JPH03198793A - 新規な抗ヒトトロンボモジユリンモノクローナル抗体および酸素免疫測定法による血管内皮障害の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗
体およびそのモノクローナル抗体を用いた酵素免疫学的
測定方法に基づき、血中に存在するヒトトロンボモジュ
リンおよびその分解産物を定量することによって、血管
内皮障害を診断することに関する。

〔背景技術〕

血管内皮細胞は、血管内腔を一層で覆い、血液と直接に
接している細胞であり、極めて多くの生理活性物質を産
生じ、抗血栓性、物質の選択的透過性、血管緊張の維持
などを司っており、血管内皮に障害が加わると、生体の
恒常性が失われ、種々の病的状態が生ずることが明らか
にされてきている（長沢俊彦、第８５回日本医学会シン
ポジウム予稿集、２（１９８９））。

動脈硬化の発症は、血管内皮の障害に端を発すると言わ
れている。この動脈硬化に基づく脳や心臓の虚血性疾患
は、欧米における死因の上３− 位を占めており、わが国でも増加の一途をたどっている
。また、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症といった血管障
害に基づく糖尿病の合併症は、糖尿病患者の余命を左右
する大きな因子であると考えられている。さらに、全身
性エリテマトーデス（Ｓ　Ｌ　Ｅ）、慢性関節リウマチ
、強皮症などの種々の膠原病は、その原因が未だ明らか
にされていないが、それらはいずれも自己免疫現象など
の免疫異常の関与が示唆され、また、炎症の場が血管結
合組織であることから血管障害を呈することが知られて
いる。

従来、各種の膠原病を診断する手段のひとつとしてリウ
マトイド因子および抗核抗体の存在、ならびに血清補体
価の増減などの免疫異常の有無を調べる方法があるが、
膠原病における血管障害の程度を示すパラメーターは、
現在までのところ報告されていない。

その他、溶血性尿毒症性症候群、妊娠腎、川崎病、腎移
植の拒絶反応制御にシクロスポリンを大量使用したとき
の腎機能障害など、病態形４− 成に血管内皮障害が関与していると考えられる疾患は極
めて多い。

そこで、血管内皮障害の程度を、簡便かつ定量的に検出
する方法があれば、血管内皮障害が関与していると考え
られている疾患の発症因子、病態形成の機序、予防法、
治療法の探索などに重要な役割を果たすと考えられる。

血管は、血液と直接に接している血管内皮細胞とそれら
を被う筋線維や結合組織から成っており、上記のことを
解決するために、血管障害に起因する血液に流出した血
管内皮細胞由来成分の測定が、有効と考えられる。しか
し、血管内皮障害は、従来の凝固系の血液検査では、検
出することが不可能であり、また、近年、血管内皮細胞
の培養系を用い、障害モデルを作成する研究や、血管内
皮由来の様々な物質に関する研究が進展し、注目されて
いるが、血管内皮障害の程度を的確に判断するための方
法は、まだ確立されていない。

血管内皮由来の物質の中で、最近特に注目されている物
質として、トロンボモジュリンがあげられる。

血管内皮細胞膜タンパク質であるヒトトロンボモジュリ
ン １本鎖糖タンパク質で、ｃＤＮＡ構造に基づくと成熟タ
ンパク質は５５７アミノ酸から成り、合成直後の未熟タ
ンパク質には１８アミノ酸から成るシグナルペプチドが
存在する。成熟タンパク質は、ＮＨ，末端側を細胞外に
、Ｃ　Ｏ　Ｏ　Ｈ末端側を細胞質に向けて配列され、細
胞外領域にはＮＨｔ末端ドメイン、連続的な６個の成長
因子様構造から成りトロンビンの結合する部位である上
皮成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ）様ドメイン、さらに、糖鎖結
合ドメインが存在する。トロンボモジュリンは、トロン
ビンと１＝１で結合し、トロンビンによるプロティンＣ
の活性化を２　、　０００倍程度高めるコファクターと
して機能し、プロティンＣ凝固制御系に関与している。

またトロンボモジュリンは、トロンビンの向凝固作用（
フィブリノーゲン凝固活性、血小板活性化、■因子５− ６− 活性化など）を阻害する。従って、トロンボモジュリン
は、トロンビンの機能を向凝固から抗凝固へと転換する
血管内皮上の重要な凝固制御因子であり、脳以外のほと
んど全ての組織の動脈、静脈、毛細血管、リンパ管の内
腔や胎盤の合胞体栄養細胞表面に存在し、体液の凝固阻
止に深く関与していると考えられている。

トロンボモジュリンは、血中や尿中にも存在することが
明らかにされている（　ｌ５ｈｉｉ　Ｈ，ａｎｄＭａｊ
ｅｒｕｓ　ＰＪ、、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、
７６、２１７８−２１８１（１，９８５））。血中に存
在するトロンボモジュリンとは、分子量の不均一な血液
溶解性のタンパク質であり、その由来は、血管内皮細胞
からの分泌反応によって遊離したものではなく、血管内
皮細胞の破壊の過程でプロテアーゼによって分解され、
血中に遊離したものと考えられている。

ボモジュリンｌＪ堅ＩＬ［ｕ□を定量できれば、その定
量値は、血管内皮障害の程度を示す指標と− なり得ることから、感度、精度および簡便性に優れた測
定法の開発が、強く望まれている。

血中トロンボモジュリンを定量する方法としては、従来
、抗トロンボモジュリンポリクローナル抗体を用いるラ
ジオイムノアッセイ（ＩｓｈｉｉＨ，ａｎｄ　Ｍａｊｅ
ｒｕｓ　Ｐ、Ｗ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、
　７６゜２１７８−２１８１　（１９８５））、抗トロ
ンボモジュリンモノクローナル抗体を用いるエンザイム
イムノアッセイ（石井ら、臨床病理、３７．２６６−２
７１　（１９８９）、Ｋｉｍｕｒａ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｊ、Ｂｊｏｃｈｅｍ、、　１０５．４７８−４８
３（１９８９）　）などが報告されているが、測定系に
よって絶対値が異なっており、また、いずれの測定系に
おいても各測定値を疾患群別に分けた場合、バラツキが
大きく、血管内皮障害の程度を如実に反映しているとは
いえない。

〔発明の開示〕

ラジオイムノアッセイやエンザイムイムノアッセイのよ
うな免疫学的測定法においては、用いる抗体の特異性、
結合部位、安定性等によって、その感度や精度が左右さ
れる。特に血中ト８− ロンボモジュリンは、分子量的に均一なタンパク質でな
いので、安定したデータを得るためには、適切な抗体の
作成が非常に重要である。そこで本発明者は、この点を
踏まえて種々検討した結果、ヒトトロンボモジュリンの
生理活性に影響を及ぼす抗ヒトトロンボモジュリンモノ
ク皿１１甑囲コ二リラつ−を持つ抗ヒトモノクローナル
抗体を用いて、酵素免疫測定を行うことにより、血中ト
ロンボモジュリンのうち、前記モノクローナル抗体と結
合する物質を定量し、その定量値を健常人血中の定量値
と比較することに基づいて、血管内皮障害を、迅速で、
簡便かつ定量的に診断する方法を提供することに成功し
た。

特に、前記の方法に用いるモノクローナル抗結合阻害作
用という）を持つモノクローナル抗体と、トロンビン結
合阻害作用は持たないが、プロティンＣ活性化阻害作用
を持つ抗ヒトモノクローナル抗体の二種類のモノクロー
ナル抗体を使用して、サンドイツチ法に基づく酵素免疫
測定を行った場合、血管内皮障害診断方法として、精度
および感度に優れ、′また、患者血中の定量値を経時的
に測定することにより、病態の経過観察に有用であるこ
とがみいだされた。

すなわち、本発明は、ヒトトロンボモジュリンの生理活
性に影響を及ぼす抗ヒトトロンボモジュリンモノクロー
ナル抗体で、特に、プロティンＣ活性化阻害作用を持つ
抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体を提供す
るものであり、さらに、そのモノクローナル抗体のうち
、トロンビン結合阻害作用を有するモノクローナル抗体
を提供するものである。さらに、本発明は、プロティン
Ｃ活性化阻害作用を持つ抗ヒトトロンボモジュリンモノ
クローナル抗体を用いて、酵素免疫測定を行うことによ
り、血中トロンボモジュリンのうち、前記のモノクロー
ナル】０ 抗体と結合する物質を定量し、その定量値を、健常人血
中の定量値と比較することに基づいて、血管内皮障害を
診断する方法を提供するものであり、さらに、前記の方
法に用いるモノクロ−／ ナル抗体として、二種類のモノクローナル抗体を使用し
、その一種類が、トロンビン結合阻害作用を持つ抗ヒト
トロンボモジュリンモノクローナル抗体であり、他の一
種類が、トロンビン結合阻害作用は持たないが、プロテ
ィンＣ活性化阻害作用を持つ抗ヒトトロンボモジュリン
モノクローナル抗体である血管内皮障害を診断する方法
を、提供するものである。

以下に本発明の実施例をあげ、本発明をさらに詳細に説
明する。尚、本実施例はひとつの例示であって、例えば
、酵素免疫測定法としては、第一抗体固相法、二抗体法
、エミツト法（Ｅｎｚｙ−ｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ
　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｔ、ｅｃｈｎｉｑｕｅ　；
　ＥＭＩＴ）、エンザイムチャンネリングイムノアッセ
イ法、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ法およびリ
ボゾーム膜−酵素イムノアッセイ法などの競１ 合法や、サンドイツチ法、イムノエンザイムメトリック
アッセイ法、酵素活性増強イムノアッセイ法およびプロ
キシマールリンケージイムノアッセイ法などの非競合法
などがあり、任意に選択、使用できる。

さらに、上記の測定法においては、固相担体として、抗
原や抗体を受動的に良く吸着するポリスチレン製、ポリ
カーボネイト製、ポリプロピレン製、あるいはポリビニ
ール製のボール、マイクロプレート、スティック、試験
管などの種々の材料および使用形態を適宜、使用できる
。

また、標識用酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
などがあり、また、それらの酵素活性の測定方法として
は、比色法、螢光法、生物発光法あるいは化学発光法な
どがあり、これらの酵素および酵素活性測定法を、適宜
組み合わせて用いることができる。一方、酵素標識を付
与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画した後、Ｄ
ＥＡＥ−セファセルのごとき陰イオン１２ 交換ゲルにより精製したＩｇＧ分画、さらには、ペプシ
ン消化後、還元して得られる特異的結合部分Ｆａｂ″を
用いることもできる。

また、測定対象試料としては、血清、血漿等、いずれも
使用することができる。

実施例　１ 抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体の作製 （ａ）抗原−ヒトトロンボモジュリンの調製ヒト胎盤を
材料として、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５９゜
１２２４６−１２２５１　（１９８４）に記載のＳａｌ
ｅｍらの方法に従って、界面活性剤を用いてヒトトロン
ボモジュリンを抽出および可溶化した。

次に、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ
、　８８２．３４３３５２　（１９８６）に記載の５ｕ
ｚｕｋｉ　らのウシ肺からトロンボモジュリンを精製す
る方法と同様に、アフィニティークロマトグラフィーお
よびゲルろ適法を用いて、このトロンボモジュリンを含
有する溶液からトロンボモジュリンを精製した。

すなわち、ジイソプロピルフルオロリン酸によす不活化
したトロンビンをアガロースに同相化したＤＩＰ−トロ
ンビン−アガロース　を用いてアフィニティークロマト
グラフィーを２回行った後、ウルトロゲルＡｃＡ　４４
カラム（ＬＫＢ）を用いたゲルろ過を行い単離、精製し
た。

精製したヒトトロンボモジュリンは、Ｊ、Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、１７，８３５−８５１（１９７５）に記載
のＢｌｏｂｅｌ、ｌ　＆Ｄｏｂｂｅｒｓ　ｔｅｊ　ｎの
方法に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて調べ
たところ、非還元状態では、分子量的７８，０００ダル
トンの１本のバンドを示し、還元状態では、１０５，０
００ダルトンの単一なバンドを示した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製 ６週令のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス２匹をまずフロイント完
全アジュバント中で、前記（ａ）で精製したヒトトロン
ボモジュリンで初回免疫した。

すなわち、それぞれのマウスに５０μｇのヒトトロンボ
モジュリンを０．５ｍｌの溶液として腹腔内投与した。

その後、１５日目に６２．５ｍＭ塩化ナト１３− １４− リウムおよび０．０３１％ルブロール含有１２．５ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐ＋＋　７．５）に溶解した５０
μｇのヒトトロンボモジュリンを追加免疫した。さらに
、最終免疫として、４９日日日、腹腔的投与（５０μｇ
／４５０　ｐ　ｌ　；　１００ｍＭ塩化ナトリウムおよ
び０．０５％ルブロール含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液、ｐａｌ　７．５に溶解）により補助免疫し、３日後
にマウス膵臓を取り出し、牌細胞を調製した。

（Ｃ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いた。

ＲＰ旧１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ｎｏ、　１６４０　
（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、。

Ｉｎｃ、）に、重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピルビ
ン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム（５
０Ｕ　／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（ｓｏ　μｇ
／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を
加え、ドライアイスでｐＨを７．２に調整し、０．２μ
ｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。

Ｎ５−１培地：上記ＲＰＭＩ　１６４０培地に除菌ろ過
した仔牛脂児血清（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）
を、１５％１５− （Ｖ／Ｖ）の濃度に加えた。

ＰＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ　４，００
０、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｇｏ。

、Ｉｎｃ、）　５０％（ｗ／Ｗ）無血清溶液を調製した
。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞Ｎ５−１　（Ｐ３
−ＮＳＩ−１）　との融合は、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅ
ｔｈｏｄｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　（ｅｄ、　Ｂ、Ｂ、Ｍｉｓｈｅｌｌａｎｄ　Ｓ、Ｍ
、Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ、ｔｌ、Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ
　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１−３７２に記載
のＯｆらの方法を若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核牌細胞（生細胞率１０
０％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５＝
１の割合で融合した。膵臓細胞とミエローマ細胞とを別
に前記のＲＰ旧１６４０培地で洗浄した。次に同じ培地
に懸濁し、融合させるため上記の割合で混合した。容量
５０ｍ１の円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｉｗａｋｉ
　Ｇ−１ａｓｓ）　を用いて、４０ｍ１のＲＰＭＩ　１
６４０培地中、４００　Ｘ　ｇ、１０分間遠心分離し、
上清を完全に吸出した。沈殿細胞に、３７℃加温ＰＥＧ
　４，０００溶１６− 液２．１ｍｌを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、
さらに１分間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させる。次に
、３７℃加温ＲＰ旧１６４０培地２．１ｍｌを１分間で
滴下した。この操作をさらに１回繰り返した後、同培地
１４．７ｍｌを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、
細胞を分散させた。これを４００　Ｘ　ｇ、１０分間遠
心分離し、上滑を完全に吸引除去した。

次にこの沈殿細胞に、３７℃加温ＭＳ−１培地２１ｍ１
をすみやかに加え、細胞の大きい塊を、１０ｍ１のピペ
ットを用いて注意深くピペッティングして分散した。さ
らに同培地４２ｍ１を加えて希釈し、ポリスチレン製９
６六マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）　に、
１ウエル当たり、６、ＯＸ　１０’個１０．１ｍｌの細
胞を加えた。なお、この時使用した９６六マイクロウエ
ルは、前処理として０．２［０１のＭＳ−１培地を加え
、炭酸ガス培養器中（３７℃）で−晩保温し、使用時に
培地を吸引除去した。細胞を加えた上記のマイクロウェ
ルを７％炭酸ガス７９３％空気中で温度３７℃、湿度１
００％下に培養に付した。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用した培地は下記のとおりである。

＋１ＡＴ培地：前記（Ｃ）で述べたＭＳ−１培地にさら
にヒボキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０
，４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。

１１Ｔ培地ニアミノブテンを除去した以外は、上記１１
ＡＴ培地と同一組成のものである。

（２）前記（Ｃ）の培養開始後翌日（１日日）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍ１）
を加えた。２．３．５．８．１１日日日培地の半分（０
，１ｍ１）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日日目
培地の半分を新しいＩＩＴ培地で置き換えた。以降３〜
４日毎に培地の半分を新しいＩＩＴ培地で置き換えた。

通常２〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が観察さ
れる。ハイブリドーマ生育ウェルについて、次項（ｅ）
に記載の固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）法７− により陽性ウェルをチエツクした。次にフィーダーとし
て１０“個のマウス＃脳細胞を含む１１Ｔ培地１ｍｌを
ポリスチレン製２４セルウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓ
ｓ）に加えたものを用い、上記で検出された各陽性ハイ
ブリドーマの全内容物を移した。これを、前記（Ｃ）に
おけると同様に７％炭酸ガス存在下、３７℃で約１週間
培養に付した。その間１〜２回、各ウェルの上滑０．５
ｍｌを新しいＩＩＴ培地０．５ｍｌと交換した。ハイブ
リドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性
を再確認し、それぞれについて、後記（ｆ）項に記載の
限界希釈法によるクロ、−ニングを行った。なお、クロ
ーニングに使用後の残液を、ポリスチレン製２５師２組
織培養フラスコ（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）に移し、凍
結保存用試料を調製した。

（ｅ）固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）による抗ヒ
トトロンボモジュリン抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　］０４．２０５−２１
４　（１９８０）に記９− 載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変した方法を用い
た。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検出に適してい
る。９６穴ミクロタイトレージヨンプレー１□　　（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂ、、Ｉｎｃ、）を５０ｎｇのヒトトロン
ボモジュリンでコートし、吹に、未コート部分を１％牛
血清アルブミン（ＵＳＡ）でブロックした。

これに前記（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウェル
の上清の一部を加えて室温で約１時間インキュベ−１−
した。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ
、）を加え、さらに室温で約１時間インキュベートした
。次に基質である過酸化水素とＯ−フェニレンジアミン
を加え、生成した褐色の程度を肉眼で定性的に判定する
か、あるいはマイクロプレートリーダー（肝Ｒ−Ａ４、
東ソー株式会社）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。

（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性がある０ ので、限界希釈法によりクローニングを行い、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを取得した。ＭＳ−１培
地１ｍｌ当たりフィーダーとして１０’個のマウス胸腺
細胞を含むクローニング培地を調製し、９６六マイクロ
ウエルの３６ウエル、３６ウエルおよび２４ウエルにウ
ェル当たり５個、１個および０．５個のハイブリドーマ
を加えた。

５ＥＩ目、１２日日日全ウェルに各々　約０．１ｍｌの
ＮＳ１培地を追加した。クローニング開始後１４〜１５
８で６充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニ
ー形成陰性ウェルが５０％以上である群についてＥＬＩ
ＳＡを行った。テストした全ウェルが陽性でない場合、
抗体陽性ウェル中のコロニー数を確認し、ウェル中に１
コロニーが確認されたウェルを４〜６個選び再クローニ
ングした。

最終的にヒトトロンボモジュリンに対するモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ６株が得られた。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は、常法に従った。

すなわち、得られた各ハイブリドーマをＮ５−１培地な
どの適当な培養液で培養（生体内増殖）し、その培養上
清から１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル
抗体を得ることができた。一方、大量に抗体を得るため
に、牌細胞とミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（
Ｂａｌｂ／ｃマウス）に、１四ツたり０．５ｍｌの腫瘍
形成促進剤ブリスタン（２，６，１０，１４−テ）・ラ
メチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）　　を腹腔内投与した。１〜３週間後に、各ハイブ
リドーマｌＸｌ０’個を同じく腹腔内投与し、さらにそ
の１〜２週間後に生体内で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌ
のモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができた。

（１１）モノクローナル抗体のアイソタイプ前述したＥ
ＬＩＳＡ法に従って、ヒトトロンボモジュリンをコート
したミクロタイトレージョンプレートに前記（ｇ）で得
られた各々の腹水を加えた。０．１５Ｍ塩化ナトリウム
含有リン酸緩衝液（ｐＨ７，１）　（ＰＢＳ）により洗
浄した後、アイソタイ１− ２− ブ特異的つサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａ
ｂ。

Ｉｎｃ、）　　を加えた。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ
）抗体を加え、基質として、過酸化水素および２．２−
アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用い
て検出した。その結果をまとめて後掲の第１表に示した
。得られた抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗
体のうち、５個が免疫グロブリン鎖　γ１／にを、また
、１個が７２ａｉにを有していた。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を、アフィゲルプロティン
Ａ　ＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて
精製した。

（ｊ）ヒｌ−トロンボモジュリンに対するモノクローナ
ル抗体の親和定数 前記（ｉ）で得られた各モノクローナル抗体のヒトトロ
ンボモジュリンに対する親和定数を、５ｍＭ　ＣａＣ］
、存在下において、ＥＬＩＳＡ法を用いて求めた。すな
わち、先述のＥＬＩＳＡ法に従って、＝２３− ミクロタイトレージョンプレートにヒトトロンボモジュ
リンをコートし、１％ＢＳＡでブロックした。次に、前
記（ｉ）で得られた各モノクローナル抗体を、５ｍＭ　
ＣａＣＬ、含有の緩衝液に溶解し、５００ｎｇ／ｍｌに
調製したものを段階希釈し、その各々１００μｌを前記
で調製したミクロタイトレージョンプレートの各ウェル
に添加し、室温で約１時間インキュベートした。以下、
二次抗体反応と発色反応を、前記（ｅ）のＥＬＩＳＡ法
に従って行い、得られた測定値から常法に従って親和定
数（Ｋｄ）を求めた。その結果を、第２表に示した。

実施例　２ 血中トロンボモジュリンの定量に用いる抗体の選択 （ａ）プロティンＣ活性化阻害作用の検討トロンボモジ
ュリン溶液と、抗体溶液を混和した溶液を、各々調製し
、これらを、プロティンＣ活性測定に用いることにより
、トロンボモジュリンのプロティンＣ活性化促進作用に
対す２４− る各モノクローナル抗体の影響を検討した。

すなわち、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６２．２
２０６−２２１２゜（１９８７）　に記載のＫｕｒｏｓ
ａｗａらの方法に従って、エラスターゼ処理によって、
分子量５０，０００のトロンボモジュリンフラグメント
（エラスターゼフラグメント）を調製した。このエラス
ターゼフラグメントは、トロンボモジュリンのプロティ
ンＣ活性化促進作用を有し、水に可溶性である。このエ
ラスターゼフラグメントを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｕ　７．５）に溶解した（５００１ｇ／ｍｌ）。このエ
ラスターゼフラグメント溶液と、実施例１（ｊ）で調製
した各モノクローナル抗体の緩衝溶液（０〜１２μｇ／
ｍｌ）を用いて、トロンボモジュリンに対する抗体のモ
ル比が、０゜１／４．１／２．１／１．２／ｌ　および
４／１　となるように、それぞれに混合液を調製した。

この混合溶液を１０ｍ１ずつ用いて、臨床病理、牡０Ｉ
ｕ、　６３　、　（１９８５）に記載の銘木らの方法に
従って、プロティンＣ活性測定を行った。その結果、Ｉ
ｇＧ（クローン２ｌ−３Ｈ１）、ＩｇＧ（クローン２ｌ
−４Ｇ３）、ＩｇＧ（クローン２ｌ−６Ｆ７）およびＩ
ｇＧ（クローン２１−９旧２）が、トロンボモジュリン
のプロティンＣ活性化促進作用を、低下させることが分
かった（第３表）。

（ｂ）トロンビン結合阻害作用の検討 固相化したトロンボモジュリンフラグメントを抗体溶液
で処理した後、トロンビンを作用させることにより、ト
ロンビンのトロンボモジュリンに対する結合における各
モノクローナル抗体の影響を検討した。

すなわち、実施例２（ａ）で調製したエラスターゼフラ
グメント溶液（５００ｎｇ／ｍｌ）で、９６ウエルミク
ロタイトレーシヨンプレート（Ｆｌｏｗ　Ｌ−ａｂ、Ｉ
ｎｃ、）をコートした後、未コート部分を１％ＢＳＡで
ブロックした。次に実施例　１（ｉ）で得られた各モノ
クローナル抗体の濃度が、０．０．２５゜０．５．１．
２および１０μｇ／＋ｎｌとなるように調製したリン酸
緩衝溶液（ｐＨ７，５）　５０μｍを、それぞれ、コー
トしたプレートの各ウェルに加え、３７℃で６時間反応
させた。次に、抗体溶液を除一路− 去し、プレートを、０．１％ＢＳＡ含有　トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄した後、トロンビン溶
液（５００ｎｇ／ｍｌ生理食塩水）５０μｌをプレート
の各ウェルに加え、３７℃で３００分間反応せた。トロ
ンビン溶液を除去し、０．１％ＢＳＡ含有トリスー塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄した後、発色性合成基
質を用いるトロンビン測定法（櫻用信男、　Ｍｅｄｉｃ
ａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１３．７０４−７１３
　（１９８５））により、トロンビン活性を測定した。

すなわち、Ｋａｂｉ社製の試薬により調製した基質−ポ
リブレン溶液（Ｓ−２２３８：０．８ｍＭ）　を、プレ
ートの各ウェルに１００μｍずっ加え、３７℃で５分間
反応させた後、５０％酢酸溶液５０μｍを加えて反応を
停止させた。反応停止後、前記マイクロプレート　リー
ダーを用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。この吸
光度は、プレートにコートされたトロンボモジュリンの
エラスターゼフラグメントに結合したｌ・ロンビンの量
に比例している。この測定結果より、ＩｇＧ（クロー２
７− ン２ｌ−３１１１）とＩｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）
は、トロンビンのトロンボモジュリンに対する結合を強
く阻害することが認められた（第３表）。

（ａ）および（ｂ）の結果から、ＩｇＧ（クローン２ｌ
−３１１１）、ＩｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）、Ｉｇ
Ｇ（クローン２ｌ−６Ｆ７）およびＩｇＧ（クローン２
ｌ−９１１１２）は、ヒトトロンボモジュリンの生理活
性に影響を及ぼす抗ヒトトロンボモジュリンモノクロー
ナル抗体であり、プロティンＣ活性化阻害作用を持つこ
とがわかった。さらに、ＩｇＧ（クローン２ｌ−３Ｈ１
）およびＩｇＧ（クローン２ｔ−４ｃ３）は、強いトロ
ンビン結合阻害作用を持つことがわかった。また、トロ
ンボモジュリンのエラスターゼフラグメントに対するこ
れらのモノクローナル抗体の結合性を、イムノブロッテ
ィング法を用いて調べた結果、ＩｇＧ（クローン２ｌ−
３Ｈ１）、ＩｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）、ＩｇＧ（
クローン２ｌ−６Ｆ７）およびｒｇａ（クローン２ｌ−
９１１１２）は、いずれも、このエラスターゼフラグメ
ントに対する結合性を持っていることがわかった。

一路 実施例　３ ヒト血中トロンボモジュリンの定量 （ａ）酵素標識モノクローナル抗体の調製（１）Ｆａｂ
’画分の調製 実施例１（ｉ）で得られた各精製モノクローナル抗体（
ＩｇＧ）を０．１Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ４，２）に溶解し、その溶液を以下述べるよ
うにしてペプシンで消化した。すなわち、前記画分中の
ＩｇＧに対して２％（Ｗ／Ｗ）のペプシンを加え、３７
℃、２４時間消化した。さらにその消化物に、２Ｍ）リ
ス溶液を加えてｐＨを７．０に調整することによって反
応を停止せしめ、０．１Ｍリン酸緩衝液（１）ＩＩ　’
７．ｏ）で平衡化したウルトロゲルＡｃ１４４カラムを
用いたゲルろ過により、Ｆ（ａｂ’）２画分を分取した
。

次に、このＦ（ａｂ″）２画分を５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸酢酸ＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）中で透析し、最終濃度１０ｍＭとなるようにア
ミノエタンチオール（ＭＥＡ）を加え３７℃で１．５時
間還元した後、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐｉｆ　６．０）で平衡化した、ウルトロゲルＡ
ｃＡ　４４カラムを用いてゲルろ過し、Ｆａｂ’画分を
分取した。

（２）マレイミド標識西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）画分の調製 上記（１）の操作とは別に、以下に述べるようにしてＰ
ＯＤにマレイミドを標識した。すなわち、ＰＯＤを１０
ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ’７
．ｏ）に溶解し、そのＰＯＤに対して、２５倍モル量の
Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミ
ド（ＥＭＣ５）をジメチルホルムアミド溶液として加え
、３０℃、３００分間反応せた。これを０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファデックスＧ−
５０カラムでゲルろ過し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を
分取した。

（３）　Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合複合体画分製調製前記）
で調製した画分中のＦａｂ’に対して、上記（２）で得
られた両分中のマレイミド２９− ３０− 標識ＰＯＤどして等モルになるように両画分を混合し、
さらにＦａｂ’およびマレイミド標識ＰＯＤの最終濃度
が１００μＭとなるように、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で希釈した。この混合
液を４℃、２０時間反応後、ｔａｂ’の］０倍モル量の
Ｎ−エチルマレイミドで未反応のチオール基をブロック
した。

これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ　４４カラムを用いてゲルろ過し
、Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体画分を分取後、０．１％ＢＳ
Ａおよびｏ、ｏｏｉ％クロルヘキシジンを添加し、４℃
で保存した。

（ｂ）１段階サンドイツチ法によるヒト血中トロンボモ
ジュリンの定量 ヒトトロンボモジュリンの生理活性に影響を及ぼす抗ヒ
ｌ−トロンボモジュリンモノクローナル抗体のうち、プ
ロティンＣ活性化阻害作用を持つモノクローナル抗体と
、トロンビン結合阻害作用を持つモノクローナル抗体と
の絹み合わせを用いて行った。

１ すなわち、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　、　４．２
０９−３２７（１９８３）に記載の石川らの方法に従っ
て、実施例１（ｉ）で得られた精製モノクロナール抗体
を、それぞれ０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐｌ＋　７．５）に溶解して、その濃度を
０．１ｍｇ／ｍｌに調整した。この抗体溶液に、固相担
体としてのポリスチレンボール（径６．５ｍｍ、Ｐｅｒ
ｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ）を浸漬し、
ポリスチレンボールに抗体をコートした。次に、抗体浸
漬液を回収し、ポリスチレンボールを０．１％ＢＳＡ、
０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１％クロルヘキ
シジン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（１）１１７．０）で
洗浄し、４℃にて保存した。

という）によるアフィニティークロマトグラフィーを用
いて、ヒト胎盤から精製したトロンボモジュリンを用い
た。すなわち、実施例１（ｉ）で得られた抗ヒトトロン
ボモジュリンモノクロ２− 一ナル抗体（クローン２ｌ−４Ｇ３）を、ＣＮＢｒ活性
化セファロース４Ｂ（ファルマシア）　ｂｎＬ当たり、
５ｍｇの割合で固定化した。これをカラム（ｌ　Ｘ　５
ｃｍ）に充填し、抗ＴＭ抗体カラムを得た。一方、実施
例１（ａ）の方法にしたがって、界面活性剤を用いてヒ
トトロンボモジュリンを抽出および可溶化した後、この
溶液を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）　（ＴＢＳ）で平衡化した抗ＴＭ抗体カラムにかけ、
０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有ＴＢＳで、非結合タンパ
ク質を充分に洗浄除去後、カラムに結合したヒトトロン
ボモジュリンを８Ｍ尿素溶液で溶出した。この溶出液を
集め、０．０１％ルブロール含有ＴＢＳで平衡化したウ
ルトロゲルＡｃＡ　４４カラム（１，５Ｘ　１００ｃｍ
　；　１６８ｍ１）を用いてゲルろ過し、Ａ２．。にお
ける吸光度が高いフラクションを分取し、濃縮してヒト
トロンボモジュリンを精製した。この精製ヒトトロンボ
モジュリンは、実施例１（ａ）に記したＳＤＳ　−ＰＡ
ＧＥで調べたところ、実施例１（ａ）で得られた精製ヒ
トトロンボモジュリンと同様の泳動パターンを示した。

この精製ヒトトロンボモジュリンを、０．１Ｍ塩化ナト
リウムおよび１％ＢＳＡ含有１０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
ｌ！　７．０）　　を用いて、６４ｎｇ／ｍｌの溶液を
調製し、これを段階希釈した溶液を各々５０μｌずつと
り、標準試料とした。

一方、検体試料としては、健常人血清および膠原病患者
血清を各々５０μｌ用いた。

上記の試料をそれぞれ試験管にとり、（ａ）で調製した
Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体画分（３００〜１１０００ｎ／
ｍｌ）、１％ＵＳＡ、　０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび
１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｔ（７
，０）　３００μｍに溶解した。次にこれらの各々の試
験管に、前記にて調製したモノクローナル抗体結合ポリ
スチレンボールを１個ずつ添加して、室温で１時間静置
した後、５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）にて洗浄した。次に、０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，５）に溶解したＰＯＤ基質、すなわち、
０．０２５％テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）を３
００μｍずつ加え、さらに０．００７５％−羽 ３４− 過酸化水素水を３００μｍずっ加え、室温で３０分間静
置した後、１．７５Ｎ硫酸８００μｌを添加することに
より反応を停止させた。高滓マイクロフロー紫外可視分
光光度計（ＩＩＶ−７３０）で反応混合液の波長４５０
ｎｍの吸光度を測定し、標準試料より作成した検量線よ
り、検体試料の吸光度に相当するヒトトロンボモジュリ
ン濃度（以下、ＴＭｍＪ灸尤」４す−）を読み取った。

ヒトトロンボモジュリンの生理活性に影響をおよぼす抗
ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体であるＩｇ
Ｇ（クローン２ｌ−３１１１）、ＩｇＧ（クローン２ｌ
−４Ｇ３）、ＩｇＧ（クローン２ｌ−６Ｆ７）およびＩ
ｇＧ（クローン２ｌ−９Ｈ１２）は、いずれも本実施例
における固相担体として用いることができた。ただし、
ＩｇＧ（クローン２ｌ−３１１１）を同相用抗体とし、
ＩｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）を標識用抗体として用
いた場合、およびＩｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）を同
相用抗体とし、ＩｇＧ（クローン２ｌ−３１１１）を標
識用抗体として用いた場合は、測定が不可能であった。

ＩｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）あ を同相用抗体とし、ＩｇＧ（クローン２ｌ−９１１１２
）を標識用抗体として用いて得られた標準曲線を第１図
に示す。第１図に示すように、ヒトトロンボモジュリン
標準試料の濃度の上昇に伴って、Ａ、６゜は増加し、定
量感度は、試料１ｍｌ当たりｌｎｇであった。

（Ｃ）膠原病患者における血中トロンボモジュリンの定
量 上記（ｂ）において示した酵素免疫測定法により、健常
人および５種類の膠原病患者における血中トロンボモジ
ュリンを定量した。すなわち、検体試料として健常人血
清（７９検体）および膠原病愚老血清（５４検体）を各
々５０μｌずつ用いて、ＴＭ濃度を測定した。その結果
、第４表の１〜３にみられるように、健常人血清中のＴ
Ｍ濃度（平均±Ｓ、Ｄ、）は、２．９６±０．７１ｎｇ
／ｍｌであった。

一方、膠原病患者では、ＳＬＥ患者血清２６検体中、混
合性結合織前患者血清５検体中、慢性関節リウマチ患者
血清９検体中、進行性全身性硬化症患者血清５検体中お
よびシエグレン症候部− 群患者血清９検体中のＴＭ濃度（平均±Ｓ、Ｄ、）はそ
れぞれ６．９８±４．５５１ｇ／ｍｌ、５．９８±３．
５３ｎｇ／ｍｌ、７．８６±４．９５ｎｇ／ｍｌ、６６
０４±４．６３Ｂ／ｍｌ、７．５７±６．１４ｎｇ／ｍ
ｌであった。これらの値はいずれも、健常人血清中のＴ
Ｍ濃度（２，９６±０．７１ｎｇ／ｍｌ）に比し有意に
高かった。

欧に、膠原病患者の病態経過におけるＴＭ濃度の変動を
上記（ｂ）において示した酵素免疫測定法を用いて観察
した結果の一例を第２図に示す。なお、第２図に示され
た患者は、ＳＬＥ患者であり、従来よりこの病態の経過
観察に用いられている、免疫異常を代表する血清中の補
体価（補体第３成分のペプチド断片：Ｃ，ｃおよび補体
第４成分：０４）の測定を同時に行った。第２図中の（
○）はＴＭ濃度を、（△）はＣ，ｃ量を、また、（ロ）
は、Ｃ４量を示す。図２にみられるように、患者血清中
のＴＭｉ度と患者血清中の補体価を示すＣ，ｃ量やＣ４
量との間には、逆相関性が認められた。ここに示された
ように、膠原病患者の治療における病態観察においては
、従来より用いられてきた免疫異常を示すパラメーター
の他に、血中トロンボモジュリンを定量することによっ
て、病変の場である血管の障害の程度を知ることができ
、治療効果の向」二をもたらすことが期待される。

（ｄ）腎臓病患者における血中ｌ・ロンボモジュリンの
定量 前記（１））において示した酵素免疫測定法を用いて、
４種類の腎臓病患者における血中トロンボモジュリンを
定量した。すなわち、検体試料として腎臓病患者血清（
３４検体）を各々５０μｌずつ用いてＴＭ濃度を測定し
、上記（Ｃ）で得られた健常人血清中のＴＭ濃度と比較
した。その結果、第４表の１および第５表に示すように
、健常人血清中のＴＭＩ度２．９６±０．７１ｎｇ／ｍ
ｌ　（平均±Ｓ、Ｄ、）に比し、腎臓病患者においては
、糖尿病性腎症患者血清１０検体中、膜性腎症患者血清
１１検体中、ネフローゼ症候群患者血清１０検体中およ
びアミロイド−シス患者血清３検体中のＴＭ濃度（平均
±Ｓ、Ｄ、）は、それぞれ７．０６３７− −羽− ±７．１９ｎｇ／ｍｌ、６．３７±２．３９Ｂ／ｍｌ、
　９．２４±５．３９ｎｇ／ｍｌ、８．８３±１．１７
ｎｇ／ｍｌ　と、有意に高かった。

クローン ２１−３１１１ １−４Ｇ３ １−５Ｄ２ １−６Ｆ７ １−７Ｅ３ ２１−９１１１２ 第１表 モノクローナル ＭＦＴＭ　−５ ＭＦＴＭ−４ ＭＦＴＭ−Ｉ ＭＦＴＭ−３ ＭＦＴＭ−２ ＭＦＴＭ−６ サブクラス ｇＧ　１／に ｇＧ２ａ／に ｇＧ　１／に ｇＧ　ｌ／に ｇＧ　１／に ｇＧ　１／に 第 表 クローン番号 ２１−３１１１ １−４Ｇ３ １−５Ｄ２ ２１−６Ｆ７ ２１−７Ｅ３ ２１−９１１１２ 親和定数（Ｋｄ） ９．６　　Ｘ　１０” ３．６　Ｘ　１０” １．７　Ｘ　１０−’ １．２　Ｘ　１０−’ ２．７　Ｘ　１０−１０ ３．５　　Ｘ　１０−” ４０− 第 表 第４表の１ クローン プロティンＣ トロンビン ２１−３１１１ ２１−４Ｇ３ ２１−５Ｄ２ １−６Ｆ７ １−７Ｅ３ ２１−９１１１２ −招一 第４表の３ −４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３　（ｂ　）で１１）られた標準曲線
、すなわち、ＴｇＧ（クローン２ｌ−４Ｇ３）を固相用
抗体とし、ＩｇＧ（クローン２ｌ−９１１１２）を標識
用抗体として用いた１段階サンドイツチ法における、ヒ
トトロンボモジュリンの標準曲線を示す図であり、第２
図は、実施例３（ｃ）で得られた膠原病患者の病態経過
における血清中のＴ　Ｍ　ｆ１５度および補体価の変動
の一例を示す図である。 以上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
   るトロンボモジュリンの作用を阻害する作用を持つ抗ヒ
   トトロンボモジュリンモノクローナル抗体。
2. （２）上記のモノクローナル抗体が、トロンビンのトロ
   ンボモジユリンに対する結合を阻害する作用を持つもの
   である請求項（１）に記載の抗ヒトトロンボモジュリン
   モノクロ ーナル抗体。
3. （３）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
   るトロンボモジュリンの作用を阻害する作用を持つ抗ヒ
   トトロンボモジュリンモノクローナル抗体を用いて、酵
   素免疫測定を行うことにより、血中に存在するヒトトロ
   ンボモジユリンおよびその分解産物のうち、前記のモノ
   クローナル抗体と結合する物質を定量し、その定量値を
   、健常人血中の定量値と比較することに基づいて、 血管内皮障害を診断する方法。
4. （４）前記のモノクローナル抗体として、二種類のモノ
   クローナル抗体を使用し、その一種類が、トロンビンの
   トロンボモジユリンに対する結合を阻害する作用を持つ
   抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体であり、
   他の一種類が、トロンビンのトロンボモジュリンに対す
   る結合を阻害する作用は持たないが、トロンビンによる
   プロテインＣ活性化を促進するトロンボモジュリンの作
   用を阻害する作用を持つ抗ヒトトロンボモジュリンモノ
   クローナル抗体である請求項（３）に記載の血管内皮障
   害を診断する方法。