JPH02210262A - 間接凝集反応測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、磁性粒子を利用した免疫学的な粒子凝集反応
分析法に関する。

〔従来の技術〕

免疫学的反応を利用した粒子凝集反応において、マイク
ロタイター法等の間接凝集反応は、安価で、簡便なこと
から免疫学的検査法の分野において広く用いられている
測定法である。この方法は赤血球、高分子粒子もしくは
ゼラチン粒子などの表面に物理あるいは化学的に結合し
た抗原又は抗体と、検体試料中の抗体又は抗原との免疫
反応により起こる粒子間凝集反応をマイクロプレートな
どの測定容器底面での粒子の凝集状態に基づいて測定す
るものである。この方法は、微量の試料で測定できるば
かりでなく、同時に多くの検体を処理しうる点で優れた
方法といえる。

しかしながら、この方法は抗原抗体反応によるシグナル
を測定容器底部における粒子の凝集像の差に基づいて測
定するため測定時間が粒子の沈降速度に大きく依存する
。このため、ヒツジ赤血球等の動物固定化赤血球を用い
ると、その比重あるいは粒径のため測定に２〜３時間と
いう長い時間を要する。そこで、測定時間を短縮するた
めの手段として、無機化合物粒子〔特開昭６２−１１５
３６６号公報〕あるいはポリアクロレイン粒子〔特開昭
６３−２４１６３号公報〕等の高比重粒子を測定担体と
して使用する方法が開発された。

これらの方法によりある程度測定時間を短縮することは
できる。しかしながら、重力に起因する自然沈降作用を
利用して、測定時間を短縮させる方法には限界がある。

即ち、測定容器底面に沿って中心まで落ちる速度を速く
する目的で容器側面の傾斜を急にすればするほど、また
沈降速度を速める目的で前記特許公報のように粒子担体
の比重や粒径を大きくすればするほど、シグナルどして
生じた凝集反応への重力の影響を増す結果となり、凝集
像を不安定にさせ、測定時間が短縮される反面、感度と
安定性を低下させる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記のような現状に鑑みて、本発明者らは間接凝集反応
の測定感度と安定性を低下させることなく、測定時間を
大幅に短縮でき、かつ測定対像が当分野で測定されてい
るものであればその種類を特に問うことなく測定可能に
する方法を提供することを目的に鋭意研究を重ねた結果
、検体試料中の被検物質に対し、親和性を有する物質を
結合した磁性粒子を使用し、該磁性粒子に磁力を作用さ
せることにより、極めて短時間に、感度よく凝集像の安
定な測定結果が得られるとの知見を得て、本発明を完成
するに至った。

〔問題点を解決するだめの手段〕

即ち、本発明は、被検物質とこれに親和性を有する物質
を結合した粒子担体の反応を粒子担体の凝集として判定
する間接凝集反応測定法において、当該親和性を有する
物質を磁性粒子担体に結合させ、同時に又は次いで当該
磁性粒子担体に磁力を作用させることを特徴とする間接
凝集反応測定法である。

本発明に用いられる磁性粒子としては、鉄、コバルト、
ニッケル、マグネタイト及び強磁性合金等の磁性体自体
か、磁性体を核として、表面をポリスチレン、シリカゲ
ル、ゼラチン、アクリルアミド等で皮膜した磁性粒子ま
たはポリスチレン、シリカゲル等の担体の外側に物理化
学的方法もしくは免疫反応等を利用した生化学的方法で
磁性体を統合させた粒子等を用いることができる。

粒子径および粒子の比重に関しては、当分野で既に使用
されている公知の間接凝集反応担体と同様のものでよい
。粒子径については、０．０１−１００μｍでよく、特
に０．５〜１０．０μｍが好ましい。粒子の比重につい
ては、１０以下、特に２以下が好ましい。さらに、これ
ら粒子径およびその比重に関しては、測定感度と凝集像
の安定性の面からは一般に重力による沈降作用を余り大
きく受けないものが好ましい。

そのような粒子としては、例えば当分野で既に免疫磁気
分離用の担体としてエンザイムイムノアッセイ、フルオ
ロイムノアッセイ、ケミルミネッセンスイムノアッセイ
、ラジオイムノアッセイ等で用いられている固相担体あ
るいは細胞分離用の担体として用いられるものも何ら制
限なく採用することができる。〔特開昭６０−１５６４
号公報、特開昭６０−７９２６６号公報、ＷＯ−８４０
２０３、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、ＭｅＬｈｏｄｓ。

９０、１７９（１９８６）等〕 本発明における間接凝集反応とは、赤血球、高分子もし
くはゼラチン粒子等の表面に物理あるいは化学的に結合
させた被検物質に対して親和性を有する物質と検体試料
中の被検物質との反応により起こる粒子間凝集反応を、
試験管あるいはマイクロプレート等の測定容器底面での
粒子の凝集状態に基づいて測定する公知の方法をいう。

検体試料中の被検物質に対する親和性を有する物質の磁
性粒子へ結合は、特に限定でなく、公知の方法が好適に
採用される。例えば、粒子表面の特性に適した方法に従
って、疎水吸着、あるいは共有結合等の物理化学的方法
を用いればよい。さらに、必要があれば磁性粒子表面を
ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等のマスキング剤で処理し
てもよい。

測定に用いる希釈液もしくは分散液については、公知の
間接凝集反応に一般に用いられているものでよい。例え
ば生理食塩水、各種緩衝液、アルブミン溶液、種々の動
物血清溶液、各種界面活性剤含有溶液、合成高分子物質
溶液およびこれらの組み合せからなる溶液を使用すれば
よい。

本発明に用いられる測定容器としては、間接凝集反応に
おいて一般に用いられている容器であればその種類、材
質、形状は何ら制限されない。例えばガラス、ポリスチ
レン、塩化ビニル、ポリメタアクリレート等からなる試
験管あるいはマイクロプレート等を用いることができる
。また、本発明者らが既に出願中である特願昭６２−２
２６５６１号に記載の測定しようとする被検物質に対す
る抗原もしくは抗体等を結合させた測定容器も使用する
ことができる。

磁性粒子を沈降させるための磁力源としては、永久磁石
あるいは電磁石等を用いればよく、その材質、形状、装
置等には特に制限されない。また、磁力の強さと磁力を
作用させた時間に関しては、磁性粒子の大きさ、比重、
測定容器の形状、測定感度、判定時間等により一定では
なく、測定対象の被検物質に最も適した条件から適宜に
決定すればよい。

本発明における検体試料中の被検物質としては、一般に
当分野で測定されている物質であれば、特に限定的であ
る必要はなく、公知の物質を測定対象にすることができ
る。代表的なものを例示すれば、例えばＣＲＰ、σ−７
エトプロラン、ＣＥＡ。

ＲＡ、梅毒抗体、マイクプラズマ抗体、ＦＤＰ。

アルブミン、Ｂ型肝炎ウィルス抗原及びその抗体、ＨＩ
Ｖ抗体等が挙げられる。

また、被検物質に対して親和性を有する物質とは、被検
物質に対する抗原もしくは抗体またはウィルスレセプタ
ーもしくはホルモンレセプター等のレセプター、もしく
はレクチン等である。

〔作用・効果〕

本発明の間接凝集反応に磁性粒子を用い、かつ磁力を作
用させることを特徴とした測定法は、粒子の沈降速度を
速めることで、測定時間を数時間から数分間に大幅に短
縮することが可能になるばかりでなく、磁力を作用させ
る時間を限定することで、高比重粒子等の重力の影響を
常に受けるために起こる測定感度や凝集像の安定性の低
下といった従来の問題点を改善することができた。

以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこ
れらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１ ヒト血清アルブミンの測定 （１）　　抗ヒト血清アルブミン抗体結合磁性化粒子の
調製 １００ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に１％
（Ｗ／Ｖ）に懸濁させたポリスチレン族の磁性化粒子（
Ｄｙｎａ１社製、４．５μｍ、　Ｄｌ、５）　ｌ容に対
し、市販抗ヒト血清アルブミンウサギ抗体（１ｍｇ／ｍ
１２ｘ　ダコ社製）■容を如来、室温で３時間反応した
。これを１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液で２回洗浄後、
５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むトリス−塩酸
緩衝液ｌ容に懸濁し、４℃で１晩処理した。これをトリ
ス−塩酸緩衝液で２回洗浄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）とな
るように１％（Ｖ／Ｖ）正常ウサギ血清を含む同緩衝液
に懸濁させ、抗ヒト血清アルブミン抗体結合磁性化粒子
を調製した。

（２）磁性化粒子沈降装置の作製 直径５　ｍｍ、高さ２ｍｍの円盤形の永久磁石（１，３
００ガウス、ピップフジモト社！ＩＪ）９６個を９６穴
Ｕ型マイクロプレートの各人と同間隔にグラスチック平
板上にＮ極を上にして接着剤で固定し、マイクロプレー
ト用磁性化粒子沈降装置を作製した。

（３）抗原の測定 正常亡ト血清より常法に従い、塩析、イオン交換クロマ
トグラフィーにより得た精製ヒト血清アルブミンをｌＯ
抛Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）にてｌＯＯμｇ／
ｍＱの濃度に調製した。このヒト血清アルブミン溶液２
５μａを１％（Ｗ／Ｖ）正常ウサギ血清と１％（Ｗ／Ｖ
）アラビアゴムを含む１００ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）２５μＱを用い、９６穴Ｕ型マイクロプ
レート（寿ガラス社製）の各人にて倍々希釈した。

次に、各人に前記Ｑ、Ｉ％ＣＷ／Ｖ＞抗ヒト血清アルブ
ミン抗体結合磁性化粒子の懸濁液を２５μαずつ加え、
マイクロプレートを１分間マイクロミキサーで振とうし
た。このプレートを前記マイクロプレート用磁性化粒子
沈降装置の上に１５ｍｍの距離をおいて静置後、１分間
ごとに凝集像を判定した。なお、ヒト血清アルブミンを
結合していない磁性化粒子の懸濁液を対照磁性化粒子と
して用いｔ；。

この結果、表１に示すとおりおよそ１０分間で判定が可
能となった。

（以下余白） 表１ ＋・・・完全凝集、±・・・不完全凝集、−・・・非凝
集実施例２ ＨＢｓ抗体の測定 （１）ＨＢｓ抗原結合磁性化粒子の調製１００ｍＭ　ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に１％（Ｗ／Ｖ）に懸
濁させたポリスチレン製の磁性化粒子（Ｄｙｎａ１社製
）ｌ容に精製ＨＢｓ抗ｊｉ［（２０ｐ　ｇ／ｍ（１、明
治乳業社製）■容を加え、室温で３時間反応した。これ
を１１００ＩＩＩトリス−塩酸緩衝液で２回洗浄後、１
％カゼインを含む同緩衝液ｌ容に懸濁し、４℃でｌ晩処
理した。これを同緩衝液で２回洗浄後、０．１％（Ｗ／
Ｖ）となるように、同緩衝液に懸濁させ、ＨＢｓ抗原結
合磁性化粒子とした。

（２）ＨＢｓ抗原結合測定容器の調製 ９６穴のＶＷマイクロプレート（ヌンク社製）の各人に
ＰＢＳで２　ｆｉ　ｇ／ｍＱに希釈した精製ＨＢｓ＃ｊ
ｃｉ液を５０μαずつ分注した。これを３７°Ｃで３時
間放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％（Ｗ／Ｖ）Ｂ　Ｓ　Ａ
　−Ｐ　ＢＳ溶液を２００μａ加え、４°Ｃで１晩放置
した。ＨＢｓ抗原結合マイクロプレートは、精製水で洗
浄後使用した。

（３）抗体の測定 市販のＨＢｓ抗体検出試薬（富士レビオ社製）により確
認されたＨＢｓ抗体陽性ヒト血清３例（Ａ。

Ｂ、Ｃ）と陰性血清２例（Ｄ、Ｅ）をそれぞれ精製水で
５倍に希釈した。この希釈血清２５μａを０．５％（Ｗ
／Ｖ）カゼインを含むｌｏＯｍＭ　トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）２５／Ｊ　Ｑを用い、ＨＢｓ抗原結合マ
イクロプレートの各穴中にて倍々希釈した。次に、各人
に前記０．１％（Ｗ／Ｖ）ＨＢ　ｓ抗原結合磁性化粒子
の懸濁液を２５μσずつ加え、マイクロプレートを１分
間マイクロミキサーで振とうした。このグレートを実施
例１に記載のマイクロプレート用磁性化粒子沈降装置の
上に５ｍｍの距離をおいて静置後、１分間ごとに凝集像
を判定した。なお、前記沈降装置を使用しない場合とＨ
Ｂｓ抗原結合磁性化粒子の代りにＨＢｓ抗厚を結合して
いない磁性化粒子の浮遊液を用いＩ；場合を対照実験と
した。

その結果を表２に示す。磁力を作用させない場合、判定
に２時間を要したのに対し、前記条件で磁力を作用させ
た場合、およそ５分間で判定可能であった。また、測定
感度および特異性の差は認められず、本発明が有効であ
ることが確認できた。

実施例３ ＣＲＰの測定 （１）　　抗ＣＲＰ抗体結合磁性化粒子の調製１００ｍ
Ｍ　）　ＩＪ　スー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）＋：　１
％（Ｗ／Ｖ）に懸濁させた磁性化粒子（Ｄｙｎａ１社製
）ｌ容に対し、精製抗ＣＲＰウサギ抗体（１００μｇ／
ｍＱｚバイオテスト社製）■容を加え、３７°Ｃで３時
間反応させた。これを同緩衝液で２回洗浄後、１％カゼ
インを含むトリス−塩酸緩衝液１容に懸濁し、３７°Ｃ
で３時間処理した。これをトリス−塩酸緩衝液で２回洗
浄後、１％（Ｖ／Ｖ）正常ウサギ血清を含む同緩衝液に
帆１％（Ｗ／Ｖ）となるように懸濁させて抗ＣＲＰ抗体
結合磁性化粒子を調製した。

（２）抗ＣＲＰ抗体結合測定容器の調製精製ＣＲＰウサ
ギ抗体（１００ｎｇ／ｍＱ）を５０．ｕｆｆずつ９６穴
Ｕ型マイクロプレート（ヌンク社製）の各人に分注した
。これを３７°Ｃで３時間放置後、ＰＢＳで洗浄し、１
％（Ｗ／Ｖ）Ｂ　Ｓ　Ａ　−Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液を２００μ
Ｑ加え、４℃で１晩放置し抗ＣＲＰ抗体結合マイクログ
レートを調製した。

（３）抗原の測定 精製ＣＲＰ抗原（実験生物医学研究所社製）を１１１１
Ｍ塩化カルシウム、１％（Ｗ／Ｖ）Ｂ　Ｓ　Ａを含む１
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）でｌ／７　
ｇ／ｍＱに調製した。この精製ＣＲＰ検体２５μＱを０
．５％（Ｗ／Ｖ）カゼインを含む１１００ｆｆＩ　トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２５μαを用い、抗ＣＲ
Ｐ抗体結合マイクロプレートの各人にて倍々希釈した。

次に、各人に前記０゜１％（Ｗ／Ｖ）抗ＣＲＰ抗体結合
磁性化粒子の懸濁液を２５μαずつ加え、マイクロプレ
ートを１分間マイクロミキサーで振とうした。このプレ
ートを実施例１に記載のマイクロプレート用磁性化粒子
沈降装置の上に２ｍｍの距離をおいて静置後、１分間ご
とに凝集像を判定しｔ；。なお、対照として精製ＣＲＰ
含まない前記希釈液を用いた。

その結果を表３に示す。およそ５分間で特異性が高く明
瞭な判定像を得ることができた。

（以下余白） 表３ 実施ｆ１１４ ＨＢｓ抗原の測定 （１）　　抗ＨＢｓ抗体結合磁性化粒子の調製精製水に
２％（Ｗ／Ｖ）に懸濁させた磁性化粒子（［）ｙｎａ１
社製）ｌ容に精製抗ＨＢｓマウス七ツクローン抗体（ジ
ノテスト社製、１００μｇ／ｍＱ）　ｌ容を加え、３７
℃で３時間反応させた。これをＰＢＳで洗浄後、０．５
％（Ｗ／ｌ／）カゼインを含む５０ＩＩＩＭトリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）　４容に懸濁し、３７℃で５時
間処理した。これを同溶液で２回洗浄後、０．２５％（
Ｗ／Ｖ）カゼインと２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５
０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液に０．１％（Ｗ／Ｖ）となる
ように懸濁させて抗ＨＢｓ抗体結合磁性化粒子を調製し
た。

（２）抗ＨＢｓ抗体結合測定容器の調製ＰＢＳで５μｇ
／ｒｎ（ｌに調製した精製抗ＨＢｓマウス七ツクローン
抗体を５０μａずつ９６穴Ｕ型マイクロプレート（ヌン
ク社製）の各人に分注した。これを３７°Ｃで３時間放
置後、ＰＢＳで洗浄し、０．５％（Ｗ／Ｖ）カゼインを
含む５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ０，８）３０
０μαを加え、４°Ｃで１晩放置し、抗ＣＲＰ抗体結合
マイクロプレートを調製した。

（３）抗原の測定 精製ＨＢｓ抗原（明治乳業社製）をＰＢＳで５０％ｇ／
ｍρに希釈した。このＨＢｓ抗原液２５μＱを０，２５
％（Ｗ／Ｖ）カゼインと２００ｍＭ塩化ナトリウムを含
む５０ｍＭト！Ｊスー塩酸緩衝液２５μＱを用い、前記
抗ＨＢｓ抗体結合Ｕ型マイクロプレートの各人にて倍々
希釈した。次に、プレートの各人に前記０．１％（Ｗ／
Ｖ）抗ＨＢｓ抗体結合磁性化粒子の懸濁液を２５μρず
つ加え、１分間マイクロミキサーで振とう後、静置した
。このプレートを実施例Ｉに記載のマイクロプレート用
磁性化粒子沈降装置の上に２ｍｍの距離をおいて、静置
後、１分間ごとに凝集像を判定した。なお、ＨＢｓ抗原
液の代わりにＰＢＳのみを検体としたものを対照検体と
した。

その結果を表４に示す。およそ５分で判定でき、高い検
出感度と鮮明な凝集像を得ることができた。

比較例 ＨＢｓ抗原の測定 （１）　　抗ＨＢｓ抗体結合固定化ヒツジ赤血球の調製 Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，６）ｌ：　５％（Ｖ／Ｖ）に浮
遊させたヒツジ赤血球４容に対し、２．５％（Ｗ／Ｖ）
グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液溶液全容え、室温で２
時間反応させた。その後、ＰＢＳで洗浄し、固定化ヒツ
ジ赤血球を調製した。この固定化ヒツジ赤血球の５％浮
遊液ｌ容に、０．００５％（Ｗ／Ｖ）タンニン酸ＰＢＳ
溶液ｌ容を加え、室温で３０分反応後、ＰＢＳで洗浄し
、タンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球を得た。

この赤血球の５％ＰＢＳ浮遊液ｌ容に精製抗ＨＢｓマウ
ス七ツクローン抗体（ジノテスト社製、２．５ｍｇ／＋
ｎ４）　ｌ容を加え、室温で３時間反応させた。その後
、ＰＢＳで洗浄し、０．５％（Ｗ／Ｖ）となるように１
％（Ｖ／Ｖ）正常ウサギ血清を含むＰＢＳに浮遊させ抗
ＨＢｓ抗体結合固定化ヒツジ赤血球とした。

（２）抗原の測定 精製ＨＢｓ抗原（明治乳業社製）をＰＢＳで５０ｎｇ／
ｍａニ希釈しｔ；。コノＨＢ　ｓ抗原液２５／ＪＩ２を
１％（Ｖ／Ｖ）正常ウサギ血清を含むＰＢＳ溶液２５μ
ａを用い、Ｕ型マイクロプレートの各人にて倍々希釈し
た。次に、プレートの各人に前記帆５％（Ｗ／Ｖ）抗Ｈ
Ｂｓ抗体結合固定化ヒツジ赤血球の懸濁液を２５μαず
つ加え、１分間マイクロミキサーで振とう静置し、凝集
像を１分間ごとに判定した。なお、ＨＢｓ抗原液の代わ
りにＰＢＳのみを検体としたものを対照検体とした。

この結果を実施例４で測定した結果と比較判定して表４
に示す。当分野で従来より広く使用されている固定化赤
血球を用いた自然沈降法による測定では、凝集像の判定
に２〜３時間を要したのに対し、磁性化粒子を用いる本
発明法では、わずか５分間で判定でき、高い検出感度と
鮮明な凝集像を得ることができた。

（以下余白）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 被検物質とこれに親和性を有する物質を結合した粒子担
   体の反応を粒子担体の凝集として判定する間接凝集反応
   測定法において、当該親和性を有する物質を磁性粒子担
   体に結合させ、同時に又は次いで当該磁性粒子担体に磁
   力を作用させることを特徴とする間接凝集反応測定法。