JPH02128697A - 抗フコシルセラミドモノクローナル抗体 - Google Patents
抗フコシルセラミドモノクローナル抗体Info
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- JPH02128697A JPH02128697A JP63281433A JP28143388A JPH02128697A JP H02128697 A JPH02128697 A JP H02128697A JP 63281433 A JP63281433 A JP 63281433A JP 28143388 A JP28143388 A JP 28143388A JP H02128697 A JPH02128697 A JP H02128697A
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- Japan
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- cancer
- monoclonal antibody
- hybridoma
- cells
- fucosylceramide
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト癌の診断に有効な新規なモノクローナル
抗体、該抗体を産生ずるハイブリドーマ、該抗体の製造
方法及び該抗体を用いた診断薬に関する。
抗体、該抗体を産生ずるハイブリドーマ、該抗体の製造
方法及び該抗体を用いた診断薬に関する。
即ち、本発明ではヒト癌組織より抽出した中性糖脂質に
含まれるセラミドモノグリコシド画分のフコシルセラミ
ドに対して特異的に反応するモノクローナル抗体、該抗
体を産生ずるハイブリドーマ、このハイブリドーマによ
る該抗体を製造する方法及び該抗体を用いた診断薬を提
供する。
含まれるセラミドモノグリコシド画分のフコシルセラミ
ドに対して特異的に反応するモノクローナル抗体、該抗
体を産生ずるハイブリドーマ、このハイブリドーマによ
る該抗体を製造する方法及び該抗体を用いた診断薬を提
供する。
１９７５年ににδｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによって
モノクローナル抗体の作製技術が確立して以来（Ｎａｔ
ｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）） 、現在まで
に数多くの研究者達が、癌細胞を特異的に識別するモノ
クローナル抗体の作製を試みてきた。彼らは、ヒトの癌
細胞を直接マウスに免疫して、ヒト正常細胞には反応せ
ず、ヒト癌細胞のみを認識するハイブリドーマを選択す
る方法を用いた。その結果得られた、モノクローナル抗
体の認識する腫瘍抗原の多くは、糖鎖抗原である事が判
明している。（Ｈａｋｏｍｏｒｉ、 Ｓ、５ｃｉｅｒｔ
ｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２５４３２．４１．１９
８６］代表的な例としては、ＣＡ１９−９、シアリル５
ＳＥＡ−１等が挙げられ、それらは既に癌のマーカーと
して広く臨床で用いられている〔神奈木令児 臨床病理
ＸＸＸＴＶ：１１１２４７−１２６４１９８６） 、
しかし、これらの抗原は、５個以上の糖を有する糖鎖で
あり、短鎖の１１！鎖抗原に関しては、Ｉｌｌ瘍抗原と
して重要でるという可能性が既に論じられているにもか
かわらず、その研究は未だ不十分であると思われる。
モノクローナル抗体の作製技術が確立して以来（Ｎａｔ
ｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）） 、現在まで
に数多くの研究者達が、癌細胞を特異的に識別するモノ
クローナル抗体の作製を試みてきた。彼らは、ヒトの癌
細胞を直接マウスに免疫して、ヒト正常細胞には反応せ
ず、ヒト癌細胞のみを認識するハイブリドーマを選択す
る方法を用いた。その結果得られた、モノクローナル抗
体の認識する腫瘍抗原の多くは、糖鎖抗原である事が判
明している。（Ｈａｋｏｍｏｒｉ、 Ｓ、５ｃｉｅｒｔ
ｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２５４３２．４１．１９
８６］代表的な例としては、ＣＡ１９−９、シアリル５
ＳＥＡ−１等が挙げられ、それらは既に癌のマーカーと
して広く臨床で用いられている〔神奈木令児 臨床病理
ＸＸＸＴＶ：１１１２４７−１２６４１９８６） 、
しかし、これらの抗原は、５個以上の糖を有する糖鎖で
あり、短鎖の１１！鎖抗原に関しては、Ｉｌｌ瘍抗原と
して重要でるという可能性が既に論じられているにもか
かわらず、その研究は未だ不十分であると思われる。
セラミド（脂質部分）にフコースの１個ついたフコシル
セラミド（構造式： Ｌ−Ｆｕｃα１→１ｃｅｒ）は、
１９７６年に初めて箱守仙一部らにより、大腸癌組織よ
り単離され、ヒト癌において特異的に発現される糖脂質
であるという可能性が示された（ＪＲＣ，２５１，２３
８５−２３８７，１９７６）。また、彼らは、人工的に
有機合成したフコシルセラミドを免疫原として用い、ウ
サギに免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。しかし
、このポリクローナル抗体は、フコシルセラミドのみに
特異的に反応するのではなく、セラミド、ガラクトシル
・セラミドとも交叉反応性を有し、ヒト癌細胞又はヒト
癌組織におけるフコシルセラミドの発現の解析を正確に
行う事は不可能であった（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２１＋９２８−９３４ （１９Ｂ２） ）。
セラミド（構造式： Ｌ−Ｆｕｃα１→１ｃｅｒ）は、
１９７６年に初めて箱守仙一部らにより、大腸癌組織よ
り単離され、ヒト癌において特異的に発現される糖脂質
であるという可能性が示された（ＪＲＣ，２５１，２３
８５−２３８７，１９７６）。また、彼らは、人工的に
有機合成したフコシルセラミドを免疫原として用い、ウ
サギに免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。しかし
、このポリクローナル抗体は、フコシルセラミドのみに
特異的に反応するのではなく、セラミド、ガラクトシル
・セラミドとも交叉反応性を有し、ヒト癌細胞又はヒト
癌組織におけるフコシルセラミドの発現の解析を正確に
行う事は不可能であった（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２１＋９２８−９３４ （１９Ｂ２） ）。
［発明が解決しようとする課題〕
上述の如く、フコシルセラミドに対して、特異的に反応
するモノクローナル抗体は、未だ知られておらず、フコ
シルセラミドを特異的に認識するモノクローナル抗体が
あればヒトの癌の診断に有用であるばかりでなくヒト癌
細胞もしくは、ヒト癌組織におけるフコシルセラミドの
発現の解析に非常に有用である。
するモノクローナル抗体は、未だ知られておらず、フコ
シルセラミドを特異的に認識するモノクローナル抗体が
あればヒトの癌の診断に有用であるばかりでなくヒト癌
細胞もしくは、ヒト癌組織におけるフコシルセラミドの
発現の解析に非常に有用である。
〔課題を解決するための手段］
我々は、ヒト膵癌組織より分離精製した中性糖脂質画分
を免疫原として樹立したハイブリドーマが生産するモノ
クローナル抗体ＰＣ４刊が、フコシルセラミドに特異的
に反応することを示し、また本抗体を用いて各種癌細胞
におけるフコシルセラミドの発現の有無の解析が可能で
あることを見出し、本発明を完成した。
を免疫原として樹立したハイブリドーマが生産するモノ
クローナル抗体ＰＣ４刊が、フコシルセラミドに特異的
に反応することを示し、また本抗体を用いて各種癌細胞
におけるフコシルセラミドの発現の有無の解析が可能で
あることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は次の通りである。
（１） フコシルセラミドを特異的に認ｉするモノク
ローナル抗体。
ローナル抗体。
（２）次の特性を有する上記（１）記載のモノクローナ
ル抗体。
ル抗体。
■ １ｇクラス：１ｇＭ
■ フコシルセラミドの由来：ヒト癌組織から抽出、精
製した中性糖脂質のセラミドモノグリコシド画分。
製した中性糖脂質のセラミドモノグリコシド画分。
■ 肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌を起源とする細胞株に対
して反応する。
して反応する。
■ 正常末梢血リンパ球、正常赤血球、正常繊維芽細胞
とは反応しない。
とは反応しない。
■ 白血病、肝癌、乳癌、神経細胞芽腫を起源とする細
胞株に対して反応しない。
胞株に対して反応しない。
（３） Ｐ Ｃ４７Ｈと名付けられた上記（１）記載
のモノクローナル抗体。
のモノクローナル抗体。
（４）上記（１）乃至（３）のいずれか記載のモノクロ
ーナル抗体を産生ずる能力を有するハイブリドーマ。
ーナル抗体を産生ずる能力を有するハイブリドーマ。
（５） ヒト膵癌組織より分離精製した中性糖脂質画
分で免疫した動物細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイ
ブリドーマを形成し、該ハイブリドーマをクローン化し
て、フコシルセラミドを特異的に認識するモノクロナー
ル抗体を産生ずるクローンを選択し、該クローンを用い
て上記（１）乃至（３）のいずれか記載のモノクロナー
ル抗体を製造する方法。
分で免疫した動物細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイ
ブリドーマを形成し、該ハイブリドーマをクローン化し
て、フコシルセラミドを特異的に認識するモノクロナー
ル抗体を産生ずるクローンを選択し、該クローンを用い
て上記（１）乃至（３）のいずれか記載のモノクロナー
ル抗体を製造する方法。
（６）上記（１）乃至（３）のいずれか記載のモノクロ
ーナル抗体を有効成分とする癌の診断薬。
ーナル抗体を有効成分とする癌の診断薬。
（力 癌が肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌であることを特徴
とする上記（６）記載の診断薬。
とする上記（６）記載の診断薬。
以下、本発明について詳細に説明する。
我々は、ヒト膵癌＆ＩＩ織より分離精製した中性糖脂質
画分をマウスに免疫し〔免疫は、カールソンらの方法に
従い行った（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９５１
＋１９８６） ） 、その肺細胞と、マウス骨髄腫細胞
とを融合させて、ハイブリドーマを作製した。次に限界
希釈法によりクローン化し、モノクローナル抗体を得た
（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）９９２６９．１９
８６ ） 。モノクローナル抗体の認識する抗原は、薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いた免疫染色法（
以下ＴＬＣ免疫染色法と略す） （Ｃａｎ、Ｒｅｓ、
４７１９６８． （１９８７） ］及び、糖脂質を吸着
させたプレートを用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によ
り、解析された（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ。
画分をマウスに免疫し〔免疫は、カールソンらの方法に
従い行った（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９５１
＋１９８６） ） 、その肺細胞と、マウス骨髄腫細胞
とを融合させて、ハイブリドーマを作製した。次に限界
希釈法によりクローン化し、モノクローナル抗体を得た
（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）９９２６９．１９
８６ ） 。モノクローナル抗体の認識する抗原は、薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いた免疫染色法（
以下ＴＬＣ免疫染色法と略す） （Ｃａｎ、Ｒｅｓ、
４７１９６８． （１９８７） ］及び、糖脂質を吸着
させたプレートを用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によ
り、解析された（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ。
１、門ｅｔｈｏｄｓ ３８，８５１９８０）。
本発明のハイブリドーマの産生ずるモノクローナル抗体
は、１ｇＭクラスに属し中性糖脂質のセラミド・モノ・
グリコシド画分に存在するフコシルセラミドを特異的に
抗原として認識する。本発明のモノクローナル抗体の具
体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＰＣ４７Ｈが産生
するＰＣ４７Ｈが挙げられる。
は、１ｇＭクラスに属し中性糖脂質のセラミド・モノ・
グリコシド画分に存在するフコシルセラミドを特異的に
抗原として認識する。本発明のモノクローナル抗体の具
体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＰＣ４７Ｈが産生
するＰＣ４７Ｈが挙げられる。
以下に本発明のモノクローナル抗体の製造法を詳細に説
明する。
明する。
（１）生血ｕｌｉΩ里！
ヒト膵癌組織をワーリング・プレンダー等を用いて細切
し、その容量の約２０倍量のクロロホルム−メタノール
混液２ ： １ （Ｃ−Ｍ ２：１と略す）、クロホル
ム−メタノール混液１ ： １ （Ｃ−Ｍ １：１と略
す）、クロロホルム−メタノール−水混液１：２：０．
８（Ｃ−ＭＷ １：２：０．８と略す）で順次抽出し、
減圧乾固することにより、総脂質画分を得る。次に、総
脂質画分を０．５Ｎ ＫＯＨのＣ−Ｍ １：１混液中に
溶かし、室温で一晩放置した後、蒸留水に対して透析す
ることにより、リン脂質画分を除去する。この画分を、
Ｃ−門−Ｗ ３０：６０：８に溶かし、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−２５（酢酸型、ファルマシアファインケ
ミカル社製）カラムにのせ、酸性脂質画分を吸着除去す
ることにより、中性脂質画分を得る。さらに中性脂質画
分を、シリカゲル６０ （Ｍｅｒｃｋ社製）カラムにの
せ、クロロホルムにて単純脂質を溶出し、Ｃ−Ｍ−Ｗ
６５：３０：８にて、粗糖脂質画分を溶出する。粗糖脂
質画分を蒸発乾固後、ピリジン−無水酢酸混液３：２に
溶かすことにより、アセチル化し、フロリジル（Ｆｌｏ
ｒｉｄｉｎ社製）カラムにのせ、１．２−ジクロエタン
で挽性の低い脂質を溶出させた後、１．２ジクロエタン
−アセトン（１： １）混液で、アセチル化糖脂質画分
を溶出する。この両分を２８％アンモニア水−メタノー
ル混液１：４に溶かし、室温で１２時間放置することに
より、脱アセチル化した。
し、その容量の約２０倍量のクロロホルム−メタノール
混液２ ： １ （Ｃ−Ｍ ２：１と略す）、クロホル
ム−メタノール混液１ ： １ （Ｃ−Ｍ １：１と略
す）、クロロホルム−メタノール−水混液１：２：０．
８（Ｃ−ＭＷ １：２：０．８と略す）で順次抽出し、
減圧乾固することにより、総脂質画分を得る。次に、総
脂質画分を０．５Ｎ ＫＯＨのＣ−Ｍ １：１混液中に
溶かし、室温で一晩放置した後、蒸留水に対して透析す
ることにより、リン脂質画分を除去する。この画分を、
Ｃ−門−Ｗ ３０：６０：８に溶かし、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−２５（酢酸型、ファルマシアファインケ
ミカル社製）カラムにのせ、酸性脂質画分を吸着除去す
ることにより、中性脂質画分を得る。さらに中性脂質画
分を、シリカゲル６０ （Ｍｅｒｃｋ社製）カラムにの
せ、クロロホルムにて単純脂質を溶出し、Ｃ−Ｍ−Ｗ
６５：３０：８にて、粗糖脂質画分を溶出する。粗糖脂
質画分を蒸発乾固後、ピリジン−無水酢酸混液３：２に
溶かすことにより、アセチル化し、フロリジル（Ｆｌｏ
ｒｉｄｉｎ社製）カラムにのせ、１．２−ジクロエタン
で挽性の低い脂質を溶出させた後、１．２ジクロエタン
−アセトン（１： １）混液で、アセチル化糖脂質画分
を溶出する。この両分を２８％アンモニア水−メタノー
ル混液１：４に溶かし、室温で１２時間放置することに
より、脱アセチル化した。
中性糖脂質画分の分析には、薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）法を用いる。ＴＬＣはシリカゲル６０プレート
（Ｍｅｒｃｋ社製５６４１もしくは５５４７）を用い、
ＣＭ−Ｗ ６５：２５：４で展開する。中性糖脂質の検
出には、オルシノール試薬を用いる。
ＴＬＣ）法を用いる。ＴＬＣはシリカゲル６０プレート
（Ｍｅｒｃｋ社製５６４１もしくは５５４７）を用い、
ＣＭ−Ｗ ６５：２５：４で展開する。中性糖脂質の検
出には、オルシノール試薬を用いる。
糖脂質の定量は、ガスリキッドクロマトグラフィーを用
いる。
いる。
（２） マウス の看。
（１）で調整した適当量の中性糖脂質と、リピドＡ５■
、シミリストイル・フォスファチジル・コリン６８ｍｇ
、コレステロール２８■、ジセチルホスフエイト６■を
適当な有機溶媒に溶かし、５０ｍ／容量のナス型フラス
コにて蒸発乾固した後、リン酸緩衝液（リン酸二ナトリ
ウム２．８ｇ、リン酸−ナトリウム０．３ｇ、食塩９ｇ
、蒸留水１！、ｐ Ｈ７，２） （ＰＢＳ）１０−とガ
ラスピーズ（２ｍｍφ）３−を加え、強く振盪撹拌する
ことにより、リポソームを形成させる。この溶液を８週
令前後のマウスの皮下（四肢のっけね部）に１５０μｌ
ｆｉ腔に５０μｌの合計２００μｌを投与することによ
り免疫する。以後２週問おきに同様の方法を用いて免疫
を行う。抗血清を１週間毎に眼底静脈叢より採血し、そ
の抗体価を酵素免疫測定法により測定する。
、シミリストイル・フォスファチジル・コリン６８ｍｇ
、コレステロール２８■、ジセチルホスフエイト６■を
適当な有機溶媒に溶かし、５０ｍ／容量のナス型フラス
コにて蒸発乾固した後、リン酸緩衝液（リン酸二ナトリ
ウム２．８ｇ、リン酸−ナトリウム０．３ｇ、食塩９ｇ
、蒸留水１！、ｐ Ｈ７，２） （ＰＢＳ）１０−とガ
ラスピーズ（２ｍｍφ）３−を加え、強く振盪撹拌する
ことにより、リポソームを形成させる。この溶液を８週
令前後のマウスの皮下（四肢のっけね部）に１５０μｌ
ｆｉ腔に５０μｌの合計２００μｌを投与することによ
り免疫する。以後２週問おきに同様の方法を用いて免疫
を行う。抗血清を１週間毎に眼底静脈叢より採血し、そ
の抗体価を酵素免疫測定法により測定する。
Ｍ案免段皿定迭工
（１）で調整した中性糖脂質をＣ−Ｍ ２ ： １で溶
解した後、適当量のエタノールに混和し、（糖脂質量と
して２２０−１Ｏ０ｎ／／含有する様に調整する）５０
μｌ／ウヱルずつ９６ウエルＥＩＡ用プレート （三光
純薬社製）に分注し、５６℃で１時間放置し、エタノー
ルを蒸発させる。１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ） −
ＰＢＳ （以下ＢＳＡ／ＰＢＳ と略す）で各ウェルを
満たし、室温で１時間放置することにより、非特異的吸
着をブロックする。その後、ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳで希釈した試料（マウス抗血清もしくは、
ハイブリドーマ培養上清）を５０μ２／ウェル分注し、
室温で１時間反応させる。ＢＳＡ／ＰＢＳで３同各ウェ
ルを洗浄した後、第２抗体として２０００倍に希釈した
ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇｓ（ＤＡＫＯ
社製）５０μｌ／ウエルで分注し、１時間室温で放置す
る。ＢＳＡ／ＰＢＳで３回ウェルを洗浄後ＯＰＤ基質溶
液（０−フェニレンジアミン１０■を１０−のクエン酸
緩衝液ｐＨ５，０に溶かし、使用直前に過酸化水素水を
最終濃度０．００６％となる様に加えた溶液）を、５０
μｌ／ウエルずつ加えて、室温で２０−３０分間反応さ
せる。２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェル加え、反応を停止し
、オートリーダーにて、ＯＤ４．。の吸光度を測定する
。
解した後、適当量のエタノールに混和し、（糖脂質量と
して２２０−１Ｏ０ｎ／／含有する様に調整する）５０
μｌ／ウヱルずつ９６ウエルＥＩＡ用プレート （三光
純薬社製）に分注し、５６℃で１時間放置し、エタノー
ルを蒸発させる。１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ） −
ＰＢＳ （以下ＢＳＡ／ＰＢＳ と略す）で各ウェルを
満たし、室温で１時間放置することにより、非特異的吸
着をブロックする。その後、ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳで希釈した試料（マウス抗血清もしくは、
ハイブリドーマ培養上清）を５０μ２／ウェル分注し、
室温で１時間反応させる。ＢＳＡ／ＰＢＳで３同各ウェ
ルを洗浄した後、第２抗体として２０００倍に希釈した
ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇｓ（ＤＡＫＯ
社製）５０μｌ／ウエルで分注し、１時間室温で放置す
る。ＢＳＡ／ＰＢＳで３回ウェルを洗浄後ＯＰＤ基質溶
液（０−フェニレンジアミン１０■を１０−のクエン酸
緩衝液ｐＨ５，０に溶かし、使用直前に過酸化水素水を
最終濃度０．００６％となる様に加えた溶液）を、５０
μｌ／ウエルずつ加えて、室温で２０−３０分間反応さ
せる。２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェル加え、反応を停止し
、オートリーダーにて、ＯＤ４．。の吸光度を測定する
。
以上の測定法により、免疫原に対して強く反応する抗血
清を有するマウスを選択し、ハイブリドーマ作製に用い
る。細胞融合を行なう３日前に再度免疫原を投与（ブー
スト）シた免疫化マウスより肺臓を無菌的に摘出する。
清を有するマウスを選択し、ハイブリドーマ作製に用い
る。細胞融合を行なう３日前に再度免疫原を投与（ブー
スト）シた免疫化マウスより肺臓を無菌的に摘出する。
ホモジナイザーを用いて個々の細胞にほぐし、牛胎児血
清を含まないＲＰ旧１６４０（日本水産社製）でよく洗
浄した後、融合用肺細胞として使用する。
清を含まないＲＰ旧１６４０（日本水産社製）でよく洗
浄した後、融合用肺細胞として使用する。
（３）量１１Ｉ■勧ｌ肘堅
骨髄腫細胞としては、マウス由来の８−アザグアニン耐
性骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３ Ａｇ８−ロ１（Ｐ３・Ｕ
ｌ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ。
性骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３ Ａｇ８−ロ１（Ｐ３・Ｕ
ｌ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ。
１ｏｇｙ １） （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ６５１１−５１９（１９７６）〕を用い
る。融合日までにこの骨髄腫細胞を８−アザグアニン存
在下で数日間培養して、復帰突然変異体を完全に除く。
ｎｏｌｏｇｙ ６５１１−５１９（１９７６）〕を用い
る。融合日までにこの骨髄腫細胞を８−アザグアニン存
在下で数日間培養して、復帰突然変異体を完全に除く。
対数増殖期の細胞を２×１０７以上使える様に準備する
。
。
（４）■血社金
（２）で調整した免疫化マウスの肺細胞と（３）で得ら
れた骨髄腫細胞を牛胎児血清を含まないＲＰＭＴ １６
４０でよく洗浄し、細胞数比が免疫化肺細胞１０に対し
て骨髄腫細胞が１となる様に混合し、遠心分離（１２０
０ｒｐｍ ５分間）後上清を捨て、沈澱した細胞群をよ
くほぐした後、３７°Ｃに予め暖めておいたポリエチレ
ングリコール溶液（ポリエチレングリコール１５４０、
和光純薬社製、４０％を含むＲＰＭＩ １６４０培養液
）を１ｄ加える。遠心分離後（３００ｒｐｍ ２分間、
７００ｒｐｍ ２分間、１１０００ｒｐ ２分間を順次
連続的に行なう。）、上清を取り除き、）ＩＡＴ培地（
ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含み１
５％牛脂児血清を含有するＲＰＭｒ １６４０）を加え
、ピペットにより、ゆるやかに細胞を懸濁する。この懸
濁液を９６ウエルプレートに２００μ２／ウヱルで分注
し、ＣＯ□インキュベーター内で７日間培養後、培養上
清１００μ２を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加える
。同様の操作を２−３日毎に融合日より３週間まで続け
た後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除い
た培地）へ漸時変換していく。ハイブリドーマが増殖し
てきたウェルより培養上清を一部サンプリングし、上記
の酵素免疫測定法により、免疫原として用いた中性糖脂
質画分に対する抗体価を測定する。
れた骨髄腫細胞を牛胎児血清を含まないＲＰＭＴ １６
４０でよく洗浄し、細胞数比が免疫化肺細胞１０に対し
て骨髄腫細胞が１となる様に混合し、遠心分離（１２０
０ｒｐｍ ５分間）後上清を捨て、沈澱した細胞群をよ
くほぐした後、３７°Ｃに予め暖めておいたポリエチレ
ングリコール溶液（ポリエチレングリコール１５４０、
和光純薬社製、４０％を含むＲＰＭＩ １６４０培養液
）を１ｄ加える。遠心分離後（３００ｒｐｍ ２分間、
７００ｒｐｍ ２分間、１１０００ｒｐ ２分間を順次
連続的に行なう。）、上清を取り除き、）ＩＡＴ培地（
ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含み１
５％牛脂児血清を含有するＲＰＭｒ １６４０）を加え
、ピペットにより、ゆるやかに細胞を懸濁する。この懸
濁液を９６ウエルプレートに２００μ２／ウヱルで分注
し、ＣＯ□インキュベーター内で７日間培養後、培養上
清１００μ２を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加える
。同様の操作を２−３日毎に融合日より３週間まで続け
た後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除い
た培地）へ漸時変換していく。ハイブリドーマが増殖し
てきたウェルより培養上清を一部サンプリングし、上記
の酵素免疫測定法により、免疫原として用いた中性糖脂
質画分に対する抗体価を測定する。
強い抗体価を示したハイブリドーマについては、４週令
前後のマウスの胸腺細胞をフィーダ細胞として用い、１
５％牛脂児血清を含むＲＰ旧１６４０培養液を希釈液と
して、限外希釈法により、クローニングを行う。
前後のマウスの胸腺細胞をフィーダ細胞として用い、１
５％牛脂児血清を含むＲＰ旧１６４０培養液を希釈液と
して、限外希釈法により、クローニングを行う。
（５）モノクロ−ル のれ
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマの培養上
清を直接使用する場合と、多量に精製したモノクローナ
ル抗体を使用する場合がある。後者の場合は、目的とす
る抗体を産生ずるハイブリドーマを約１０”細胞ずつ、
予めブリスタンで前処理したマウスに腹腔内投与し、約
２週間後腹水癌を生じたマウスから腹水を採取し、遠心
分離（３０００ｒｐｍ １０分間）後、その上清を一７
０℃以下で凍結保存する。
清を直接使用する場合と、多量に精製したモノクローナ
ル抗体を使用する場合がある。後者の場合は、目的とす
る抗体を産生ずるハイブリドーマを約１０”細胞ずつ、
予めブリスタンで前処理したマウスに腹腔内投与し、約
２週間後腹水癌を生じたマウスから腹水を採取し、遠心
分離（３０００ｒｐｍ １０分間）後、その上清を一７
０℃以下で凍結保存する。
この腹水から抗体を精製する場合は、腹水を４５％飽和
硫酸アンモニウムで、３回、４°Ｃで塩析し、さらにセ
ファクリルＳ ３００（ファルマシア ファイン ケミ
カルズ社製）を用いてゲル濾過をする。
硫酸アンモニウムで、３回、４°Ｃで塩析し、さらにセ
ファクリルＳ ３００（ファルマシア ファイン ケミ
カルズ社製）を用いてゲル濾過をする。
抗体のアイソタイプがＩｇＭの場合は、０．５Ｍの塩化
ナトリウムを含むリン酸緩衝液を用いてゲル濾過を行う
。タンパク賞の定量は、バイオラド社のプロティン ア
ッセイ キットを用いる。
ナトリウムを含むリン酸緩衝液を用いてゲル濾過を行う
。タンパク賞の定量は、バイオラド社のプロティン ア
ッセイ キットを用いる。
抗体のアイソタイプの決定は、各アイソタイプに特異的
なウサギ抗血清（マイルス社製）を用いたオクタロニイ
法（二重免疫拡散法）によって行う。
なウサギ抗血清（マイルス社製）を用いたオクタロニイ
法（二重免疫拡散法）によって行う。
（６） クロマトブーツ − いた 洗（ＴＬ
Ｃ免疫染色法） 薄層プレートには、シリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃ
ｋ社製５５４７）を用い、各種癌もしくは正常組織より
抽出精製した中性ｖｌ脂質画分を、展開溶媒Ｃ−ＭＷ
６５：３０：６を用い展開する。薄層プレートを十分に
乾燥させた後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸し、１時間室温
で放置し、非特異的な抗体の反応をブロックする。５％
ＢＳＡ／ＰＢＳを吸引除去した後、薄層プレートを（４
）で得られた陽性ハイブリドーマの培養上清に浸し、室
温で３時間放置する。０．５％ＵＳＡ／ＰＢＳにて５−
８回洗浄後、ビオチン化抗マウスＩｇｓ （ＤＡＫＯ社
製）の１００倍希釈液を加え、室温で１時間反応させ、
その後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて、５−８回洗浄す
る。
Ｃ免疫染色法） 薄層プレートには、シリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃ
ｋ社製５５４７）を用い、各種癌もしくは正常組織より
抽出精製した中性ｖｌ脂質画分を、展開溶媒Ｃ−ＭＷ
６５：３０：６を用い展開する。薄層プレートを十分に
乾燥させた後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸し、１時間室温
で放置し、非特異的な抗体の反応をブロックする。５％
ＢＳＡ／ＰＢＳを吸引除去した後、薄層プレートを（４
）で得られた陽性ハイブリドーマの培養上清に浸し、室
温で３時間放置する。０．５％ＵＳＡ／ＰＢＳにて５−
８回洗浄後、ビオチン化抗マウスＩｇｓ （ＤＡＫＯ社
製）の１００倍希釈液を加え、室温で１時間反応させ、
その後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて、５−８回洗浄す
る。
予め調整しておいた、アビジン化ペルオキシダーゼ溶液
（フナコシ社製）を加え、室温で１時間反応させる。０
．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで５−８回洗浄後、ＰＢＳで２回
洗浄し、基質溶液（イムノスティン■、コニカ社製）を
加え、室温で２０〜３０分間、軽く振盪を加えながら反
応させる。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２−３回洗浄後
、風乾にてプレートを乾燥させ、培養上清中に含まれる
モノクローナル抗体の認識する抗原の薄層プレート上で
の位置を同定する。
（フナコシ社製）を加え、室温で１時間反応させる。０
．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで５−８回洗浄後、ＰＢＳで２回
洗浄し、基質溶液（イムノスティン■、コニカ社製）を
加え、室温で２０〜３０分間、軽く振盪を加えながら反
応させる。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２−３回洗浄後
、風乾にてプレートを乾燥させ、培養上清中に含まれる
モノクローナル抗体の認識する抗原の薄層プレート上で
の位置を同定する。
以下本発明の実施例を示す。
実施例１
（］）中中性糖質の調整
ヒト膵癌組４６２５．８ｇより、前述した一般的な方法
に従って、中性糖脂質画分を抽出精製した。得られた中
性本店脂質の総量は３．７４ｍｇであった。薄層プレー
ト（Ｍｅｒｃｋ社製５５４７）を用いたこの中性糖脂質
画分の展開パターンを第１図のＡに示す。
に従って、中性糖脂質画分を抽出精製した。得られた中
性本店脂質の総量は３．７４ｍｇであった。薄層プレー
ト（Ｍｅｒｃｋ社製５５４７）を用いたこの中性糖脂質
画分の展開パターンを第１図のＡに示す。
（２）免疫化マウス牌細胞の調整
（１）で示した様に、ヒト膵癌組織より得た中性糖脂質
画分を２５μｇ（糖脂質換算）７匹の条件で、前述の方
法に従い、８週令のマウスに投与免疫した。
画分を２５μｇ（糖脂質換算）７匹の条件で、前述の方
法に従い、８週令のマウスに投与免疫した。
以後２週間おきに、同一抗原２５μｇ（糖脂質換算）７
匹で５回免疫した。これら、免疫したマウスのうち、酵
素免疫測定法によりその抗血清の抗体価が最も高いマウ
スを選択し、そのマウスより肺細胞を調整して、細胞融
合に供した。
匹で５回免疫した。これら、免疫したマウスのうち、酵
素免疫測定法によりその抗血清の抗体価が最も高いマウ
スを選択し、そのマウスより肺細胞を調整して、細胞融
合に供した。
（３）マウス骨髄腫細胞の調整
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
１５％牛脂児血清を含むＦＣ５ＲＰＭｌ １６４０で堵
養し、細胞融合時に親株として２Ｘ１０？以上の細胞を
供した。
１５％牛脂児血清を含むＦＣ５ＲＰＭｌ １６４０で堵
養し、細胞融合時に親株として２Ｘ１０？以上の細胞を
供した。
（４）ハイブリドーマの作製
（２）、 （３）で得られた肺細胞と骨髄腫細胞とを１
０：１の割合で混合し、前述した方法で細胞融合を行っ
た。
０：１の割合で混合し、前述した方法で細胞融合を行っ
た。
ハイブリドーマが増殖してきたウェルより、培養上清を
一部サンプリングし、前述の酵素免疫測定法により、そ
の抗体価を測定して、高い反応性を有するウェルを選択
し、クローニングを行い、ハイブリドーマＰＣ４７Ｈ株
を確立した。
一部サンプリングし、前述の酵素免疫測定法により、そ
の抗体価を測定して、高い反応性を有するウェルを選択
し、クローニングを行い、ハイブリドーマＰＣ４７Ｈ株
を確立した。
（５）Ｔ ｔ、ｃ−免疫染色法
得られたハイブリドーマ株が産生ずるモノクローナル抗
体の認識する抗原の解析を行う為、シリカゲル６０プレ
ート（Ｍｅｒｃｋ社製５５４７）を用い、前述したＴＬ
Ｃ−免疫染色法を行った。
体の認識する抗原の解析を行う為、シリカゲル６０プレ
ート（Ｍｅｒｃｋ社製５５４７）を用い、前述したＴＬ
Ｃ−免疫染色法を行った。
その結果としてヒト膵癌組織より抽出精製した中性糖脂
質に含まれるセラミド・モノ・グリコシド画分に反応す
るモノクローナル抗体ＰＣ４７Ｈを得た。
質に含まれるセラミド・モノ・グリコシド画分に反応す
るモノクローナル抗体ＰＣ４７Ｈを得た。
ＰＣ４７ＨのＴＬＣ−免疫染色法による反応パターンを
第１図のＢに示した。
第１図のＢに示した。
ＰＣ４１Ｈは、中性ネ唐脂質のセラミド・モノ・グリコ
シド画分のフコシルセラミド以外には、どの両分に対し
ても反応性を示さなかった。
シド画分のフコシルセラミド以外には、どの両分に対し
ても反応性を示さなかった。
（６） ＰＣ４７Ｈのアイソタイプ
マウスの各アイソタイプに特異的なウサギ抗血清（マイ
ルス社製）を用いて、二重免疫拡散法により、そのアイ
ソタイプを判定した。その結果、モノクローナル抗体Ｐ
Ｃ４７Ｈは、１ｇＭクラスに属していることが明らかと
なった。なお、本発明によって作成された抗フコシルセ
ラミドモノクローナル抗体ＰＣ４７Ｈを産生ずるハイブ
リドーマは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号
微工研菌寄第１０３８３号（ＦＥＲＭ Ｐ４０３８３）
として寄託されいてる。
ルス社製）を用いて、二重免疫拡散法により、そのアイ
ソタイプを判定した。その結果、モノクローナル抗体Ｐ
Ｃ４７Ｈは、１ｇＭクラスに属していることが明らかと
なった。なお、本発明によって作成された抗フコシルセ
ラミドモノクローナル抗体ＰＣ４７Ｈを産生ずるハイブ
リドーマは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号
微工研菌寄第１０３８３号（ＦＥＲＭ Ｐ４０３８３）
として寄託されいてる。
実施例２
補乳類におけるセラミド・モノ・グリコシド画分に含ま
れる抗原としては、ガラクトシル・セラミド（以下Ｇａ
１−Ｃｅｒと略す）、グルコシル・セラミド（以下Ｇｌ
ｃ−Ｃｅｒと略す）、フコシル・セラミド（以下Ｆｕｃ
−Ｃｅｒと略す）の三つが報告されている。（続生化学
実験講座４ 東京、東京化学同人１９８６） ｒ複合
糖脂質研究法Ｕ Ｊ Ｉ）、３−１２牧１）章）我々は
、ＰＣ４７Ｈの認識する抗原の同定をする為、以下に述
べる実験を行った。
れる抗原としては、ガラクトシル・セラミド（以下Ｇａ
１−Ｃｅｒと略す）、グルコシル・セラミド（以下Ｇｌ
ｃ−Ｃｅｒと略す）、フコシル・セラミド（以下Ｆｕｃ
−Ｃｅｒと略す）の三つが報告されている。（続生化学
実験講座４ 東京、東京化学同人１９８６） ｒ複合
糖脂質研究法Ｕ Ｊ Ｉ）、３−１２牧１）章）我々は
、ＰＣ４７Ｈの認識する抗原の同定をする為、以下に述
べる実験を行った。
単離精製されたＧａ１−Ｃｅｒ（生化学工業社製）、Ｇ
ｌｃ−Ｃｅｒ、 Ｆｕｃ−ＣｅｒをＣＨ２：１にて溶解
した後、エタノールに混和し、各ウェルに８０．４０．
２０．１０． ５ｎｇずつ分注し、室温で一晩放置する
事により、溶媒を蒸発させた。
ｌｃ−Ｃｅｒ、 Ｆｕｃ−ＣｅｒをＣＨ２：１にて溶解
した後、エタノールに混和し、各ウェルに８０．４０．
２０．１０． ５ｎｇずつ分注し、室温で一晩放置する
事により、溶媒を蒸発させた。
ＢＳＡ／ＰＢＳでウェルをブロックした後、ＰＣ４７Ｈ
の培養上清を５０μｉ／ウエルで分注し、室温で２時間
反応させた。
の培養上清を５０μｉ／ウエルで分注し、室温で２時間
反応させた。
ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄後、２０００倍に希釈したペ
ルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（ＰＡＫＯＰＡ
ＴＴＳ社製）を５０μｌ／ウエルで分注し、１時間室温
で放置した。
ルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（ＰＡＫＯＰＡ
ＴＴＳ社製）を５０μｌ／ウエルで分注し、１時間室温
で放置した。
ＢＳＡ／ＰＢＳで３同各ウェルを洗浄後、前述したＯＰ
Ｄ基質溶液を加え、室温で２０分間反応させた後、５０
μｌの２Ｍ硫酸で反応を停止し、オートリーダにて００
４９７＋の吸光度を測定した。結果を第２図に示す。
Ｄ基質溶液を加え、室温で２０分間反応させた後、５０
μｌの２Ｍ硫酸で反応を停止し、オートリーダにて００
４９７＋の吸光度を測定した。結果を第２図に示す。
ＰＣ４１Ｈは、Ｇａ１−Ｃｅｒ、 Ｇｌｃ−Ｃｅｒとは
全く交叉反応性を示さず、Ｆｕｃ−Ｃｅｒに対してのみ
、反応性を示した。この結果より、ＰＣ４７Ｈは、中性
糖脂質のセラミド・モノ・グリコシド画分に存在するＦ
ｕｃ−Ｃｅｒに対して特異的に反応するモノクローナル
抗体であることが証明された。
全く交叉反応性を示さず、Ｆｕｃ−Ｃｅｒに対してのみ
、反応性を示した。この結果より、ＰＣ４７Ｈは、中性
糖脂質のセラミド・モノ・グリコシド画分に存在するＦ
ｕｃ−Ｃｅｒに対して特異的に反応するモノクローナル
抗体であることが証明された。
実施例３
種々の細胞株に対する抗フコシルセラミドモノクローナ
ル抗体ＰＣ４７Ｈの反応性を、以下に述べる、ＥＩＡの
方法により、調べた。
ル抗体ＰＣ４７Ｈの反応性を、以下に述べる、ＥＩＡの
方法により、調べた。
すなわち、９６ウエルフイルトレーシヨンプレート （
ミリタイターＧｖ、ミリポア社製）を用い、１５％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ １６４０培養液に懸濁した細胞を１
０’細胞数／ウエルで加え、３７°Ｃで１時間放置する
。 （この操作により、非特異的な抗体の反応をもブロ
ックする）、培養液をアスピレータ−を用いてウェルか
ら取り除き、ＰＣ４７Ｈの培養上清を１００μ２／ウエ
ルで分注し、４°Ｃ１時間反応させる。
ミリタイターＧｖ、ミリポア社製）を用い、１５％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ １６４０培養液に懸濁した細胞を１
０’細胞数／ウエルで加え、３７°Ｃで１時間放置する
。 （この操作により、非特異的な抗体の反応をもブロ
ックする）、培養液をアスピレータ−を用いてウェルか
ら取り除き、ＰＣ４７Ｈの培養上清を１００μ２／ウエ
ルで分注し、４°Ｃ１時間反応させる。
次に細胞を細胞用ＰＢＳ （リン酸二ナトリウム２．９
ｇ、リン酸−カリウム０．２ｇ、塩化カリウム０．２ｇ
１食塩８ｇ、蒸留水ＩＩｌ、 ｐＨ７，２）で３回洗
浄し、２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合ウサ
ギ抗マウス抗体を１００μ！／ウエルで加え、４°Ｃで
１時間反応させる。細胞用ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄
後、１００μｌ／ウエルでＯＰＤ基質溶液を加えて反応
させる。
ｇ、リン酸−カリウム０．２ｇ、塩化カリウム０．２ｇ
１食塩８ｇ、蒸留水ＩＩｌ、 ｐＨ７，２）で３回洗
浄し、２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合ウサ
ギ抗マウス抗体を１００μ！／ウエルで加え、４°Ｃで
１時間反応させる。細胞用ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄
後、１００μｌ／ウエルでＯＰＤ基質溶液を加えて反応
させる。
酵素反応は２０分間行い２Ｍ硫酸を５０μｍ／ウェル加
えて反応を停止させる。発色の程度はオートリーダーに
て判定する。結果を第１表に示す。
えて反応を停止させる。発色の程度はオートリーダーに
て判定する。結果を第１表に示す。
抗フコシルセラミドモノクローナル抗体ＰＣ４７１（は
、肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌を起源とする細胞株に対し
て反応性を示した。しかし、正常末梢血リンパ球、正常
赤血球、正常繊維芽細胞には反応性を示さず、又、白血
病、肝癌、乳癌、神経細胞芽腫を起源とする細胞株に対
して反応性を示さなかった。
、肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌を起源とする細胞株に対し
て反応性を示した。しかし、正常末梢血リンパ球、正常
赤血球、正常繊維芽細胞には反応性を示さず、又、白血
病、肝癌、乳癌、神経細胞芽腫を起源とする細胞株に対
して反応性を示さなかった。
（本頁以下余白）
第 １ 表
細胞を用いた酵素免疫測定法（ＥＴＡ）によるモノクロ
ーナル抗体ＰＣ４７Ｈの種々の細胞に対する反応性細胞
基 白血病細胞株 肺癌細胞株 胃癌細胞株 大腸癌細胞株 膵癌細胞株 肝臓癌細胞株 神経細胞芽腫細胞株 乳癌細胞株 正常繊維芽細胞株 正常末梢血リンパ球 正常赤血球 Ｃ４７Ｈ Ｏ／６ ” ２／３ １／１ ２１／２ ３１／３ ０／１ ０／１ ０／１ ０／１ ０／３ ０／３ るフコシルセラミドの発現の有無の正確な解析に有用な
モノクローナル抗体が供給される。更にこのモノクロナ
ール抗体を用いて癌の診断に有効な診断薬が提供される
。
ーナル抗体ＰＣ４７Ｈの種々の細胞に対する反応性細胞
基 白血病細胞株 肺癌細胞株 胃癌細胞株 大腸癌細胞株 膵癌細胞株 肝臓癌細胞株 神経細胞芽腫細胞株 乳癌細胞株 正常繊維芽細胞株 正常末梢血リンパ球 正常赤血球 Ｃ４７Ｈ Ｏ／６ ” ２／３ １／１ ２１／２ ３１／３ ０／１ ０／１ ０／１ ０／１ ０／３ ０／３ るフコシルセラミドの発現の有無の正確な解析に有用な
モノクローナル抗体が供給される。更にこのモノクロナ
ール抗体を用いて癌の診断に有効な診断薬が提供される
。
本発明によれば、
各種癌組織及び癌細胞におけ
第１
図
第
図
１ セラミド・モノ・グリコシド
■ セラミド・ジ・グリコシド
■ セラミド・トリ・グリコンド
■ セラミド・テトラ・グリコシド
展開溶媒 ＣＭＷ６５二３０：６
４へ一発色 オルシノール塩酸試薬（全中性糖脂質画分
）Ｂ；ＰＣ４７ＨによるＴＬＣ免疫染色 （ｎｇ／ｗｅ
）Ｂ；ＰＣ４７ＨによるＴＬＣ免疫染色 （ｎｇ／ｗｅ
Claims (7)
- （１）フコシルセラミドを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体。 - （２）次の特性を有する請求項１記載のモノクローナル
抗体。 ［１］Ｉｇクラス：１ｇＭ ［２］フコシルセラミドの由来：ヒト癌組織から抽出、
精製した中性糖脂質のセラミドモノグリコシド画分。 ［３］肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌を起源とする細胞株に
対して反応する。 ［４］正常末梢血リンパ球、正常赤血球、正常繊維芽細
胞とは反応しない。 ［５］白血病、肝癌、乳癌、神経細胞芽腫を起源とする
細胞株に対して反応しない。 - （３）ＰＣ４７Ｈと名付けられた請求項１記載のモノク
ローナル抗体。 - （４）請求項１乃至３のいずれかの項記載のモノクロー
ナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマ。 - （５）ヒト膵癌組織より分離精製した中性糖脂質分画で
免疫した動物細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリ
ドーマを形成し、該ハイブリドーマをクローン化して、
フコシルセラミドを特異的に認識するモノクロナール抗
体を産生するクローンを選択し、該クローンを用いて請
求項１乃至３のいずれかの項記載のモノクロナール抗体
の製造方法。 - （６）請求項１乃至３のいずれかの項記載のモノクロー
ナル抗体を有効成分とする癌の診断薬。 - （７）癌が肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌であることを特徴
とする請求項６記載の診断薬。
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63281433A JPH02128697A (ja) | 1988-11-09 | 1988-11-09 | 抗フコシルセラミドモノクローナル抗体 |
| FI895287A FI895287A7 (fi) | 1988-11-09 | 1989-11-07 | Fukosyylikeramidin vastainen monoklonaalinen vasta-aine |
| KR1019890016069A KR900007430A (ko) | 1988-11-09 | 1989-11-07 | 항-퓨코실세르아미드 모노클로날 항체 |
| IL92232A IL92232A0 (en) | 1988-11-09 | 1989-11-07 | Anti-fucosylceramide monoclonal antibody |
| NZ231292A NZ231292A (en) | 1988-11-09 | 1989-11-07 | Anti-fucosylceramide monoclonal antibody and the detection of cancer |
| EP89120549A EP0368222A1 (en) | 1988-11-09 | 1989-11-07 | Anti-fucosylceramide monoclonal antibody |
| NO894444A NO177311C (no) | 1988-11-09 | 1989-11-08 | Anti-fucosylceramid monoklonalt antistoff |
| PT92235A PT92235B (pt) | 1988-11-09 | 1989-11-08 | Processo para a preparacao de um anticorpo monoclonal anti-fucosilceramida e de agentes de diagnostico que o contem |
| DK557289A DK557289A (da) | 1988-11-09 | 1989-11-08 | Monoklonalt, fucosylceramiderkendende antistof, dets fremstilling og anvendelse samt hybridoma til fremstillingen |
| ZA898499A ZA898499B (en) | 1988-11-09 | 1989-11-08 | Anti-fucosylcermiade monoclonal antibody |
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