JPH0320232B2 - - Google Patents
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- JPH0320232B2 JPH0320232B2 JP17588182A JP17588182A JPH0320232B2 JP H0320232 B2 JPH0320232 B2 JP H0320232B2 JP 17588182 A JP17588182 A JP 17588182A JP 17588182 A JP17588182 A JP 17588182A JP H0320232 B2 JPH0320232 B2 JP H0320232B2
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
本発明は酵素活性物質を、蛋白ゲルの格子中に
包括させる方法に関する。 生理活性物質、特に酵素を、高分子担体を用い
て固定化し、連続的かつ経済的に使用しようとす
る試みはアミノ酸、異性化糖、６−アミノペニシ
ラミン、低乳糖牛乳の生産等々、1960年代後半よ
り既に実用段階に入り、現在もバイオリアクタ
ー、バイオセンサーの開発として盛んに技術開発
がなされている。 このような固定化法としては、(1)不溶性担体に
吸着固定する方法、(2)不溶性担体に共有結合によ
つて固定化する方法、(3)酵素間で架橋重合化する
方法、(4)高分子担体の格子中に包括する方法等が
知られている。(1)は結合力が弱いため、PHや緩衝
液等の外部環境によつて酵素が担体から離脱しや
すい。(2)や(3)は比較的激しい条件下で固定化する
ため、酵素の失活を伴なつたり、立体構造の変
化、固定化操作の煩雑さなどが欠点としてあげら
れている。そこで温和な条件で調製できる方法と
して(4)の包括法が考えられる。その包括材として
は、天然系素材として寒天、アルギン酸塩、コラ
ーゲン、ゼラチン等があり、化学合成系素材とし
て、ポリアクリルアミド、光架橋性樹脂プレポリ
マー、ウレタンプレポリマー等があげられる。天
然系素材では反応条件が限定される事が多い。た
とえば、寒天ゲルやゼラチンゲルは40℃以上の反
応温度では、ゲルが溶解しはじるため、反応を低
温で行なわなければならない。また、化学合成系
素材も、固定化する際に重合促進剤や開始剤によ
つて酵素が失活する等の欠点が知られている。 本発明者らは、上記のような欠点を補い、天然
系素材を用いて温和な条件で酵素活性物質を固定
化し、温度やPH等の外部環境の変化に強く、か
つ、安全性の点で問題がない固定化物を開発しよ
うと種々研究を行なつた結果、トランスグルタミ
ナーゼを用いて蛋白ゲルを調製し、該蛋白ゲルの
格子中に酵素活性物質を包括させることによつて
酵素を固定化しうることを発見し、本発明を完成
した。 即ち、本発明は、蛋白質濃度２重量％以上の蛋
白含有溶液にトランスグルタミナーゼを蛋白１ｇ
に対して１ユニツト以上添加しゲル化させ、該蛋
白ゲルの格子中に酵素活性物質を包括させること
を特徴とする酵素の固定化方法である。 本発明に用いられるゲル化担体用蛋白質は、そ
の起源に制約されず、植物性蛋白質、動物性蛋白
質などいかなるものでも使用できる。植物性蛋白
質としては油糧種子の脱脂物（脱脂大豆など）及
びそれらより分離した蛋白を挙げることができ
る。また、動物性蛋白質としては、乳蛋白質、ゼ
ラチン、コラーゲン等を例示することができる。
これらの蛋白質の２重量％以上の蛋白含有液を調
製する。蛋白含有溶液の濃度は比較的高いことが
望ましく、通常２重量％以上、好ましくは５重量
％ないし15重量％であればよい。 本発明に使用される酵素活性物質としては、ト
ランスグルタミナーゼの蛋白ゲル化反応を阻害し
ないものであれば、特に制限されず、例えば、グ
リコシダーゼ、マンノシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、カタラーゼ、ジアフオラーゼ、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼＡな
どを挙げることができる。またこれらを２種類以
上混合することも可能である。これらの固定化し
ようとする酵素活性物質を蛋白含有溶液に配合し
ておけばよい。その量は後のトランスグルタミナ
ーゼによるゲル化を阻害したり、担体となる蛋白
質の溶解性を低めない範囲で適宜選択して配合す
ればよい。具体的な添加量は例えば蛋白量10％溶
液に対しては0.5重量％程度、蛋白質５％溶液に
対しては１重量％程度が好ましい。 この蛋白質と酵素活性物質の混合溶液に、特願
昭57−31978号（特開昭58−149646号）に記載さ
れている方法で調製したトランスグルタミナーゼ
を蛋白１ｇに対して１ユニツト以上添加してゲル
化させることによつて、蛋白ゲルの格子中に酵素
活性物質を包括させることができる。トランスグ
ルタミナーゼの添加量が１ユニツト以下であれ
ば、高粘性溶液となり、また、2000ユニツト以上
添加しても効果はそれほど変らず、蛋白含有溶液
の濃度、蛋白の種類、PH等を変化させることで、
ゲル強度やゲル格子の大きさを調整しうる。 このようにして得られた酵素活性物質を包括さ
せた蛋白ゲルは、これを凍結後乾燥して、その構
造を走査顕微鏡で観察したところ、網目構造を形
成しており、この蛋白ゲルが格子を形成している
ことが証明される。また酵素活性物質が共存すれ
ば、この蛋白ゲルの格子内に酵素活性物質が包括
されて固定化している考えられる。 このようにして、蛋白格子中に包括された酵素
活性を有する蛋白ゲル化物が得られる。この蛋白
ゲル化物は水に不溶であるため、連続的に反応を
実施することができる。また、この蛋白ゲル化物
は100℃に加熱しても安定であり、また全PH領域
では安定で固定化される酵素活性物質に適する反
応条件であれば、いかなる条件にも耐えうるもの
で、長期間、安定に反応に供する事ができる。 更に、本発明によつて得られる固定化酵素は、
ゲル化担体は天然の蛋白であり、かつ、総合剤も
酵素であるため、生体に対する影響が少なく、食
品用や医薬用などの製品の製造に用いる酵素の固
定化法として有効である。 以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明は、これら実施例によつて何ら制限されるも
のではない。 実施例 １ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製した。この溶液
１mlにグルコースオキシダーゼ（ベーリンガー、
マンハイム山之内製薬製）１mg（13ユニツト）を
添加、充分溶解させた後、特願昭57−31978号に
記載されている方法にて調整したトランスグルタ
ミナーゼをαS1カゼイン１mgあたり0.01ユニツト
添加し、30分間37°に振盪恒温し、蛋白ゲル化物
を得た（湿重量870mg）。 このようにして得られた固定化グルコースオキ
シダーゼαS1カゼインゲルを、MBTH−DEA溶
液（EDTA・2Na 100mg、３−Methyl−２−
benzothiazolinone−hydrazone17mg、
diethylaniline 0.4mlを0.1M酢酸で溶解し、最終
液量１とする）2.0ml、POD溶液（0.1M酢酸ナ
トリウム溶液でperoxidaseを８プルプロガリン
単位／mlに希釈した溶液）0.5ml、基質溶液
（0.01M酢酸で15％グルコース溶液とする）0.5ml
に添加し、37°で15分間反応させた後、0.5NHCl
１mlを添加し、反応を停止させた。この液のO.
D.590nｍに於ける吸光度を測定する方法（R.
Bentley、Methods in Enzymology、Vol 、
86（1966））で活性を測定した。 このように測定した固定化グルコースオキシダ
ーゼは0.145ユニツトを示した（0.166ユニツト／
ｇ）。 同様にして、この固定化グルコースオキシダー
ゼαS1カゼインゲルの安定性を２ケ月に渡り、測
定したところ、表１の通りとなつた。
包括させる方法に関する。 生理活性物質、特に酵素を、高分子担体を用い
て固定化し、連続的かつ経済的に使用しようとす
る試みはアミノ酸、異性化糖、６−アミノペニシ
ラミン、低乳糖牛乳の生産等々、1960年代後半よ
り既に実用段階に入り、現在もバイオリアクタ
ー、バイオセンサーの開発として盛んに技術開発
がなされている。 このような固定化法としては、(1)不溶性担体に
吸着固定する方法、(2)不溶性担体に共有結合によ
つて固定化する方法、(3)酵素間で架橋重合化する
方法、(4)高分子担体の格子中に包括する方法等が
知られている。(1)は結合力が弱いため、PHや緩衝
液等の外部環境によつて酵素が担体から離脱しや
すい。(2)や(3)は比較的激しい条件下で固定化する
ため、酵素の失活を伴なつたり、立体構造の変
化、固定化操作の煩雑さなどが欠点としてあげら
れている。そこで温和な条件で調製できる方法と
して(4)の包括法が考えられる。その包括材として
は、天然系素材として寒天、アルギン酸塩、コラ
ーゲン、ゼラチン等があり、化学合成系素材とし
て、ポリアクリルアミド、光架橋性樹脂プレポリ
マー、ウレタンプレポリマー等があげられる。天
然系素材では反応条件が限定される事が多い。た
とえば、寒天ゲルやゼラチンゲルは40℃以上の反
応温度では、ゲルが溶解しはじるため、反応を低
温で行なわなければならない。また、化学合成系
素材も、固定化する際に重合促進剤や開始剤によ
つて酵素が失活する等の欠点が知られている。 本発明者らは、上記のような欠点を補い、天然
系素材を用いて温和な条件で酵素活性物質を固定
化し、温度やPH等の外部環境の変化に強く、か
つ、安全性の点で問題がない固定化物を開発しよ
うと種々研究を行なつた結果、トランスグルタミ
ナーゼを用いて蛋白ゲルを調製し、該蛋白ゲルの
格子中に酵素活性物質を包括させることによつて
酵素を固定化しうることを発見し、本発明を完成
した。 即ち、本発明は、蛋白質濃度２重量％以上の蛋
白含有溶液にトランスグルタミナーゼを蛋白１ｇ
に対して１ユニツト以上添加しゲル化させ、該蛋
白ゲルの格子中に酵素活性物質を包括させること
を特徴とする酵素の固定化方法である。 本発明に用いられるゲル化担体用蛋白質は、そ
の起源に制約されず、植物性蛋白質、動物性蛋白
質などいかなるものでも使用できる。植物性蛋白
質としては油糧種子の脱脂物（脱脂大豆など）及
びそれらより分離した蛋白を挙げることができ
る。また、動物性蛋白質としては、乳蛋白質、ゼ
ラチン、コラーゲン等を例示することができる。
これらの蛋白質の２重量％以上の蛋白含有液を調
製する。蛋白含有溶液の濃度は比較的高いことが
望ましく、通常２重量％以上、好ましくは５重量
％ないし15重量％であればよい。 本発明に使用される酵素活性物質としては、ト
ランスグルタミナーゼの蛋白ゲル化反応を阻害し
ないものであれば、特に制限されず、例えば、グ
リコシダーゼ、マンノシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、カタラーゼ、ジアフオラーゼ、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼＡな
どを挙げることができる。またこれらを２種類以
上混合することも可能である。これらの固定化し
ようとする酵素活性物質を蛋白含有溶液に配合し
ておけばよい。その量は後のトランスグルタミナ
ーゼによるゲル化を阻害したり、担体となる蛋白
質の溶解性を低めない範囲で適宜選択して配合す
ればよい。具体的な添加量は例えば蛋白量10％溶
液に対しては0.5重量％程度、蛋白質５％溶液に
対しては１重量％程度が好ましい。 この蛋白質と酵素活性物質の混合溶液に、特願
昭57−31978号（特開昭58−149646号）に記載さ
れている方法で調製したトランスグルタミナーゼ
を蛋白１ｇに対して１ユニツト以上添加してゲル
化させることによつて、蛋白ゲルの格子中に酵素
活性物質を包括させることができる。トランスグ
ルタミナーゼの添加量が１ユニツト以下であれ
ば、高粘性溶液となり、また、2000ユニツト以上
添加しても効果はそれほど変らず、蛋白含有溶液
の濃度、蛋白の種類、PH等を変化させることで、
ゲル強度やゲル格子の大きさを調整しうる。 このようにして得られた酵素活性物質を包括さ
せた蛋白ゲルは、これを凍結後乾燥して、その構
造を走査顕微鏡で観察したところ、網目構造を形
成しており、この蛋白ゲルが格子を形成している
ことが証明される。また酵素活性物質が共存すれ
ば、この蛋白ゲルの格子内に酵素活性物質が包括
されて固定化している考えられる。 このようにして、蛋白格子中に包括された酵素
活性を有する蛋白ゲル化物が得られる。この蛋白
ゲル化物は水に不溶であるため、連続的に反応を
実施することができる。また、この蛋白ゲル化物
は100℃に加熱しても安定であり、また全PH領域
では安定で固定化される酵素活性物質に適する反
応条件であれば、いかなる条件にも耐えうるもの
で、長期間、安定に反応に供する事ができる。 更に、本発明によつて得られる固定化酵素は、
ゲル化担体は天然の蛋白であり、かつ、総合剤も
酵素であるため、生体に対する影響が少なく、食
品用や医薬用などの製品の製造に用いる酵素の固
定化法として有効である。 以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明は、これら実施例によつて何ら制限されるも
のではない。 実施例 １ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製した。この溶液
１mlにグルコースオキシダーゼ（ベーリンガー、
マンハイム山之内製薬製）１mg（13ユニツト）を
添加、充分溶解させた後、特願昭57−31978号に
記載されている方法にて調整したトランスグルタ
ミナーゼをαS1カゼイン１mgあたり0.01ユニツト
添加し、30分間37°に振盪恒温し、蛋白ゲル化物
を得た（湿重量870mg）。 このようにして得られた固定化グルコースオキ
シダーゼαS1カゼインゲルを、MBTH−DEA溶
液（EDTA・2Na 100mg、３−Methyl−２−
benzothiazolinone−hydrazone17mg、
diethylaniline 0.4mlを0.1M酢酸で溶解し、最終
液量１とする）2.0ml、POD溶液（0.1M酢酸ナ
トリウム溶液でperoxidaseを８プルプロガリン
単位／mlに希釈した溶液）0.5ml、基質溶液
（0.01M酢酸で15％グルコース溶液とする）0.5ml
に添加し、37°で15分間反応させた後、0.5NHCl
１mlを添加し、反応を停止させた。この液のO.
D.590nｍに於ける吸光度を測定する方法（R.
Bentley、Methods in Enzymology、Vol 、
86（1966））で活性を測定した。 このように測定した固定化グルコースオキシダ
ーゼは0.145ユニツトを示した（0.166ユニツト／
ｇ）。 同様にして、この固定化グルコースオキシダー
ゼαS1カゼインゲルの安定性を２ケ月に渡り、測
定したところ、表１の通りとなつた。
【表】
実施例 ２
αS1カゼインの５重量％溶液を0.1Mトリス−塩
酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオスレ
イトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液１ml
にカタラーゼ（和光純薬社製）１mg（2350ユニツ
ト）を添加、充分溶解させた後、トランスグルタ
ミナーゼをαS1カゼイン１mgあたり、0.01ユニツ
ト添加し、30分間、37°に振盪恒温し、蛋白ゲル
化物を得た（湿重量910mg）。 このようにして得られた固定化カタラーゼαS1
カゼインゲルを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）３ml
に添加した。これに30％過酸化水素25μlを加え、
25°で、O.D.240nｍに於ける吸光度の減少を測定
し、１分間に1μmolの過酸化水素を分解する量を
１ユニツトとして活性を測定した。 このようにして測定した固定化カタラーゼαS1
カゼインゲルは、567ユニツトの活性を示した。
（623ユニツト／ｇ） 実施例 ３ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液１
mlにグルコースオキシダーゼ１mgとカタラーゼ１
mgを添加、充分溶解後、トランスグルタミナーゼ
をαS1カゼイン１mgあたり0.01ユニツト添加し、
30分間、37°に振盪恒温し、蛋白ゲル化物を得た
（湿重量905mg）。 この固定化グルコースオキシダーゼ、カタラー
ゼαS1カゼインゲルを実施例１及び２で用いた活
性測定を行なつたところ、各々、実施例１及び２
と同等の結果を得た。 実施例 ４ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにジアフオラーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム山之内社製）１mg（15ユニツト）を添加、充分
溶解し、トランスグルタミナーゼをαS1カゼイン
１mgあたり、0.01ユニツト添加し、30分間37°に
振盪恒温し、蛋白ゲル化物を得た（湿重量210
mg）。 このようにして得られた固定化ジアフオラーゼ
αS1カゼインゲルを、蒸留水2.4ml、200ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.5）、６ｍＭ NADH（ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）0.1
ml、1.2ｍＭ DCPIP（２−６−
dichlorophenolindophenol）0.1mlに添加し、25
で、600nｍの吸光度の１分間当りの変化を求め
た（１分間に600nｍの吸光度を１減少させる量
を１ユニツトとした。）。（F.Kaplanら、Aroh.
Biochim.Biophys.132、91（1966）。 このようにして求めた固定化ジアフオラーゼ
αS1カゼインゲルは7.2ユニツトを示した（34ユニ
ツト／ｇ）。 同様にして、２ケ月間に渡り、この固定化ジア
フオラーゼαS1カゼインゲルの安定性を測定した
ところ、表２のようになつた。
酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオスレ
イトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液１ml
にカタラーゼ（和光純薬社製）１mg（2350ユニツ
ト）を添加、充分溶解させた後、トランスグルタ
ミナーゼをαS1カゼイン１mgあたり、0.01ユニツ
ト添加し、30分間、37°に振盪恒温し、蛋白ゲル
化物を得た（湿重量910mg）。 このようにして得られた固定化カタラーゼαS1
カゼインゲルを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）３ml
に添加した。これに30％過酸化水素25μlを加え、
25°で、O.D.240nｍに於ける吸光度の減少を測定
し、１分間に1μmolの過酸化水素を分解する量を
１ユニツトとして活性を測定した。 このようにして測定した固定化カタラーゼαS1
カゼインゲルは、567ユニツトの活性を示した。
（623ユニツト／ｇ） 実施例 ３ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液１
mlにグルコースオキシダーゼ１mgとカタラーゼ１
mgを添加、充分溶解後、トランスグルタミナーゼ
をαS1カゼイン１mgあたり0.01ユニツト添加し、
30分間、37°に振盪恒温し、蛋白ゲル化物を得た
（湿重量905mg）。 この固定化グルコースオキシダーゼ、カタラー
ゼαS1カゼインゲルを実施例１及び２で用いた活
性測定を行なつたところ、各々、実施例１及び２
と同等の結果を得た。 実施例 ４ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにジアフオラーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム山之内社製）１mg（15ユニツト）を添加、充分
溶解し、トランスグルタミナーゼをαS1カゼイン
１mgあたり、0.01ユニツト添加し、30分間37°に
振盪恒温し、蛋白ゲル化物を得た（湿重量210
mg）。 このようにして得られた固定化ジアフオラーゼ
αS1カゼインゲルを、蒸留水2.4ml、200ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.5）、６ｍＭ NADH（ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）0.1
ml、1.2ｍＭ DCPIP（２−６−
dichlorophenolindophenol）0.1mlに添加し、25
で、600nｍの吸光度の１分間当りの変化を求め
た（１分間に600nｍの吸光度を１減少させる量
を１ユニツトとした。）。（F.Kaplanら、Aroh.
Biochim.Biophys.132、91（1966）。 このようにして求めた固定化ジアフオラーゼ
αS1カゼインゲルは7.2ユニツトを示した（34ユニ
ツト／ｇ）。 同様にして、２ケ月間に渡り、この固定化ジア
フオラーゼαS1カゼインゲルの安定性を測定した
ところ、表２のようになつた。
【表】
実施例 ５
αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオスレイ
トール含有、PH7.6）で調製し、この溶液0.25ml
にリボヌクレアーゼＡ（ベーリンガーマンハイム
山之内社製）１mg（50ユニツト）を添加、充分溶
解し、トランスグルタミナーゼをαS1カゼイン１
mgあたり、0.01ユニツト添加し、30分間、37°に
振盪恒温し、固定化リボヌクレアーゼＡ αS1カ
ゼインゲルを得た（湿重量198mg）。 得られたゲルをKunitz法（M.Kunitz、J.Gen.
Physiol.、24、15（1940））に従つて活性測定した
ところ16ユニツトを示した。（84ユニツト／ｇ） 実施例 ６ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにグリコシダーゼ（生化学工業社製）１mg
（５ユニツト）を添加溶解し、トランスグルタミ
ナーゼをαS1カゼイン１mgあたり、0.01ユニツト
添加し、30分間、37°に振盪恒温し、固定化グリ
コシダーゼαS1カゼインゲルを得た（湿重量205
mg）。 このゲルをｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−グル
コピラノシドを基質として活性を測定した（N.
A.Khan anh N.R.Eaton、Biodhim.Biophys.
Acta.、146、173（1967））ところ、１ユニツトを
示した（4.8ユニツト／ｇ）。 実施例 ７ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCll2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにマンノシダーゼ（生化学工業社製）１mg
（7.1ユニツト）を添加溶解し、トランスグルタミ
ナーゼをαS1カゼイン１mgあたり、0.01ユニツト
添加し、30分間、37°に振盪恒温し、固定化マン
ノシダーゼαS1カゼインゲルを得た（湿重量220
mg）。 これを、ｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−マンノ
ピラノサイドを基質として活性を測定したとこ
ろ、3.4ユニツトを示した（15ユニツト／ｇ）。 実施例 ８ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ50％グリ
セロール溶液（和光純薬社製）50μl（５ユニツト）
を添加混合し、トランスグルタミナーゼをαS1カ
ゼイン１mgあたり、0.01ユニツト添加し、30分
間、37°に振盪恒温し、固定化グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼαS1カゼインを得た（湿重量264mg）。 このようにして得られた固定化グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼを、α−ケトグルタル酸と酢酸ナ
トウムを基質として、PH8.0で30°にて１分間に
340nｍの吸光度を0.1減少させる量を１ユニツト
として、活性を測定した。（Enzymes、11、293
（1975）） このようにして求めた固定化グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼの活性は1.26ユニツトを示した。
（4.77ユニツト／ｇ） 利用例 （無グルコース乾燥卵白の製造） 実施例３に従つて調製した固定化グルコースオ
キシダーゼ、カタラーゼαS1カゼインゲル（湿重
量３ｇ）を細分し、0.01M酢酸緩衝液に分散さ
せ、5°にて一昼夜放置後、ロ過して不定形球状ゲ
ルを得た。 卵白50mlを0.9％NaClで調製した2NHClでPH
5.0〜6.0に調整した。これに、0.9％NaCl溶液２
mlに分散させた上記ゲルを加え、37°にて酸素気
流下で２時間撹拌した。これをガーゼロ過し、得
られた卵白溶液をスプレードライし、酵素処理乾
燥卵白とした。これとは別に、ゲルを添加せずに
同様の処理をして得られた乾燥卵白を5°で３週間
放置した。両者500mgを50mlの水に懸濁しメスシ
リンダー中でホモゲナイズ（2000rpm、３分間）
して、泡の体積を測定したところ、酵素処理乾燥
卵白の方が1.25倍の体積を有していた。
緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオスレイ
トール含有、PH7.6）で調製し、この溶液0.25ml
にリボヌクレアーゼＡ（ベーリンガーマンハイム
山之内社製）１mg（50ユニツト）を添加、充分溶
解し、トランスグルタミナーゼをαS1カゼイン１
mgあたり、0.01ユニツト添加し、30分間、37°に
振盪恒温し、固定化リボヌクレアーゼＡ αS1カ
ゼインゲルを得た（湿重量198mg）。 得られたゲルをKunitz法（M.Kunitz、J.Gen.
Physiol.、24、15（1940））に従つて活性測定した
ところ16ユニツトを示した。（84ユニツト／ｇ） 実施例 ６ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにグリコシダーゼ（生化学工業社製）１mg
（５ユニツト）を添加溶解し、トランスグルタミ
ナーゼをαS1カゼイン１mgあたり、0.01ユニツト
添加し、30分間、37°に振盪恒温し、固定化グリ
コシダーゼαS1カゼインゲルを得た（湿重量205
mg）。 このゲルをｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−グル
コピラノシドを基質として活性を測定した（N.
A.Khan anh N.R.Eaton、Biodhim.Biophys.
Acta.、146、173（1967））ところ、１ユニツトを
示した（4.8ユニツト／ｇ）。 実施例 ７ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCll2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにマンノシダーゼ（生化学工業社製）１mg
（7.1ユニツト）を添加溶解し、トランスグルタミ
ナーゼをαS1カゼイン１mgあたり、0.01ユニツト
添加し、30分間、37°に振盪恒温し、固定化マン
ノシダーゼαS1カゼインゲルを得た（湿重量220
mg）。 これを、ｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−マンノ
ピラノサイドを基質として活性を測定したとこ
ろ、3.4ユニツトを示した（15ユニツト／ｇ）。 実施例 ８ αS1カゼインの５重量％溶液を、0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl2、20ｍＭ ジチオス
レイトール含有、PH7.6）で調製し、この溶液
0.25mlにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ50％グリ
セロール溶液（和光純薬社製）50μl（５ユニツト）
を添加混合し、トランスグルタミナーゼをαS1カ
ゼイン１mgあたり、0.01ユニツト添加し、30分
間、37°に振盪恒温し、固定化グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼαS1カゼインを得た（湿重量264mg）。 このようにして得られた固定化グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼを、α−ケトグルタル酸と酢酸ナ
トウムを基質として、PH8.0で30°にて１分間に
340nｍの吸光度を0.1減少させる量を１ユニツト
として、活性を測定した。（Enzymes、11、293
（1975）） このようにして求めた固定化グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼの活性は1.26ユニツトを示した。
（4.77ユニツト／ｇ） 利用例 （無グルコース乾燥卵白の製造） 実施例３に従つて調製した固定化グルコースオ
キシダーゼ、カタラーゼαS1カゼインゲル（湿重
量３ｇ）を細分し、0.01M酢酸緩衝液に分散さ
せ、5°にて一昼夜放置後、ロ過して不定形球状ゲ
ルを得た。 卵白50mlを0.9％NaClで調製した2NHClでPH
5.0〜6.0に調整した。これに、0.9％NaCl溶液２
mlに分散させた上記ゲルを加え、37°にて酸素気
流下で２時間撹拌した。これをガーゼロ過し、得
られた卵白溶液をスプレードライし、酵素処理乾
燥卵白とした。これとは別に、ゲルを添加せずに
同様の処理をして得られた乾燥卵白を5°で３週間
放置した。両者500mgを50mlの水に懸濁しメスシ
リンダー中でホモゲナイズ（2000rpm、３分間）
して、泡の体積を測定したところ、酵素処理乾燥
卵白の方が1.25倍の体積を有していた。
Claims (1)
- １ 蛋白質濃度２重量％以上の蛋白含有溶液にト
ランスグルタミナーゼを蛋白１ｇに対して１ユニ
ツト以上添加しゲル化させ、該蛋白ゲルの格子中
に酵素活性物質を包括させることを特徴とする酵
素の固定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17588182A JPS5966886A (ja) | 1982-10-06 | 1982-10-06 | 酵素の固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17588182A JPS5966886A (ja) | 1982-10-06 | 1982-10-06 | 酵素の固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5966886A JPS5966886A (ja) | 1984-04-16 |
| JPH0320232B2 true JPH0320232B2 (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=16003836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17588182A Granted JPS5966886A (ja) | 1982-10-06 | 1982-10-06 | 酵素の固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5966886A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61227783A (ja) * | 1985-04-03 | 1986-10-09 | Ajinomoto Co Inc | 固定化酵素膜の製造法 |
| JPH02107163A (ja) * | 1988-10-15 | 1990-04-19 | Suntory Ltd | 新規なゲル状食品の製造方法 |
| DE19732917C1 (de) * | 1997-07-30 | 1998-10-15 | Fuchsbauer Hans Lothar | Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger |
| AU761467B2 (en) * | 1998-06-09 | 2003-06-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel enzyme-treated protein-containing food, and methods for producing the same |
-
1982
- 1982-10-06 JP JP17588182A patent/JPS5966886A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5966886A (ja) | 1984-04-16 |
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