被測定物質と
   の結合部位以外の部位で前記磁性粒子に結合できる磁性
   粒子捕捉物質が内壁に固定化されている粒子凝集判定容
   器内に注入する工程と、磁界を印加して前記磁性マーカ
   ー粒子を沈降させ、沈降した磁性マーカー粒子の磁性粒
   子と前記磁性粒子捕捉物質との結合により、前記磁性マ
   ーカー粒子を前記粒子凝集判定容器の内壁に捕捉する工
   程と、 捕捉されなかった前記磁性マカー粒子を容器内から除去
   する工程と、 サンプル溶液を粒子凝集判定容器内へ注入して反応させ
   、容器内壁に捕捉されている前記磁性マーカー粒子に被
   測定物質を結合させる工程と、磁性マーカー粒子に結合
   されなかった物質を前記粒子凝集判定容器から除去する
   工程と、 前記磁性マーカー粒子の懸濁液を粒子凝集判定容器内へ
   注入する工程と、 磁界を印加して磁性マーカー粒子の沈降を促進させる工
   程と、 粒子凝集判定容器の内壁に沈降した磁性マーカー粒子の
   凝集パターンに基づいて、サンプル溶液中に含まれる被
   測定物質を測定する工程とを具備することを特徴とする
   磁性マーカー粒子を用いた免疫学的測定方法。
2. （２）被測定物質に特異的に結合する物質を磁性粒子に
   固定化した磁性マーカー粒子の懸濁液およびサンプル溶
   液を、被測定物質との結合部位以外の部位で前記磁性粒
   子に結合できる磁性粒子捕捉物質が内壁に固定化されて
   いる粒子凝集判定容器内に注入する工程と、 反応溶液に磁界を印加して前記磁性マーカー粒子の沈降
   を促進させる工程と、 粒子凝集判定容器内壁に沈降した磁性マーカー粒子の凝
   集パターンに基づいてサンプル溶液中に含まれる被測定
   物質を測定する工程とを具備することを特徴とする磁性
   マーカー粒子を用いた免疫額的測定方法。