JPS6317688A - ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 - Google Patents
ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法Info
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- JPS6317688A JPS6317688A JP62072767A JP7276787A JPS6317688A JP S6317688 A JPS6317688 A JP S6317688A JP 62072767 A JP62072767 A JP 62072767A JP 7276787 A JP7276787 A JP 7276787A JP S6317688 A JPS6317688 A JP S6317688A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、所望のヒト抗体の産生能を有するヒト−ヒト
ハイブリドーマ及びその製造法並びにそれが産生ずるモ
ノクローナル抗体に関する。
ハイブリドーマ及びその製造法並びにそれが産生ずるモ
ノクローナル抗体に関する。
モノクローナル抗体は免疫学領域のみならず、他の多く
の領域においてもその有用性が確認され、広く応用され
ている。しかしながらこれらの抗体は、主にマウスで作
成されているものであり、ヒトの診断及び治療への応用
てはおのずとその限界がある。
の領域においてもその有用性が確認され、広く応用され
ている。しかしながらこれらの抗体は、主にマウスで作
成されているものであり、ヒトの診断及び治療への応用
てはおのずとその限界がある。
ヒトのモノクローナル抗体全製造するに際しては、所望
の抗原により感作された該抗原に特異的なヒトの抗体産
生細胞を得ることが必要であるが、ヒトでは、生体内（
ｉｎ ｖｉｖｏ）の抗原刺激が一部の抗原を除いては不
可能であることから、種々の抗原に対応するその様な手
段は、繁用技術として、未だ確立されたものはない。
の抗原により感作された該抗原に特異的なヒトの抗体産
生細胞を得ることが必要であるが、ヒトでは、生体内（
ｉｎ ｖｉｖｏ）の抗原刺激が一部の抗原を除いては不
可能であることから、種々の抗原に対応するその様な手
段は、繁用技術として、未だ確立されたものはない。
また、抗体産生細胞の不死化（ｉｍｍｏ ｒｔａｌ １
ｚａｔｉｏｎ ）手段、例えば、ヒト骨髄腫細胞との融
合、エプスタイン・パー・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ ； ＥＢＶ）での形質転換（ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍ ） 等により、ヒトの永久株化細胞
を得、これからモノクローナル抗体を取得する試みがな
されているが、ヒトの系においては、マウスの系の様に
、その抗体産生能の安定したハイブリドーマもしくは形
質転換細胞は得られていないのが現状であった。
ｚａｔｉｏｎ ）手段、例えば、ヒト骨髄腫細胞との融
合、エプスタイン・パー・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ ； ＥＢＶ）での形質転換（ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍ ） 等により、ヒトの永久株化細胞
を得、これからモノクローナル抗体を取得する試みがな
されているが、ヒトの系においては、マウスの系の様に
、その抗体産生能の安定したハイブリドーマもしくは形
質転換細胞は得られていないのが現状であった。
したがって、所望のヒトモノクローナル抗体を安定に産
生ずる永久株化細胞の提供が強く要望されていた。
生ずる永久株化細胞の提供が強く要望されていた。
ｃ問題点′ｆ、Ｗ！Ｉ決するための手段〕本発明者はヒ
ト細胞についてのハイブリドーマを得べく種々研究をお
こなっていたところ、ヒトの永久株化細胞の特定の処理
を施した後、これとヒト抗体産生細胞を融合すれば、安
定なヒトモノクローナル抗体全産生ずるヒト−ヒトハイ
ブリドーマが得られることを見出し、本発明を完成した
。
ト細胞についてのハイブリドーマを得べく種々研究をお
こなっていたところ、ヒトの永久株化細胞の特定の処理
を施した後、これとヒト抗体産生細胞を融合すれば、安
定なヒトモノクローナル抗体全産生ずるヒト−ヒトハイ
ブリドーマが得られることを見出し、本発明を完成した
。
したがって本発明は形質転換ヒト細胞を増殖抑制処理し
、次いでこれをヒト抗体産生細胞と融合させることを特
徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ、及びその製造法並
びに該ノ１イブリドーマの産生ずるモノクローナル抗体
を提供するものである。
、次いでこれをヒト抗体産生細胞と融合させることを特
徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ、及びその製造法並
びに該ノ１イブリドーマの産生ずるモノクローナル抗体
を提供するものである。
本発明方法を実施するには、まず、形質転換ヒト細胞の
増殖を抑制する。
増殖を抑制する。
親株としての形質転換ヒト細胞としては、ヒト腫腸細胞
、例えばミエローマ細胞、白血病細胞等が挙げられるが
、更にヒト細胞を公知の方法、例えば細胞にウィルスを
感染さぜろ方法、遺伝子組み換え等の手段により形質転
換することによっても得られる。また、好ましいヒト細
胞としては、例えばヒトＢ細胞、ヒト肝細胞、ヒト脾細
胞、ヒトリッツＱ節細胞、扁桃細胞等が挙げられる。こ
の形質転換ヒト細胞の増殖を抑制する方法としては、薬
剤処理、放射線照射等が挙げられるが、このうち、タン
、Ｑり質又はＲＮＡの合成を阻害する薬剤、例えば、エ
メチン、アクチノマイシンＤ等を単独又は組合せておこ
なう薬剤処理が好ましい。薬剤処理をおこなう場合の薬
剤使用量については、融合に用いる細胞の種類によって
定める必要があるが、一般には形質転換ヒト細胞が７〜
ｌＯ日で完全に死滅する量ケ用いることが好ましい。こ
のようにして得られた形質転換ヒト細胞は、ペテロ接合
性であってもホモ接合性であっても良いが、後のスクリ
ーニング等を勘案するとホモ接合性のものであることが
好ましい。
、例えばミエローマ細胞、白血病細胞等が挙げられるが
、更にヒト細胞を公知の方法、例えば細胞にウィルスを
感染さぜろ方法、遺伝子組み換え等の手段により形質転
換することによっても得られる。また、好ましいヒト細
胞としては、例えばヒトＢ細胞、ヒト肝細胞、ヒト脾細
胞、ヒトリッツＱ節細胞、扁桃細胞等が挙げられる。こ
の形質転換ヒト細胞の増殖を抑制する方法としては、薬
剤処理、放射線照射等が挙げられるが、このうち、タン
、Ｑり質又はＲＮＡの合成を阻害する薬剤、例えば、エ
メチン、アクチノマイシンＤ等を単独又は組合せておこ
なう薬剤処理が好ましい。薬剤処理をおこなう場合の薬
剤使用量については、融合に用いる細胞の種類によって
定める必要があるが、一般には形質転換ヒト細胞が７〜
ｌＯ日で完全に死滅する量ケ用いることが好ましい。こ
のようにして得られた形質転換ヒト細胞は、ペテロ接合
性であってもホモ接合性であっても良いが、後のスクリ
ーニング等を勘案するとホモ接合性のものであることが
好ましい。
次に、増殖抑制処理された形質転換ヒト細胞は、抗体産
生ヒト細胞と融合される。
生ヒト細胞と融合される。
抗体産生ヒト細胞としては、例えばヒトＢ細胞、ヒトプ
ラズマ細胞、ヒト肝細胞、ヒト胎児肝細胞、ヒト脾細胞
、ヒト ＩＪン／Ｑ＠細胞、培養ヒトＢ細胞等が挙げら
れるが、このうち、ヒトＢｉ胞が好ましい。この抗体産
生ヒト細胞は、ヒト組織又は血液から分離したものをそ
のまま用いても良いが、融合操作等の容易さの点から形
質転換せしめたものを用いても良い。この場合一般には
融合操作ののちに抗ＨＬＡ抗体処理全おこない、非融合
抗体産生ヒト細胞を排除することが望ましい。また、細
胞融合は、公知の方法、例えば、ポリエチレングリコー
ル、ウィルス等を用いる方法又は電気細胞融合法等によ
りおこなわれる。細胞融合における増殖抑制されたヒト
ミＪ胞と抗体産生ヒト細胞の比は１〜３０二１が好まし
い。
ラズマ細胞、ヒト肝細胞、ヒト胎児肝細胞、ヒト脾細胞
、ヒト ＩＪン／Ｑ＠細胞、培養ヒトＢ細胞等が挙げら
れるが、このうち、ヒトＢｉ胞が好ましい。この抗体産
生ヒト細胞は、ヒト組織又は血液から分離したものをそ
のまま用いても良いが、融合操作等の容易さの点から形
質転換せしめたものを用いても良い。この場合一般には
融合操作ののちに抗ＨＬＡ抗体処理全おこない、非融合
抗体産生ヒト細胞を排除することが望ましい。また、細
胞融合は、公知の方法、例えば、ポリエチレングリコー
ル、ウィルス等を用いる方法又は電気細胞融合法等によ
りおこなわれる。細胞融合における増殖抑制されたヒト
ミＪ胞と抗体産生ヒト細胞の比は１〜３０二１が好まし
い。
この細胞融合に用いられる培地としては、例えばＲＰＭ
Ｉ １６４０培地、■瓦培地、ダルベツコ変法培地、及
びそれらの血清加培地、並びにそれらの無血清培地等が
挙げられる。
Ｉ １６４０培地、■瓦培地、ダルベツコ変法培地、及
びそれらの血清加培地、並びにそれらの無血清培地等が
挙げられる。
かくして得られたヒト−ヒトハイブリドーマは、更に所
望の抗体産生能の有無についての検索及びクローン化に
付される。
望の抗体産生能の有無についての検索及びクローン化に
付される。
抗体産生能の有無は、ヒト−ヒトハイブリドーマの産生
ずる抗体の検定により確認される。この抗体検定は、感
作抗原に対する反応性を試験することにより実施され、
その方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法（： Ｍｅ
ｔ ｈ、 Ｅｎｚｙｍｏ ｌ 、 。
ずる抗体の検定により確認される。この抗体検定は、感
作抗原に対する反応性を試験することにより実施され、
その方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法（： Ｍｅ
ｔ ｈ、 Ｅｎｚｙｍｏ ｌ 、 。
Ｌ四、４１９−４３９（１９８０） 〕ｔプラーク法
、スポット法、凝集反応法、オクテロニイ法、酵素免疫
法（ＥＩＡ）、放射免疫法（ＲＩＡ）、細胞毒試験法等
の一般の抗体検出に利用される各種方法に従うことがで
きる〔「ハイプリドーマ法とモノクローナル抗体Ｊ、ｔ
ｆ’ｆＪＲ＆Ｄデラニング発行、３０〜５３頁、昭和５
７年３月５日、等〕。また、クローニングは、例えば公
知の継代培養操作をくり返すことにより、また通常の限
界希釈法に従うことにより容易に達成される。
、スポット法、凝集反応法、オクテロニイ法、酵素免疫
法（ＥＩＡ）、放射免疫法（ＲＩＡ）、細胞毒試験法等
の一般の抗体検出に利用される各種方法に従うことがで
きる〔「ハイプリドーマ法とモノクローナル抗体Ｊ、ｔ
ｆ’ｆＪＲ＆Ｄデラニング発行、３０〜５３頁、昭和５
７年３月５日、等〕。また、クローニングは、例えば公
知の継代培養操作をくり返すことにより、また通常の限
界希釈法に従うことにより容易に達成される。
かくして製造されるヒト−ヒトハイブリドーマは、これ
を常法に従い培饗することにより、その培養上清中に所
望のヒトモノクローナル抗体を産生し、極めて有用であ
る。そして、本発明のとトーヒトハイブリドーマは高い
融合率で得られ、クローン化された該パイブリドーマは
長期間安定にモノクローナル抗体を産生ずる。尚、上記
抗体は、常法に従い、更に精製・単離することができ、
例えば高速液体クロマトグラフィー、抗原カラムを用い
るアフイニテイクロマト法等はことに好適な手段である
。
を常法に従い培饗することにより、その培養上清中に所
望のヒトモノクローナル抗体を産生し、極めて有用であ
る。そして、本発明のとトーヒトハイブリドーマは高い
融合率で得られ、クローン化された該パイブリドーマは
長期間安定にモノクローナル抗体を産生ずる。尚、上記
抗体は、常法に従い、更に精製・単離することができ、
例えば高速液体クロマトグラフィー、抗原カラムを用い
るアフイニテイクロマト法等はことに好適な手段である
。
更に、本発明方法で得られるヒト−ヒトハイブリドーマ
から導かれるヒトモノクローナル抗体は、動物細胞を用
いだノ・イブリドーマから導かれたモノクローナル抗体
と比べ異種抗原性が低いので、治療用及び診断用の医薬
等として有用なものである。
から導かれるヒトモノクローナル抗体は、動物細胞を用
いだノ・イブリドーマから導かれたモノクローナル抗体
と比べ異種抗原性が低いので、治療用及び診断用の医薬
等として有用なものである。
次に実施例を挙げ、本発明を説明する。
実施例
（１）抗体産生Ｂ細胞の調製：
妊娠した供与者（ＳＵ：ＨＬＡ−Ａ ２ 、− ； Ｂ
ｗ ４６ 。
ｗ ４６ 。
２２ ；Ｃｗ７ 、−；ＤＲ４、８）の末梢血を取す、
これから９７７９球をフィコール−コンレイ勾配により
分離した。Ｔ細胞及びＢ細胞を、ノイラミダーゼで処理
した５ＲＢＣｉ用いるロゼツト形成法により分離し、Ｂ
細胞を得た。
これから９７７９球をフィコール−コンレイ勾配により
分離した。Ｔ細胞及びＢ細胞を、ノイラミダーゼで処理
した５ＲＢＣｉ用いるロゼツト形成法により分離し、Ｂ
細胞を得た。
（ｎ） ニジスタイン−バービールス（ＥＢＶ ）に
よるＢ細胞の感作： ＥＢｖ株ヲ、１０％牛脂児血清（Ｆ′Ｃ８）加ＲＰＭ１
１６４０培地中で生育しているＥＢＶ−形質転換モーモ
セット（ｍｏｒｍｏｓｅｔ ）細胞、Ｂ９５−８株の培
養物中で調製し、ビールスを含む上清を得、２回濾過し
た。Ｂ細＠を５ Ｘ １０’ｃｅｌＡ’／１００ ｐｌ
含有する懸濁液１００ ｐｉ中に、ビールス株を加え、
３７℃で１時間インキユヘートシた。次イテ、１０ ％
Ｆｅ２７１０ ＲＰＭ１１６４０培地８００μｌを加
えた。培地は３〜４日毎に加えた。形質転換したＢ細胞
は、感作後約２週間で見出された。このＢ、ｌ胞をＥＢ
Ｖ−ＳＵと称する。
よるＢ細胞の感作： ＥＢｖ株ヲ、１０％牛脂児血清（Ｆ′Ｃ８）加ＲＰＭ１
１６４０培地中で生育しているＥＢＶ−形質転換モーモ
セット（ｍｏｒｍｏｓｅｔ ）細胞、Ｂ９５−８株の培
養物中で調製し、ビールスを含む上清を得、２回濾過し
た。Ｂ細＠を５ Ｘ １０’ｃｅｌＡ’／１００ ｐｌ
含有する懸濁液１００ ｐｉ中に、ビールス株を加え、
３７℃で１時間インキユヘートシた。次イテ、１０ ％
Ｆｅ２７１０ ＲＰＭ１１６４０培地８００μｌを加
えた。培地は３〜４日毎に加えた。形質転換したＢ細胞
は、感作後約２週間で見出された。このＢ、ｌ胞をＥＢ
Ｖ−ＳＵと称する。
（＋ｉｉ） 親株、ＥＢＶ−形質転換Ｂリン・Ｑ芽細
胞（ＳＡ−１）のエメテン及びアクチノマイシンＤ処理
： ホモ接合性５Ａ−１細胞（ＨＬＡ−Ａ ２４ 、 Ｂ７
、Ｃ−、ＤＲ１、Ｄｗ １ ）を１０％ＦＣ８加ＲＰＭ
１１６４０培地中で培養した。この細胞をその増殖期に
おいて採取し、ＲＰＭＩ １６４０で３回（１０００ｒ
ｐｍ 、１０分間）洗浄し、１×１０６ｃｅｌｌｌ／ｒ
ｎｌ！の濃度に調整した。次いで５ Ｘ １０−５Ｍエ
メチン塩塩基塩び０．１μ？ ／ｍｌアクチノマイシン
Ｄを用い、３７℃で２時間処理した。
胞（ＳＡ−１）のエメテン及びアクチノマイシンＤ処理
： ホモ接合性５Ａ−１細胞（ＨＬＡ−Ａ ２４ 、 Ｂ７
、Ｃ−、ＤＲ１、Ｄｗ １ ）を１０％ＦＣ８加ＲＰＭ
１１６４０培地中で培養した。この細胞をその増殖期に
おいて採取し、ＲＰＭＩ １６４０で３回（１０００ｒ
ｐｍ 、１０分間）洗浄し、１×１０６ｃｅｌｌｌ／ｒ
ｎｌ！の濃度に調整した。次いで５ Ｘ １０−５Ｍエ
メチン塩塩基塩び０．１μ？ ／ｍｌアクチノマイシン
Ｄを用い、３７℃で２時間処理した。
こ−ｈらのエメチン及びアクナノマイ７ンＤｆｉ度にお
いて、５Ａ−１細胞の分裂増殖は完全に抑制された。遊
離のエメチン及びアクチノマイシンＤを完全に除去する
ため、この細胞をＲＰｆＶｉ１１６４０で３回洗浄し、
増殖抑制５Ａ−１を得た。
いて、５Ａ−１細胞の分裂増殖は完全に抑制された。遊
離のエメチン及びアクチノマイシンＤを完全に除去する
ため、この細胞をＲＰｆＶｉ１１６４０で３回洗浄し、
増殖抑制５Ａ−１を得た。
Ｇｙ） Ｍ胞融合技術及びハイブリッドの生育条件：
ＥＢＶ−８Ｕ’＆５［Ｌ、ＲＰ！’ｉ／ＩＩ １６４
０ ｆ３回洗浄した。この細胞をＲＰＭＩ １６４０に
懸濁さぜ、増殖抑制５Ａ−１とｌＯ：１の割合で混合し
た。
０ ｆ３回洗浄した。この細胞をＲＰＭＩ １６４０に
懸濁さぜ、増殖抑制５Ａ−１とｌＯ：１の割合で混合し
た。
１５ ％ ＤＭＳＯ−４１５％＆ ＩＪ ：ｒ−ｆＶ７
りＩＪ ：ｒ−ル（Ｐが１ｏｏｏ）の０．２５−を継続
的にスウイリング（ｓｗｉ ｌ ｉｎｇ ）させながら
１分間を要して加え、次いで予熱（３７℃）したＲＰＭ
１１６４０を１ｒｎｌ／分の割合で加えた。
りＩＪ ：ｒ−ル（Ｐが１ｏｏｏ）の０．２５−を継続
的にスウイリング（ｓｗｉ ｌ ｉｎｇ ）させながら
１分間を要して加え、次いで予熱（３７℃）したＲＰＭ
１１６４０を１ｒｎｌ／分の割合で加えた。
細胞を１０分間１０００ ｒｐｍで回転して固型化し、
増殖抑制ＳＡ −Ｉ ＭＵ胞が１ウェル当り５ Ｘ １
０’個となるようにｌＯ％ＦＣ８加ＲＰＭ１１６４０で
懸濁させ、ミクロチットル−トのウェルに分配した。培
地は２〜３日毎に加えた。
増殖抑制ＳＡ −Ｉ ＭＵ胞が１ウェル当り５ Ｘ １
０’個となるようにｌＯ％ＦＣ８加ＲＰＭ１１６４０で
懸濁させ、ミクロチットル−トのウェルに分配した。培
地は２〜３日毎に加えた。
（ｖ） ＨＬＡ抗原の検出及び融合細胞の選択；ハイ
プリドーマの表面ＨＬＡ −ＤＲ抗原を標準の微小リン
ＪＱ球障害試験（ｒｎｉ ｃｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏ
ｌｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔ）により検出し、１，４．８
を有する融合細胞の選択をおこなった。百方〇ＥＢＶ
−ＳＵ細胞から、ｆ（ＬＡ−ＤＲｌ 、 ４ 、８抗原
を有するハイプリドーマ２個を得た。更に、限界希釈法
により目的のハイプリドーマを得た。
プリドーマの表面ＨＬＡ −ＤＲ抗原を標準の微小リン
ＪＱ球障害試験（ｒｎｉ ｃｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏ
ｌｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔ）により検出し、１，４．８
を有する融合細胞の選択をおこなった。百方〇ＥＢＶ
−ＳＵ細胞から、ｆ（ＬＡ−ＤＲｌ 、 ４ 、８抗原
を有するハイプリドーマ２個を得た。更に、限界希釈法
により目的のハイプリドーマを得た。
（ｖｌ） イムノグロブリンの検定：ハイプリドーマ
培養液の上清を微小リン、ｅ球障害試験と免疫螢光法に
より調べた。すなわち、ハイプリドーマ培養上清−ｉ
ＰＢＬと種々の培養細胞系統を標的細胞として用いる標
準微小リンパ球障害試験法によシスクリーニングした。
培養液の上清を微小リン、ｅ球障害試験と免疫螢光法に
より調べた。すなわち、ハイプリドーマ培養上清−ｉ
ＰＢＬと種々の培養細胞系統を標的細胞として用いる標
準微小リンパ球障害試験法によシスクリーニングした。
細胞は、２ Ｘ １０’ Ｃｅ１ｌｓ ／−となるよう
調整された。この細胞１μｇを、テ２サキタイピングト
レーで３７℃、１時間培養された培養液上滑とともに培
養した。ウサギ血清（５μｇ、×２倍希釈）を補体源と
して加え、培養は室温下で２時間おこなった。細胞の生
存能をエオシン染料排除により調べた。反応は次の通り
評価した。
調整された。この細胞１μｇを、テ２サキタイピングト
レーで３７℃、１時間培養された培養液上滑とともに培
養した。ウサギ血清（５μｇ、×２倍希釈）を補体源と
して加え、培養は室温下で２時間おこなった。細胞の生
存能をエオシン染料排除により調べた。反応は次の通り
評価した。
評点 内 容
１ 陽性（０〜１０％死滅）
２ 弱陰性（１１〜２０％死滅）
４ 弱陽性（２１〜４０％死滅）
６ 陽性（４１〜８０％死滅）
８ 残湯性（８１〜１００％死滅）細胞表面の分析
は、ノ・イブリドーマ培養液上清と螢光物質結合ヤギ抗
ヒト Ｉｇ又はウサギ抗ヒトＩｇを用いる間接免疫螢光
法によりおこなった。
は、ノ・イブリドーマ培養液上清と螢光物質結合ヤギ抗
ヒト Ｉｇ又はウサギ抗ヒトＩｇを用いる間接免疫螢光
法によりおこなった。
（ｖｌ １ｇクラスの決定因子：
抗体のクラス決定因子の分析には、セファクリルＳ−３
００グル濾過フラクシヨンを用いる免疫螢光法を採用し
た。すなわち、ハイプリドーマ培養上清を１０倍に濃縮
し、次いでセファクリルＳ−３ｏ ｏグル濾過により分
画する。分画した試料は、第２の抗体としてウサギ抗ヒ
トＩｇ （ＩｇＭ又はＩｇＧ）を、第３の抗体として螢
光物質結合ヤギ抗ウサギＩｇ（ＩｇＭ又はＩｇＧ）を用
い、標的細胞の肺ガン細胞系統（ＱＧ５６）に対する間
接免疫螢光法により調べた。
００グル濾過フラクシヨンを用いる免疫螢光法を採用し
た。すなわち、ハイプリドーマ培養上清を１０倍に濃縮
し、次いでセファクリルＳ−３ｏ ｏグル濾過により分
画する。分画した試料は、第２の抗体としてウサギ抗ヒ
トＩｇ （ＩｇＭ又はＩｇＧ）を、第３の抗体として螢
光物質結合ヤギ抗ウサギＩｇ（ＩｇＭ又はＩｇＧ）を用
い、標的細胞の肺ガン細胞系統（ＱＧ５６）に対する間
接免疫螢光法により調べた。
ＱＪ 抗体分泌細胞の検出：
Ｉ ｇＭ又はＩｇＧ分泌細胞の検出には、プロティンＡ
結合５ＲＢＣ及び牟−特異的抗μ又は抗γ抗体を用いる
リバースプラーク検出法が採用された。
結合５ＲＢＣ及び牟−特異的抗μ又は抗γ抗体を用いる
リバースプラーク検出法が採用された。
１Ｉｘ） ５Ａ−ｘｌａＵ系ａ（親株）ｏ特性：ＥＢ
Ｖ−形質転換ヒト Ｂ １７ン・Ｑ芽細胞系統（ＳＡ）
がフィーダ一層としてＢＡＬＢ／Ｃネズミ胸腺細胞を用
いるクローニング（０，３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）により
選び出された。速やかに生長するクローンを選び出し、
これ２Ｓｈ−１と命名した。５Ａ−１細胞系統は、■請
−Ａ２４、Ｂ７、Ｃ−１ＤＲ１，Ｄｗｌを発現し、下記
第１表のＩｇＧを分泌した。
Ｖ−形質転換ヒト Ｂ １７ン・Ｑ芽細胞系統（ＳＡ）
がフィーダ一層としてＢＡＬＢ／Ｃネズミ胸腺細胞を用
いるクローニング（０，３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）により
選び出された。速やかに生長するクローンを選び出し、
これ２Ｓｈ−１と命名した。５Ａ−１細胞系統は、■請
−Ａ２４、Ｂ７、Ｃ−１ＤＲ１，Ｄｗｌを発現し、下記
第１表のＩｇＧを分泌した。
第 １ 表
（ｘ） ＳＵ血清の抗ＨＬＡ反応性のスクリーニング
：妊娠した供与者（ＳＵ ）の血清について、そのＨＬ
Ａ抗原に対する反応性を標準微小リン・Ｑ球障害試験法
によりスクリーニングした。この抗体は、８名の健常供
与者の９７７９球及びＥＢＶ形質転換ホモ接合タイピン
グ細胞に対し障害性であった。しかしながらこの抗体の
特異性は、下の第２表及び第３表に示す如く公知のＨＬ
Ａ−Ａ、ＢＸＣ又はＤＲ遺伝子座抗原のいずれとも相関
性がなかった。
：妊娠した供与者（ＳＵ ）の血清について、そのＨＬ
Ａ抗原に対する反応性を標準微小リン・Ｑ球障害試験法
によりスクリーニングした。この抗体は、８名の健常供
与者の９７７９球及びＥＢＶ形質転換ホモ接合タイピン
グ細胞に対し障害性であった。しかしながらこの抗体の
特異性は、下の第２表及び第３表に示す如く公知のＨＬ
Ａ−Ａ、ＢＸＣ又はＤＲ遺伝子座抗原のいずれとも相関
性がなかった。
ＣＸＤ ＥＢＶ −ＳＵ細胞系ａｔＤ特性：ＥＢＶ
−ＳＵ細胞系統は■請−Ａ ２．− ； ８ｗ４６．２
２；Ｃｗ７．−ＤＲ４，８を発現する。
−ＳＵ細胞系統は■請−Ａ ２．− ； ８ｗ４６．２
２；Ｃｗ７．−ＤＲ４，８を発現する。
この細ｌ泡系統は下の第４表の通りＩｇＭ及びＩｇＧを
分泌することが見出された。
分泌することが見出された。
第４表
（ｘｌｉｌ 種々の細胞及び細胞系統についての）・
イブリドーマ培養上清の検定： 増殖抑制５Ａ−１及びＥＢｖ−ＳＵから導かれたハイブ
リッド細胞（２２３）は■請−ＤＲ１゜４．８抗原を発
現する。このハイブリッド細胞（２２３）はクローン化
（ｌ Ｑ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）され、サブクローン
（２２３・１０・３３）が得られた。このサブクローン
（２２３・１０・３３）は補体依存性リン）Ｑ球障害性
抗体を産生じた。この抗体は、ヒトＢリン、Ｑ芽細胞系
統及びＥＢＶで活性化されたＢ芽細胞と反応性をＭして
いた。更に、肺ガン細胞系統（ＱＧ５６）及び胃ガン細
胞系統（ＫａｔｏｌＩＩ）とも反応性を有していた。こ
れに対し、この抗体は、通常のリン／Ｑｆｆｌ織、Ｔ芽
細胞、白血病Ｔ細胞、腫腸細胞（Ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃ
ｙｔｅｓ ） 、バーキットリン、Ｑ球及び白血病プレ
Ｂ細胞に対しては反応性がなかった（第５表及び第６表
）第５表 第６表 （ｘｉｉ）サブクローン（２２３・１０・３３）Ｉｇの
分析二 抗体クラスの特異性を免疫螢光法により判定した（第７
表）。サブクローン（２２３・１０・３３）はそのセフ
ァクリルＳ−３００デル濾過の分画からヒトＩｇＭを産
生することを見出した（第１図）。
イブリドーマ培養上清の検定： 増殖抑制５Ａ−１及びＥＢｖ−ＳＵから導かれたハイブ
リッド細胞（２２３）は■請−ＤＲ１゜４．８抗原を発
現する。このハイブリッド細胞（２２３）はクローン化
（ｌ Ｑ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）され、サブクローン
（２２３・１０・３３）が得られた。このサブクローン
（２２３・１０・３３）は補体依存性リン）Ｑ球障害性
抗体を産生じた。この抗体は、ヒトＢリン、Ｑ芽細胞系
統及びＥＢＶで活性化されたＢ芽細胞と反応性をＭして
いた。更に、肺ガン細胞系統（ＱＧ５６）及び胃ガン細
胞系統（ＫａｔｏｌＩＩ）とも反応性を有していた。こ
れに対し、この抗体は、通常のリン／Ｑｆｆｌ織、Ｔ芽
細胞、白血病Ｔ細胞、腫腸細胞（Ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃ
ｙｔｅｓ ） 、バーキットリン、Ｑ球及び白血病プレ
Ｂ細胞に対しては反応性がなかった（第５表及び第６表
）第５表 第６表 （ｘｉｉ）サブクローン（２２３・１０・３３）Ｉｇの
分析二 抗体クラスの特異性を免疫螢光法により判定した（第７
表）。サブクローン（２２３・１０・３３）はそのセフ
ァクリルＳ−３００デル濾過の分画からヒトＩｇＭを産
生することを見出した（第１図）。
第７表
（ｘｉｖ）サブクローン（２２３・１０・３３）の抗体
産生能： サブクローン（２２３・１０・３３）を、１０％ＦＣ８
，０，６％ヘベス、０．２％重炭酸ソーダ、１００単位
／ｍｌ！のヘニシリン、１００μｙ／ｍｔのストレプト
マイシンを添加したＲＰＭ１１６４０培地で３７℃、３
日間培養した。
産生能： サブクローン（２２３・１０・３３）を、１０％ＦＣ８
，０，６％ヘベス、０．２％重炭酸ソーダ、１００単位
／ｍｌ！のヘニシリン、１００μｙ／ｍｔのストレプト
マイシンを添加したＲＰＭ１１６４０培地で３７℃、３
日間培養した。
初発細胞濃度は１×１０５／−１最終細胞濃度は３〜４
Ｘ１０５／−とした。培地交換は３日毎に行なった。
４゜サブクローン（２２３
・１Ｏ−３３）により産生される抗体は、ＥＢＶ−形質
転換Ｂ細胞系列であるＢ８５を標的細胞とする微小リン
、Ｑ球細胞障害試験により定量した。抗体の力価は、標
的細胞の９０％以上が死滅する抗体溶液の最大希釈率で
表わした。
Ｘ１０５／−とした。培地交換は３日毎に行なった。
４゜サブクローン（２２３
・１Ｏ−３３）により産生される抗体は、ＥＢＶ−形質
転換Ｂ細胞系列であるＢ８５を標的細胞とする微小リン
、Ｑ球細胞障害試験により定量した。抗体の力価は、標
的細胞の９０％以上が死滅する抗体溶液の最大希釈率で
表わした。
サブクローン（２２３・１Ｏ−３３）は、下の第８表に
示すように長期間安定に抗体を産生した。
示すように長期間安定に抗体を産生した。
第８表
第１図はサブクローン（２２３＠１０・３３）の七フア
クリルＳ−３００グル濾過分画の２８０ｎＩｎの吸光度
及びＩｇに対する陽性率を示す図面である。 以上
クリルＳ−３００グル濾過分画の２８０ｎＩｎの吸光度
及びＩｇに対する陽性率を示す図面である。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、形質転換ヒト細胞を増殖抑制処理し、次いでこれを
ヒト抗体産生細胞と融合させることを特徴とするヒト−
ヒトハイブリドーマの製造法。 ２、形質転換ヒト細胞がウィルス感染によつて形質転換
されたものである特許請求の範囲第１項記載のヒト−ヒ
トハイブリドーマの製造法。 ３、ウィルスがエプスタイン−パーウィルスである特許
請求の範囲第２項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製
造法。 ４、形質転換ヒト細胞がヒトＢ細胞、ヒト肝細胞、ヒト
脾細胞、扁桃細胞およびヒトリンパ節細胞よりなる群か
ら選ばれたヒト細胞を形質転換させたものである特許請
求の範囲第１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造
法。 ５、形質転換ヒト細胞がヒトＢ細胞を形質転換させたも
のである特許請求の範囲第１項又は第４項記載のヒト−
ヒトハイブリドーマの製造法。 ６、形質転換ヒト細胞の細胞表面抗原であるＨＬＡがホ
モ接合性のものである特許請求の範囲第１項〜第５項の
いずれか１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造法
。 ７、形質転換ヒト細胞の細胞表面抗原であるＨＬＡがＤ
Ｒ１である特許請求の範囲第６項記載のヒト−ヒトハイ
ブリドーマの製造法。 ８、増殖抑制処理を薬剤処理によりおこなう特許請求の
範囲第１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造法。 ９、増殖抑制処理をエメチン及びアクチノマイシンＤの
薬剤処理によりおこなう特許請求の範囲第１項記載のヒ
ト−ヒトハイブリドーマの製造法。 １０、増殖抑制処理を形質転換ヒト細胞が７〜１０日で
完全に死滅する量の薬剤処理によりおこなう特許請求の
範囲第１項、８項、９項のいずれか１項記載のヒト−ヒ
トハイブリドーマの製造法。 １１、ヒト抗体産生細胞がヒトＢ細胞、ヒトプラズマ細
胞、ヒト脾細胞、ヒト肝細胞、ヒト胎児肝細胞、ヒトリ
ンパ節細胞及び培養ヒトＢ細胞よりなる群から選ばれた
細胞である特許請求の範囲第１項記載のヒト−ヒトハイ
ブリドーマの製造法。 １２、ヒト抗体産生細胞がヒトＢ細胞又は培養ヒトＢ細
胞である特許請求の範囲第１項又は第１１項記載のヒト
−ヒトハイブリドーマの製造法。 １３、ヒトＢ細胞が妊産婦由来のＢ細胞である特許請求
の範囲第１２項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造
法。 １４、ヒト抗体産生細胞が形質転換されたものである特
許請求の範囲第１項、１１項、１２項、１３項のいずれ
か１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造法。 １５、細胞融合がポリエチレングリコールを添加して行
なわれる特許請求の範囲第１項記載のヒト−ヒトハイブ
リドーマの製造法。 １６、細胞融合が、増殖抑制された形質転換ヒト細胞と
ヒト抗体産生細胞を１〜３０：１の割合で混合して行な
われる特許請求の範囲第１項又は第１５項記載のヒト−
ヒトハイブリドーマの製造法。 １７、細胞融合がＲＰＭＩ１６４０培地を用いて行なわ
れる特許請求の範囲第１項、１５項、１６項のいずれか
１項記載のヒト−ヒトハイブリドーマの製造法。 １８、形質転換ヒト細胞を増殖抑制処理し、次いでこれ
をヒト抗体産生細胞と融合させた後、抗ＨＬＡ抗体処理
により融合細胞を選択することを特徴とするヒト−ヒト
ハイブリドーマの製造法。 １９、形質転換ヒト細胞を増殖抑制処理し、次いでこれ
をヒト抗体産生細胞と融合させることによつて得られる
ヒト−ヒトハイブリドーマ。 ２０、形質転換ヒト細胞を増殖抑制処理し、次いでこれ
をヒト抗体産生細胞と融合させることによつて得られる
ヒト−ヒトハイブリドーマが産生するモノクローナル抗
体。 ２１、ヒトイムノグロプリンクラスがＩｇＭである特許
請求の範囲第２０項記載のモノクローナル抗体。 ２２、補体依存性リンパ球障害性である特許請求の範囲
第２０項又は第２１項記載のモノクローナル抗体。 ２３、形質転換Ｂ細胞系、肺ガン細胞系および胃ガン細
胞系に反応性があり、正常リンパ組織、白血病Ｔ細胞、
白血病Ｂ細胞に反応性がない特許請求の範囲第２０〜２
２項のいずれかの項記載のモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-70199 | 1986-03-28 | ||
| JP7019986 | 1986-03-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6317688A true JPS6317688A (ja) | 1988-01-25 |
| JP2640463B2 JP2640463B2 (ja) | 1997-08-13 |
Family
ID=13424603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62072767A Expired - Lifetime JP2640463B2 (ja) | 1986-03-28 | 1987-03-26 | ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4916072A (ja) |
| EP (1) | EP0239102A3 (ja) |
| JP (1) | JP2640463B2 (ja) |
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| WO2005017155A1 (ja) | 2003-06-18 | 2005-02-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | フコーストランスポーター |
| WO2006009241A1 (ja) | 2004-07-22 | 2006-01-26 | Eisai Co., Ltd. | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー |
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-
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- 1987-03-25 EP EP87104436A patent/EP0239102A3/en not_active Withdrawn
- 1987-03-26 JP JP62072767A patent/JP2640463B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-30 US US07/031,671 patent/US4916072A/en not_active Expired - Fee Related
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