JPH04501666A - 真正ｆｇｆの酵母における発現およびプロセシング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 真正ＦＧＦの酵母における発現およびプロセシング本発明は組み替えＤＮＡ技術 を利用したヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の一般的な生産、特にＦＧＦの酵 母内での発現に関する。

ＦＧＦ発現を１９７０年代（ゴスポダロピッチ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚ） 　１９７４　Ｎａｔｕｒｅ２４９：　１２３−１２７）に有糸分裂誘発性の下垂 体ホルモンとしてはじめて同定された。

その後、初期脳および下垂体組織に存在する因子が内皮細胞、線維芽細胞、網膜 細胞およびその他の細胞等のさまざまな種類の多くの細胞の成長を促進させ得る ことが明らかになった。ごく最近、さまざまな成長因子をコードする遺伝子のク ローン化により、その活性のほとんどは２種類の微小な異種蛋白質、塩基性及び 酸性ＦＧＦ　（引例としてここに含まれるゴスボダロピッチ（Ｇｏｓｐｏｄａｒ ｏｗｉｃｚ）　１９８６Ｍｏ１．ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、４６ ：１８７−２０４を参照せよ）に存在することが明らかになった。

塩基性及び酸性ＦＧＦは現在までに多くのさまざまな種からさまざまな精製法に より単離されて来た。ＦＧＦ前駆体をコードするゲノミッククローンおよびＣＤ ＮＡの生産がさまざまな成長因子の一般的な共通性を証明してきたが、それらの 生物学的な面において新しい問題が起こった。例えば、ＦＧＦのｃＤＮＡクロー ンは分泌された蛋白質と広く結合する古くから知られるシグナル配列を含まなか った。また、多くの研究グループがＦＧＦ蛋白質全体の長さが違うことばかりで なくＮＨ２末端アミノ酸が違っていることを報告した。

正確に生物学的な特徴を解読するために、もしＦＧＦの微小な異種蛋白質があれ ば、さまざまなＦＧＦの生産のための組替え発現系を確立する必要がある。その 発現系はアミノ末端のアセチレーションを含む自然な様式での後翻訳過程の修飾 かできるはずである。理想的には、この系か経済的な方法で容易に精製できる形 で蛋白質を高発現レベルで供給することもできるであろう。本発明はこれらのお よび他の要求について実行した。

本発明は典型として実質的にアミン末端がアセチル化されているヒト塩基性およ び酸性ＦＧＦの酵母における生産の方法および構成を供給する。これらの真にア ミノ末端がプロセッシングされた蛋白質が酵母の細胞内で高レベルで発現され、 実質的に均質な状態に容易に精製された。ヒト塩基性ＦＧＦポリペプチドとして は、少なくとも約９．３Ｘ１０５ユニット／■ｇの特異的活性が得られた；ヒト 酸性ＦＧＦポリペプチドとしては、少なくとも約０．６１Ｘ１０５ユニット／Ｉ １ｇの特異的活性が得られた。

ヒトＦＧＦの後翻訳過程の修飾の真正な形を生産する本発明の方法は次の段階か らなる。

ａ）Ｎ末端のメチオニンを含んだ約１５５のアミノ酸からなるＦＧＦをコードす る遺伝子をもった発現ベクターを用いて酵母を形質転換する、但し遺伝子は酵母 内で機能するプロモーターの転写制御下にある。

ｂ）形質転換された酵母を実質的な分泌がない状態でＦＧＦ遺伝子を発現させる のに適した状態で培養する、但しＮ末端がアセチル化されたＦＧＦポリペプチド が生産される；そしてＣ）酵母の培養液からＦＧＦポリペプチドを分離する。

この方法では、通常３０％から１００％のＦＧＦポリペプチドがアセチル化され ていた。ＦＧＦポリペプチドはしばしば２から約５の修飾形を含んだ微小の不均 一からなる。これらのポリペプチドのそれぞれは例えばヘパリンアフィニティー カラムおよび／あるいはＨＰＬＣカラムにより均質に精製される。

本発明のＤＮＡの組換え体は最終的なプロセッシングを受けたヒト塩基性あるい は酸性ＦＧＦおよび欠失したかたちで酵母の細胞内で発現することを指示するこ とができる。その組換え体は適切なＦＧＦをコードする遺伝子と融合する開始コ ドンから上流の酵母の転写プロモーターＤＮＡ領域もまた含む。その遺伝子は実 質的には下流に転写ターミネータ−をもつ。一般的には、その組換え体は形質転 換された宿主酵母細胞からのポリペプチドの分泌を指示することはできない。

本発明のアセチル化されたヒトＦＧＩ”を含んだ組成物は一般に一次構造のコン フォメーションのすべておよび生来関連した１あるいは幾つかの天然のＦＧＦの 生物学的特性を本質的にもっている。これらの組成物は実質的にバクテリアある いは他の哺乳類の蛋白質を含まず、一般に最初のメチオニン残基を含まない。

第１図はヒト塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列および対応する合成ヌクレオチド配列 を表す。

第２図はヒト酸性ＦＧＦのアミノ酸配列を表す（１−１５４）。

第３図はウシおよびヒトＦＧＦの発現のための組換え体プラスミドの模式的な図 を表す。（ａ）シストロンをもたないメツセージとしてウシ酸性ＦＧＦ（１−ｉ ４０）およびＦＧＦ（１−１４６）のＲＮＡをもったｈｓＯＤの転写をさせるｐ ｔａｃ５ｓＯＤ由来のｐｔａｃ５ｓＯＤ／ｂＦＧＦ（ｂ）サツカロミセス　セル ビシエにおけるａ−因子リーダー融合蛋白質のプロセッシングおよび発現のため のｐＡＢ２４ａ／ＧａＦ−ｂａＦＧＦ（１−１４のおよびｐＡＢ２４Ａ／ＧａＦ ｂｂＦＧＦ（１−１４６）酵母分泌プラスミド。転写はグルコース制御可能なＡ ＤＨ−２／ＧＡＰＤＥ［プロモーターにより操作される。（Ｃ）ヒトＦＧＦ前駆 体のグルコース制御可能な細胞内発現のためのｐＡＢ２４　Ａ／Ｇ−ｈａＦＧＦ およびｐＡＢ２４　ａ／Ｇ−ｈｂＦＧＦプラスミド。再び、転写はＡＤＡ−２／ ＧＡＰ囲プロモーターにより操作される。親の酵母のベクターは、ロイシンある いはウラシル欠乏状態における形質転換体の分泌のためのＬＥＵ２およびＵＲＡ ３遺伝子を含む。プロモーターの回りの詳細なりＮＡおよびコードされるアミノ 酸の配列および分泌シグナルとＦＧＦの融合が第４図に表されている。

第４図は大腸菌内での発現（Ａ、　Ｄ）　、サツカロミセス　セルビシエ内での 分泌（Ｂ、　Ｅ）　、およびサツカロミセス　セルビシエ内での発現および分泌 （Ｃ１Ｆ）のための塩基性ＦＧＦ　（Ａ−Ｃ）　、および酸性ＦＧＦ　（Ｄ−Ｆ ）組換え体のつなぎめの合成りＮＡおよびコードされるアミノ酸の配列を表して いる。

第５図は”短い”ｒｈｂＦＧＦのＳＤＳゲル分析を表す。ガラスピーズを用いた 破壊により得られた酵母細胞の抽出物を、５０．００Ｏｒｐｍにて１時間超遠心 した。これらの透明になった抽出物のアリコートをＳＤＳゲル電気泳動により分 析した。ｒｈｂＦＧＦはヘパリン５−ＰＶ　ＨＰＬＣカラムでクロマトグラフィ ーにより精製し、そしてその精製された蛋白質の一部もまた電気泳動に供した。

第６図は′短い’　ｒｈｂＦＧＦの９−１５４および１０−１５４の逆相ＨＰＬ Ｃの分析を表す。精製されたｒｈｂＦＧＦの一部は室温にてＶｙｄａｃ　Ｃ−４ 逆相カラムでクロマトグラフィーにより分析した。

第７図はｒｈｂＦＧＦのアルカリホスファターゼ処理を表す。ゲルで精製された １７．５キロドルトンおよび１９．５キロドルトンのｒｈｂＦＧＦのアリコート は子牛の腸のアルカリホスファターゼ存在下あるいは非存在下において３７℃で ２時間インキュベートし、サンプルバッファーと混合して１５％ＳＤＳゲルで電 気泳動した。

第８図は温度を上昇させた場合のｒｈｂＦＧＦの逆相ＨＰＬＣを表す。Ａ−Ｃの 部分、ｒｈｂＦＧＦ（Ｌｏｔ　Ｆｉｂ１６）は室温において（Ａ部分）、および ５０℃において（ＢおよびＣ部分）ｖｙａａｃ　Ｃ−４カラムでクロマトグラフ ィーにより分析した。Ｃ部分はＡおよびＢよりゆるい傾斜を表す。ｐの部分にお いては、ｒｈｂＦＧＦ（Ｌｏｔ　Ｉｎ＋１９）のサンプルをポリマーラブズ（Ｐ ｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｓ）　ＰＬＲＰ−５，３００オングストローム（Ａｎｇｓ ｔｒｏｓ＋）カラムで５０℃において分析した。

真正ＦＧＦポリペプチド、特に酵母細胞の発現の間にアミノ末端がアセチル化さ れた酸性および塩基性ＦＧＦの十分な発現のための方法および組成物を提供する 。上記方法は酵母細胞内における発現を最大限にする翻訳開始領域とともに適切 なＦＧＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いている。その遺伝子は細 胞内発現（すなわち実質的な分泌のない）が可能なベクターに挿入する。モして ＦＧＦポリペプチドは細胞が破壊されたときのみに得られる。その後、ＦＧＦは 敏感な細胞のインビトロの成長を高めることを含んださまざまな方法を使用する ためおよび治療薬として精製される。

本発明の組成物は一般的にアセチル化されるヒトＦＧＦからなる。ここで用いら れたように、アセチル化はここに引用されているような米国特許出願第６０９． ４１２号（１９８４年１１月５日出願）に開示されているような蛋白質のアミノ 末端へのアセチル基への付加である。

アセチル化は幾つかの理由、最も著しくは適切な天然の構造およびコンホメーシ ョンをもった生産物を提供することである。このようにして医学用途で受容者に 投与されるときはアセチル化されたＦＧＦは事実上還元されるかあるいは免疫原 性を除去する。さらにアセチル化されたポリペプチドはさらに安定になりそ゛し てインビボで利用されるときの分解に抵抗性を示すと思われ、受容者内において 抵抗性が延長される。本発明の組成物は１００％アセチル化されたポリペプチド からなるしかしさらに一般的なアセチル化は７０勤）ら５０％の範囲になり、期 待されるのは３０％あるいはそれ以下であろう。

本発明のＦＧＦはふたつの一般的なカテゴリーすなわち塩基性ＦＧＦおよび酸性 ＦＧＦに分けられる。ここで用いられたように、塩基性ＦＧＦは通常９．０から １０゜０の間、好ましくはおよそ９．６の等電点におけるｐＨ値をもち、ヘパリ ンに結合することができる。塩基性ＦＧＦは脈管形成の因子であり、顆粒球、副 腎皮質細胞、クロンドサイト（Ｃｈｒｏｎｄｏｃｙｔｅｓ）、骨髄芽細胞、角膜 および血管の内皮細胞、血管の平滑筋細胞を含む広範囲な通常の二倍体の中胚葉 由来のおよび神経堤由来の細胞において有糸分裂誘発性である（米国特許出願第 ６０９．４１２号（１９８４年１１月５日出ｍ＞を参照せよ）。本発明に従って 、塩基性ＦＧＦはさまざまな分割された形で生産されてきたしかし好ましい形は 第１図のヒト塩基性ＦＧＦに見られるように開始コドンの直後のアラニン残基か ら始まる番号付けをもったアミノ末端がアセチル化された塩基性ＦＧＦである（ １−１５４）　（ＰＣＴ／ＵＳ８６／１０８７９出願（１９８７年３月２６日公 開）を参照）。ここで用いられたように、酸性ＦＧＦは事実上７．０以下で、通 常はおよそ５．０から６．０の間の等電点におけるｐＨ値をもち、ヘパリンに結 合することができる。通常、酸性ＦＧＦは塩基性ＦＧＦのように繊維芽細胞、血 管および角膜の内皮細胞、クロンドサイト（Ｃｈｒｏｎｄｏｃｙｔｅｓ）、骨芽 細胞、骨髄芽細胞、平滑筋細胞およびダリア細胞のような、塩基性ＦＧＦの場合 と同じ種類の多くの細胞の有糸分裂を促進する。第２図のヒト塩基性ＦＧＦに見 られるような番号付けを利用すれば、塩基性ＦＧＦと同様に好ましい酸性ＦＧＦ もまた約１５４アミノ酸である（ここに引用されているヨーロッパ特許出願第８ ７３０６０６６、９号（１９８８年３月１６日公開）を参照せよ）。

酸性および塩基性ＦＧＦの両方ははさまざまな微小な不均質な形すなわち１５４ アミノ酸中に存在していることは知られており、特に蛋白質分解に関与している しかし付加的な修飾には関与していないはずである。したがって、実施例によっ て提供されたしかし限定されない付加的な形はヒト酸性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（９−１５ ４）、　（１３−１５４）および（１６−１５４）、およびヒト塩基性Ｆ　Ｇ　 Ｆ　（９−１５４）および（１０−１５４）を含む。したがってここで用いられ たように、アミノ末端がプロセシングを受けたＦＧＦは通常アセチル化されるそ のような微小の不均質な形に属する。もちろん、当業者は本発明のＦＧＦが期待 された生物学的活性を残して提供された内部の欠失、多くのアミノ酸残基の付加 あるいは交換のような対立した相違および通常の変位にもまた関与していること を認識してる。

酵母において本発明のＦＧＦポリペプチドを調製するために、そのポリペプチド をコードする適切なりＮＡ配列を単離するがあるいは通常の技術に従いヌクレオ チドど塩基の集合により化学的に合成しなければならない。好ましくは、次に完 全鎖長の遺伝子を組み立てるために期待された遺伝子の両方の鎖がらの対応する 配列のすべてのヌクレオチドをあるいはオーバーラツプする部分で合成する化学 的な合成が利用される。

これらの遺伝子を得たら、期待された蛋白質の細胞内発現を指示することができ る酵母のプロモーターを含んだ酵母の染色体外因子のようなベクターに挿入する 。これらのベクターは通常遺伝子からすぐ上流に融合する開始コドンおよび遺伝 子のすぐ下流に融合する終止コドンを含む。適切な強いプロモーターはアルコー ルデヒドロゲナーゼ１および２、トリオースホスフェートイソメラーゼおよび他 のどのようなよく知られたプロモーターでもよい。正確なアセチル化を確実にす るために、しかしながら、分泌シグナル配列は通常十分なアセチル化を確実にす ることを避けられている。ＴＰＩ−１ターミネータ−のような酵母に一般的なタ ーミネータ−配列もまた利用される。引例として引用されているマニアティスら 、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ狽盾窒凵@１９ ８２に述べられているよく知られた技術にしたがって、これらのＤＮＡ断片のす べては連結される。

期待されたＤＮＡの調製か行われた後に、ベクターは通常の技術により適切な宿 主酵母において形質転換させた。好ましい宿主はプロテアーゼレベルを下げたサ ツ力ロミセスセルヒシェであるが、ＮＡＴＩ　（Ｎ−ターミナルアセチルトラン スフエラーセ）マイナス変位株が好ましい。サツ力ロミセスセルビシェの中で特 に好ましい株はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　１ｌａｒｙｌａｎｄ　Ｕ、Ｓ、`、に預 ＪすられているＪＳＣ３（＋２と呼ばれるものである。付加的なアセチラーセ活 性を供給し明らかに大量生産されているはずであるＮＡＴＩおよびＡＲＤＩ（停 止欠損）の大量生産により、実質的に著しくアセチル化されたＦＧＦが生産され 得る。そのような大量生産のために強いプロモーターの制御下にＮＡＴＩおよび ＡＲＤＩは、ＦＧＦを含む適切な発現ベクターの形質転換に適した二倍体をつく るような別々の宿主に挿入される。

形質転換された酵母細胞は、利用した特別なベクターへの依存をよく変える慣用 的な複合媒体で生育させることにより選択される。一度選択されれば、ベクター を含んだ形質転換体をクローン化し、高生産菌を選択し、適切な培地で生育させ る。

酵母細胞が適切な密度に成長したら、本発明の細胞内ＦＧＦは、着初の細胞破壊 により得られ、通常の精製技術により適切な蛋白質が単離される。そのような技 術は当業者にはよく知られており、アフィニティクロマトグラフィー（特にヘパ リン支持）、電気泳動、透析、ＨＰＬＣあるいは他のカラムクロマトグラフィー および類似物を含みうる。ＦＧＦは通常少なくとも９５％純正あるいは９鴎から ９９％あるいはそれ以上に均質に精製されるであろう。

本発明の酸性および塩基性ＦＧＦは天然に存在する蛋白質としては実質的に同じ アミノ酸配列をもっている。以前に指摘したとうり、微小の不均質さによりさま ざまな長さで、実質的にはアミノ末端から蛋白質が分解される。５あるいはそれ 以上のＦＧＦポリペプチド形が単一の酵母培養液から精製されるが、より一般的 には、２ないし３の形が生産される。通常は、少なくとも約５０％あるいはそれ 以上のＦＧＦ形がアセチル化され、最低２％から５％、最高４０勤１ら５０％の 範囲で他の形が存在する。

特に好ましい組成物は単一形のＦＧＦのみを含む。そのような組成物は、さらに クロマトグラフィーあるいは電気泳動をすることにより微小の不均質なＦＧＦ調 製物から得られる。一方、ヒト塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（９−１５４）は微小で不均 質になることなく発現される。

本発明の実質的に純正なＦＧＦポリペプチドは静脈内、皮下、筋向、あるいは経 口により患者に与えられる薬剤学的な組成物を形成する薬剤学的に受容されるキ ャリアーと化合させ得る。もちろん要求は扱われている特別な状況、その状況の 厳格さおよび適切な扱いの期間により変えられる。適切な濃度は広範囲に変えら れ、通常１から５０　ｍｇ／■ｌで、好ましくは１０から１００１ｇ／ｍｌの間 である。インビボで繊維芽細胞の出現および増加の速度を上昇させるために十分 な、治療に効果的な量は高濃度の調製物で１から霜１の間である。同様の濃度、 しかし通常は低いが、が細胞培養液のようなインビボでのＦＧＦ受容細胞の成長 および生育力を高めるために使用される。

これらの蛋白質は、酸付加塩あるいは金属化合物たとえば亜鉛、鉄あるいは類似 物のような薬剤学的に受容される無毒の塩の形でしばしば投与される。本発明の 蛋白質は薬剤師の指導の元に投与されるべきである。もし望むのであれば、血小 板由来の成長因子、表皮由来の成長因子、インスリン様因子、およびＴＧＦ−ａ 、　ＴＧＦ−あるいは類似物のようなよく知られたどのような形質転換成長因子 でも含む他の有糸分裂誘発剤のような他の治療剤ばかりでなく適切なキャリアー 、安定剤中の希釈剤とともに投与される。

本発明の精製された真正ＦＧＦの組換え体はさまざまな系において活性があるこ とが明らかになっている。これらは脈管形成のモデルにおいてばかりでなく線維 芽細胞および内皮細胞のような細胞増殖の通常のアッセイを含む。したがって、 これらのＦＧＦは他のＦＧＦが活性をもっていたことが証明されたように広範囲 な応用に利用される。これらはインビボにおける神経の再生、傷の修復、虚血お よび角膜の修復のモデルを含む。さらに、神経の存続および分化を促進すること ができる好中球因子として、本ＦＧＦは細胞の老朽、神経の退化、および細胞死 のような中心的および周辺の神経系に有効な治療薬の発明を許容する。

以下の実施例は実例によるものであるが、限定はされない。

実施例 ■、材料および方法 以下の一般的な材料および方法は本発明のＤＮＡ組替え体および発現されたＦＧ Ｆ蛋白質の調製に利用された。引用されたそれぞれの引例は特に本文中に入れら れている。また、以下の略語も用いられている：ｂａＦＧＦはウシ酸性ＦＧＦを 、ｈａＦＧＦはヒト散性ＦＧＦを、ｂｂＦＧＦはウシ塩基性ＦＧＦを、ｈｂＦＧ Ｆはヒト塩基性ＦＧＦを表す。

Ａ、ＤＮＡ合成および遺伝子の組み立てオリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０＾合成機を用いてホスホアミダイト法により合成 された。シアノエトキシホスホアミダイト中間産物（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏ ｎｅｔｉｃｓ、　ｌ１ａｙｖａｒｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）、および０−ニ トロフェニルテトラブル活性試薬（Ａｍｅｒｉｃａｎｓ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ） は１８から４５塩基のオリゴヌクレオチドの合成に使用された。

一般的に、完全な遺伝子は相補的なオリゴヌクレオチド間で最大のオーバーラツ プをもつ約２２のそのようなオリゴヌクレオチドからなる。それらのオリゴヌク レオチドの精製およびリン酸化はウーデア（Ｕｒｄｅａ）ら（１９８３）Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１，Ｓ、　Ａ、　８０　ニア４６ １−７４６５に述べられている。混合したオリゴヌクレオチドは２％Ｍ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，０，１０＋ｏＭ　ＩＩｇｃｈ、および１ｈｌ［ジチオス レイトールを含む緩衝液中で９０に熱しそして２５になるまで３時間以上冷やし た。アニーリングさせた後、その混合物に３ｍ１ｌ　ＡＴＰを加えた。２５にお ける１５分間のＴ４リガーゼ（５ａｌ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ、　４Ｘ１０５−Ｌ二ｙト／ｍｌ）によるライゲージ３ンの後エタノール沈 殿を行いＸｂａ＝Ｉおよび５ａｌ−Ｉで切断した。それぞれ合成したウシ遺伝子 は７％アクリルアミドにてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、エレ クトロエリューションしてからＸｈａ−Ｉ／５ａｌ−Ｉで切断したｐＨＧ１００ 中にクローン化した。対応するヒト遺伝子は同様にＮｅｏ−／５ａｌ−１で切断 したｐＢｓｌｏｏ（Ｂａｒｒ、　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８７）　 Ｖａｃｃｉｎｅ　５：　９Ｏ−１０１）中にクローン化された。これらのプラス ミドを、　ＢａｍＦｉｌで切断されさらにアルカリホスファターゼ処理された酵 母プラスミドｐＡＢ２４　（第３図）中にクローン化されている発現２カセツト １をフリーにしてやるためにＢａｔｎｆｉｌで切断した。遺伝子配列およびそれ に引きつずく発現ベクターとのっなぎめの配列はＭ１３ジデオキシ塩基塩基法定 法により決められた。塩基性ＦＧＦ遺伝子のとくにＧ−Ｃが豊富な領域について は配列情報が凝縮された部分を解読するためにｄＧＴＰアナログである７−デア ザｄＧＴＰをもちいた（Ｂａｒｒ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）旦 ｋｎ勉庶些胚４：　４２８−４３２）。

Ｂ、プラスミド ｐｆｌＧｌｏｏはｐＡＢ１１４にＭｇのｐＢＲ３２２由来のプラスミドである（ Ｂｒａｋｅ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、 　８１：４６４２−４６４６）。それぞれのプラスミドはサツカロミセスセレビ シェのａ因子プロモーター、ｐＡＢ１１４のａ因子の構造遺伝子の周囲のリーダ ー配列およびターミネータ−配列を含む。さらに、ｐＨＧ１００は完全なｈＩＬ −２をコードしている配列のすぐ５“側の唯一のＸｂａ−１クロ一ニング部位を コードする沈黙変異を挿入することにより修飾されている（第４図）。発現の研 究のために、ａ因子リーダー合成遺伝子構成物はｐＡ／Ｇａ−因子ｂＦＧＦ　（ 第３図［ｂ］）と呼ばれるベクターを作るためにＡＤＨ−２／ＧＡＰＤＨプロモ ーター（Ｂａｒｒ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）　Ｖａｃｃｉｎｅ 　５：　９Ｏ−１０１）　ニ使用された。ｐＢｓｌｏｏはＡＤｆｌ−２／ＧＡＦ Ｄｆ［プロモーターおよびＧＡＰＤＨの転写ターミネータ−の雑種からなるＢａ ｄ１発現”カセッピを含む。これらの制御因子はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ ）のｅｎｖ遺伝子の領域の両側に位置する（Ｂａｒｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１ ９８７）　Ｖａｃｃｉｎｅ　５：９Ｏ−１０１）。これらの構成物のクローニン グ部位は、メチオニン開始コドンをコードするＮｅｏ−１部位（第４図［Ｃ］　 ）および、発現される遺伝子の終止コドンの下流に位置する５ａｌ−１部位であ る。Ｂａｒｒ　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８６）　ムαニ初巴桓訂５ ：　４８６−４８９において記述されている酵母プラスミドｐＡＪ１２４はウラ シルあるいはロイシンのどちらかの欠乏培地の生育に選択可能なマーカーを含む 。大腸菌におけるｈｓＯＤ融合蛋白質の発現のためのｐｔａｃ５ｓＯＤの使用は Ｓｔｅｉｍｅｒ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　ＪＪｉｒｏｌ、　５ ８：９−１６に記載されている。

Ｃ１菌株 大腸菌内での形質転換および発現のためにＤ１２１０株が使用されたαａｎｉａ ｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｆ ｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ■ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。利用されたサツカロミセスセレビシェは以下の とうりである：　Ａ　Ｂ　１１０　ＣＭａｔａ、　１ｅｕ２−３．１１２ｕｒａ ３−５２．　匹ｐ！１＝≦１．ｈｉｓ４−５８０．　［ｃｉｒ］　）；　２１５ ０−２−３　（Ｍａｔａ　１ｅｕ２．ａｄｅｌ、　［ｃｉｒコ）；ＡＢ１１UＭ ａ 釦、に婬、旦１」、町〆ヒ５２．−一旦η９匹剋」、匠Ω−４０７，［ｃｉｒ］ ）。酵母の形質転換は以前にＨｉｎｎｅｎ、　Ｌ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７８ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、７５二１９ １X−１ ９３３に記述されたとうりに遂行された。

０１組換え体バクテリアおよび酵母培養液からのＦＧＦの精製それぞれの組換え 体ＦＧＦはヘパリンセファロースクロマトグラフィーにより精製された（Ｓｈｉ ｎｇ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：　 １２９６−１２９９）。簡潔に言えば、溶菌させたバクテリアおよび酵母からの 抽出物をそのままＴｒｉｓ−ＣＬ緩緩衝液１０輩輩ｐＨ７，０，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ）中のヘパリンセファロースカラム（ファルマシア）にのせ、０゜６ｘ塩化ナ トリウム（酸性ＦＧＦに対して）および１４０舅塩化ナトリウム（塩基性ＦＧＦ に対して）により溶出した。大腸菌由来のｂａＦＧＦについては、ヘパリンカラ ムの前にＣＭセファデックス（ファルマシア）のクロマトグラフィーを行った。

ヘパリンセファロースの溶出については、２．０Ｍ（酸性ＦＧＦ）および３．０ Ｍ＜塩基性ＦＧＦ）に上げた塩化ナトリウムグラディエンドが使用された。大腸 菌由来のｂｂＦＧ＃ｌ最終的な精製ニツイテハ、２ｈｌ［Ｔｒｉｓ−ＣＬＬ衝液 、（ｐＨ７，５，０，１ｍ１ｉ　ＥＤＴＡ、　０．３Ｍ　ＮａＣ１）中のＵｌｔ ｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ３４（ＩＪＢ）によるゲル濾過を含む。

Ｎ末端がアセチル化されそしてボロツクされていない形のｈｂＦＧＦはＶｙｄａ ｃ　Ｃ−４カラム（０，４６Ｘ２５ＣＪｌ）の逆相Ｈ′ＰＬＣカラムで分離した 。カラムは０．１％　トリフルオロ酢酸で平衡化し、ｈｂＦＧＦは３２から３４ ％のアセトニトリルを用いて溶出した。すべての精製されたＦＧＦのＮ末端の配 列の分析はＰＴＨアミノ酸のオンーラインＨＰＬＣ分析をもちいたＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ気相シクエネーターを用いて遂行された。

Ｅ、ペプチドマツピング ＨＰＬＣにより解明された２つの形のｈｂＦＧＦはＤＴＴにより還元されそして システィン残基をブロックするためにビニルビリデンで処理した。スタフィロコ ッカスアウレウスのＶ８プロテアーゼによる処理後、ペプチドは１０から４０％ のアセトニトリルを用いた５０分間のグラディエンドで０．１％ＴＦＡ中のＶｙ ｄａｃ　Ｃ−１８カラム（０、４６Ｘ　２５ｃｍ）上でＩＩＰＬＣにより分離し た。それぞれのピークを集め続くアミノ酸組成分析により同定した。

Ｆ、総分光測光 蛋白質（１−２ｎｓ＋ｏｌ）を重炭酸アンモニウム（１５０吐、　５ｈＭ、　ｐ Ｈ７，８，０，１ａｌ［ｉｎ　（Ｃａ２＋）に溶解しトリプシン（１％重量）を 加えた。サンプルを室温でインキュベートした。さらに１％重量のトリプシンを 加えて１時間後、分解をさらに１時間続けた。分解は凍結および凍結乾燥により 停止した。

Ｎ末端ペプチドのプロトン化された分子のイオンの移動は高界磁磁石、陽イオン モードのＬＳＩＭＳソースおよびポスト−アクセレーター検出機（１０Ｋｅｖ） を備えたＥｒａｔｏｓ　ＭＳ５０Ｓ二重焦点機により行われた（Ａｂｅｒｔｚ、 　Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８２）＾ｎａ１．　ＣｈｅｌＩ。

５４　：２０２９−２０３４）。サンプルをプローブチップに加え、真空乾燥し た。チオグリセロールの充填：塩酸溶液（０，１ｍ）を含んだグリセロール（１ ：　１）をソースに挿入する前に加えた。スペクトルはＭ／ｚ３０００−３００ で分析した。

Ｇ、ＦＧＦのを糸分裂促進分析 さまざまなＦＧＦの有糸分裂促進活性は密度阻止されたヒト包皮線維芽細胞（Ｈ ＦＦ）、血管内皮細胞および毛細管内皮細胞を用いて分析した。ＨＦＦ細胞は５ ％の胎児の牛の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｏｇｄｅｎ　Ｕｔａｈ）とともに、Ｄｕ ｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ１１ｅｄｉｕ■（ＤＭＥ Ｍ）中の９６ウエルのマイクロタイタープレートにぶれ−とした（ＩＸ１０４／ ウェル）。５日後、調製されたさまざまなＦＧＦの希釈物液を血清を含まないＤ ｉ［ＥＭｌｋｌに加えた。１８時間後、３■−チミヂン（１ｍＣｉ／ウェル：ア マジャム、２５Ｃｉ／ｍｍｏ１．１０３ｍＣ１／ｍｇ）を加えた。プレートを２ ４時間インキュベートした後、培養液をリン酸緩衝塩（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗った。

三塩化酢酸（５％）をウェルに加えて１５分後にメタノールを工５分間加えた。

プレートをメタノールであふれさせ、空気乾燥した。それぞれのウェルの内容物 は０．３Ｍ　Ｎａ０１１に溶解して計数のためのシンチレーションの液体を含ん だバイアルに移した。ＦＧＦサンプルのそれぞれの希釈は３つの平均である。活 性の１ユニツトは３■チミジンの取り込みの最大値の半分の値を刺激するのに必 要なＦＧＦの量である。さまざまな調整の特異的活性は蛋白質の濃度により、最 大値の半分の取り込みを生じる希釈の逆数を割り算することにより決定される。

ＦＧＦの生物学的な活性はモニターが分化する機能のモデルにおいてもまた評価 される。これらはＰＣ１２細胞（Ｇｏｓｐｏｎｄａｒｏｖｉｃｚ、　Ｄ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　（１９８６）　Ｊ、　Ｃｅ１Ｌハ■髄、　１２７：１２１−１３ ６）、　ＧＨ３細胞によるプロラクチン放出（Ｇｏｓｐｏｎｄａｒｏｗｉｃｚ。

Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５７ ：１２６６−１２２７８）および線維芽細胞および顆粒層細胞のアロマターゼ活 性（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、　（１９８４）　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ ｒ　Ｐｒｅ　ａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｄｉａ、Ｓｕ　Ｉｅｍｅｎｔｓ　ａｎ ｄ　５ｕｂｓｔｒａｔａ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｗｒ　Ｆｒｅｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃ ｅ１戟@Ｃｕｌｔｕｒ ｇ、　ｐｐ、　２７５−２９３．　Ａｌａｎ　Ｌ　Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ）神経の自然成長を含む。成長因子の脈管形成の活性はニワトリ しょう尿膜（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９ ８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、＾、　８ １：６９６３−６９６７）、ラットの脳（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、n、。

ｅｔ　ａｌ、、　（１９７４）　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、 　５２：４１３−４２７）および腎臓被膜（Ｒｉｓｕａ、　v 、　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵ、Ｓ、Ａ、 ）において試験された。

Ｉｌ、実施例 ｂ　ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１−１４０）（Ｇｉｍｅｎｅｚ−ｇａｌｌｅｇｏ、　Ｇ 、、　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　Q３０：１３８５ −１３８８と一致して数えられた）およびｂ　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１−１４６） （Ｅｓｃｈ、Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃ ａｄ、　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：６５０７−６５１１）のそれぞれ４３５ ｂｐおよび４５６ｂｐの遺伝子を合成した。それらの構成物はｂａＦＧＦおよび ｂｂＦＧＦの５゛末端の近傍の唯一のＨｉｎｄ−ＩＩＩおよびＮａｒ−１の制限 酵素部位に挿入した。このことにより合成アダプターを用いた適切な発現系にそ れぞれの遺伝子が滑らかに移動させられる。ｈａＦＧＦ前駆体（Ｊａｙｅ、　Ｍ 、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：　５４１−５ ４５）も同様にして合成しそして２９から４４塩基の長さのオリゴヌクレオチド をもちいてクローン化した。

成熟したウシおよびヒトの塩基性ＦＧＦは２アミノ酸のみが違っているので、１ ８から４３塩基の間の７つの新しい分子を合成ｈｂＦＧＦ前駆体の遺伝子のため に合成した。これらを以前に合成された適切なオリゴヌクレオチド配列に沿って ｈｂＦＧＦを与えるようにライゲーションした（Ａｂｒａｈａｍ、　Ｊ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　（１９８６）　ＥｎＯＪ、　５：　２５２３−２５２８）。

実施例１ ウシＦＧＦｉ　−の発 ｂｂＦＧ　Ｆ　（１−１４６）およびｂａＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１４０）の合成遺 伝子はｔａｃ−１プロモーターにより支配されている２つのシストロン情報を用 いて大腸菌内で発現させた（Ｈａｌｌｅｙｅｌｌ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（ １９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：２０１７−２０３ ３）（第３図［ａ］）B２つ のシストロン情報の使用はリポソーム結合部位の周囲のステム−ループ構造を形 成させる元になっていた翻訳の最初の問題に打ち勝つことができる（Ｓｃｈｏｎ ｅｒ、　Ｂ。

、　ａｔ　ａｌ、、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：５４０３−５４０７）。高発現■■ たヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈｓＯＤ）遺伝子はメツセージの最初の コドンを供給した。この遺伝子は新しいリポソーム結合部位、終止コドン、およ びそれぞれのウシＦＧＦ遺伝子の開始コドンを従える（第４図）。これらのプラ スミドにより形質転換された大腸菌株Ｄ１２１０細胞のＩＰＴＧｍ導はウシＦＧ Ｆの発現のレベルを変えることかできる。

これらの遺伝子は酵母のａ因子交配フェロモンリーダー配列との融合によっても 発現した（Ｂｒａｋｅ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、σ、Ｓ、Ａ、８１：４６S２ −４６４６）。合成アダプターはこの分泌およびプロセシングシグナルをコード する配列とそれぞれの遺伝子を融合させるのに使用された。この雑種遺伝子はＣ ｏｕｓｅｎｓＬ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）　Ｇｅｎｅ山−匹、）　６ １：２６５−２７５およびＢａｒｒ　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８V） Ｌ」狸−ｋ（１６５：１１６０−１１７１に記述されているグルコース制御可能 なアルコールデヒドａゲ六−ゼー２　（ＡＤＩｉ−２）／グリセルアルデヒドー ３〜ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）雑種プロモーターおよびａ因 子転写ターミネータ−（Ｂｒａｋｅ、　Ａ、、　ｅｔ　ａ蛋白質の５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ分析および生物試験により酵母の浮遊物中に検出された。

Ｎ末端のアミノ酸の構造およびそれぞれの組替えウシＦＧＦの特異的活性を正確 に決定するために、それぞれの蛋白質は大腸菌細胞およびサツカロミセスセレビ シェ培養液から精製された。これはヘパリンセファロースクロマトグラフィによ り行われた。その方法を用いて、ウシＦＧＦサンプルが９８％以上の精製度で得 られた。Ｎ末端のアミノ酸分析はそれぞれのこれらの精製されたサンプルで行わ れ、結果は表１に表した。

均買なＮ末端は大腸菌内で発現されたｂａＦＧＦにおいてのみ見られた。しかし 、このポリペプチドでさえも、大腸菌内で発現されたｂａＦＧＦを以前に報告し た（Ｌｉｎｅｍｅｙｅｒ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）　里彰！血 庶恒旺５：　９６０−９６５）ようにＮ末端メチオニン由来の開始コドンがイン ビボにおいて除去されないという真正のｈａＦＧＦ（１−１４０）分子は存在し なかった。メチオニン除去に関して量的にプロセッシングされているが、大腸菌 由来のｂｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１−１４６）はｂｂＦＧＦ種の不均質な混合物にさ らに分解されていた（表１）。同様に、両ウシＦＧＦは酵母から分泌されそして 精製されるときに不均質なＮ末端をもつことが明らかにされた。ｋｅｘ−２遺伝 子産物（Ｊｕｌｉｕｓ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　 ３７：　１０７５−１０８９）により介される２つの塩基性アミノ酸のプロセッ シング部位における自然な切断に加えて、ｈａＦＧＦはさらにＮ末端から分解さ れた（表１）。また、分泌されたＦＧＦは真正なりｂＦＧＦ（１〜１４６）にく わえてプロセッシング部位由来のアルギニンを含んだメジャーな種を含むことが 明らかになった（表１）。我々はこの異常なプロセッシングがアルギニンとプロ リンの間の要求された切断を十分に介すことがｋｅｘ−２プロテアーゼにとって 不可能であったことによると言える。観察されたリジンとアルギニンの間の切断 はｋｅｇ−２よりも酵母のプロテアーゼによる事が最も考えられる。

実施医又 ヒトＦＧＦ′Ｔ　の 組換え体ウシＦＧＦのＮ末端が不均質であったことから、対応するヒトＦＧＦは 細胞内の酵母発現系をもちいて前駆体として発現させた。蛋白質の分析（Ｓｔｏ ｒｙ、　ＩＩ−、ｅｔ　ａｌｌ、（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ 　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｅｍｕｎ、　１４２：　７０２−７０９jおよびｎ ａＦ　Ｇ　Ｆ　（ＥＣＧＦ）（Ｊａｙｅ、　Ｉｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９ ８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：　５４１−５４５）およ■■ｂeＧ Ｆ　ＣＡｂｒａｈａｍ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、（１９８６）　ＥｌｇＢＯＪ 、　５：２５２３−２５２８）それぞれのＤＮＡ配列から予想される開始コドン をもちいて、合成前駆体遺伝子はＡＤｌｌ−２／ＧＡＰＤＩＩ雑種プロモーター に直接融合させた（第４図［Ｃ］）。これらの配列（第３図［Ｃ］）を含むプラ スミドはロイシン選択条件下において酵母を形質転換させるのに使用した。ＦＧ Ｆ遺伝子発現の誘導は培地による生育の間の酵母培養液中のグルコースの消耗に より付随的に起こった（Ｃｏｕｓｅｎｓ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８ ７）　Ｇｅｎｅ堕ｍｓｔ、）　６１：２６５−２７５）。

細胞は集められそして上述のようにＦＧＦ発現を分析した。ＦＧＦは哺乳類のイ ンビトロのモデルにおいて細胞に結合しているから、これらの培養液の浮遊物を 輸送されたＦＧＦについて試験した。それぞれの場合において、破壊した酵母細 胞の中においてのみＦＧＦポリペプチドを見いだした。哺乳類の系のように、培 養液はほんのわずかなＦＧＦを含んでいた（合計約５Ｘ以下）。

実施例１ 酵四本」鈷ｙ（蛮勇査れたヒトＦＧＦの　ダ可溶性のｈａＦＧＦおよびｈｂＦＧ Ｆポリペプチドはあらかじめヘパリンセファロースをもちいて精製された。ｈａ ＦＧＦの発現における内因性の酵母液胞プロテアーゼの効果は匹剋」野生型株２ １５０をもちいて研究された。２１５０からのそれに対するＡＢ１１６において 発現されたｈａＦＧＦはゲル電気泳動の移動度において明らかな相違が見られた 。したがって、それぞれの精製されたｈＦＧＦについてＮ末端の配列分析および 結分光測光を行った。ｈａＦＧＦ前駆体はＬＳＯＤのようにＮ末端が量的にブロ ー７りされていた（ｌｌａｌｌｅｗｅｌｌ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７ ）　彪俳：加曵技訂５：　３６３−３６６）。このポリペプチドをトリプシン分 解した断片の総スペクトル分析はｔｒｅｅにおいてアセチル化されたＮ末端のペ プチドＡｃ−ＡＥＧＥ　ＩＴＴＦＲＡＬＴＥＫにたい追いしたプロトン化された 分子を表した。したがって、天然のｈｓＯＤＳ酵母由来の組換え体ｈｓＯＤ（Ｈ ａｌｌｅｗｅｌｌ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）　Ｌ式奥向庶桓旺５ ：３６３−３６６）、天然のｂａＦＧＦ（ＥＦＧＦ）（Ｂｕｒｇｅｓｓ、　Ｗ、 、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄA　Ｓ ｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８３　：　７２１６−７２２０）およびｂａＦＧＦ　（プロ スタトロピン）（Ｃｒａｂｂ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、（１X ８６）　」倶急山迎歴Ｕ２５・５９８８−４９９３）をもちいたように、ブロッ クする基はアセチル部分であることが明らかになった。アミノ酸分析とともにこ のデータは内因性のメチオニルアミノペプチダーセがアセチル化に先立って開始 コドン由来のメチオニンを十分に切断できる事もまた示している。

酵母株２１５０から精製されたｈａＦＧＦはブロックされた前駆体（５４％）と ともに、Ｐｈｅ８（２６％）、　Ｔｈｒ１２（１１％）、　Ｐｈｅ１５（７％） の後の残基か切断された３つのメジャーな種の混合物であることか明らかになっ た。この観察からＦＧＦのＮ末端が、ｂｂＦＧＦにおいて報告されたようなアス バチルプロテアーゼによる分解に感受性を示す事が強１８３９−１８４２）。

発現されたヒト塩基性ＦＧＦの前駆体の精製および分析からＮ末端のメチオニン が量的に除去されていることか明らかになった。しかしながら驚いたことに、そ れらのＮ末端がＦＧＦ間で等しいにもかかわらず、ペプチドマツピング、量的な アミノ酸分析および総スペクトルが示したことは、ｈｂＦＧＦは単に部分的にア セチレーションにより修飾されているということであった。したがって、ヘパリ ンセファロースの逆相ＨＰＬＣで精製されたｈｂＦＧＦはほぼ等モル比で明らか に２つの形のポリペプチドで単離されてきた。ｖ８プロテアーゼ由来のペプチド の単離および同定はＮ末端のペプチドが違っていることを明らかにした。ｈｂＦ ＧＦのトリプシン分解物を総スペクトルにおいて分析すると、アセチル化された Ｎ末端ペプチドＡｃ−ＡＡＧＳ　ＩＴＴＬＰＡＬＰＥＤＧＧＳＧＡＦＰＰＧＨＦ Ｋに対応したプロトン化されたイオンがｖａ／ｅ　２５３７において観察された 。さらに、ブロックされていない種がｔｒｅｅ　２４９５において観察された。

ＨＰＬＣのデータと一致して、相対的なピークの高さが示すことは２つの種がお およそ等モル比で存在することである。幾つかの方法によるこの状況はヒトの良 性の前立腺増殖性の組織からのｈｂＦＧＦがブロックされていないＮ末端を含ん でいたことにおいて哺乳類組織からの塩基性ＦＧＦの分離の結果をまねたもので ある（Ｓｔｏｒｙ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）旦実施泗Ａ 。さまざまな調製物の特異的活性を表１に表す。内皮細胞の分化を促進させる組 換え体蛋白質の許容量は天然のを糸分裂と区別できなかった。組換え体ｈｂＦＧ Ｆもまた試験し、脈管形成、神経の自然成長、インビボにおける神経の生存およ び頚粒層の細胞および繊維が細胞の分化した機能の制御において活性があること が明らかになった。

実施皿旦 修飾された　”　い”　ｒｈｂＦＧＦの　造ヒト塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（９−１５ ４）および（１０−１５４）はそれぞれ最初の８および９アミノ酸を除去するた めにプラスミドｐＡＢ２４＾／Ｇ−ｈｂＦＧＦのＮ末端を修飾することにより調 製されうる。そのプラスミドをＮｃｏ−１からＭａｒ−１部位を切り出すために 処理し、それぞれＮｅｏ−１およびＭａｒ−１の突出部分をもった以下の合成オ リゴヌクレオチドを挿入した： ｈ　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（９−１５４） １１ｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ 　Ｓｅｒ　ＧｌｙＣＡＴＧＣＣＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＣ ＡＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣｈ 　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１０−１５４）１１ｅｔ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡ ＧＧＡＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧ ＴＣＧＣＣＧにれらのプラスミドは酵母において部分的にアセチル化されている ｈｂＦＧＦとともに、期待されたＦＧＦを発現することができる、そしてそれら の遺伝子は以前に記述したとうり（Ｂａｒｒ、　ｅｔ　ａｌｌ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｂｅｙａ−、２６３：１６４７１−１６４７８．１９８８）、ＡＤ１１２ ／ＧＡＰＤｆｌプロモーターを使用して発現されうる。

組換え体　菌株あるいは　Ｎ−末端アミノ酸配列　特異的活性１　参　の　びお およその　・　ユニット／Ｉｌ×１ｏツＡ　ｂｂＦＧＦ　大腸菌Ｄ１２１０　Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（５４％）８．９＾１ａ−Ｌｅｕ−（４６％） Ｂ　ｂｂＦＧＦ　サツカロミセス　＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（７４％ ）　８．０セレビシエ八ＢＩＩＯＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（２６％）ＣｈｂＦ ＧＦ　サツカロミセス　Ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−（５０％）９．３セレ ビシエＡＢ１１６　Ａｌａ−Ａｌａ−（５０％）Ｄ　ｂａＦＧＦ　大腸菌ＤＩ２ １０　電ｅｔ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−（１００％）０．５２Ｅ　ｂａＦＧＦ 　サツカロミセス　Ｐｈｅ−＾５ａ−Ｌｅｕ−（９０％）工、８セレビシ！ＡＢ ＩＩＯＡｓｎ−Ｌｅｕ−（５％）Ｌｅｕ−（５％） Ｆ（ｉ）　ｈａＦＧＦ　サツカロミセス　Ａｃｅｔｙｌ−＾１ａ−Ｇｌｕ−（１ ００％）　０−６１セレビシエＡＢ１１６ （ｉｉ）　ｈａＦＧＦサツカロミセス　Ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−（５４ ％）　０．３１セレビシエ　Ａｌａ−Ｇｌｕ−（２％）Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ −（２６％） Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（１１％） Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−（７％） 太施例旦 ”　い”　ｒｈｂＦＧＦの　および これらのｒｈｂＦＧＦは実施例５において教示されたように酵母の中で発現され たそして細胞の破壊および遠心をスタートにして精製された。第５図に見られる とうり、透明な酵母抽出物のゲル上においてｒｈｂＦＧＦが見え、しかし対照の プラスミドの細胞抽出物からは何もなかった。これらの蛋白質は第５図のほぼ均 質な材料を生じるヘパリン−５ＰＷ　ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製さ れた。マイナーなバンドを検出するために多量のｒｈｂＦＧＦ　（約１５μｇ） を電気泳動すると、２つの大変マイナーな高分子量の不純物が見られた、がしか し１９．５　ドルトンのｒｈｂＦＧＦに等しい物は見られなかった。これらの短 いｒｈｂＦＧＦは通常ヘパリンに結合し、これらの短いｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆは活性 があることを示している。この発現レベルは１０−１５４の形より９−１５４の 形のほうが高かった。どちらの形も、１−１５４ｒｈｂＦＧＦにとってはＪＳＣ ３０２が好ましい酵母の宿主であった。ＪＳＣ３０２におけるｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆ 　９−１５４の発現はｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆ　１−１５４（約３５ｍｇ／リットル） と同様の発現の範囲の酵母培養液のリットルあたり２４ｍｇであると見積もられ る。

精製されたＪＳＣ３０２からのｒｈｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　９−１５４およびｒｈｂＦ 　Ｇ　Ｆ　１０−１５４はＣ−４逆相クロマトグラフイーにより解析された。第 ６図に見られるとうり、両方の蛋白質は単一のメジャーなピークとして溶出され 、ｒｈｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　１−１５４のようにアセトニトリルとほぼ同様のパーセ ンテージであった。はとんど確実にｒｈｂＦＧＦがジスルフィド結合している形 の２つの小さい最初のピークもまた明白であった。

しかし、最も明らかなことはメインのｒｈｂＦＧＦのピークが鋭く、１−１５４ 　ｒｈｂＦＧＦの完全長の２倍でなかったことである。９−１５４形の最初の２ ２アミノ酸のアミン末端の配列は期待さｔＬ７’：”　ＰＡＬＰＥＤＧＧＳＧＡ ＦＰＰＧＨＦＫＤＡＰＫＲ”　配列であった。マイナーな配列は検出されなかっ た。したがって、９−１５４形は均質なＮ末端をもつことが明らかとなり、鋭い ＨＰＬＣのピークは顕著な小さな不均質さがないことを示唆している。ｒｈｂＦ 　Ｇ　Ｆ　９−１５４はアセチル化されていると期待されていないＮ末端のプロ リン残基、１０−１５４形はアラニンで始まるが、アセチル化のための好ましい 残基をもつ。

叉施倒ユ １９．５キロドルトンのｒｈｂＦＧＦの０定ｒｈｂＦＧＦの１９．５キロドルト ン形はメジャーなｒｈｂＦＧＦ１７．５キロドルトン形よりも低いそくどでいど うするマイナーな種である。ゲルで精製された１７．５キロドルトンおよび１９ ．５キロドルトンのｒｈｂＦＧＦのサンプルを、リン酸化が１９．５キロドルト ンのｒｈｂＦＧＦの移動度を低下させるかどうかを直接試験するために子牛アル カリホスファターゼとインキュベートした。第７図に見られるように、この処理 は１７．５キロドルトンに対して効果を示さず、しかし１９．５キロドルトンか ら１７．５キロドルトンへの部分的な変換をした。第７図の右側において、アル カリホスファターゼ処理後の１９．５キロドルトンのサンプルの電気泳動が示す ことは、１９．５キロドルトンの大部分が１７．５キロドルトンに変換されてい ることである。（実際にはリン酸化タンパク質はアルカリホスファターゼにとっ てとぼしい基質であるので１９．５キロドルトンｒｈｂＦＧＦのすべてが１７． ５コロドルトンに変換されていないということは驚くべきことではない。）この 実験が示すことは、リン酸化は１９６５キロドルトンｒｈｂＦＧＦの電気泳動の 異常な移動度の原因であるということである。

太施凹旦 １アセチルイか゛アセチルイされたｒｈｂＦＧＦの　された大変に滑らかなグラ ヂエントのＶｙｄａｃＣ−４カラムによるＴＦＡ／アセトニトリルの逆相ＨＰＬ Ｃは２つの形のｒｈｂＦＧＦを分離することができるが、室温における分離は好 ましくなく、ベースラインに接近できない（第８図Ａ）。第８図ＡおよびＢに見 られるように、ＴＦＡ／アセトニトリル緩衝液およびＶｙｄａｃｃ−４カラムの ５０’Ｃにおける単純な使用は２つのｒｈｂＦＧＦのベースラインの分離に近付 くことができる。不都合にも、ＶｙｄａｃＣ−４カラムは一日以上は上昇させた 温度に耐えられない。

ポリマーをベースにした逆相カラム、ポリマーＰＬＲＰ−８，０，４６Ｘ２５ａ ｍ、３００オンゲスドロームロ径をこの系に使用した。第８図のＤに見られるよ うに、５０°ＣにおけるＰ　Ｌ　Ｒ，Ｐ　−Ｓカラムによる２つのｒｈｂＦＧＦ の分離はＶｙｄａｃＣ−４に比べて大変改良された。そしてポリマーを基質とし たカラムはより高温に耐えられるようになった。５０°Ｃにおけるポリマーの逆 相カラムを使用した非アセチル化およびアセチル化されたｒｈｂＦＧＦの解析は 微小で不均質な短い形のｒｈｂＦＧＦの分離に応用されるはずである。

本発明は現在発明者に知られたベストモードを構成するその好適具体例に関して 記述されたものであり、別添の請求の範囲に示したように、当業者に自明のさま ざまの変化および修飾か本発明の範囲を外れる事がないことが理解されよう。

Ｌ１肛１ユ ムユ扛しユ ＭｅｔＡｌａＧ１ｕＧｌｙＧｌｕ工１ｅＴｈｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＬａｕ ＴｈｒＧｌｕＬｙｓＰｈ＠２０　コ０ ＡｓｎＬａｕＰｒｏＰｒｏＧ　ｌ　ｙＡｓｎＴｙｒＬｙｓ　Ｌｙｓ　ＰｒｏＬｙ ｓＬａｕＬａｕＴｙｒＣｙｓコ５　４５ Ｓ　ｅｒＡｓｎＧｌｙＧｌｙＨｌｓ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＡｒｑ　Ｉ　ｌ　ａＬａｕ ＰｒｏＡｓｐＧ　ＬｙＴｈｒＶａ１ＡｓｐＧｌｙＴｈｒＡｒｇ入ｓｐＡｒｇｓａ ｒＡｓｐＧｌｎＨｉｓ工１＠Ｇ１ｎｕｓｕＧ１ｎＬａｕＣｙｓＡ１ａＧ１ｕＳｅ ｒ工１＠１Ｇ１ｙＧ１ｕＶａｌＴｙｒ工１ａｌ、ｙｓＳｅｒＴｈｒＧｌｕＴｈｒ Ｇｌ　ｙＧｌｎＰｈａ　ＬａｕＡ　１　ａＭｅ　ｔＡｓｐＴｈ　ｒＡｓｐＧ　ｌ ’ｆＬａｕ　ＬｅｕＴｙｒＧ　ＩＹＳ　＠　ｒＧ　ｌ　ｎＴｈｒＰｒＯＡＳｎＧ 　１ｕＧ　１ｕＣｙＳ　ＬａｕＰｈ　＠Ｌ＠ｕＧ　ｌ　ｕＡｒＣＪＬ＠　ｕＧｌ 　ｕＧ　１ｕＡｓｎＨ１ｓＴｙｒＡｓｓｎＴｈｒＴｙｒ工１ｅＳａｒＬｙｓＬｙ ｓＨ１ｓＡ１ａＧ１ｕＬｙｓＨ１ｓ１２５　１コ５ ＴｒｐＰｈ＠ＶａＩＧｌｙＬｅｕＬｙｓＬｙｓＡｓｎＧ１ｙＡｒｇＳｅｒＬｙｓ ＬａｕＧ１ｙＰｒ。

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Ｖａ１５＠ｒＡｓｐ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　３（ｂ） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５ 旦匹匹匝 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、７ 凶匹二Ｊ −ｍ−−＾−”””　′ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４８２１国際調査報告 麺−ｋｍｎｍ−１−一一一軸署−−−−−−ｔ−−−−−−−−に＝＝二コｚ＝ ：：’　＝＝に′：−−−〇−１ｗ　ｌ＆’＋ル。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的にバクテリアおよび他の哺乳類の蛋白質を含まない実質的に純粋なア ミノ末端がアセチル化されたヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（１−１５４） からなる組成物。 ２．さらに実質的に純粋なヒト塩基性ＦＧＦ（１−１５４）からなる請求の範囲 第１項に記載の組成物。 ３．各ＦＧＦは実質的に等量で存在する請求の範囲第２項に記載の組成物。 ４特異的活性は少なくとも約９３ｘ１０５ユニット／ｍｇである請求の範囲第３ 項に記載の組成物。 ５．実質的に純粋なアミノ末端がアセチル化されたヒト酸性線維芽細胞成長因子 （１−１５４）からなる請求の範囲第１項に記載の組成物。 ６．さらにヒト酸性ＦＧＦ（１−１５４）、（９−１５４）、（１３−１５４） および（１６−１５４）からなる請求の範囲第５項に記載の組成物。 ７．アセチル化されたヒト酸性ＦＧＦ（１−１５４）は約５０％の各ＦＧＦから なる請求の範囲第６項に記載の組成物。 ８．特異的活性は少なくとも約０．６１×１０５ユニット／ｍｇである請求の範 囲第７項に記載の組成物。 ９．後翻訳過程において修飾された真正な形のヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ ）の製造法であって、以下の段階からなる方法：ａ）酵母を切断可能なアミノ末 端のメチオニン、酵母内において機能するプロモーターの転写制御下に位置する 遺伝子を含んだ１５５のアミノ酸からなるＦＧＦポリペプチドをコードする遺伝 子からなる発現プラスミドによって形質転換しｂ）ＦＧＦ遺伝子の発現に適した 条件における形質転換酵母を培養し、但しＦＧＦポリペプチドは細胞内において 生産され；およびｃ）酵母からのＦＧＦポリペプチドの単離。 １０．少なくとも約３０％のＦＧＦポリペプチドのアミノ末端がアセチル化され ている請求の範囲第９項に記載の組成物。 １１．ＦＧＦはヒト塩基性ＦＧＦ（１−１５４）である請求の範囲第９項に記載 の方法。 １２．ＦＧＦはヒト酸性ＦＧＦである請求の範囲第９項に記載の方法。 １３．ＦＧＦポリペプチドは少なくとも約５０％のアミノ末端がアセチル化され ている請求の範囲第１１項あるいは第１２項に記載の方法。 １４．ＦＧＦポリペプチドは実質的にすべてのアミノ末端がアセチル化されてい る請求の範囲第１１項あるいは第１２項に記載の方法。 １５．約２ないし５の修飾されたＦＧＦポリペプチドが生産される請求の範囲第 ９項に記載の方法。 １６．さらに修飾されたＦＧＦポリペプチドを実質的に均質に精製することから なる請求の範囲第９項に記載の方法。 １７．ＦＧＦポリペプチドはヘパリンアフィニティカラムにより精製される請求 の範囲第１４項に記載の方法。 １８．ＦＧＦポリペプチドはＨＰＬＣカラムにより精製される請求の範囲第１４ 項に記載の方法。 １９．プロセッシングされた塩基性あるいは酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ） （１−１５４）を生産するために酵母細胞内において発現させることを指示する ことができるＤＮＡ組換え体であって、開始コドンの上流の酵母転写プロモータ ーＤＮＡ領域を上記ＦＧＦをコードしている遺伝子に融合させたものからなり、 該遺伝子は下流に転写ターミネーターを従えており、上記組換え体は酵母から上 記ポリペプチドを分泌することを指示できないＤＮＡ構成物。 ２０．プロモーターはグルコースにより制御可能である請求の範囲第１９項に記 載のＤＮＡ組換え体。 ２１．プロモーターはアルコールデヒドロゲナーゼ−２ノグリセルアルデヒド− ３−ホスフェートデヒドロゲナーゼである請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡ組 換え体２２．ＤＮＡ組換え体ｐＡＢ２４Ａ／Ｇ−ｈＦＧＦにより形質転換された 酵母宿主細胞。 ２３．ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（９−１５４）からなる組成物 。 ２４．実質的にバクテリアおよび他の哺乳類の蛋白質を含まない請求の範囲第２ ３項に記載の組成物。 ２５．アミノ末端がアセチル化されたヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ） （１０−１５４）からなる組成物。 ２６．実質的にバクテリアおよび他の哺乳類の蛋白質を含まない請求の範囲第２ ５項に記載の組成物。 ２７．ＦＧＦがヒト塩基性ＦＧＦ（９−１５４）である請求の範囲第９項に記載 の方法。 ２８．ＦＧＦがヒト塩基性ＦＧＦ（１０−１５４）である請求の範囲第９項に記 載の方法２９．アミノ末端がアセチル化されたＦＧＦポリペプチドをアセチル化 されていないＦＧＦポリペプチドから分離する請求の範囲第１６項に記載の方法 。 ３０．さらにＦＧＦポリペプチドをリン酸化酵素により処理することからなる請 求の範囲第９項に記載の方法。 ３１．上記酵母はＪＳＣ３０２株である請求の範囲第９項に記載の方法。 ３２．上記遺伝子はヒト塩基性ＦＧＦ（９−１５４）をコードする請求の範囲第 １９項に記載のＤＮＡ組換え体。 ３３．上記遺伝子はヒト塩基性ＦＧＦ（１０−１５４）をコードする請求の範囲 第１９項に記載のＤＮＡ組換え体。 ３４．請求の範囲第１９項のＤＮＡ組換え体により形質転換された酵母宿主細胞 。 ３５．上記遺伝子はヒト塩基性ＦＧＦ（９−１５４）をコードする請求の範囲第 ３４項の細胞。 ３６．上記遺伝子はヒト塩基性ＦＧＦ（１０−１５４）をコードする請求の範囲 第３４項の細胞。 ３７．酵母ＪＳＣ３０２株は上記ＤＮＡ組換え体により形質転換された請求の範 囲第３３項、第３４項あるいは第３５項の細胞。