JPH03215747A - エラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法および測定用試薬 - Google Patents
エラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法および測定用試薬Info
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- JPH03215747A JPH03215747A JP2009524A JP952490A JPH03215747A JP H03215747 A JPH03215747 A JP H03215747A JP 2009524 A JP2009524 A JP 2009524A JP 952490 A JP952490 A JP 952490A JP H03215747 A JPH03215747 A JP H03215747A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
＾．産業上の利用分野
本発明は膵臓疾患の診断に有用な、体液中に存在する膵
外分泌蛋白分解酵素エラスターゼ１の酵素免疫学的測定
方法及び測定用試薬に関するものである。
外分泌蛋白分解酵素エラスターゼ１の酵素免疫学的測定
方法及び測定用試薬に関するものである。
Ｂ従来の技術
膵臓から血中に逸蜆する酵素を測定し、膵疾患の診断に
利用する試みは古くからあり、血清及び尿中アミラーゼ
，血清リパーゼなどの測定は診断的意義が高いと言われ
ている。しかしながら、これらの酵素は膵臓以外の臓器
からも産生され、膵疾徹以外でも翼常を示すため膵疾患
のスクリーニング検査法として特異性に欠けるため他の
生化学的診断法の開発が望まれていた。
利用する試みは古くからあり、血清及び尿中アミラーゼ
，血清リパーゼなどの測定は診断的意義が高いと言われ
ている。しかしながら、これらの酵素は膵臓以外の臓器
からも産生され、膵疾徹以外でも翼常を示すため膵疾患
のスクリーニング検査法として特異性に欠けるため他の
生化学的診断法の開発が望まれていた。
エラスターゼは結合組織エラスチンを分解しうる唯一の
蛋白分解酵素であり、物理化学的，酵素化学的，また免
疫学的に異なった２種類（エラスターゼ】，２）が存在
している（大山俊郎：医学のあゆみ１０３：６９７（１
９７７＞）。
蛋白分解酵素であり、物理化学的，酵素化学的，また免
疫学的に異なった２種類（エラスターゼ】，２）が存在
している（大山俊郎：医学のあゆみ１０３：６９７（１
９７７＞）。
エラスターゼｌの測定はエラスチンや合成基質を用いた
活性測定法が試みられた。しかしながら、血中での測定
は多量に存在するプロテアーゼインヒビターの活性阻害
をうけるため困難とされていた。このような理由からエ
ラスタゼ１を免疫学的方法により測定してみようという
試みがなされ、放射性免疫学的測定法（ＲｆＡ法）が大
山らにより開発された（特公昭５９−２５１１１３）。
活性測定法が試みられた。しかしながら、血中での測定
は多量に存在するプロテアーゼインヒビターの活性阻害
をうけるため困難とされていた。このような理由からエ
ラスタゼ１を免疫学的方法により測定してみようという
試みがなされ、放射性免疫学的測定法（ＲｆＡ法）が大
山らにより開発された（特公昭５９−２５１１１３）。
血中のエラスターゼ１はプロテアーゼインヒビターの１
つであるα２−マクログロプリンと結合した褒合体の状
態では免疫学的活性を有していないが、α１−アンチト
リプンンと結合した複合体の状態では免疫学的活性を有
している。標識抗原を用いる免疫学的方法においては血
中のプロテアーゼインヒビターと結合するため標職抗原
の一部または殆んどの抗原性が消失するため血中エラス
ターゼｌの正確な測定は困難であった。しかしながらＲ
ＩＡ法においては標識抗原を合成インヒピターであるＤ
ＦＰ（ジイソブロビルフルオロフォスフェート）で処理
し標識抗原が血中のプロテアーゼインヒビターと結合で
きないようにした。ＤＦＰ処理によりエラスターゼｌの
抗原活性には何ら変化を与えないため免疫学的測定法が
可能としている。
つであるα２−マクログロプリンと結合した褒合体の状
態では免疫学的活性を有していないが、α１−アンチト
リプンンと結合した複合体の状態では免疫学的活性を有
している。標識抗原を用いる免疫学的方法においては血
中のプロテアーゼインヒビターと結合するため標職抗原
の一部または殆んどの抗原性が消失するため血中エラス
ターゼｌの正確な測定は困難であった。しかしながらＲ
ＩＡ法においては標識抗原を合成インヒピターであるＤ
ＦＰ（ジイソブロビルフルオロフォスフェート）で処理
し標識抗原が血中のプロテアーゼインヒビターと結合で
きないようにした。ＤＦＰ処理によりエラスターゼｌの
抗原活性には何ら変化を与えないため免疫学的測定法が
可能としている。
しかしながらポリクローナル抗体を用いたＥＩＡ系にお
いて、ＤＦＰ処理されたエラスターゼｌは本来のエラス
ターゼｌと抗原性が異なるため、エラスターゼｌの正確
な値を示さないことが判明した。さらに、ＲＩＡ法にお
いては放射性物質を使用しているため安全性の面で問題
があること及びポリクローナル抗体を使用しているため
抗体の製造口１トにより結合性に差が生ずるため、製造
管理の面で問題があった。そのために別の測定法の開発
が望まれてきた。その後、ＲＩＡの欠点の中で後者の問
題を解決すべくポリクローナル抗体をモノクローナル抗
体に変更したＲＩＡ法の報告があるもののく特開昭６３
−７３１５２） Ｒ Ｉ Ａ法の根本的欠点（放射性
物賞の使用）を解消するものではない。
いて、ＤＦＰ処理されたエラスターゼｌは本来のエラス
ターゼｌと抗原性が異なるため、エラスターゼｌの正確
な値を示さないことが判明した。さらに、ＲＩＡ法にお
いては放射性物質を使用しているため安全性の面で問題
があること及びポリクローナル抗体を使用しているため
抗体の製造口１トにより結合性に差が生ずるため、製造
管理の面で問題があった。そのために別の測定法の開発
が望まれてきた。その後、ＲＩＡの欠点の中で後者の問
題を解決すべくポリクローナル抗体をモノクローナル抗
体に変更したＲＩＡ法の報告があるもののく特開昭６３
−７３１５２） Ｒ Ｉ Ａ法の根本的欠点（放射性
物賞の使用）を解消するものではない。
Ｃ．発明が解決しようとする問題点
前述した様に、従来のエラスターゼｌの測定方法は放射
性物質を使用し、安全性の面で問題を有している。また
、製造ロノトによる結合性の差が生じ、安定した試薬を
供給する為の製造管理の面でも問題を有している。
性物質を使用し、安全性の面で問題を有している。また
、製造ロノトによる結合性の差が生じ、安定した試薬を
供給する為の製造管理の面でも問題を有している。
本発明の目的は放射性物質を使用しないで一般の臨床検
査室でも特殊な装置を使わないで容易に行える測定方法
及び製造ロフトによる結合性の差が生じない安定した測
定試薬を提供することにある。更に標準品としてＤＦＰ
又はＰＭＳＦ（７エニルメチルスルフォニルフルオライ
ド）化したエラスータゼｌの代わりにエラスターゼｌと
α１−アンチトリプシンとの複合体又はプロエラスター
ゼｌとα１−アンチトリプシンとの複合体を使用し、血
中の濃度を正確に反映できるようにすることにある。
査室でも特殊な装置を使わないで容易に行える測定方法
及び製造ロフトによる結合性の差が生じない安定した測
定試薬を提供することにある。更に標準品としてＤＦＰ
又はＰＭＳＦ（７エニルメチルスルフォニルフルオライ
ド）化したエラスータゼｌの代わりにエラスターゼｌと
α１−アンチトリプシンとの複合体又はプロエラスター
ゼｌとα１−アンチトリプシンとの複合体を使用し、血
中の濃度を正確に反映できるようにすることにある。
Ｄ．問題を解決するための手段と作用
本発見はエラスターゼ１とα，−アンチトリブシンとの
複合体あるいはプロエラスターセｌとα１−アンチトリ
ブンンとの複合体に対する２種のモノクローナル抗体を
用いる体液中のエラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法
及び測定用試薬を提供するものである。本発明者らはエ
ラスターゼ１とα１−アンチトリブンンとの複合体およ
びプロエラスターゼｌとα１−アンチトリブ／ンとの複
合体を認クする２種のモノクローナル抗体を得、感度面
に優れ精度の高い体液中のエラスターゼｌの測定法を確
立すると同時に抗体の安定な供給を確保することに成功
した。
複合体あるいはプロエラスターセｌとα１−アンチトリ
ブンンとの複合体に対する２種のモノクローナル抗体を
用いる体液中のエラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法
及び測定用試薬を提供するものである。本発明者らはエ
ラスターゼ１とα１−アンチトリブンンとの複合体およ
びプロエラスターゼｌとα１−アンチトリブ／ンとの複
合体を認クする２種のモノクローナル抗体を得、感度面
に優れ精度の高い体液中のエラスターゼｌの測定法を確
立すると同時に抗体の安定な供給を確保することに成功
した。
本発明によるエラスターゼ１の測定において、ＤＦＰ処
理またはＰＭＳＦ処理エラスターゼ１を用いた場合はほ
とんど免疫活性を示さないが、エラスターゼ１とα１−
アンチトリブ７ンとの複合体またはプロエラスターゼｌ
とα１−アンチトリブンンとの複合体を用いた場合は両
複合体は同程度の免疫反応性を示した。このことはＤＦ
Ｐ処理・ＰＭＳ Ｆ処理によりエラスターゼ１の抗原性
が変化していることを示している。
理またはＰＭＳＦ処理エラスターゼ１を用いた場合はほ
とんど免疫活性を示さないが、エラスターゼ１とα１−
アンチトリブ７ンとの複合体またはプロエラスターゼｌ
とα１−アンチトリブンンとの複合体を用いた場合は両
複合体は同程度の免疫反応性を示した。このことはＤＦ
Ｐ処理・ＰＭＳ Ｆ処理によりエラスターゼ１の抗原性
が変化していることを示している。
他方、血中におけるエラスターゼｌの存在様式はエラス
ターゼｌとα２−マクログロプリンまたはα１−アンチ
トリブンンとの複合体といわれているが、膵液中にはプ
ロエラスターゼｌの存在することも確認された。またポ
リクローナル抗体を用いたＲｒＡ法では、標準エラスタ
ーゼｌとして使用しているＤＦＰ処理またはＰＭＳＦ処
理エラスターゼ１に比較して、エラスターゼ１とα１−
アンチトリブシンとの複合体もしくはプロエラスターゼ
ｌとα１−アンチトリプンンとの複合体との反応性が低
《、血清検体についても同様に低い反応性であった。従
って標準エラスターゼｌとしては抗原の免疫活性が変化
するＤＦＰ処理またはＰＭＳ Ｆ処理エラスターゼｌを
使用することは問題があると考えられ、本発明において
は血中に実在するエラスタゼｌとα区−アンチトリプシ
ンとの複合体または本発明者らにより実在が確認された
プロエラスターゼｌとα１−アンチトリプンンとの複合
体を使用することの妥当性を提唱するものである。
ターゼｌとα２−マクログロプリンまたはα１−アンチ
トリブンンとの複合体といわれているが、膵液中にはプ
ロエラスターゼｌの存在することも確認された。またポ
リクローナル抗体を用いたＲｒＡ法では、標準エラスタ
ーゼｌとして使用しているＤＦＰ処理またはＰＭＳＦ処
理エラスターゼ１に比較して、エラスターゼ１とα１−
アンチトリブシンとの複合体もしくはプロエラスターゼ
ｌとα１−アンチトリプンンとの複合体との反応性が低
《、血清検体についても同様に低い反応性であった。従
って標準エラスターゼｌとしては抗原の免疫活性が変化
するＤＦＰ処理またはＰＭＳ Ｆ処理エラスターゼｌを
使用することは問題があると考えられ、本発明において
は血中に実在するエラスタゼｌとα区−アンチトリプシ
ンとの複合体または本発明者らにより実在が確認された
プロエラスターゼｌとα１−アンチトリプンンとの複合
体を使用することの妥当性を提唱するものである。
本発明によるエラスターゼｌの測定は、エラスターゼｌ
に対する２種の異なった抗原決定基をＵ２議するモノク
ローナル抗体を用い、一方は固相に結合し、他方は酵素
を標識し、被検々体中のエラスターゼｌを固相に結合さ
せた後、固相上の標識酵素の活性を測定し、別に被検々
体の代わりに濃度既知の標準エラスターゼｌについて同
様に操作して作製した標準曲線により被検々体中のエラ
スターゼ１量を求めるものである。
に対する２種の異なった抗原決定基をＵ２議するモノク
ローナル抗体を用い、一方は固相に結合し、他方は酵素
を標識し、被検々体中のエラスターゼｌを固相に結合さ
せた後、固相上の標識酵素の活性を測定し、別に被検々
体の代わりに濃度既知の標準エラスターゼｌについて同
様に操作して作製した標準曲線により被検々体中のエラ
スターゼ１量を求めるものである。
エラスターゼｌに対するモノクローナル抗体は噛乳動物
，例えばマウスをエラスターゼ１で免疫し、該マウスよ
り摘出した抗体産生細胞．例えば肺臓細胞に、骨髄腫細
胞を融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）よ
り目的とするモノクローナル抗体を産生ずる細胞をクロ
ーニングするＫｏｈｌｅｒ−Ｍｌｌｓｔｅｉｎの細胞融
合法により得ることができる。
，例えばマウスをエラスターゼ１で免疫し、該マウスよ
り摘出した抗体産生細胞．例えば肺臓細胞に、骨髄腫細
胞を融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）よ
り目的とするモノクローナル抗体を産生ずる細胞をクロ
ーニングするＫｏｈｌｅｒ−Ｍｌｌｓｔｅｉｎの細胞融
合法により得ることができる。
標識抗体の標識酵素としては、ベルオキシダーゼ，アル
カリ性ホスファターゼ．β−ガラクトンダーゼなど通常
標識酵素として用いられるものを使用することができる
。これら酵素の抗体への標識化は公知の方法、例えばグ
ルタルアルデヒド法，過ヨウ素酸酸化法などにより行う
ことができる。
カリ性ホスファターゼ．β−ガラクトンダーゼなど通常
標識酵素として用いられるものを使用することができる
。これら酵素の抗体への標識化は公知の方法、例えばグ
ルタルアルデヒド法，過ヨウ素酸酸化法などにより行う
ことができる。
固相化抗エラスターゼ１モノクローナル抗体に用いる固
相担体は公知の担体、例えばポリスチレンビーズなどを
使用することができる。
相担体は公知の担体、例えばポリスチレンビーズなどを
使用することができる。
本発明に用いる測定用試薬キットは、
ｌ》エラスターゼ１とα１−アンチトリブシンとの複合
体またはプロエラスターゼｌとα１−アンチトリブシン
との複合体より成る標準エラスターゼ１ ２》固相化抗エラスターゼｌモノクローナル抗体３）酵
素標識化抗エラスターゼ１モノクローナル抗体 を含有してなる。固相化あるいは酵素標識化抗エラスタ
ーゼ１モノクローナル抗体は各々異ナった抗原決定基を
認識するものである。
体またはプロエラスターゼｌとα１−アンチトリブシン
との複合体より成る標準エラスターゼ１ ２》固相化抗エラスターゼｌモノクローナル抗体３）酵
素標識化抗エラスターゼ１モノクローナル抗体 を含有してなる。固相化あるいは酵素標識化抗エラスタ
ーゼ１モノクローナル抗体は各々異ナった抗原決定基を
認識するものである。
Ｅ．実施例
（＋） 抗エラスターゼｌモノクローナル抗体の作製
精製エラスターゼｌｆＩ液ｏ．ｔｍｌ （エラスターゼ
１；７０μｇ含有）に７口インド・フンブリート・アジ
二バントＯ，ｌｍｌを加え、エマルジ１ンを調製し、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に３週間間隔で投与した。２
〜３ケ月後エラスターゼ１溶液０．１ｍｌ （エラスタ
ーゼｌ；７０μｇ含有）を尾静脈より靜注した。３ＥＩ
後に肺臓を摘出し、牌細胞３Ｘ１０’個とマウスミエロ
ーマ細胞（×６３＾ｇＬ ６． ５． ３株）３Ｘ１０
’個をＰ Ｅ Ｇ４０００ｉ ５ ０％存在下で細胞融
合を行った。９６穴培養皿に各０．ｌｍｌずつ分注し、
ＨＡＴ培地で２４間培養した後、培養土清中の抗体を検
定した。抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法によりク
ローニングを行い抗体産生株を得た。得られたハイブリ
ドーマ１ｘｌｏ’＋１１を予め２Ｊ，１０．１４−テト
ラメチルベンタデカン１．０ｍｌを投与したＢ Ａ Ｌ
Ｂ／Ｃマウスの腹腔に投与し、１４日後に腹水５ｍｌ
／匹を採取シ、抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を
得た。上記の如く得られた２橿の抗体はヒトエスターゼ
ｌとα１−アンチトリプシンとの複合体またはプロエラ
スターゼ１とα■−アンチトリブンンとの複合体と反応
し、かつ酵素免疫学的測定法に適応可能であった。
１；７０μｇ含有）に７口インド・フンブリート・アジ
二バントＯ，ｌｍｌを加え、エマルジ１ンを調製し、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に３週間間隔で投与した。２
〜３ケ月後エラスターゼ１溶液０．１ｍｌ （エラスタ
ーゼｌ；７０μｇ含有）を尾静脈より靜注した。３ＥＩ
後に肺臓を摘出し、牌細胞３Ｘ１０’個とマウスミエロ
ーマ細胞（×６３＾ｇＬ ６． ５． ３株）３Ｘ１０
’個をＰ Ｅ Ｇ４０００ｉ ５ ０％存在下で細胞融
合を行った。９６穴培養皿に各０．ｌｍｌずつ分注し、
ＨＡＴ培地で２４間培養した後、培養土清中の抗体を検
定した。抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法によりク
ローニングを行い抗体産生株を得た。得られたハイブリ
ドーマ１ｘｌｏ’＋１１を予め２Ｊ，１０．１４−テト
ラメチルベンタデカン１．０ｍｌを投与したＢ Ａ Ｌ
Ｂ／Ｃマウスの腹腔に投与し、１４日後に腹水５ｍｌ
／匹を採取シ、抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を
得た。上記の如く得られた２橿の抗体はヒトエスターゼ
ｌとα１−アンチトリプシンとの複合体またはプロエラ
スターゼ１とα■−アンチトリブンンとの複合体と反応
し、かつ酵素免疫学的測定法に適応可能であった。
（２）抗エラスターゼｌ抗体のべルオヰンダーゼによる
標識 ベルオキンダーゼ４ ０ｍｇを１，２５％グルタールア
ルデヒド溶液に溶解し、セファデ，クスＧ−２５による
ゲルろ過を行った。ベルオキンダーゼ画分を分取し、抗
エラスターゼ１抗体溶液（抗体２０ｍｇ）およびＩＭ炭
酸緩衝液（ＰＨ９．５）０．４ｍｌを加え一晩放置した
後、０．２Ｍリジン溶液０．４ｍｌを加えて一晩放置後
、セフアクリルＳ−３００ＨＲ力ラムにてゲルろ過を行
いベルオキシダーゼ標Ｅ［．エラスターゼ１抗体液を得
た。
標識 ベルオキンダーゼ４ ０ｍｇを１，２５％グルタールア
ルデヒド溶液に溶解し、セファデ，クスＧ−２５による
ゲルろ過を行った。ベルオキンダーゼ画分を分取し、抗
エラスターゼ１抗体溶液（抗体２０ｍｇ）およびＩＭ炭
酸緩衝液（ＰＨ９．５）０．４ｍｌを加え一晩放置した
後、０．２Ｍリジン溶液０．４ｍｌを加えて一晩放置後
、セフアクリルＳ−３００ＨＲ力ラムにてゲルろ過を行
いベルオキシダーゼ標Ｅ［．エラスターゼ１抗体液を得
た。
（３）固相化抗エラスターゼｌ抗体の作製ポリスチレン
ビーズをスキャノト２０Ｘ−ＰＦで洗浄した後、精製水
を加えて洗浄し抗エラスターゼｌ抗体溶液（抗体１００
ｍｇ）を加えて一昼夜４°Ｃで放置した後、ポリスチレ
ンビーズを０．１％牛血清アルブミンを含有するリン酸
緩衝液（ＰＨ７．０）で洗浄し、固相化抗エラスターゼ
１抗体を得た。
ビーズをスキャノト２０Ｘ−ＰＦで洗浄した後、精製水
を加えて洗浄し抗エラスターゼｌ抗体溶液（抗体１００
ｍｇ）を加えて一昼夜４°Ｃで放置した後、ポリスチレ
ンビーズを０．１％牛血清アルブミンを含有するリン酸
緩衝液（ＰＨ７．０）で洗浄し、固相化抗エラスターゼ
１抗体を得た。
（４）プロエラスターゼｌの精製
活性化していないヒト膵液２０ｍｌを０．１Ｍトリスー
ＭＣＩ緩衝液（ＰＨ８．０）で平衡化した抗ヒトエラス
ターゼ１抗体結合セファロース４Ｂに展開し、素通り部
分を除去後、０．２ＭグリンンーＭＣＩ緩衝液（０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有，ＰＨ２．８）にて溶出しプロエ
ラスターゼｌ画分を得た。この画分をＯ．１Ｍ酢酸緩衝
ｌ （ＰＨ５．５）で平衡化したセフアクリルＳ−２０
０ＨＨに展開し精製プロエラスタ−ゼｌ ；ｏ．２ｍｇ
を得た。本精製品はサクシニルーアラニルーアラニルー
アラニルーＰ−二トロアニリドを基質として活性測定し
た結果、活性は認められなかったがトリブンン（ウシ由
来）の添加により初めて活性の発現が認められた。又、
本精製品はＳＤＳＩ！気泳動的に均一であった。
ＭＣＩ緩衝液（ＰＨ８．０）で平衡化した抗ヒトエラス
ターゼ１抗体結合セファロース４Ｂに展開し、素通り部
分を除去後、０．２ＭグリンンーＭＣＩ緩衝液（０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有，ＰＨ２．８）にて溶出しプロエ
ラスターゼｌ画分を得た。この画分をＯ．１Ｍ酢酸緩衝
ｌ （ＰＨ５．５）で平衡化したセフアクリルＳ−２０
０ＨＨに展開し精製プロエラスタ−ゼｌ ；ｏ．２ｍｇ
を得た。本精製品はサクシニルーアラニルーアラニルー
アラニルーＰ−二トロアニリドを基質として活性測定し
た結果、活性は認められなかったがトリブンン（ウシ由
来）の添加により初めて活性の発現が認められた。又、
本精製品はＳＤＳＩ！気泳動的に均一であった。
（５）α，−アンチトリプシンとプロエラスターゼ１と
の複合体の作製 α１−アンチトリプシン０．５ｍｌ （３．１６ｍ
ｇ ／ ｍ １ ）とプロエラスターゼ１；２０μ＋（
２ ０ ０ μｇ ／ ｍ Ｉ ）を混和し３７°Ｃ
で３時間静置後、４°Ｃで一晩放置することによりα蔦
アンチトリブシンとプロエラスターゼ１との複合体を作
製することができる。本調製品をセフアクリル−ＳＩＯ
ＯＨＲカラムに展開した結果、プロエラスターゼ１の９
５％以上がα８アンチトリプンンと結合していることが
明らかとなった。
の複合体の作製 α１−アンチトリプシン０．５ｍｌ （３．１６ｍ
ｇ ／ ｍ １ ）とプロエラスターゼ１；２０μ＋（
２ ０ ０ μｇ ／ ｍ Ｉ ）を混和し３７°Ｃ
で３時間静置後、４°Ｃで一晩放置することによりα蔦
アンチトリブシンとプロエラスターゼ１との複合体を作
製することができる。本調製品をセフアクリル−ＳＩＯ
ＯＨＲカラムに展開した結果、プロエラスターゼ１の９
５％以上がα８アンチトリプンンと結合していることが
明らかとなった。
（６）酵素免疫学的測定法による血中エラスターゼｌの
測定法（標準品としてエラスターゼ１とα１−アンチト
リブシンの複合体を用いる系）樟準エラスターゼｌ （
エラスターゼｌとαアンチトリプンンの複合体）または
被検血清５０μ１にベルオキ／ダーゼ標準抗エラスター
ゼ１抗体液０．３ｍｌ及びポリスチレンピーズ（固相化
抗エラスターゼｌ抗体）１個を加え、３７°Ｃで３０分
間静置した後、ポリスチレンビーズを０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含有する］ＯｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０
）２ｍｌで２回洗浄した後、ポリスチレンビーズを別の
試験管に移し３％の０−フェニレンジアミン及び０．０
２％過酸化水素を含有するクエン酸緩衝液０．５ｍｌを
加え室温で１５分間静置した後、１．６Ｎの硫酸２ｍｌ
を加えて反応を停止し波長４９２ｎｍにおける吸光度を
測定した。標準エラスターゼｌ（エラスターゼｌとα，
−アンチトリブンンの複合体）で作製した標準曲線より
被検血清中のエラスターゼ１置を算出した。
測定法（標準品としてエラスターゼ１とα１−アンチト
リブシンの複合体を用いる系）樟準エラスターゼｌ （
エラスターゼｌとαアンチトリプンンの複合体）または
被検血清５０μ１にベルオキ／ダーゼ標準抗エラスター
ゼ１抗体液０．３ｍｌ及びポリスチレンピーズ（固相化
抗エラスターゼｌ抗体）１個を加え、３７°Ｃで３０分
間静置した後、ポリスチレンビーズを０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含有する］ＯｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０
）２ｍｌで２回洗浄した後、ポリスチレンビーズを別の
試験管に移し３％の０−フェニレンジアミン及び０．０
２％過酸化水素を含有するクエン酸緩衝液０．５ｍｌを
加え室温で１５分間静置した後、１．６Ｎの硫酸２ｍｌ
を加えて反応を停止し波長４９２ｎｍにおける吸光度を
測定した。標準エラスターゼｌ（エラスターゼｌとα，
−アンチトリブンンの複合体）で作製した標準曲線より
被検血清中のエラスターゼ１置を算出した。
プロエラスターゼによる標準エラスターゼｌ （プロエ
ラスターゼ１とα１−アンチトリブシンの複合体）を検
体として測定した結果、エラスターゼｌの表示濃度と本
測定法より算出したエラスターゼｌ濃度は一致した。
ラスターゼ１とα１−アンチトリブシンの複合体）を検
体として測定した結果、エラスターゼｌの表示濃度と本
測定法より算出したエラスターゼｌ濃度は一致した。
（７）酵素免疫学的測定法による血中エラスターゼｌの
測定法（標単品としてプロエラスターゼ１とα，−アン
チトリプシンの複合体を用いる系） 標準エラスターゼ１（プロエラスターゼｌと。 −アン
チトリブンンの複合体）または被検血清５０μｌにベル
オキシダーゼ標準抗エラスターゼｌ抗体液０．３ｍｌ及
びポリスチレンビーズ（固相化抗エラスターゼ１抗体）
１個を加え、３７９Ｃで３０分間静置した後、ポリスチ
レンビーズを０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有するｌｏ
ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）２ｍｌで２回洗浄した
後、ポリスチレンビーズを別の試験官に移し３％の０−
７エニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含有す
るクエン酸緩衝液０．５ｍｌを加え室温で１５分間静置
した後、１．６Ｎの硫酸２ｍｌを加えて反応を停止Ｌ、
波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
測定法（標単品としてプロエラスターゼ１とα，−アン
チトリプシンの複合体を用いる系） 標準エラスターゼ１（プロエラスターゼｌと。 −アン
チトリブンンの複合体）または被検血清５０μｌにベル
オキシダーゼ標準抗エラスターゼｌ抗体液０．３ｍｌ及
びポリスチレンビーズ（固相化抗エラスターゼ１抗体）
１個を加え、３７９Ｃで３０分間静置した後、ポリスチ
レンビーズを０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有するｌｏ
ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）２ｍｌで２回洗浄した
後、ポリスチレンビーズを別の試験官に移し３％の０−
７エニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含有す
るクエン酸緩衝液０．５ｍｌを加え室温で１５分間静置
した後、１．６Ｎの硫酸２ｍｌを加えて反応を停止Ｌ、
波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
標準エラスターゼｌ （プロエラスターゼ■とαアンチ
トリブ／ンの複合体）で作製した標準曲線より被検血清
中のエラスターゼｌ量を算出した。
トリブ／ンの複合体）で作製した標準曲線より被検血清
中のエラスターゼｌ量を算出した。
（８）エラスターゼ１のキノト組成（標準品トシてエラ
スターゼ１とα１−アンチトリプンンの複合体を用いる
系） 酵素免疫学的測定法によるエラスターゼ１キトの組成を
以下に示す。
スターゼ１とα１−アンチトリプンンの複合体を用いる
系） 酵素免疫学的測定法によるエラスターゼ１キトの組成を
以下に示す。
１） 標 準 エ ラ ス タ ー ゼ
１ （ エ ラ ス タ ー ゼ １
とα１−アンチトリプ／ンの複合体） Ｏ ｎ ｇ ／ ｍ １ ２》 ５ｎｇ／ｍｌ３）
２０ｎｇ／ｍｌ４）
５０ｎｇ／ｍｌ５）
１００ｎｇ／ｍ＋６）
２００ｎｇ／ｍ＋７）緩衝剤（
動物血清を含む） ８》緩衝剤溶解液 ９》ベルオキ／ダーゼ標謙抗体 １Ｇ）洗浄液 １１）固相化抗体 １２） Ｏ−フエニレンジアミン １３）０．０２％過酸化水素含有クエン酸緩衝液＋４）
１ ． ６ Ｎ硫酸 （９）エラスターゼｌのキノト組成（襟準品としてプロ
エラスターゼｌとα１−アンチトリブンノの複合体を用
いる系） 酵素免疫学的測定法によるエラスターゼｌキノトの組成
を以下に示す。
１ （ エ ラ ス タ ー ゼ １
とα１−アンチトリプ／ンの複合体） Ｏ ｎ ｇ ／ ｍ １ ２》 ５ｎｇ／ｍｌ３）
２０ｎｇ／ｍｌ４）
５０ｎｇ／ｍｌ５）
１００ｎｇ／ｍ＋６）
２００ｎｇ／ｍ＋７）緩衝剤（
動物血清を含む） ８》緩衝剤溶解液 ９》ベルオキ／ダーゼ標謙抗体 １Ｇ）洗浄液 １１）固相化抗体 １２） Ｏ−フエニレンジアミン １３）０．０２％過酸化水素含有クエン酸緩衝液＋４）
１ ． ６ Ｎ硫酸 （９）エラスターゼｌのキノト組成（襟準品としてプロ
エラスターゼｌとα１−アンチトリブンノの複合体を用
いる系） 酵素免疫学的測定法によるエラスターゼｌキノトの組成
を以下に示す。
１）ｍｌエラスターゼｌ（プロエラスターゼｌとα１−
アンチトリプンンの複合体） Ｏ ｎ ｇ ／ ｍ １ ２） ノ／
５
ｎ ｇ ／ ｍ ｌ３）
２０ｎｇ／ｍｌ４）
５０ｎｇ／ｍ＋５）
１００ｎｇ／ｍｌ６）
２００ｎｇ／ｍｌ７）緩衝剤（動物血清を含む） ８）緩衝剤溶解液 ９》ベルオキンダーゼ樟識抗体 １０）洗浄液 １１）固相化抗体 １２）０−フェニレンジアミン ＋３）０．０２％過酸化水素含有クエン酸緩衝液１４）
１ ． ６ Ｎ硫酸 Ｆ．発明の効果 エラスターゼｌは膵臓に特異的な酵素であるため種々の
膵疾患の診断が可能であり、特に膵癌のスクリーニング
及び急性膵炎の診断とその経過観察として有用である。
アンチトリプンンの複合体） Ｏ ｎ ｇ ／ ｍ １ ２） ノ／
５
ｎ ｇ ／ ｍ ｌ３）
２０ｎｇ／ｍｌ４）
５０ｎｇ／ｍ＋５）
１００ｎｇ／ｍｌ６）
２００ｎｇ／ｍｌ７）緩衝剤（動物血清を含む） ８）緩衝剤溶解液 ９》ベルオキンダーゼ樟識抗体 １０）洗浄液 １１）固相化抗体 １２）０−フェニレンジアミン ＋３）０．０２％過酸化水素含有クエン酸緩衝液１４）
１ ． ６ Ｎ硫酸 Ｆ．発明の効果 エラスターゼｌは膵臓に特異的な酵素であるため種々の
膵疾患の診断が可能であり、特に膵癌のスクリーニング
及び急性膵炎の診断とその経過観察として有用である。
図１は酵素免疫学的測定法によるエラスターゼｌ測定の
標準曲線である。
標準曲線である。
Claims (6)
- （１）固相化した抗エラスターゼ１モノクローナル抗体
及び酵素標識抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を用
いて被検々体中のエラスターゼ１を固相に結合させ、被
検々体よりエラスターゼ１を分離し、固相に結合した標
識酵素の活性を測定する。別に被検々体の代わりに既知
濃度の標準エラスターゼ１を用いて同様に操作して得ら
れた標準曲線より被検々体中のエラスターゼ１量を求め
ることからなるエラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法
。 - （２）標準エラスターゼ１がエラスターゼ１とα＿１−
アンチトリプシンとの複合体である特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - （３）標準エラスターゼ１がプロエラスターゼ１とα＿
１−アンチトリプシンとの複合体である特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 - （４）マウスをエラスターゼ１で免疫して得たマウスの
抗体産生細胞とマウス骨髄腫細胞とを細胞融合法により
融合して得られる特許請求の範囲第１項に記載のモノク
ローナル抗体。 - （５）精製したヒトエラスターゼ１を抗原として得られ
る抗エラスターゼ１抗体を精製し、抗エラスターゼ１抗
体を酵素と共有結合により結合させた酵素標識抗体と、
抗エラスターゼ１抗体を物理的吸着により不溶性担体に
結合させた抗エラスターゼ１抗体結合担体およびエラス
ターゼ１とα＿１−アンチトリプシンとの複合体からな
る標準エラスターゼとからなることを特徴とするヒト体
液などの被検々体中のエラスターゼ１測定用試薬。 - （６）標準エラスターゼ１がプロエラスターゼ１とα＿
１−アンチトリプシンとの複合体からなる特許請求の範
囲第５項に記載のエラスターゼ１測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009524A JPH03215747A (ja) | 1990-01-19 | 1990-01-19 | エラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法および測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009524A JPH03215747A (ja) | 1990-01-19 | 1990-01-19 | エラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法および測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03215747A true JPH03215747A (ja) | 1991-09-20 |
Family
ID=11722660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009524A Pending JPH03215747A (ja) | 1990-01-19 | 1990-01-19 | エラスターゼ１の酵素免疫学的測定方法および測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03215747A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002079782A1 (fr) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Reactif et procede pour l'immunoanalyse de l'elastase 1, et procede de detection de pathologie pancreatique |
| JP2012052875A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Univ Of Tokyo | オートタキシン測定による膵疾患の検査方法および検査薬 |
| WO2023100910A1 (ja) * | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 糞便中エラスターゼ１を測定する方法 |
-
1990
- 1990-01-19 JP JP2009524A patent/JPH03215747A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002079782A1 (fr) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Reactif et procede pour l'immunoanalyse de l'elastase 1, et procede de detection de pathologie pancreatique |
| JP2012052875A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Univ Of Tokyo | オートタキシン測定による膵疾患の検査方法および検査薬 |
| WO2023100910A1 (ja) * | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 糞便中エラスターゼ１を測定する方法 |
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