JPH03197865A - フォスファチジルコリンの測定法 - Google Patents
フォスファチジルコリンの測定法Info
- Publication number
- JPH03197865A JPH03197865A JP33627589A JP33627589A JPH03197865A JP H03197865 A JPH03197865 A JP H03197865A JP 33627589 A JP33627589 A JP 33627589A JP 33627589 A JP33627589 A JP 33627589A JP H03197865 A JPH03197865 A JP H03197865A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- prepd
- hybridoma
- phosphatidylcholine
- phospholipids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、フオスファチジルコリン（以下ＰＣと略す）
に特異的なモノクローナル抗体を利用したＰＣの測定方
法に関するものである。
に特異的なモノクローナル抗体を利用したＰＣの測定方
法に関するものである。
（従来の技術）
ＰＣは細胞膜を構成する主成分のリン脂質であり、生体
内で非常に重要な役割を占めている。もっとも重要なも
のは、細胞膜の骨格形成ならびに膜透過に関与する働き
であるが、そのほかにもレシチン中コレステロールアシ
ルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の基質であるＨＤＬ
の主要脂質成分、血液凝固第Ｘ因子の活性化因子として
の役割を持つ。さらに胆汁、腸液、血漿など体液中の界
面活性化物質としての重要な働きを有する。
内で非常に重要な役割を占めている。もっとも重要なも
のは、細胞膜の骨格形成ならびに膜透過に関与する働き
であるが、そのほかにもレシチン中コレステロールアシ
ルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の基質であるＨＤＬ
の主要脂質成分、血液凝固第Ｘ因子の活性化因子として
の役割を持つ。さらに胆汁、腸液、血漿など体液中の界
面活性化物質としての重要な働きを有する。
臨床的には、激痛肝炎、非代償性肝硬変などの肝実質障
害により、血漿中のリン脂質濃度が上昇し、肝内胆汁う
つ滞や閉塞性黄痘では血漿中リン脂質濃度が低下するこ
とが知られている。血漿中のリン脂質のうち、約７０〜
８０％がＰＣであるため、血漿中のＰＣを測定すること
により、これらの疾患の早期診断・経過観察が可能にな
る。
害により、血漿中のリン脂質濃度が上昇し、肝内胆汁う
つ滞や閉塞性黄痘では血漿中リン脂質濃度が低下するこ
とが知られている。血漿中のリン脂質のうち、約７０〜
８０％がＰＣであるため、血漿中のＰＣを測定すること
により、これらの疾患の早期診断・経過観察が可能にな
る。
従来リン脂質の定量法としては、湿性灰化法と酵素比色
法が知られている。湿性灰化法は抽出したリン脂質を湿
性灰化し、無機リン酸を定量して換算によりリン脂質量
を測定する方法である。定量性には優れているが、操作
が煩雑で時間を要するため、現在ではあまり行なわれて
いない。この方法で測定できるのは総リン脂質量であり
、ＰＣのみを定量することはできない。
法が知られている。湿性灰化法は抽出したリン脂質を湿
性灰化し、無機リン酸を定量して換算によりリン脂質量
を測定する方法である。定量性には優れているが、操作
が煩雑で時間を要するため、現在ではあまり行なわれて
いない。この方法で測定できるのは総リン脂質量であり
、ＰＣのみを定量することはできない。
酵素比色法は現在のリン脂質測定の主流であり、フォス
フオリパーゼＤによりコリン含有リン脂質を分解し、生
成したコリンを発色反応により定量する方法である。こ
の方法は、ワンステップの操作による約５分間の反応で
測定が可能である。しかし、コリン含有リン脂質を測定
しているため、生体、特に血漿中に多量に含まれるスフ
ィンゴミエリンも測定値に含まれ、ＰＣのみを定量する
ことができない。
フオリパーゼＤによりコリン含有リン脂質を分解し、生
成したコリンを発色反応により定量する方法である。こ
の方法は、ワンステップの操作による約５分間の反応で
測定が可能である。しかし、コリン含有リン脂質を測定
しているため、生体、特に血漿中に多量に含まれるスフ
ィンゴミエリンも測定値に含まれ、ＰＣのみを定量する
ことができない。
従来リン脂質中のＰＣの分離測定には、カラムクロマト
グラフィー、薄層クロマトグラフィーガスクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィーなどの分画・定量
法が使用されてきたが、いずれも操作が煩雑で時間がか
かる欠点があった。
グラフィー、薄層クロマトグラフィーガスクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィーなどの分画・定量
法が使用されてきたが、いずれも操作が煩雑で時間がか
かる欠点があった。
（発明が解決しようとする課題）
本発明の目的は、ＰＣに特異的なモノクローナル抗体を
用いることによって従来の方法よりも簡便な操作で安全
かつ高感度にしかも短時間のうちにＰＣを免疫学的に測
定する方法を提供することにある。
用いることによって従来の方法よりも簡便な操作で安全
かつ高感度にしかも短時間のうちにＰＣを免疫学的に測
定する方法を提供することにある。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果本発明に
到達した。すなわち本発明は、ＰＣを特異的に認識する
モノクローナル抗体を用いるＰＣの免疫学的測定法であ
り、以下その詳細について説明する。
到達した。すなわち本発明は、ＰＣを特異的に認識する
モノクローナル抗体を用いるＰＣの免疫学的測定法であ
り、以下その詳細について説明する。
免疫学的測定方法としては、例えばサンドイッチ法ある
いは競合法があげられる。
いは競合法があげられる。
サンドイッチ法は、例えば
（１）ＰＣに特異的な、固定化されたモノクローナル抗
体に （２）ＰＣを含む試料及びＰＣに特異的な他種の標識抗
体を加えてＰＣに結合させ （３）上記（２）項で行われた反応によって、固定化さ
れたまたは遊離の標識抗体の標識を検出する 工程を包含する。
体に （２）ＰＣを含む試料及びＰＣに特異的な他種の標識抗
体を加えてＰＣに結合させ （３）上記（２）項で行われた反応によって、固定化さ
れたまたは遊離の標識抗体の標識を検出する 工程を包含する。
また競合法は、例えば
（１）ＰＣに特異的な、固定化されたモノクローナル抗
体に （２）ＰＣを含む試料および標識したＰＣを加えて、Ｐ
Ｃを固定化された抗体に結合させ（３）上記（２）項で
得られた反応によって固定化された又は遊離の標識化Ｐ
Ｃの標識を検出する工程を包含する。
体に （２）ＰＣを含む試料および標識したＰＣを加えて、Ｐ
Ｃを固定化された抗体に結合させ（３）上記（２）項で
得られた反応によって固定化された又は遊離の標識化Ｐ
Ｃの標識を検出する工程を包含する。
本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体の
調製は、それ自体公知である方法（Ｇ、Ｋ。
調製は、それ自体公知である方法（Ｇ、Ｋ。
ｈｌｅｒ＆Ｃ，旧ｌ５ｔｅｌｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２
５６ 、４９５． （１９７５） ）に準じて製造する
ことができる。以下、本発明のモノクローナル抗体の製
造方法について詳細に説明する。
５６ 、４９５． （１９７５） ）に準じて製造する
ことができる。以下、本発明のモノクローナル抗体の製
造方法について詳細に説明する。
（Ａ）ＰＣの調製
ＰＣは、卵黄等から調製することが可能であるが、他の
試料から調製してもよい。ＰＣの調製法自体は公知であ
り、何ら限定はない。
試料から調製してもよい。ＰＣの調製法自体は公知であ
り、何ら限定はない。
（Ｂ）ハイブリドーマの確立
ハイブリドーマは、適当な動物を前記抗原で免疫した後
、肺細胞を摘出し公知の方法に従って、調製することが
できる。
、肺細胞を摘出し公知の方法に従って、調製することが
できる。
本発明においては、例えば卵黄から調製したＰＣをニト
ロセルロース紙上に固定化し、ＰＢＳ中にホモジネート
したものを抗原としてマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の肺臓に
直接免疫（実験医学第６巻、９１５〜９１９頁、羊上社
、１９８８年）し、２週間後に前記ＰＣを酸処理したサ
ルモネラミネソタ菌にコートしたものを足部静脈より追
加免疫し、最終免疫３日後にこの肺臓をマウスより抽出
し、抗体産生細胞を調製できる。調製した牌細胞を従来
の細胞融合技術を用いて、ミエローマ細胞株Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ６５３とＤＭＥＭ培地中にて、５０％ポリエチ
レングリコール存在下で細胞融合を行いハイブリドーマ
を調製できる。
ロセルロース紙上に固定化し、ＰＢＳ中にホモジネート
したものを抗原としてマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の肺臓に
直接免疫（実験医学第６巻、９１５〜９１９頁、羊上社
、１９８８年）し、２週間後に前記ＰＣを酸処理したサ
ルモネラミネソタ菌にコートしたものを足部静脈より追
加免疫し、最終免疫３日後にこの肺臓をマウスより抽出
し、抗体産生細胞を調製できる。調製した牌細胞を従来
の細胞融合技術を用いて、ミエローマ細胞株Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ６５３とＤＭＥＭ培地中にて、５０％ポリエチ
レングリコール存在下で細胞融合を行いハイブリドーマ
を調製できる。
（Ｃ）ハイブリドーマの選択
目的とするハイブリドーマは、例えば固相酵素免疫ハｊ
定法（Ｍａｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 ７０．４１９
−４３９． （１９８０））を用いてハイブリドーマ培
養上清の分析を行い、ＰＣに特異的に反応する抗体を産
生じているハイブリドーマを選択し、限界希釈法を２回
行なうことにより確立できる。
定法（Ｍａｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 ７０．４１９
−４３９． （１９８０））を用いてハイブリドーマ培
養上清の分析を行い、ＰＣに特異的に反応する抗体を産
生じているハイブリドーマを選択し、限界希釈法を２回
行なうことにより確立できる。
（Ｄ）抗体の回収および精製
常法にしたがって、生育培地中で培養するか、あるいは
、ハイブリドーマをこの細胞が増殖可能な実験動物（マ
ウス、ラット等）の腹腔内に投与し生体内で培養するこ
とにより抗体の産生を行なうことができる。抗体は生育
培地でハイブリドーマの増殖を行なった場合には培養上
清より、実験動物の腹腔内で増殖を行なった場合にはそ
の動物の腹水より回収できる。培養上清あるいは腹水は
硫酸アンモニウム沈澱分画法にしたがって粗精製したの
ち、イオン交換クロマトグラフィーにより精製できる。
、ハイブリドーマをこの細胞が増殖可能な実験動物（マ
ウス、ラット等）の腹腔内に投与し生体内で培養するこ
とにより抗体の産生を行なうことができる。抗体は生育
培地でハイブリドーマの増殖を行なった場合には培養上
清より、実験動物の腹腔内で増殖を行なった場合にはそ
の動物の腹水より回収できる。培養上清あるいは腹水は
硫酸アンモニウム沈澱分画法にしたがって粗精製したの
ち、イオン交換クロマトグラフィーにより精製できる。
メルカプトエタノール還元下での１２％５ＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動で１本の重鎖と１本の軽鎖の２本
のバンドになったことで抗体の純度が確認できる。
クリルアミド電気泳動で１本の重鎖と１本の軽鎖の２本
のバンドになったことで抗体の純度が確認できる。
以上の方法により、ＰＣを特異的に認識する複数種のモ
ノクローナル抗体を得た。それぞれの抗体の結合定数は
、１０７〜１ｏ１１Ｍ−１の範囲内であった。これらの
モノクローナル抗体を使って、ＰＣを定量的に１１）Ｊ
定できるサンドイッチ法又は競合法による免疫学的＋１
１１定法が可能となった。
ノクローナル抗体を得た。それぞれの抗体の結合定数は
、１０７〜１ｏ１１Ｍ−１の範囲内であった。これらの
モノクローナル抗体を使って、ＰＣを定量的に１１）Ｊ
定できるサンドイッチ法又は競合法による免疫学的＋１
１１定法が可能となった。
また、ＰＣを特異的に認識し、フォスファチジルセリン
（ＰＳ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）
、フォスファチジル酸（ＰＡ）、カルシオリピン（ＣＬ
）、フォスファチジルイノシトール（ＰＩ）または、フ
ォスファチジルグリセロール（ＰＣ）とは交叉反応性を
示さないモノクローナル抗体を得るには、ＰＣを特異的
に認識するが、ＰＳ、ＰＥ、ＰＡ、ＣＬ、ＰＩ、ＰＧと
は交差反応しないものを選択すればよい。
（ＰＳ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）
、フォスファチジル酸（ＰＡ）、カルシオリピン（ＣＬ
）、フォスファチジルイノシトール（ＰＩ）または、フ
ォスファチジルグリセロール（ＰＣ）とは交叉反応性を
示さないモノクローナル抗体を得るには、ＰＣを特異的
に認識するが、ＰＳ、ＰＥ、ＰＡ、ＣＬ、ＰＩ、ＰＧと
は交差反応しないものを選択すればよい。
本発明方法において用いられる抗体又はＰＣを固相に固
定化する方法は、公知の方法を採用でき、固相としては
例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル
、ポリカーボネート、セファロース粒子、ラテックス、
アガロース、セルロース、ポリメタアクリレート等が使
用される。
定化する方法は、公知の方法を採用でき、固相としては
例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル
、ポリカーボネート、セファロース粒子、ラテックス、
アガロース、セルロース、ポリメタアクリレート等が使
用される。
また抗体又はＰＣの標識化の方法とその検出方法もなん
ら限定されるものでなく、公知の方法により標識化およ
び検出を行なうことができる。標識として酵素を用いる
場合、標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ等の
酵素が使われる。放射性物質としては、３Ｈ，＋２５１
または１３１１等が、蛍光物質を使用する方法としては
、例えば、フルオレスカミン、フルオレラセンチオシア
ネート、テトラローダミンイソチオシアネート等が常法
によりモノクローナル抗体に結合される。しかしながら
、標識物質は上記物質になんら限定されるべきものでは
ない。
ら限定されるものでなく、公知の方法により標識化およ
び検出を行なうことができる。標識として酵素を用いる
場合、標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ等の
酵素が使われる。放射性物質としては、３Ｈ，＋２５１
または１３１１等が、蛍光物質を使用する方法としては
、例えば、フルオレスカミン、フルオレラセンチオシア
ネート、テトラローダミンイソチオシアネート等が常法
によりモノクローナル抗体に結合される。しかしながら
、標識物質は上記物質になんら限定されるべきものでは
ない。
測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
（発明の効果）
以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のＰＣを他のリン脂質と識別して単独で測定する
ことができ、 （２）従来法に比べて簡便な操作で短時間に感度よく多
数の検体のｉｌＪ定が可能である。
試料中のＰＣを他のリン脂質と識別して単独で測定する
ことができ、 （２）従来法に比べて簡便な操作で短時間に感度よく多
数の検体のｉｌＪ定が可能である。
（実施例）
以下に本発明の実施例を記載し、本発明の効果を詳細に
説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるもの
ではない。
説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるもの
ではない。
実施例１
卵黄由来のＰＣ（フナコシ薬品（株）製、メーカーコー
ドＡ−３１）を初期免疫の抗原としてマウス（ＢＡＬＢ
／Ｃ）を免疫し、さらにＰＣを用いて追加免疫した。
ドＡ−３１）を初期免疫の抗原としてマウス（ＢＡＬＢ
／Ｃ）を免疫し、さらにＰＣを用いて追加免疫した。
まずＰＣをニトロセルロース紙上に固定化し、ＰＢＳ中
にてホモジネートしたものを抗原としてマウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）の肺臓に直接免疫し、２週間後に前記ＰＣを酸
処理したサルモネラミネソタ菌にコートしたものを元部
静脈より追加免疫した。最終免疫３日後にこの肺臓をマ
ウスより摘出し、抗体産生細胞を調製した。
にてホモジネートしたものを抗原としてマウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）の肺臓に直接免疫し、２週間後に前記ＰＣを酸
処理したサルモネラミネソタ菌にコートしたものを元部
静脈より追加免疫した。最終免疫３日後にこの肺臓をマ
ウスより摘出し、抗体産生細胞を調製した。
上記で調製した肺細胞を従来の細胞融合技術を用いて、
ミニローマ細胞株Ｐａ−Ｘ８３−Ａｇ８５３とＤＭＥＭ
培地中にて、５０％ポリエチレングリコール存在下にて
細胞融合を行いハイブリドーマを調製した。
ミニローマ細胞株Ｐａ−Ｘ８３−Ａｇ８５３とＤＭＥＭ
培地中にて、５０％ポリエチレングリコール存在下にて
細胞融合を行いハイブリドーマを調製した。
目的とするハイブリドーマの選択は、固相酵素免疫測定
法を用いてハイブリドーマ培養上清の分析を行い、ＰＣ
のみに反応する抗体を産生じているハイブリドーマを選
択し、限界希釈法を２回行なうことによりハイブリドー
マを確立した。得られたハイブリドーマ細胞は９６ウエ
ルマイクロタイタープレート中で常法にしたがって“培
養を行い、培養開始１週間後、培養上清の抗体価、特異
性を固相酵素免疫測定法により評価し、ハイブリドーマ
細胞の選択を行なった。
法を用いてハイブリドーマ培養上清の分析を行い、ＰＣ
のみに反応する抗体を産生じているハイブリドーマを選
択し、限界希釈法を２回行なうことによりハイブリドー
マを確立した。得られたハイブリドーマ細胞は９６ウエ
ルマイクロタイタープレート中で常法にしたがって“培
養を行い、培養開始１週間後、培養上清の抗体価、特異
性を固相酵素免疫測定法により評価し、ハイブリドーマ
細胞の選択を行なった。
固相酵素免疫測定法はマイクロタイタープレートに各種
リン脂質即ちＰＳ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ。
リン脂質即ちＰＳ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ。
ＣＬ、ＰＩ、ＰＣを０．５ｎｍｏｌ／ウェルでコートし
、３％ＢＳＡ （牛血清アルブミン）にて２時間室温で
ブロッキングを行なった。ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
、 １５０ｍＭ ＮａＣ１，ｐｔ（７，４にて洗浄後、
培養上清をｓｏμＩ／ウェルで加え、２時間室温で放置
した。洗浄後、ビオチン標識抗体（ＺＹＭＥＤ社製、８
２−６４４０旧ｏｔｌｎ−Ｇｔｘ Ｍｏｕｓｅ１ｇＧ＋
ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｍ＋Ｌ））およびワサビペルオキシダ
ーゼ・アビジンＤ（フナコシ薬品（株）製、Ａ−２００
４、ＶＥＣ４１０１２００４）を添加して抗体価陽性の
ウェルを選択し、ＰＣにのみ反応性を示す抗体（以下こ
の抗体を抗体Ａ、Ｂ、Ｃとする）を得た。
、３％ＢＳＡ （牛血清アルブミン）にて２時間室温で
ブロッキングを行なった。ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
、 １５０ｍＭ ＮａＣ１，ｐｔ（７，４にて洗浄後、
培養上清をｓｏμＩ／ウェルで加え、２時間室温で放置
した。洗浄後、ビオチン標識抗体（ＺＹＭＥＤ社製、８
２−６４４０旧ｏｔｌｎ−Ｇｔｘ Ｍｏｕｓｅ１ｇＧ＋
ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｍ＋Ｌ））およびワサビペルオキシダ
ーゼ・アビジンＤ（フナコシ薬品（株）製、Ａ−２００
４、ＶＥＣ４１０１２００４）を添加して抗体価陽性の
ウェルを選択し、ＰＣにのみ反応性を示す抗体（以下こ
の抗体を抗体Ａ、Ｂ、Ｃとする）を得た。
実施例２
抗体ＡのＰＣ類似物質に対する交叉反応性を調査する目
的で以下の実験を行なった。
的で以下の実験を行なった。
まず、マイクロタイタープレートを０．５ｎｍｏｌのＰ
Ｃでコートし、３％ＢＳＡでブロッキングした後、Ｉｔ
）ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣ１，１５０（ＩＩＭ ＮａＣＩ
（ｐＨ７，４）で洗浄した。
Ｃでコートし、３％ＢＳＡでブロッキングした後、Ｉｔ
）ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣ１，１５０（ＩＩＭ ＮａＣＩ
（ｐＨ７，４）で洗浄した。
次に、抗体Ａを産生ずるハイブリドーマの培養上清５０
μｍに対し、それぞれＰＣ１コリン−Ｃ１、フォスフォ
リルコリン、グリセルフォスフォコリン、リゾ−ＰＣ１
又はスフィンゴミエリンを添加し、室温で２時間放置し
た後、実施例１と同様にして抗体Ａと上述のＰＣ類似物
質の交叉反応性を調査した。その結果、抗体ＡはＰＣに
対してのみ特異的に反応することが判明した。
μｍに対し、それぞれＰＣ１コリン−Ｃ１、フォスフォ
リルコリン、グリセルフォスフォコリン、リゾ−ＰＣ１
又はスフィンゴミエリンを添加し、室温で２時間放置し
た後、実施例１と同様にして抗体Ａと上述のＰＣ類似物
質の交叉反応性を調査した。その結果、抗体ＡはＰＣに
対してのみ特異的に反応することが判明した。
実施例３
サンドイッチ法によりＰＣの測定を行なった。
（Ａ）抗ＰＣ抗体の固定化：未処理マイクロタイタープ
レートの各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，６）に溶解した３ ｕ ｇ ／ ｍ １のマウス
由来の抗ＰＣ抗体（抗体Ｂ）の溶液２００μｍを加えて
、４℃で一夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶
液を除去し、ＰＢＳに０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０を含
んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１
％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェ
ルに加えて、４℃で一夜ブロッキング処理を行なった。
レートの各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，６）に溶解した３ ｕ ｇ ／ ｍ １のマウス
由来の抗ＰＣ抗体（抗体Ｂ）の溶液２００μｍを加えて
、４℃で一夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶
液を除去し、ＰＢＳに０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０を含
んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１
％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェ
ルに加えて、４℃で一夜ブロッキング処理を行なった。
（Ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製： ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８，１）に溶解したＨＲＰ溶液（５Ｂ／ｎｌ）に１％１
−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶
液０．１１を加え、室温にて１時間反応させた。その溶
液に０．０８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０１を添加し
３０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０
．１８Ｍのエチレングリコール１．０１を加えて除去し
た後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）
で透析した。次に、マウス由来抗ＰＣモノクローナル抗
体（抗体Ｃ）５ｍｇを加えて５〜６時間反応させた。水
素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４℃中で一夜放
置した。この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除
去するため、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０１１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に対して４℃
で一夜撹拌しながら透析した。上記反応物をＴＳＫゲル
Ｇ３０００ＳＷ （東ソー（株）製）を用いて高速液体
クロマトグラフィーにより精製し、ＨＲＰ標識抗体とし
た。
抗体の調製： ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８，１）に溶解したＨＲＰ溶液（５Ｂ／ｎｌ）に１％１
−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶
液０．１１を加え、室温にて１時間反応させた。その溶
液に０．０８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０１を添加し
３０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０
．１８Ｍのエチレングリコール１．０１を加えて除去し
た後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）
で透析した。次に、マウス由来抗ＰＣモノクローナル抗
体（抗体Ｃ）５ｍｇを加えて５〜６時間反応させた。水
素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４℃中で一夜放
置した。この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除
去するため、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０１１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に対して４℃
で一夜撹拌しながら透析した。上記反応物をＴＳＫゲル
Ｇ３０００ＳＷ （東ソー（株）製）を用いて高速液体
クロマトグラフィーにより精製し、ＨＲＰ標識抗体とし
た。
（Ｃ）試料中のＰＣの定量二本実施例中の（Ａ）で記述
した方法で作製したマイクロタイタープレートを室温に
戻し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ＰＣを含む標準試
料を各ウェルにそれぞれ２０μｍ加えた。次に、本実施
例（Ｂ）で得たＨＲＰ標識抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈
し、各ウェルに２００μｌずつ添加した。そのまま室温
で３時間インキュベートした後、溶液を除去し、ＰＢＳ
−Ｔ溶液で３回洗浄した。１．２％２．２−アジノジー
（３−エチルベンズチアリゾリン硫酸）−ジアンモニウ
ム塩（ＡＢＴＳ）および０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ
２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）
からなる基質溶成を各つ°エルに２０ｃｊμｌ添加し、
室温で３０分酵素反応させた後、２０（ｌｅＭシュウ酸
溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マ
イクロタイタープレートを各ウェルについて、波長４１
５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロ
タイタープレートリーダ（東ソー（株）製、ＭＰＲ−Ａ
４）で測定した。結果を表１に示す。
した方法で作製したマイクロタイタープレートを室温に
戻し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ＰＣを含む標準試
料を各ウェルにそれぞれ２０μｍ加えた。次に、本実施
例（Ｂ）で得たＨＲＰ標識抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈
し、各ウェルに２００μｌずつ添加した。そのまま室温
で３時間インキュベートした後、溶液を除去し、ＰＢＳ
−Ｔ溶液で３回洗浄した。１．２％２．２−アジノジー
（３−エチルベンズチアリゾリン硫酸）−ジアンモニウ
ム塩（ＡＢＴＳ）および０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ
２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）
からなる基質溶成を各つ°エルに２０ｃｊμｌ添加し、
室温で３０分酵素反応させた後、２０（ｌｅＭシュウ酸
溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マ
イクロタイタープレートを各ウェルについて、波長４１
５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロ
タイタープレートリーダ（東ソー（株）製、ＭＰＲ−Ａ
４）で測定した。結果を表１に示す。
表１
結果からも明らかなように、試料中のＰＣは１〜２００
ｎｇ／ｍｌの範囲で定量できることが確認された。
ｎｇ／ｍｌの範囲で定量できることが確認された。
Claims (4)
- （１）フォスファチジルコリンを測定する方法において
、フォスファチジルコリンを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を用いることを特徴とするフォスファチジル
コリンの測定法。 - （２）フォスファチジルコリンを特異的に認識し、フォ
スファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミ
ン、フォスファチジル酸、カルジオリピン、フォスファ
チジルイノシトールまたは、フォスファチジルグリセロ
ールとは交叉反応性を示さないモノクローナル抗体を用
いる特許請求の範囲第（１）項記載のフオスファチジル
コリンの測定法。 - （３）サンドイッチ法により測定する特許請求の範囲第
１項または第２項記載の方法。 - （４）競合法により測定する特許請求の範囲第１項また
は第２項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33627589A JPH03197865A (ja) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | フォスファチジルコリンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33627589A JPH03197865A (ja) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | フォスファチジルコリンの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03197865A true JPH03197865A (ja) | 1991-08-29 |
Family
ID=18297426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33627589A Pending JPH03197865A (ja) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | フォスファチジルコリンの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03197865A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999033522A3 (en) * | 1997-12-31 | 1999-09-16 | Univ Texas | Use of a phosphatidylserine/polypeptide conjugate for inducing autoimmunity in the treatment of cancer |
| EP1792625A1 (en) * | 1997-12-31 | 2007-06-06 | Board of Regents, The University of Texas System | Use of a phosphatidylserine/polypeptide conjugate for inducing autoimmunity in the treatment of cancers |
| WO2007026972A3 (en) * | 2005-09-01 | 2007-09-13 | Canon Kk | Binding protein molecule |
-
1989
- 1989-12-27 JP JP33627589A patent/JPH03197865A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999033522A3 (en) * | 1997-12-31 | 1999-09-16 | Univ Texas | Use of a phosphatidylserine/polypeptide conjugate for inducing autoimmunity in the treatment of cancer |
| US6300308B1 (en) | 1997-12-31 | 2001-10-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for inducing autoimmunity in the treatment of cancers |
| EP1792625A1 (en) * | 1997-12-31 | 2007-06-06 | Board of Regents, The University of Texas System | Use of a phosphatidylserine/polypeptide conjugate for inducing autoimmunity in the treatment of cancers |
| US7563446B2 (en) | 1997-12-31 | 2009-07-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for inducing autoimmunity in the treatment of cancers |
| WO2007026972A3 (en) * | 2005-09-01 | 2007-09-13 | Canon Kk | Binding protein molecule |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3589912B2 (ja) | ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識するモノクローナル抗体 | |
| EA002520B1 (ru) | Выделенное антитело и его фрагмент, способы и набор для оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце и способ диагностики заболеваний, обусловленных перекисным окислением липидов | |
| US5767247A (en) | Anti-annexin-V monoclonal antibodies, and preparation and use thereof | |
| EP0384130A2 (en) | Myocardial infarction immunoassay | |
| US4780410A (en) | Sandwich enzyme immunoassay for PIVKA-II with monoclonal anti-PIVKA-II antibody | |
| JP7313659B2 (ja) | 試料中のｈｍｇｂ１の測定方法及び測定試薬 | |
| JP3620696B2 (ja) | ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸を認識するモノクローナル抗体 | |
| JPH02128697A (ja) | 抗フコシルセラミドモノクローナル抗体 | |
| US4885256A (en) | Monoclonal antibodies to cholesterol and methods | |
| JPH08508297A (ja) | ヒト−プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼの特殊免疫分析法、その実施のための道具、及び該分析法のためのオリゴペプチドと抗体 | |
| US4786591A (en) | Process for determining the binding capacity of thyroxin-binding globulin | |
| JPH0437380B2 (ja) | ||
| EP0757250B1 (en) | Method of assaying asialoglycoprotein receptor and assay reagent therefor | |
| JP2508915B2 (ja) | 抗ＳＳＡ／ＲｏおよびＳＳＢ／Ｌａ抗体測定用抗原、その製造法ならびに抗ＳＳＡ／ＲｏおよびＳＳＢ／Ｌａ抗体の測定法 | |
| JP3451783B2 (ja) | コリンエステラーゼの測定法及び肝硬変と肝炎の識別法 | |
| CA2355893C (en) | Antiuracil monoclonal antibody | |
| JP2002243737A (ja) | 抗スフィンゴ脂質モノクローナル抗体 | |
| JP7822024B2 (ja) | 試料中のｈｍｇｂ１の測定方法及び測定試薬、抗ｈｍｇｂ１抗体を固定化した担体の非特異的凝集の抑制方法並びに試料中のｈｍｇｂ１測定時の試薬ブランクの上昇の抑制方法 | |
| JPWO1991006005A1 (ja) | Ｄ型バニリルマンデル酸の測定法およびそれに使用する試薬およびキット | |
| JPH04135484A (ja) | ８―ハイドロキシ―２’―デオキシグアノシンのモノクローナル抗体及びその製造法並びにモノクローナル抗体を生産するハイブリッド細胞 | |
| JP2609908B2 (ja) | 慢性関節リウマチ疾患の診断用試薬 | |
| JP3036545B2 (ja) | モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法 | |
| JPH09154596A (ja) | パラニトロフェノキシ系有機リン化合物に特異的な抗体、その製造方法、及びパラニトロフェノキシ系有機リン化合物の測定方法 | |
| CA1340816C (en) | Diagnostic test for pseudomonas aeruginosa infections | |
| JPS61502350A (ja) | アルカリ性ホスフアタ−ゼのイソ酵素を鑑別して測定する方法及び試薬並びにこのために適当なモノクロナ−ル抗体 |