JPH03197496A - 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組み換えアプロチニン変異型、形質転換した
酵母菌で均質に処理した分泌産生物硫酸アンモニウム前
記アプロチニン変異型を調製する方法、および組み換え
アプロチニン変異型を含有する薬物に関する。

アプロチニンは、５８アミノ酸を含有し、そしてトリプ
シン、キモトリプシンおよび血漿カリクレインを阻害す
ることか知られている、よく研究されているタンパク質
である［Ｈ，Ｆｒ１ｔｚおよびＧ、Ｗｕｎｄｅｒｅｒ、
Ｄｒａｇ、Ｒｅｓ。

３３、４７９−４９４、１９８３；Ｗ、Ｇｅｂｈａ　ｒ
　ｄ　、　Ｈ、Ｔ　ｓ　ｃ　ｈ　ｅＳｃ　ｈ　ｅおよび
Ｈ，Ｆｒ１ｔｚ、プロテイナーセ阻害因子（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、Ｂａｒｒｅｌ
ｌおよび５ａｌｖｅｓｅｎ（編）、ＥＩＳｅｖｉｅｒ　
　５ｃｉｅｎｃｅ　　Ｐｕｂｌ、ＢＶ３７５３８７．１
９８６）。

ウシの器官から得られるアプロチニンは薬物Ｔｒａｓｙ
ｌｏｌ■中の活性物質であり、この薬物は種々の疾患、
例えば、線溶亢進性出血および外傷出血ショックの処置
のために使用される。

さらに、新しい臨床的発見が存在し、この発見は関心術
における線維素溶解および凝固により弓き起こされる血
液の損失はＴｒａｓｙｌｏｌ■の使用によりかなり減少
することができることを示す（Ｗ、ｖａｎ　　０ｅｖｅ
ｒｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｔｈｏｒａｃ、Ｓ
ｕｒｇ、４４．６４０６４５．１９８７；Ｄ、Ｒｏｙｓ
ｔｏｎ　　ｅｔａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ　　ＩＩＳ　１２
８９−１２９１．１９８７；Ｂ、Ｐ、Ｂ１５ｔｒｕｐ　
　ｅｔａ　　１．　　、　Ｌａｎｃｅ　　ｔ　　　Ｉ、
　　３６６−３６７、ｌ９８８）　　。

そのアミノ酸配列の位置１５にリジンの代わりニ他のア
ミノ酸を含有するアプロチニンの半合成的に発生した相
同体は、アプロチニンのそれらと明確に異なる作用のプ
ロフィルおよび作用の特異性を有することを示すことが
できた［Ｔ　ｓ　ｃ　ｈ　ｅｓｃｈｅ　　ｅｔ　　ａｌ
、、米国特許第４，５９５゜６７４号；Ｈ，Ｒ，Ｗｅｎ
ｚｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｘペプチドおよびタンパク質
の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ　　ａｎｄ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｖｏｌ、３．
１９８５］。

これらの半合成アプロチニン相同体のあるもは、例えば
、膵臓および白血球からのエラスターゼへ強い阻害作用
を有する。この作用の新規な特異性のために、これらの
アプロチニン相同体はエラスターゼの解放の増加により
引き起こされる疾患、例えば、気腫の発生、ＡＲＤＳ　
（大人の呼吸窮迫症候群）および慢性関節リウマチのた
めに治療学的に使用することができる。

位置１５にアルギニンを有する他のアプロチニン相同体
は、血液凝固のカスケードの中央に含まれる血漿カリク
レインへのアプロチニンの阻害作用より明確により大き
い阻害作用により特性決定される。

ウシのアプロチニンの半合成的修飾により達成可能な収
率は小さいことが、経験により示された。

したがって、有利には合成的に調製した遺伝子を使用し
て大量のアプロチニン相同体調製するために、組み換え
遺伝子産生物を発酵により調製した［ＡｕｅｒＳＷａｌ
ｄ　ｅｔ　ａｌｌ、欧州特許（ＥＰ）０１２３８９９３
Ａ２号；Ｂ、Ｖ、Ｗｉｌｃｋｅｎ−Ｂｅｒｇｍａｎ　　
ｅｔ　　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、、５．３２１９−３２２
５．１９８６］。

例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２菌株中の組み換えアプ
ロチニン変異型の調製に使用する発現系は、細胞内封入
体の形態で、アプロチニン突然変異タンパク質を融合タ
ンパク質として蓄積するものであり、アプロチニン突然
変異タンパク質は、細胸肉で、適当な融合相手、例えば
、ＭＳ２レプリカーゼのＮ末端ペプチド部分と形成する
（Ｅ、Ａ。

Ａｕｅｒｓｗａｌｄ　　ｅｔ　　ａｔ、、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ　　５ｅｙｌｅｒ　　３６９．２
７−３５．１９８８）。

これらを別として、また、Ｅ、ｃｏｌｉ発現系発現系７
奢泌系することは可能であり、これらの系は、アプロチ
ニン突然変異タンパク質と分泌シグナルペプチドのため
の適当な遺伝子配列、例えば、Ｏｍ　ｐ　Ａ配列または
ｐｈｏＡシグナル配列との融合により、阻害アプロチニ
ン変異型をバクテリア細胞のペリプラズム中に分泌する
ことができるようにする［個人的情報、Ｗ、バーンズ博
士バイエル社；Ｃ，Ｂ、Ｍａｒｋｓｒ　　ｅｔ　　ａｌ
、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１１７１１５　７１
１８．１９８６］。

真核生物系のうちで、酵母菌発現系は組み換えアプロチ
ニン変異型の遺伝子操作の調製にとくに適当であり、こ
こで遺伝子産生物は細胞内に蓄積されるか、あるいは酵
母菌からの適当な分泌シブナル配列との融合として、分
泌通路を通過しそして、膜グロテアーゼにより切断後、
阻害物質として培地中に輸送される。分泌のために使用
することができる適当なシグナル配列の例は、アルファ
交配因子、アルファーアミラーゼ、グルコアミラーゼま
たはインベルターゼのシグナル配列である。

しかしながら、Ｅ、ｃｏｌｉおよび酵母菌の外に、また
、トランスアクチベーターの調製のために多数の他の原
核生物および真核生物発現系／分泌系、例えば、バチノ
ビス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはアスペルギルス属（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕＳ）を使用することができる。

前述の例が示すように、種々の原核生物および真核生物
の系におけるアプロチニン突然’Ｒ’Ａ’ｉ’ンパク質
の発現はこの技術水準である。

これに関して、工業的規模の調製にかんがみて、細胞内
に蓄積された形態でなく、この系に固有の分泌機構を利
用することによって、アブロチニン変異型を発酵媒質中
に輸送された活性物質として得ることは有利である。

この目的に、酵母菌糸を使用するとき、分泌酵母菌タン
パク質のシグナル配列、例えば、アルファアミラーゼ、
グルコアミラーゼ、インベルターゼまたはアルファー交
配因子のシグナル配列を遺伝子操作によりアプロチニン
変異型のＮ末端に融合する。

アプロチニン変異型のＮ末端のシグナルペプチドの酵素
により切断は、酵母菌に対して固有でありかつ特異的切
断配列（シグナルペプチドのＣ末端における）を認識す
る酵素により、膜輸送により起こる（参照、Ｒｅｖｉｅ
ｗ　　ＡｒｔｉｃｌｅＲ，Ｃ，ＤａｓおよびＪ、Ｌ、５
ｃｈｕ　ｌ　ｔｚ。

Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　　３．４３−４８．
１９８７）。

しかしなから、酵母菌において発現される自然Ｎ末端配
列ｒＡｒｇ−Ｐｒｏ−ＡｓｐＪをもつ組み換えアプロチ
ニン変異型の場合において、分泌された物質は種々の融
合したシグナルペプチドのアミノ酸の変動するＮ末端付
加を有することが明らかにされた。精製に適当な均一に
かつ正しくプロセシングされた分泌産生物は発見されな
い。

分泌産生物の部分的または完全な誤ったプロセシングは
、また、酵母菌に対して固有の分泌シグナル配列との融
合産生物硫酸アンモニウム発現された他の異質タンパク
質について文献に記載されている（Ｒ，Ｃ，Ｄａ　ｓお
よびＪ、Ｌ、５ｃｈｕｌｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓ　　３．４３−４８．１９８７；Ｐ、Ｊ、　　
ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３，１
６４７１１６４７８．１９８８）。

驚くべきことには、今回、遺伝子操作により修飾されそ
して、例えば、位置２にアミノ酸プロリンの欠失を有す
るか、あるいはＡｌａ−（−２）Ｇｌｎ−（１）のＮ末
端付加を有するアプロチニン変異型が、高い百分率で、
酵母菌中で正しく発現されることが発見された。

こうして、本発明は、位置２にアミノ酸プロリンの欠失
を有するか、あるいはアラニン−（−２）グルタミン−
（−１）の付加を有する組み換えアプロチニンまたはア
プロチニン変異型に関する。

アプロチニンはヒトまたは動物の由来であることができ
る。

非常にとくに好ましいアプロチニン変異型は、群 Ｄｅ　Ｐｒｏ２−Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７、Ｄｅ　
Ｐｒｏ２−Ｖａｔ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ａｒｇ−１９
、Ａｌａ（−２）−Ｇｉｎ（−１）−Ｖａｌ１５−Ｌｅ
ｕ−１７、Ａｌａ（−２）−Ｇｌｎ（−１）−Ｖａｌ１
５−Ｌｅｕ−１７−Ａｒｇ−１９、Ｄｅ　Ｐｒｏ２−Ａ
ｒｇ−１５、 Ｄｅ　Ｐｒｏ２−Ａｒｇ−１５−Ａｌａ−１７、Ａｌａ
（−２）−Ｇｌｎ（−１）−Ａｒｇ−１５、Ａｌａ（−
２）−Ｇｌｎ（月）−Ａｒｇ−１５−Ａｌａ−１７から
なる群からのものである。

本発明は、また、前述のアプロチニンの１種または２種
以上を含有する薬物に関する。

好ましいアプロチニンは、前述の交換に加えて、位置１
２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．３４
．３６．３７．３８．３９．４１、４２および５２の１
または２以上の他の交換を有する。位置の各に存在する
ことができる交換およびアミノ酸についてのそれ以上の
詳細は、欧州特許（ＥＰ）２３８．９９３号、２９７，
３６２号および３０７．５９２号に記載されている。

以下の実施例は、自然アプロチニンと比較して修飾され
たＮ末端アミノ酸配列を有する、組み換えアプロチニン
突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）の遺伝子操作した
構成を記載する。さらに、酵母菌中のアルファー交配因
子ｐｒｅ−ｐｒｏ配列をもつ融合産生物としてのこれら
のアプロチニン突然変異タンパク質の発現、およびプロ
セシングされた分泌産生物の精製を例示する。単離され
たアプロチニン変異型の主として均一なＮ末端のプロセ
シングおよびその阻害性質を、同様に示す。

衰蒸庄 酵素および標準の技術 分子の遺伝子実験のための酵素は、ベーリンガー拳マン
ヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
（ＦＲＧ）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ　（米国）お
よびファーマシア（スウェーデン）から入手した。

分子遺伝子実験のための標準の技術、例えば、Ｅ、ｃｏ
ｌｉからのプラスミドＤＮＡの単離、種々の酵素を使用
するクローニング実験のためのＤＮＡ断片の単離および
結合は、次の文献に記載されている：マニアチス（Ｍａ
ｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コー
ルド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　　Ｈａｒｂ。

ｒ）（１９８２）。

ＤＮＡの合成 アプロチニン変異型およびＤＮＡプライマーの調製Ｉこ
要求されるＤＮＡブロックＬ特異的突然変異誘発（ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）］　を、ア
プライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０ＡＤＮＡ合成装置を使用し
て調製した。脱保護されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは
、変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によるか、あ
るいは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）に
よるトリチル誘導体として、日常的に精製した。

特異的突然変異誘発 特異的軟寒天コドンまたは遺伝子区画の特異的突然変異
誘発は、エクスティン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）の方法（Ｊ
、Ｗ、Ｔａｙ　Ｉ　ｏ　ｒ、Ｊ、Ｏｔ　ｔおよびＦ、Ｅ
ｃｋｓｔｅｉｎＸＮｕｃ、１．Ａｃ＋ｄｓ　　Ｒｅｓ、
１３．８７６４−８７８５）により、アマ−シャムーブ
ヒラ−（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ１３ｕｃｈｌｅｒ）
（注文Ｎｏ、ＲＰＮ、２３２２）を使用して実施する。

ＤＮＡの配列決定 遺伝子およびベクターの構成体のＤＮＡ配列を検査する
ために、ＭＩ３ベクター中のザブクロニングした一本鎖
ＤＮＡをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の方法（Ｆ、Ｓａｎ
ｇｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＰＮＡＳ　　７４．５４６
３−５４６７．１９７７）配列決定した。二本鎖ＤＮＡ
は、Ｍ、ハラトリおよびＹ、サカイの方法（Ａｎａ　＋
、Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ、１５２．２３２−２３８．１９
８６）により１ 配列決定した。

１００ｍ＋２の菌株ＳＣ１０ＳＣ１０６（アルファ、ｈ
ｏｍ３、ｇａ１２、ｈｉｓ６、ｕｒａ３ｉ菌株５２２０
７Ａ、Ｙｅａｓｔ　　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　　Ｃ
ｅｎｔｅｒ、カリフォルニア・バーケレイ大学、米国カ
リフォルニア州９４７２０）の酵母菌の２×１０７／ｍ
ｃＬの細胞濃度を有する懸濁液を遠心した；細胞の沈降
を５ｍ１２のＴＥ緩衝液（１０ミリモルのトリスｘ’Ｈ
ｃＩＳ　ｐＨ７゜５．１ミリモルのＥＤＴＡ）で１回、
次いで５ｍａのＬｉＡ緩衝液（ＴＥ緩衝液中の０．１モ
ルの酢酸リチウム）で洗浄した。次いで、細胞を１ｍ４
Ｌ７）ＬｉＡ緩衝液中に懸濁し、そして３０℃において
１時間インキュベーションした。

１０μＱのプラスミド溶液溶液（１〜５μｇのＤＮＡ）
および１５μＣの担体ＤＮＡ　にシン精子、３ｍｇ／ｍ
Ｑからの変性ＤＮＡ）を、０．１ｍＱの細胞懸濁液に添
加した。３０℃において３２ ０分間インキュベーションし、そして０．７ｍＱのポリ
プロピレングリコール（ＬｉＡ緩衝液中の４０％のポリ
プロピレングリコール３３５０）に添加し、そして３０
°Ｃにおいてさらに６０分間インキュベーションした。

次いで、細胞を熱衝撃しく４２°Ｃ１５分）次いでエッ
ペンドルフのマイクロフーグで４秒間遠心した。細胞の
沈澱を０．５ｍＱ、のＴＥ緩衝液で２回洗浄した：次い
で、細胞をＯ，１ｍＱのＴＥ緩衝液中に懸濁させ、そし
て選択栄養培地で平板培養した。３０°Ｃにおいて３日
後、形質転換体か得られた。

形質転換体の増殖および分泌産生物の分析形質転換体を
、スレオニン、メチオニンおよびヒスチジン（各場合に
おいて２０ｍｇ／（＋）を補充したＳＤ培地（０，６７
％の酵母菌窒素塩基、アミノ酸を含まない、２％のＤ−
グルコース）中で３０℃において培養した。十分な細胞
密度（通常５ＸＩＱ’細胞／ｍ４＋）に到達した後、細
胞を遠心し、そして培養上澄み液中のトリプシンまたは
エラスターゼ阻害活性を測定した。

１０ｃ規模の組み換えアプロチニン変異型の発現法の培
地を使用した： ＳＤ　　　バクト酵母菌窒素塩基 グルコース　　　　　　　６．７ｇ／Ｄ。

グルコース　　　　　　２０．Ｏｇ／１２バクト酵母菌
窒素塩基 グルコース グルコース ＫＨ２ＰＯ。

デイフコ酵母 エキス Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏｔ （ＮＨ４）２ＳＯＩ ＭｇＳＯ，Ｘ７Ｈ２０ 泡消剤５ＡＧ４７１ （ユニオン・カーμ イド）　　　　　　　　　　　０．１ｍ（Ｘ／１２成分
を脱イオン水中に溶解し、そしてｐＨを５５に調節する
。栄養溶液を１２］°Ｃにおいて２０２０．０ｇ／ｆｆ １　、４ｇ／ｇ １．４ｇ／Ｑ ０．２５ｇ／Ｑ ２０．０ｇ／１２ ６．７ｇ１０ ６．７ｇ／ｆｆ ＳＤ２ Ｃ６ 分間滅菌する。グルコースを必要な体積の１１５の脱イ
オン水中に溶解しそして、冷却後、栄養溶液と一緒にす
る。

源培養物： 酵母菌形質転換体を、冷蔵庫内でＳＤ平板（ＳＤ＋２％
の寒天）上で４週まで維持した。長期間の貯蔵は液体窒
素中である。

前培養物： １１２の震盪フラスコないでＳＤ２栄養溶液中で前培養
物を調製した（内容物の体積：１００ｍｆｆ）。フラス
コをＳＤ源平板からの単一のコロニーで接種し、そして
震盪器内で２８°Ｃおよび２８０ｒｐｍで２〜３日間イ
ンキュベーションした。（震盪器の軌道の直径：２．５
または５．０ｃｍ）。

１０（２の発酵： １０Ｉ２の発酵槽を約２００ｍ（２の前培養物培地中に
懸濁した１、０１２の前培養物からの細胞沈澱で接種し
た。発酵条件は、次の通りであった：Ｓ０６の溶液、２
８°Ｃ１撹拌機の速度６００ｒｐｍ。

通気速度０．５ｖｖｍ、２．５ＮのＮａＯＨおよ５ び２．５Ｎ（７１１Ｈ２Ｓｏ、１．：よるｐＩ］ノ制御
。

供給： 培養物にグルコースを連続的に供給し、そして１日■回
デイ７コ酵母エキスを供給した。

グルコース溶液： 合計体積］、ＯＯＯｍｆ２の５００ｇのグルコース；供
給を接種後４時間に０．０２ｍ（（ｌＱ　ｘ分の速度で
開始し、１０〜２０時間後にＯ，１ｍ１２／ＱＸ分に増
加した。呼吸商が１より非常に上昇しないように、グル
コースの導入を選択した。

デイフコ酵母エキス：酵母エキスは５ｇ／（ｌの量で１
日１回添加した。酵母エキスは脱イオン水中の懸濁液と
して調製した。

グルコースおよび酵母エキス溶液を１２１００において
２０分間インキュベーションした。

述べた条件下に９６時間発酵した後、約３０ｇ／αの細
胞乾燥重量に到達した。達成された産生物の収量は６ｇ
／Ｑであった。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 タンパク質は通常５Ｉ）Ｓポリアクリルアミトゲ１６〜 ルの電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ１スユ、
６８０．１９７０）により検出し、そしてクーマノシー
・ブリリアント・ブルーで染色した。

アミノ酸分析 約１ナノモルのタンパク質を２００μａの６ＭのＨＣＩ
、０．０５％のβ−メルカプトエタノールの存在下に１
１０’（！において真空下に２２時間インキュベーショ
ンした。加水分解物を乾燥し、１５０μａのクエン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ２゜２中に溶解し、そして濾過した
。アミノ酸分析は、蛍光検出器およびシマズＣ−Ｒ２Ａ
Ｘ積分器ヲ有するバイオトロニックＬＣ５０００アミノ
酸分析器で実施した。アミノ酸を、文献に記載されてい
るようにしてフタルアルデヒドとの反応後、定量し　？
こ　（Ｂｅｎｓｏｎ　　　　＆　　　　Ｈａｒｅ、Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ−ＵＳＡ％　７２．
６１９．１９７５）。

アミノ酸の配列決定 １〜２ナノモルのタンパク質を３０μＱのトリフルオロ
酢酸中に溶解し、次いでポリブレン処理したガラス線維
のフィルターに適用し、そして気相配列決定装置（アプ
ライド・バイオシステムス）でヘラインク（Ｈｅｗｉｃ
ｋ）らｎＯ方法（Ｊ。

Ｂ　ｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、２５６．７９９０．１９８
１）により配列決定した。フェニルチオヒダントイン誘
導体を分離し、そしてベウレウザー（Ｂｅｙｒｅｕｔｈ
ｅｒ）　　ｅｔ　　ａｔ、、タンパク質化学における現
代の方法（Ｍｄｅｒｎ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３０３−３
２５、Ｗａｉｔｅｒ　　ｄｅＧｒｕｙｔｅｒｔベルリン
（１９８３）に記載されているシアノＨＰＬＣカラム（
デュポン）およびウォーターズＨＰＬＣ系を使用して分
析した。

トリプシン阻害アッセイ トリプシン活性は、ゲイカー（Ｇｅｉｇｅｒ）およびフ
リッノ（Ｆｒｉｔｚ）、酵素分析の化学（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｏｆ　　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ）
、Ｖｏｌ、第３版、Ｂｅ　ｒｇｍｅｙｅｒ（編）、Ｖｅ
ｒｌａｇ　　Ｃｈｅｍ＋ｅ。

ワインハイム（１９８４）、ｐ、１２１の方法により、
ベンゾイル−し−アルギニンｐ−ニトロアニリドを基質
として使用して決定した。遊離したｐ−ニトロアニリン
を分光光度計で４０５％ｍにおいて測定した。酵素およ
び阻害因子は、基質の添加前に、１５分間予備インキュ
ベーションした。

エラスターゼ阻害アッセイ ヒト白血球エラスターゼは、エラスチン・７０ダクツ・
カンパニー・インコーホレーテッド（ＥＩａｓｔｉｎ　
　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｎｃ、、、
米国ミンシツピイ州６３０６９パシフィックＰ、Ｏ，Ｂ
ｏｘ１４７）から入手した。

使用した基質は、ＭｅＯ３ｕｃ−Ａｌａ−ＡｌａＰｒｏ
−Ｖａ　Ｉ−ｐＮＡ　［ベイケム（Ｂ　ａ　ｃ　ｈｅｍ
）、スイス国フベンドルフ］であった。アッセイの条件
は表３に示す。一般に、アッセイ緩衝液で希釈しそして
基質（ＤＭＳＯ中に０．１モルの濃度で溶解し、そして
緩衝液で原溶液の濃度に調節した）後、阻害因子の試料
を開始し、そして基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離
を４０５ｎ９ ｍにおいて連続的に追跡した。１００％の値を阻害因子
なしの対応するアッセイにおいて決定した。

阻害（％）を次の式から計算した： 阻害％−１００Ｘ　［１−（阻害因子の存在下の光学密
度／阻害因子の不存在下の光学密度）］緩衝液＝０．２
モルのトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８゜０＋Ｏ，１％のツイー
ン８０ 基質の添加後の合計の体積：０．６５ｍ１２酵素の量／
アッセイ：５０ｎｇ 室温における予備インキュベーション時間＝３０分 基質：ＭｅＯ−５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒ。

Ｖａｔ−ｐＮＡ 原溶液：Ｑ、０６５モル 量／アッセイ：Ｑ、１ｍＱ アッセイ温度＝３０°Ｃ 表：エラスターゼ阻害アッセイの条件（ナカジマら、Ｊ
、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、２５４．４０２７．１９７９
）。

実施例１ ０ Ｅ、ｃｏｌｉ−酵母菌シャトルベクターｐＭＴ１５の誘
導体（第１図）を、酵母菌中アプロチニン突然変異タン
パク質のクローニングのために使用した。

ベクターｐＭＴ１５は、Ｅ、ｃｏｌｉのための選択的マ
ーカーとしてアンピシリン抵抗性遺伝子および酵母菌の
ためにＵＲＡ３遺伝子断片を含有する。Ｅ、ｃｏｌｉお
よび酵母菌中の複製のために、ｐＢＲ３２２から由来し
たＣｏｌ　　Ｅｌおよび酵母菌からのＢ形態の２μプラ
スミドのＤＮＡセグメント使用した。異種の遺伝子の発
現のために、ＭＡＴ　ｌ−アルファープロモーターおよ
びアルファー因子の前駆体タンパク質のＮ末端ｐｒｅ−
ｐｒｏ配列のための解読領域を、プラスミドｐｃＹ１７
　（Ｋａｒ　ｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｃｅ
１１　３０．９３３．１．９８２）からのＥｃｏＲＩ−
Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片の形態で組み込んだ。

アルファー因子のｐｒｅ−ｐｒｏ配列から下流において
、ベクターｐＭＴ１５は転写ターミネータ−機能をもつ
酵母菌からのＵＲＡ３遺伝子のＢａｍＨＩ−５ａｉｌ断
片を含有する（Ｙａｒｇｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉ。

１．８．１０９５．１９８６）。

アルファー因子のｐｒｅ−ｐｒｏ配列の解読領域を有す
る２３５ｂｐのｐＭＴ１５のＰｓｔｌＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ
　Ｉ　Ｉ断片を、ベクターＭｌ　３ｍｐ　］　８中にク
ローニングし、そしてオリゴヌクレオチドブライマー５
’−ＧＡＡ−ＧＡＡ　　ＧＧＧ　　ＧＴＡ　　ＴＴＧ　
　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＡＧＡ−３’　　を使用して特
異的突然変異誘発させた。突然変異誘発の結果は、アル
ファー因子のｐｒｅ−ｐｒｏ配列の位１ｔ１８において
ＴＣＴからＡＧＣのセリンコドンの変更であり、これは
新しいＨｉｎｄｌｌｌｂｐのＰｓｔｌ−ＨｉｎｄｌＩＩ
断片を使用して、ｐＭＴｌｓ中の２３５ｂｐのＰｓｔＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を置換した。このようにして修飾
されたプラスミドをｐｓ５８０と呼んだ；それはＫＥＸ
２プロセシング部位としてＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａの代わりにＬｙｓＡｒｇのための
解読配列を含有する（第３図）。

ｐｓ５８０中のアルファー因子のｐ　ｒ　ｅ　−ｐ　Ｉ
’０配列との融合のために、合成Ｖａｌ−１５〜Ｌｅｕ
−１７−アプロチニン遺伝子を使用し、これは５′末端
においてアルファー因子のｐｒｅ−ｐ１’　Ｏ配列の少
なくとも５つのコドンによりｐＳ５８０中のＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断部位まで伸長された（第４図）。

修飾されたＶａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−アプロチニ
ン遺伝子をｐ５５８０の開いたＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍ
ＨＩ切断部位中に組み込んだ。このようにして、アルフ
ァー因子のｐｒｅ−ｐｒｏ配列の３′末端をＬｙｓ−Ａ
ｒｇ−プロセシング部３ ４ 位で再構成し、そしてＶａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−
アプロチニン遺伝子とのリーディングフレームの融合を
発生させた（第５図］。

ｐｓ５８０誘導体をｐｓ６０４と呼んだ。

Ｖａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−アプロチニンの位置２
におけるアミノ酸プロリンを排除するために、アルファ
ー因子のｐｒｅ−ｐｒｏ配列に対して５′末端において
融合したアプロチニン突然変異タンパク質を、ｐｓ６０
４からＨｉｎｄｌＩＩＢａｍＨＩカセットとして単離し
、そして突然変異誘発ベクターＭ１３−ｍｐ１３中でク
ローニングした。

位置２におけるプロリンコドンを欠失するために、次の
合成突然変異誘発ブライマーを第１突然変異誘発サイク
ルにおいて使用した： ５’−ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＣＧＴ
　ＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　
ＴＡＣＡＣＴ　ＧＧＧ　ＣＣ−３’。

Ｖａｔ−１５−Ｌｅｕ　　１７−アプロチニン遺伝子の
位置２におけるプロリンコドンの欠失は、ＤＮＡ配列決
定により評価した。

ＤｅＰｒｏ２−Ａｒｇ　　１５−アプロチニン遺伝子を
構成するために、Ｍ１３−ｍｐ１８突然変異誘発ベクタ
ー中でクローニングしたＤｅＰｒ。

２　　Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−アプロチニン遺伝
子を第２突然変異誘発サイクルにかけた。

次の突然変異誘発ブライマーを、位置１５および位置１
７のためのコドンの分子遺伝子交換のために使用した： ５’−Ｔ　ＧＧＧ　ＣＣＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＣＴ　ＣＧ
Ｔ　ＡＴＣＡＴＣＣＧＴ　Ｔ−３’棚　　狛 Ａｒｇ−１５によるＶａｌ−１５の置換およびＡｒｇ−
１７によるＬｅｕ−１７の置換を、ＤＮＡ配列決定によ
り確証した。

引き続いて、両者の組み換えアプロチニン突然変異タン
パク質を、シャトルベクターｐｓ５８０のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢａｍＨＩ切断部位中への組み込みにより、アルフ
ァー因子のｐｒｅ−ｐｒ。

配列に融合した。ｐ３５８０誘導体をｐｓ７０７（Ｄｅ
Ｐｒｏ２−Ｖａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７アブロチニン
を含有する）およびｐＡ２０２（ＤｅＰｒｏ２−Ａｒｇ
−１５−アプロチニンを含有する）と呼んだ。

突然変異体ＤｅＰｒｏ２−Ｖａ　Ｉｌ−１５−Ｌｅｕ−
１７−Ａｒ　　１９−アプロチニン（ベクタｐＳ７７３
）およびＤｅＰｒｏ２−Ａｒｇ−１５−Ａｌａ−１７−
アプロチニン（ベクターｐＡ２０２）を、前述の方法で
構成し、そしてクローニングした。

実施例２ 籠火 前述のアプロチニン突然変異タンパク質のＮ末端上への
ジペプチドＡｌａ−Ｇｌｎの遺伝子操作した付加のため
に、Ｍ１３突然変異誘発ベクター中でクローニングした
ＤｅＰｒｏ２−Ｖａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−アプロチニン
およびＤｅＰｒｏ２Ａ　ｒ　ｇ　−１５−アプロチニン
を、次のＤＮＡプライマーを使用して他の突然変異誘発
サイクルにか（す　に ５”ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　
ＣＡＡ　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’
Ａｌａ　　Ｇｌｎ ５′末端において修飾さ４％だ２つのアプロチニン突然
変異タンパク質のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により
確証した。

Ａｌ　ａ　（−２）　　Ｇｌ　ｎ　（−１）　−Ｖａ　
ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−アプロチニン遺伝子およびＡ
ｌａ　（−２）−Ｇｉｎ　（−１）−Ａｒｇ−１５アプ
ロチニン遺伝子を、実施例１に記載した方法に類似する
方法で酵母菌シャトルベクター中にクローニングしｌ二
。

クローニングしたアプロチニン突然変異タンパク質をも
つＡｌａ　（２）−Ｇｌｎ　（−１）−Ｖａｔ−１５−
Ｌｅｕ−１７−アプロチニンおよびＡｌａ　（−２）　
−ＧＩｎ　（−１）−Ａｒｇ−１５アプロチニンを、ｐ
Ｓ７４４およびｐＡ２０２７ と呼んだ。

Ａｌａ　（−２）−Ｇｌｎ　（−１）−Ｖａｔ−１５−
Ｌｅｕ−１７−Ａｒｇ−アプロチニン（ベクターｐＳ７
７４）およびＡ　Ｉ　ａ　（−２−）　−Ｇ　Ｉｎ　（
−１）−Ａｒｇ−Ａｈａ−１７−アプロチニン（ベクタ
ーｐ　Ａ　２０７　）を、前述の方法で構成し、そして
クローニングした。

実施例３ 酵母菌中の組み換えアプロチニン変異型の発現酵母菌菌
株ＳＣ］０６を、プラスミドベクタｐｓ６０４、ｐｓ７
０７、ｐＳ７４４、ｐＳ７７３、ｐＳ７７４、ｐＡ２０
２、ｐＡ２０４およびｐＡ２０７で前述のように形質転
換した。

ＵＲＡ＋酵母菌形質転換体を単離し、そして誘発条件下
に培養した（参照、方法の節）。収率を測定するために
、発現すべきアプロチニン突然変異タンパク質が位置１
５にバリンおよび位置１７にロイシンを有する場合、培
養上澄み液をエラスターゼ阻害活性について試験した。

発現すべきアプロチニン突然変異タンパク質が位置１５
にアル８ ギニンを有する場合、前述のトリプシン阻害アッセイを
実施した。引き続いて、１０Ｑの発酵槽中で分泌された
アプロチニン突然変異タンパク質の発現産生物を精製し
、そして特性決定した。

実施例４ 組み換えアプロチニン変異型の精製 １００、のバッチからの発酵ブロスを９００Ｏｒｐｍ（
１５〜３０分間）において遠心した。上澄み液を種々の
フィルター（８〜０．２μｍ）で濾過し、水で７．５ｍ
Ｓの伝導度に希釈し、そしてクエン酸でｐＨ３に調節し
た。このようにして予備処理した試料を５０ミリモルの
クエン酸すトリウムｐＨ３中のｌ　ＯＯ−２００ｍ０．
Ｓ−セファ０−ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ファスト・フ
ロー（ファーマシア）と混合し、そして３０〜６０分間
撹拌した。引き続いて、ゲルをｌ〜５Ｑの５０ミリモル
のクエン酸ナトリウムｐＨ３，１０ミリモルのトリスＨ
ＣＩ、ｐ　Ｈ９で洗浄し、そして最後に２０ミリモルの
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６で洗浄した。

洗浄したゲルを適当なカラムに移し、溶離し、そしてＢ
ＩＯ−ＰＩＬＯＴ系（ファーマシア）中で分画し、ここ
で２０ミリモルのＨＥＰＥＳ中の０〜１モルの塩化ナト
リウムの勾配使用した。ヒト白血球エラスターセまたは
ウシトリプシンを使用する阻害アッセイにおいて阻害活
性の決定後、適当な分画を集め、そして回転蒸発器で濃
縮した。

この材料をさらにセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−５０スーパーフアイン（７アーマシア）のゲル濾過
および２０ミリモルのＨＥＰＥＳ。

ｐ、　Ｈ６中のＳ−セファローズファスト・フローまｌ
二はＳ−セファロース゛ＨＰまｌこ（まモノＳ（ファー
マシア）のクロマトグラフィーによりさらに精製した。

０〜１モルのＮａＣ］の勾配をＳ−セファロースからの
溶離に使用した。分画をゲル電気泳動および適当な阻害
アッセイにより検査した。阻害活性をもつを集め、０．
１モルのＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析し、そして凍結乾
燥した。

前記の工程図を下記に示す。

遠心（９０００ｒ、ｐ、ｍ） φ ゲル濾過（セファデックスＧ−５０） ・Ｊ７ 十 透析（ＮＨ，ＨＣＯ３） ］・ 凍結乾燥 典型的には、発酵バッチ中に存在する阻害因子の量に基
づいて２０〜４０％の収率が得られた。

実施例５ 実施例４におけるように得られた阻害因子の特性醪 凍結乾燥物を最初にアミノ酸分析（第１表）お１ よびＮ末端配列決定（アプライド・ハイオシステムスの
配列決定装置）（第２表）により特性決定した。その結
果を下記第１表および第２表に示す。

２ Ｖａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−アプロチニンの場合に
おいて、このアプロチニン変異型のＮ末端において正し
く切断された分泌された物質（正しいプロセシング）は
発見されなかった。対照的に、位置２における欠失また
はＮ末端の伸長Ａｈａ（２）−Ｇｌｎ（−１）ｆｉ：有
するアプロチニン変異型は、７０〜８０％の正しいＮ末
端のプロセシングで発見された。

この結果を第３表に示す。

第３表 さらに、阻害の反応速度論をヒト白血球エラスターゼま
たはウシ膵臓カリクレインで決定した。

この結果を第４表に示す。

３に れから、Ｎ末端における変化は阻害性質に影響を与えな
いことが見いたされた。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、位置２にアミノ酸プロリンの欠失を有するか、ある
いはアラニン−（−２）−グルタミン（−１）の付加を
有するアプロチニン。

２、ヒトまたは動物由来の上記第１項記載のアプロチニ
ン。

３、位置１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．
１９．３４．３６．３７．３８．３９．４１１４２およ
び５２の１または２以上の追加の変動を有する上記第１
または２項記載のアプロチニン。

４、群 ＤｅＰｒｏ２−Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７、ＤｅＰｒ
ｏ２−Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ａｒｇ−１９、Ａ
ｌａ（−２）−Ｇｌｎ（−１）−Ｖａｌ−１５−Ｌｅａ
−１７、Ａｌａ（−２）−Ｇｌｎ（−１）−Ｖａｔ−１
５−Ｌｅｕ−１７−Ａｒｇ−１９、ＤｅＰｒｏ２−Ａｒ
ｇ−１５、 ＤｅＰｒｏ２−Ａｒｇ−１５−Ａｌａ−１７、Ａｌａ（
−２）−Ｇｌｎ（−１）−Ａｒｇ　　１５、Ａ１．ａ（
−２）−Ｇｌｎ（−１）−Ａｒｇ−１５−Ａｌａ−１７
からのアプロチニン変異型。

５、上記第１〜４項のいずれかに記載のアプロチニンを
含有する薬物。

６、適当なベクターを使用して酵母菌または他の下等の
真核生物を形質転換し、この形質転換体を培養し、そし
てアプロチニン変異型を培養ブロスから精製することを
特徴とする、上記第１〜４項のいずれかに記載のアプロ
チニン変異型を調製する方法。

７、形質転換しそして培養する下等の真核生物はサン力
ロミセス・セレヒシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
である、上記第６項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｅ−ｃｏｌｉ−酵母菌シャトルベクターｐＭ
Ｔ１５の制限地図である。酵母菌中の遺伝子の発現のた
めｔこ必須なりＮＡシグナル配列は箱で囲まれている。 第２図は、ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子の配列中の
新規なＨｉｎｄｌ１１切断部位の遺伝子操作した導入を
示す。ＨｉｎｄｌＩＩの認識はセリンコドンの交換（Ｔ
ＣＴ−ＡＧＣ）により発生しＩこ。 第３図は、Ｅ、ｃｏｌｉ−酵母菌シャトルベクターｐ３
５８０の構成の線図である。 第４図は、５′末端においてＨｉｎｄｌＩＩ切断部位ま
で伸長したアルファー因子のリーダーのＤＮＡ配列をも
つ、合成Ｖａ　］−１５−Ｌｅｕ１７−アプロチニン遺
伝子のＤＮＡ配列を示す。 アミノ酸配列中のＫＥＸ２酵母菌酵素の切断部位にしる
しが付されている。 第５図は、Ｅ、ｃＯ！＋酵母菌−シャトルベクターｐｓ
６０４の構成の線図である。 ９ ０ １−１（Ｃ左 ）−１く （１＋　トぽ ＜？ト 手続補装置 （方式） ％式％ 事件の表示 平成２年特許願第２３５９６１、 発明の名称 ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、位置２にアミノ酸プロリンの欠失を有するか、ある
   いはアラニン−（−２）−グルタミン−（−１）の付加
   を有するアプロチニン。