JPH0320238B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

(イ) 産業上の利用分野 本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス（Variceila
Zoster Virus、以下VZVという）の90Kと55Kの
糖蛋白抗原を認識するヒト型モノクローナル抗体
（以下MCAという）とその製造法に関する。その
目的とするところは、VZVによるウイルス感染
症の診断及び治療等に役立つ、VZVの特定分子
量の糖蛋白抗原に特異的なヒト型MCAを提供す
ることにある。 (ロ) 従来技術とその問題点 VZVに対するMCAとしては、マウス型のもの
が既に作製されている（T.Okuno他、
Varology、129巻、357ページ、1983年）。しかし
ながら、マウス型MCAは人間にとつて抗原性が
あるので、人間の体内に投与したとき抗体が生じ
てしまい、アナフイラキシー様の副作用を惹起す
ることになる。従つて、ヒト型MCAが特に治療
のためには望まれる。ヒト型MCAとしては、ガ
ン細胞に対するMCA（Ｊ、Schlom他、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、77巻、6841ページ、
1980）、テクヌス毒素に対するMCA（Ｎ、N.
Teng他、Proc.Natl、Acad、Sci.USA、80巻、
7308ページ、1983年）、摩疹に対するMCA（C.A.
Croce他、Nature、288巻、488ページ、1980）等
が知られている。しかしながら、マウス型MCA
に比較して、ヒト型MCAは極めて限られたもの
しかこれまでに知られておらず、VZVに対する
ヒト型MCAも未だ知られていない。マウス型に
比較してヒト型MCAの作製が困難である理由は
２点挙げられる。第１点は、MCAを産生するハ
イブリドーマを形成する効率がヒト・リンパ球を
用いたときには非常に低いということ、第２点
は、人間には免疫することが多くの場合困難であ
るので有効に刺激されたヒトリンパ球を得ること
が難しいことである。特に後者の問題は、感染症
あるいは癌等に特異的なヒト型MCAを作製する
上で重要である。 (ハ) 問題点を解決するための手段 本発明者らは、VZVを人間に投与して免疫す
ることが不可能である現在、体外でヒト・リンパ
球を感作する方法が不可欠であると考え、鋭意研
究の結果、VZVで感作されたヒト・リンパ球
（抗体産生細胞）を、マウス・ミエローマ細胞や
ヒトのリンパ球株化細胞等の腫瘍細胞と融合して
ハイブリドーマを作製するか、あるいはエプスタ
イン・バーウイルス（Epstein−Barr Virus、以
下BEVという）で形質転換することによつて、
VZVと特異的なヒト型MCAを産生する細胞株を
得た。そして、本発明者らは、かかる細胞株を培
養し、培養物からVZVの90Kと55Kの糖蛋白抗原
に特異的に反応するヒト型MCAを得ることがで
きた。 即ち、本発明は、VZVの90Kと55Kの糖蛋白抗
原に特異的に反応するヒト型MCAである。かか
るヒト型MCAは、in vitroでマイトージエンの
存在下又は不存在下に、VZV又は該ウイルス由
来の蛋白若しくは糖蛋白で感作したヒト・リンパ
球と腫瘍細胞とを融合させて、VZVに特異的に
反応するヒト型MCAを産生するハイブリドーマ
を作成し、該ハイブリドーマ及び／又はそれに由
来する細胞株を培養し、培養物からMCAを採取
することによつて得られる。 あるいは、また、前記の如く感作されたヒト・
リンパ球を、EBVによつて形質転換することに
よつて得られた、VZVに特異的に反応するヒト
型MCAを産生するリンパ芽球細胞、及び／又は
それに由来する細胞株の培養物からも得られる。 本発明において、ヒト・リンパ球とは、抗体を
産生しているＢリンパン球の他に、その前駆細
胞、記憶細胞等を含む。それらの細胞はヒト脾
臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイド
等の組織から得られる。しかし、所定の抗原に特
異的なＢリンパ球は極めて少なく、そのままハイ
ブリドーマを作製したりEBVでトランスフオー
ムしても、その抗原に特異的なMCAを産生する
細胞を得る確率は極めて小さい。そこで、本発明
においては次のようなリンパ球を抗原でin vitro
感作する。in vitro感作では、例えば、リンパ球
を0.5×10⁶ないし３×10⁶／mlの細胞密度で培養
液に分散させ、96穴プレートに0.1ないし0.2mlず
つ、または24穴プレートに0.5ないし２mlずつ入
れておく。抗原としては、感染力を失活させた
VZVあるいはそのウイルス由来タンパクや糖タ
ンパクを用い、リンパ球浮遊液に0.2nｇ／mlない
し1000nｇ／ml、好ましくは１〜100nｇ／mlの抗
原を加える。また、リンパ球マイトージエンも抗
原感作には効果がある。マイトージエンとして
は、ポークウイードマイトージエン（以下、
PWMという）、プロテインＡ、Ｂ細胞増殖因子
（いわゆるBCGF）等がある。PWMを用いると
きには、1μｇ／mlないし200μｇ／ml、好ましく
は約20μｇ／mlをリンパ球浮遊液に添加する。特
に、抗原とPWMとを共に加えると、相乗的にそ
の抗原に特異的なリンパ球が増加する。このよう
に、リンパ球浮遊液に抗原又は抗原とマイトージ
エンを加えて、例えば、37℃で３ないし20日間、
好ましくは４日ないし８日間培養する。培養液と
しては種々の血清、例えば、胎児ウシ血清（以下
FCSという）、仔ウシ血清、ウマ血清等を含む培
養液（例えば、RPMI1640やザルベツコーMEM）
が用いられる。 かくして得られた感作ヒト・リンパ球は、マウ
ス又はヒトのリンパ系株化細胞と融合、ないしは
EBVでトランスフオームさせられる。細胞融合
の相手としては、マウスのミエローマ細胞株、
P3×63Ag8、P3−NS1／１−Ag4−１、P3×
63Ag8u1、SP2／0Ag14、P3×63Ag8.6.5.3、
MPC1145.6、TG1.7あるいはSP−１が用いられ
る。ヒトのリンパ系細胞株としては、ミエローマ
RPMI8226株、リンパ芽球細胞u729−６株や
ARH77株、さらにＢリンフオーマも用いられる。
さらにマウス・ミエローマとヒト・リンパ系細胞
とから生じたヘテロ・ミエローマ（N.N.Teng
他、Proc.Nati.Acad.Sci.USA.80巻、7308ペー
ジ、1983年参照）を用いることもできる。 感作リンパ球とマウス又はヒトのリンパ系株化
細胞とは、次のように公知の方法に従つて細胞融
合せしめられる。例えば、感作リンパ球とリンパ
系株化細胞を10：１〜１：100、好ましくは１：
１〜１：20の比率で混合し、適当な細胞融合用溶
液、例えば、35％ポリエチレングリコール（分子
量1000−6000程度）および7.5％ジメチルスルホ
キシドを含むRPMI1640を加えて、室温〜37℃で
１ないし数分間振盪し、その後RPMI1640、さら
に10％FCS添加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄
の後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン（以下HATという）選択培養液にて細胞密度
が0.5〜５×10⁵個／mlになるように調製する。こ
れを0.2mlずつ93穴プレートに分注し、５％CO₂
を含む湿潤空気中で35〜38℃で２〜４週間培養す
る。HAT培養液中ではハイブリドーマのみが生
存し、未融合の８−アザグアニン耐性のリンパ系
株化細胞とリンパ球は死滅していく。 培養後、培養液中の抗体価をスクリーニング
し、目的のMCAを産生しているハイブリドーマ
を選別する。スクリーニング法としてはラジオイ
ムノアツセイ（RIA）、酵素抗体法（ELISA）、
蛍光抗体法等がある。 ハイブリドーマを作製するかわりに、感作リン
パ球をEBVで形質転換し、永続的にMCAを産生
する細胞株を得ることも出来るEBVを産生し続
ける細胞、例えばB95−８株化細胞を培養する
と、その培養上清には感染力をもつたEBVが含
まれている。この培養上清をEBVのソースとし
て、リンパ球をトランスフオームする。トランス
フオームするときには、EBVを、例えば、0.01
〜10、好ましくは0.2〜１トランスフオーム・ユ
ニツト（TD₅₀）／リンパ球を添加する。 そして、例えば、37℃で約１〜２時間インキユ
ベートした後、遠心によつて遊離のウイルスを除
去し、得られたEBV感染細胞を10〜20％FCS加
RPMI1640培地に分散させる。この細胞浮遊液
（細胞密度400〜50000個／ml）を0.2mlずつ、96穴
プレートに蒔く。そして、例えば、37℃、CO₂イ
ンキユベーター中で３ないし５週間培養後、その
上清をハイブリドーマの場合と同様にスクリーニ
ングする。 このようにして得られたMCA産生細胞株は限
界希釈法あるいはソフト・アガー法によつてクロ
ーニングされる。クローニングされたハイブリド
ーマあるいはEBVトランスフオーマントは、液
体窒素の入つた細胞保存タンクに保存される。 かかるハイブリドーマ又はEBVトランスフオ
ーマントのセルライン（細胞株）及び／又はそれ
に由来する細胞株を適当な方法で大量に培養する
と、培養上清から本発明の目的とするヒト型
MCAを得ることができる。またこのハイブリド
ーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清
からヒト型MCAを得ることもできる。かかる方
法によつて得られた本発明において特徴的な
MCAは、VZVに特異的に反応する。そして、特
にヒト型MCAV1は分子量108K、105K及び62K
の糖蛋白抗原を認識するという特徴を有しまたヒ
ト型MCAV2は、分子量90Kと55Kの糖蛋白抗原
を認識する。そしてV1、V2共に補体の存在下
で、MCA抗体量1μｇ／ml以下の濃度で、VZVを
50％不活性化し得るという優れた下和活性を持つ
ている。 以下、実施例により本発明を詳述する。 (ニ) 実施例 実施例 VZVに対するヒト型MCAを産生するハイブリ
ドーマ (1) VZV抗原の作製 ヒト胎児肺細胞（HeL）の培養液中にVZV
（Kawagucni株）を接種し、細胞変性が現れて
きた時点で細胞をラバーポリスマンで取り出し
た。細胞を１分間超音波処理して破壊したの
ち、3000rpmで10間遠心した。その上清をセシ
ウム・クロライドの層に乗せて、23000rpmで
３時間遠心した。密度1.4と1.2の間にVSVは集
まつた。このウイルス分画をさらに25000rpm、
１時間半の遠心で沈澱させ、沈澱をリン酸緩衝
生理食塩水に分散させて、５秒間３回超音波処
理を行なつた。かくして得られたウイルス標品
を紫外線照射によつて不活化したのち、以下の
実験に用いた。 (2) VZVによるリンパ球の感作 ヒト扁桃リンパ球を培養液Ａ（RPMI1640＋
20％胎児牛血清＋20ｍＭ HEPES＋２ｍＭグ
ルタミン＋１ｍＭ Naピルビン酸＋0.02mg／
mlセリン＋80μｇ／mlゲンタマイシン）に2.6×
10⁶個／mlに浮遊させた。これに上記(1)で得ら
れたVZV（最終濃度17nｇプロテイン／ml）と
PWM（20μｇ／ml）を加えて、３、５、または
７日間培養した。こうして感作したリンパ球を
以下の細胞融合に使用した。 (3) マウス・ミエローマ細胞P3×63Ag8U1株
（P3U1と略記する）との細胞融合 前もつてP3U1を培養液Ｂ（RPMI1640＋10％
児牛血清＋２ｍＭグルタミン＋80μｇ／mlゲン
タマイシン）中で培養しておいた。使用時の細
胞濃度は６×10⁵個／mlであつた。上記(2)の感
作リンパ球（３穴を一緒にした）４群とP3U1
を、それぞれ別々に無血清RPMI1640で２回洗
浄した。各群のリンパ球と５×10⁶個のP3UIと
を試験管の中で一緒にした。1500rpmで５分間
遠心し、上清を捨てた。細胞ペレツトを試験管
をたたくことによつて、よく分散させた。これ
に0.5mlのポリエチレングリコール液
（RPMI1640 5.75ml＋ポリエチレングリコール
1000 3.5ml＋ジメチルスルホキサイド0.75ml）
（PEG液と略記する）を加えて、細胞をゆるや
かに浮遊させた。１分後に0.5mlRPMI1640を
加え、さらに１分後に１mlRPMI、さらに２分
後に４mlのHAT培養液（RPMI1640＋20％胎
児牛血清＋80μｇ／mlゲンタマインシン＋
95μMヒポキサンチン＋0.4μMアミノプテリン
＋1.6μMチミジン）、さらに２分後には４mlの
HAT培養液を加えた。最後に、HAT培養液
で25ml細胞浮遊液とした。これを培養プレート
（96穴）１枚に蒔いて、37℃、５％CO₂含有空
気中で培養した。一週間毎に半量の培養液を新
しいHT培養液（HATからＡを除去したもの）
で交換していきハイブリドーマを得た。 (4) ヒト抗VZV抗体の測定 こうして形成されてきたハイブリドーマの培
養上清について、1gMあるいは1gG抗VZV
MCAを酵素抗体法によつて測定した。即ち、
抗VZV抗体を測定するためにVZV（河口株）
2μｇタンパク／mlをそれぞれフアルコン・ミ
クロテストの96穴プレートに固定した。この
プレートにハイブリドーマ培養上清60μを加
えて、室温で１時間放置した。そして１％
BSA（牛血清アルブミン）を含むハンクス塩類
溶液（HBSS−BSA）で洗浄し、その後、ヤ
ギ抗ヒト1gG抗体または抗1gM抗体−アルカリ
フオスフアターゼ（2000倍希釈液）を60μ加
えて、室温で１時間反応させた。さらにHBSS
−BSAで３回洗浄したのち、Ｐ−ニトロフエ
ニルフオスフエートを1Mジエタノールアミン
＋１ｍＭ MgCl₂のPH9.8溶液に0.6mg／mlの割
合で溶かした溶液100μを加えた。30分から
60分後に405ｍμの吸光度を測定した。 結果を第１表に示した。

【表】 実施例 ２ 自己免疫性血小板減少症の患者より手術によつ
て取り出された脾臓より、リンパ吸をフイコー
ル・パツク法によつて分離した。このリンパ球を
実施例１の(2)と同様にVZV（17nｇ／ml）とPWM
（20μｇ／ml）を加えて、６日間感作した。こう
して感作したリンパ球を実施例１の(3)と同様にし
て細胞融合した。こうして形成されてきたハイブ
リドーマの培養上清について、全体のヒト1gGお
よび1gM、VZV感染Hel細胞に反応する1gG及び
1gM、さらに非感染Hel細胞に反応する1gG及び
1gMを酵素抗体法によつて測定した。その結果
を96穴のプレート中の該当穴数として第２表に示
した。 第２表より、VZVに選択的な1gG型MCAの産
生が起つていることがわかる。 さらに、そのようなVZV選択的MCAを産生す
るハイブリドーマはVZV＋PWMの感作で著しく
増加していることがわかる。PWMのみでもその
ようなハイブリドーマは出現するが（６／55）、
VZVのみの感作に較べて（９／27）非選択的な
ハイブリドーマが増加している点がある。

【表】 実施例 ３ 抗VZV抗体産生ハイブリドーマのクローニン
グ及び抗VZVMCAの特異性。 (1) クローニング 抗VZV活性陽性の穴より細胞を取り出し、
細胞数を計測し、１細胞／穴あるいは10細胞／
穴だけ96穴培養プレートに細胞を蒔いた。３な
いし４週間後に細胞は十分増殖したので、この
培養上清中に、抗VZV抗体活性があるか否か
スクリーニングした。こうして出来るだけ１細
胞／穴で蒔いた方から、由来する細胞を選別し
た。この操作を２ないし４回繰返し、すべての
クローンが抗VZV抗体活性を保有するように
した。 マウス×ヒト細胞融合より３つのハイブリド
ーマが樹立された。それらハイブリドーマは６
ないし25μｇ／日・10⁶細胞のMCAを産生して
いた。これらをV1、V2、V6と命名した。 (2) MCAの特異性 V1、V2及びV6のサブクラスとＬ鎖タイプを
決定した。ヒツジ抗ヒト1gG、抗ヒト1gG2、
抗ヒト1gG3及び抗ヒト1gG4を用いてオクター
ローニ法によりサブクラスを決定した。その結
果、V1、V2、V6とも抗ヒト1gG1抗体とのみ
反応した。さらにアルカリホスフアターゼーヤ
ギ1gG抗ヒトＫ鎖またな抗入鎖を用いたELISA
の結果、３つのMCAとも入鎖を有しているこ
とが判つた。 V1、V2、V6の免疫的特異性を検討すべく、
種々のウイルスあるいはその宿主細胞を抗原と
するELISAを行なつた。 結果を第３表に示した。 V1、V2、V6とも試験した６株のVZVすべ
てに反応したが、その宿主細胞HELにはまつ
たく反応しなかつた。またV1はHSV1型と２
型に弱く反応したが、V2、V6は反応しなかつ
た。さらにCMVとEBVにはいずれのMCAも
反応しなかつた。

【表】

【表】 実施例 ４ 抗VZV・MCAの認識抗原分子の決定 抗原分子は免疫沈降法とドデシル硫酸ナイリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電泳動法（SDS−
PAGE）によつて決定した。 培養２日目のヒト 児肺細胞（HEL）単層培
養（64cm²）に、トリプシンで浮遊させた1/5量の
VZV感染細胞を接種した。48時間後に80％以上
の細胞変性（CPE）が出現した時点で、接地を
４mlの100μciトリチウムグルコサミン塩酸塩
（〔1.6− ³H（Ｎ）〕glucos amine；20ci／mmol；
NEN Research Products、Boston、MA）を含
む1/10グルコースMEM−２％FCSまたは５mlの
50μci〔 ³⁵S〕−メチオニン（400ci／ｍmol；NEN
Research Products）を含む1/10メチオニン
MEM−２％FCSにおきかえた。さらに37℃で18
時間培養し、その間にCPEが単層細胞全体に及
んだ時点で細胞を集めた。集めた細胞を洗浄し、
10ｍＭ Tris HCl（PH7.4）、0.15MNaCl、１ｍＭ
フエニルメチルスルホニルフルオライド（Signa
Chemicals CO.、ST Louse、Mo）、１ｍＭエチ
レンジアユンテトラ酢酸、１％Tritton Ｘ−100、
0.1％ソジウムドデジルサルフエート、１％ソジ
ウムデオキシコリン酸（RIPA緩衝液）中で超音
波処理によつて分散、可溶化した。これを60％シ
ヨ糖溶液に重層し、100000ｇ、１時間の超遠心に
よつて不溶物を取り除き上清を抗原として−70℃
に凍結保存した。 〔 ³H〕−グルコサミン標識抗原分画（200μ、
400000cpm）または〔 ³⁵S〕メチオニン標識抗原
分画（200μ1200000cpm）とハイブリドーマ上
清150μを混合し、室温で30分間、さらに４℃
で１晩反応させた。翌朝、前もつて膨潤させてお
いたプロテインＡ−セフアロースCL4Bビーズ
（100μの標濁液中に3mgrを含む：Pharmacia
Fine Chemicals、Inc.、Tokyo）を加え４℃で
３時間反応させた。免疫複合体を含むビーズは遠
心ペレツトにし、２mlのRIPA緩衝液で５回、さ
らに２mlの10ｍＭ Tri HCl（PH6.8）で２回洗浄
した。洗浄の済んだ免疫複合体は、110μの
SDS−サンプル緩衝液を加え、100℃で溶出させ
た。 SDS−PAGE可溶化試料の電気泳動は室温で
Tris HCl−グリシン−SDS緩衝液系（PH8.3）の
標準的な方法に従つて行なつた。スラブゲルは
1Mサルチル酸ナトリウム水溶液に浸漬した後、
口紙上で乾燥させた。乾燥させたゲルは−70℃で
７日から21日間、KODAKX−OMATSフイルム
に感光させた。 結果は第１図に示した。MCAのV1は分子量
108K、105K及び62Kの糖蛋白を認識しV2は分子
量90Kと55Kの異なる糖蛋白を認識していると認
められた。 なお、第１図において、V1（Ａ列）とV2（Ｂ
列）は〔 ³⁵S〕−メチオニン標識ウイルス抗原で
沈降させた。V1（Ｃ列）とV2（Ｄ列）は〔 ³H〕−
グルコサミン標識抗原で沈降させた。右の矢印は
標準タンパク質の移動度を示している。また、Ｋ
はキロダルトンを意味する。 また、V6はV1と全く同じ電気泳動パターンを
示した。 実施例 ５ 抗VZV・MCAのウイルス中和活性 抗VZV・MCA産生細胞の培養上清を集めて、
50％飽和硫安によつてMCAを沈澱させ、リン産
緩衝生理食塩水に対して透析した。これをMCA
標品として以下の実験に供した。これら標品に含
まれるMCAの量は、抗ヒト１ｇＧ抗体を用いた
免疫一次元拡散法によつて決定した。MCA標品
を５％FCS−MEMで３倍段階希釈し、その溶液
（200μl）とVZV（川口株、4000PFU、100μ）
と、モルモツト補体（５倍希釈液、100μ）あ
るいは５％FCS−MEM（100μ）とを混合し、
37℃で１時間培養した。このウイルス混合液を、
前もつて培養してあるHEL細胞の単層培養上に
加えて、37℃で１時間ウイルスを吸着させた。そ
の後、2.5％メチルセルロースを含む５％FCS−
MEMを重層し、５ないし７日間CO₂培養器中で
培養した。その後、感染HEL細胞を10％ホルマ
リンで固定し、さらに0.15％クリスタルバイオレ
ツトで染色し、プラーク数を計数した。 その結果、MCA、V1、V2とV6についてのウ
イルス活性は、第４表の如くであつた。 V1とV2は補体存在下で、ウイルスを50％不活
化するのに必要なMCAの量が1μｇ／ml以下のす
ぐれた中和活性をもつことがわかる。

【表】 実施例 ６ ヒト×ヒト・ハイブリドーマの作製 ヒト脾臓リンパ球を、培養液Ａ（実施例１の(2)
参照）に1.2×10⁶個／mlになるように浮遊させ
た。この細胞浮遊液を、1.2mlずつ24穴プレート
の穴に入れた。そこに、抗原（VZV、河口株）
を4.9nｇタンパク／mlになるように加え、更に
PWMを20μｇ／mlになるように添加した。CO₂
インキユベーターで６日間培養することによつ
て、リンパ球を抗原感作した。 前もつてヒト・リンパ芽球細胞729−６を培養
液Ｂ（RPMI1640＋10％FCS＋２ｍＭグルタミン
＋80μｇ／mlゲンタマイシン）中で培養しておい
た。使用時の細胞密度は８×10⁵個／mlであつた。
上記感作リンパ球を12穴分プールして、無血清
RPMI1640で２回洗浄した。729−６細胞も２回
洗浄後、２×10⁷個の729−６細胞を感作リンパ球
と遠心管の中で混合した。1500rpmで５分間遠心
し、上清を捨てた。細胞ペレツトを、試験管をた
たくことによつて、よく分散させた。これに２ml
のPEG液を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させ
た。１分後にmlRPMI1640を加え、さらに１分後
に４mlRPMI、さらに２分後に８mlのHAT培養
液（RPMI1640＋20％FCS＋80μｇ／mlゲンタマ
イシン＋95μMヒポキサンチン＋0.4μMアミノプ
テリン＋1.6μMチミジン）、さらに２分後には16
mlのHAT培養液を加えた。最後に、HAT培養
液で100ml細胞浮遊液とした。これを培養プレー
ト（96穴）４枚に蒔いて、37℃、５％CO₂含有空
気中で培養した。一週間毎に半量の培養液を新し
いHT培養液で交換していきハイブリドーマを得
た。そして、３ないし４週間培養後に抗体の測定
を行なつた。４プレート384穴中118穴にハイブリ
ドーマの増殖が見られた。これらの培養上清の抗
VZV抗体活性をスクリーニングした結果、16穴
が陽性であつた。これらの穴には非感染HELに
対する抗体価は測定されず、産生されているヒト
型MCAは、VZV特異的であると考えられる。ア
イソタイプはすべて１ｇＧであつた。 実施例 ７ EBVによる形質転換細胞の作製 (1) EBVの調製 ヒトＢ細胞由来のEBV持続産生株である
B95−８株化細胞を凍結からもどし、培養液Ｃ
（RPMI1640＋10％FCS＋50I.U.／mlストレプ
トマイシン＋50μｇ／mlペニシリンＧカリウ
ム）に終濃度２×10⁵個／mlで植え込み、37℃
で３日間培養した。その後、再び終濃度２×
10⁵個／mlで新しい培養液Ｃに植え込んで、更
に２日間培養した。このようにしてスケールア
ツプした対数増殖期のB95−８細胞を終濃度１
×10⁵個／mlで、新しい培養液Ｃ中で更に37℃
で７日間培養しEBVを含む培養上清を
3000rpm30分の遠心を行ない、更に0.45μｍの
ポアサイズをもつミリポアフイルターで過し
た。かくして得られたEBV調製液は、−80℃で
凍結保存した。なお、調製液中のEBVの力価
は１×10⁵TD₅₀／mlであつた。 (2) VZVによるリンパ球の感作とEBVによるリ
ンパ球のトランスフオーメイシヨン ヒト脾臓リンパ球を、培養液Ｂ（実施例１の
(3)参照）に２×10⁶個／ml浮遊させた。この細
胞浮遊液を1.2mlずつ24穴プレートの穴に入れ
た。これにVZV（河口株）4.9nｇタンパク／ml
を加えて、４日間CO₂インキユベーター中で培
養した。 こうして感作したリンパ球を、15000rpm5分
間遠心沈澱させ、細胞ペレツトを試験管をたた
くことによつてよく分散させた。これに、上記
(1)で得られたEBV調製液を、0.5TD₅₀／cellの
容量で加え、時々撹拌しながら37℃で60分間イ
ンキユベーシヨンした。最後に培養液
DRPMI1640＋10％FCS＋２ｍＭグルタミン＋
１ｍＭ Na−ピルビン酸＋0.02mg／mlセリン
＋80μｇ／mlゲンタマイシン）を加え、96穴プ
レートに1.2×10⁴cells／穴／0.2ml培養液となる
ように蒔いて、37℃、５％CO₂含有空気中で培
養した。一週間毎に半量の培養液を新しい培養
液Ｄで交換していき、リンパ芽球細胞を得た。 リンパ芽球細胞は、全４プレートの穴に増殖
してきた。トランスフオーム後４週目に抗
VZV抗体価を測定した結果、384穴中238穴が
抗体を有していた。しかしながらクローニング
を始める前に多くの細胞は抗体を産生しなくな
り、抗体を産生し続けていた。12クローンがソ
フト・アガー法によつてクローニングされた。
それらのうち３個は抗VZVのヒト型MCAを産
生するリンパ芽球株化細胞として樹立された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗VZV、MCAの認識抗原を示す、
SDS−PAGE電気泳動図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水痘帯状疱疹ウイルスの分子量90Kと55Kの
   糖蛋白抗原を認識するヒト型モノクローナル抗
   体。 ２ in vitroでマイト−ジエンの存在下または不
   存在下に、水痘帯状疱疹ウイルスまたは該ウイル
   ス由来の蛋白若しくは糖蛋白で感作したヒト・リ
   ンパ球と、腫瘍細胞とを融合させて、水痘帯状疱
   疹ウイルスの分子量90Kと55Kの糖蛋白抗原を認
   識するヒト型モノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマを作成し、該ハイブリドーマ及び／又
   はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からモ
   ノクローナル抗体を採取することからなる、水痘
   帯状疱疹ウイルスの分子量90Kと55Kの糖蛋白抗
   原を認識するヒト型モノクローナル抗体の製造
   法。 ３ 腫瘍細胞がマウスのミエローマ細胞である特
   許請求の範囲第２項記載の水痘帯状疱疹ウイルス
   の分子量90Kと55Kの糖蛋白抗原を認識するヒト
   型モノクローナル抗体の製造法。 ４ 腫瘍細胞がヒト由来のリンパ系株化細胞であ
   る、特許請求の範囲第２項記載の水痘帯状疱疹ウ
   イルスの分子量90Kと55Kの糖蛋白抗原を認識す
   るヒト型モノクローナル抗体の製造法。