JPH03204896A

JPH03204896A - インターフェロンレセプター細胞外断片

Info

Publication number: JPH03204896A
Application number: JP2236013A
Authority: JP
Inventors: Daniela Novick; ノビックダニエラ; Menachem Rubinstein; メナケム　ルビンスティン
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1989-09-07
Filing date: 1990-09-07
Publication date: 1991-09-06
Also published as: AU649406B2; US5221789A; CA2024767A1; AU6220690A; IL91562A0; ZA907110B; EP0416652A3; CA2024767C; EP0416652A2; US5578707A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、可溶性ヒトインターフェロンガンマ−（ここ
では工ＩＰＮ−７とする）レセプター細胞外断片及びそ
の塩、官能基誘導体、前駆体及びそれらの活性分画に関
する。本発明は、また人尿から該ヒトＩＦＮ−７レセプ
ター可溶性細胞外断片を得る工程、そのりａ−ニング及
び組換え体ＭＡ技術による生産に関する。本発明は、さ
らに、可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片、ま
たは塩、官能基誘導体、前駆体及びそれらの活性分画を
含む医薬組成物に関する。

インターフェロンガンマ−は、活性化され″ｒ−Ｔ−１
Ｊンパ球及び大型顆粒リンパ球（１ａｒｇθｇｒａｎｕ
ｌａｒ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）　ＶＣよって産生さ
れる１穐のリンホカインである。それは、抗ウィルス、
抗腫瘍性及び免疫調節作用を有し、臨床的潜在価値があ
る。しかし、その正の生物学活性とともに、ＩＮＦ−１
１ｔ工、好ましくない作用を誘発し、自己免疫疾患の発
現に関与していることが示された。このようにして、Ｉ
ＮＦ−７は、新たに診断された糖尿病の子供に存在し、
そして多発性筋炎の患者からの筋肉生検において存在し
ていた。ＩＮＦ−７は、多発性硬化症及び乾癖のような
自己免疫疾患悪化の原因となることも見出された。

それゆえ、内生的に過剰に生成した、または、外部から
与えられたＩＦＮ−γの好１しくない活性、または作用
な除去するか、またはそれらを打消す方法、特に自己免
疫過程の進展乞促進するその作用を阻止する方法を見出
すことが必要である。

同じ出願者による出願ム８６７４９／８７において、６
つの異なる型のヒトエＦトγレセプターが記ｗｔされに
０種々のレセプターが、異なる細胞から抽出後固定化工
ＰＨ−γカラム上でアブイニテイクロマトグラフイーな
行うことによって単離された。

レセプターは、工Ｆトγに結合することが示された。

それらは、更にＩＮＦ−７のある細胞への結合を、選択
的に防ぎ、他の細胞への結合は防がないポリクローナル
抗体を得る責めに、抗原としてマウスを免疫するｋめに
使用された。それらは、単独でまたは抗体、モして／ま
たにＩＦＮ−１とともに自己免疫疾患において、免疫抑
制剤としても使用されることがある。日本特許出願、ｒ
、２９６０３３／８９においては、ＩＮＦ−γのそのレ
セプターに対する結合を防ぎ、モしてＩＮＦ−７の生物
学的活性を阻害したヒトＩＦＮ−γレセプターに対する
モノクローナル抗体が明らかにされた。

ホルモン１にはサイトカインの活性を中和する効果的な
方法の１つは、細胞の外で、そのタンパク質に結合し、
その結性を遮断するレセプターの可溶性の形を提供する
ことである。全レセプターを使用することは必要ではな
い。ホルモンまたはサイトカイン、例えばレセプターの
細胞外可溶性断片の結合部位を含むレセプターの断片は
、その生物学的活性を効果的に遮断することができるで
あろう。

本発明は、ＩＮＦ−７の作用と拮抗し、天然の遮断薬と
して役立つところの、人尿から得られた可溶性ヒトＩＦ
Ｎ−γレセプター、細胞外断片、塩、官能基誘導体、前
駆体、及びそれらの活性分画を提供する。本発明はさら
に、タンパク性不純物を含まない高度に精製した形の該
細胞外断片、及びその精製の過程に関する。

本発明は、ヒトＩＦＮ−ｒレセプター可溶性細胞外断片
ｔコードするヌクレオチド配列からなる組換え体ＤＮＡ
分子、それらを含む発現ビークル、及びそれで形質転換
を受ける宿主細胞、及び該形質転換細胞を、適切な培地
で培養し、工ＩＮＮ−ｒレセプターの可溶性細胞外断片
ｔ１細胞または培養上清から収穫することによるヒトＩ
ＦＮ−γレセプター可溶断片を産生ずる工程にも向けら
れている。

本発明の可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片と
、塩、官能基誘導体、前駆体、及びそれらの活性分画は
、哺乳動物を、ＩＦＮ−７の好ましくない作用に対して
防衛するための医薬組成物として使用するためのもので
ある。

ＩＮＦ−γレセプターの可溶性細胞外断片は、人尿中に
見出される。実質的タンパク性不純物を含まない、はぼ
純粋に精製されにタンパク質は、非還元条件下で、５Ｄ
８−ＰＡＧＥによって分析されるとき、約４０にの分子
量をもっている。それは、逆相ＨＰＬＣ上で率−ビーク
として移動する。

ここにおいて用いられる意味では、′塩”といつ用語は
、タンパク質の分子のカルボキシル基の塩とアミノ基に
酸を付加した塩の両方を指している。ここで用いられる
意味での１官能基誘導体”は、残基上の開鎖として、ま
たはＮ−またはＣ−末端基上に存在する官能基から、こ
の分野の技術で知られている方法で調製することができ
る誘導体を網羅している。′前駆体′″は、あらかじめ
形成された、動物または人体中でＩＮＦ−γレセプター
断片へ転換される化合物である。はぼ完全に精製された
タンパク質の゛活性分画”は、該分画がＩＮＦ−７と結
合する能力があり、望ましくない作用を阻害すること馨
条件として、タンパク質分子のポリペプチド鎖のいかな
る断片や、前駆体単独、またに、例えば糖またはリン酸
残基まｋはタンパク分子の集合体のような、それらに関
連しに分子とそれらに結合しに残基を含めて、または糖
残基それ自体を網羅する。

本発明の好ましい態様においては、本発明の十分にＳ裂
した工’ＦＮ−γの可溶性細胞外断片は、ａ）人尿の透
析濃縮物からの粗タンパク質分画を回収すること：ｂ）段階（ａ）の該粗タンパク質をＩＮＦ−γ固定カヲ
ム、または抗−ＩＮＦ−７レセプターモノクローナル抗
体の固定化カラム上で、アフィニティークロマトグラフ
ィーによる精製を行うこと：そして、Ｃ）非還元条件下
の８ＤＥＩ　ＰＡＧＥｉ上で、約４０にの分子量乞もつ
、はぼ純粋に精製されたタンパク質を回収すること：からなる工程によりズ生産される。逆相ＨＰＬＣに適用
したとき、該タンパク質は、単一ピークとして移動する
。

好ましい１つの態様においては、段階（ａ）の粗タンパ
ク質の分画は、まず、例えばカルボキシメチルセフ　７
０−Ｘ　（ｃＭ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ）またはＤＩｌ！
ＡＩ−セルローズカラム上で、イオン交換クロマトグラ
フィーにかけられる。

もう１つの好ましい態様においてを工、固定化抗−ｘｐ
Ｎ−ルセゾターモノクローナル抗体のカラムから段階（
匂において得られた物質は、さらにそれｔ固定化工ＩＰ
Ｎ−７のカラムに適用することによって精製される。

本発明は、これによって本特許が制約を受けない、以下
の例によってさらに具体的に説明される。

例１：尿の濃縮物の調製健康な男性供与者からの２００１の尿の貯蔵物をボーア
サイズ０．４５μｍのＰ８１１１ＣＯｎ膜上で微細濾過
にかけた。濾液を分子量カットオフポイント１０Ｋにお
いて、ｐｅｌｌｉＱＯｎ膜を用いて限外濾過により、最
終容量５００−に濃縮した。濃縮物は、１ｍＭペンツア
ミドと０．１％ナトリウムアシドを含むリン酸バッファ
ー食塩水（ＰＢＸ）に対して透析された。

クエン酸、−５，０（バッファーＣ）で洗滌し、０．０
２％Ｎａｐ、　”＆含む１ＱｍＭクエン酸（ｐＨ５）（
バッファーＡ）で平衡させた。尿のタンパク質の濃縮物
を、バッフアームに対して透析し、遠心分離した。そし
て、上溝を、４℃でカラム上に適用した。カラムは、バ
ッファーＡで洗い、１ず２００ＭＮａｃｚ、　１　［３
ｍＭり−”１１１（ｐＨ５，０）及び０．０２％１ｉａ
Ｎ３　（バッファーＢ）を含む溶液で溶出し、そして次
に１５０−のバッファーＣで溶出した。５０−ずつの分
画を集め、ＩＮＦ−γ結合活性（”’Ｉ（ＦＮ−ｒの結
合〕について試験し、それらのタンパク質濃度を決定し
た。

ＤＩＡＩ−セルローズカラムを使用したとき、溶出は、
食塩（０−０，５Ｍ　）の濃度勾配または、ｐ）１７−
０のＩＱｍＭホスフェートバッファーｖｃオイて行われ
た。

ＣＭ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐａ
ａｌａ、　Ｘ　ｘ−デン）カチオン交換カラム（２，７
Ｘ１０ｃｍ）を前もって０−０２　％　ＮａＮ３　Ｙ含
む１Ｍ　Ｎａ（Ｊ　、　Ｉ　ＱｍＭチャイニーズハムス
ターの卵巣細胞からの組換え体重ＦＮ−ｒを３ｗ／−の
濃度とし、次ＫＯ，０２％ナトリウアシドを含むＰＢ８
で平衡させＡ　ｆｆ１ｇθ１１０　（０，５−に対し２
．５　ｗｅのビーズ）に結合させた。例１または２の尿
タンパク質の濃縮物を、ＩＮＦ−ｒ　Ａｆｆｉｇｅｌ　
−１０カラムに４℃で０，２−一分の流速で適用した。

ＰＢＥＩで洗った後、結合しπりｙ　／（’　り質は、
クエン酸（２５ｍＭ、ｐ）１２．５ンの溶液を用いて溶
出しく　２５ｍＭ、ｐＨ２，５）ｓそして直ちに中和し
た。

日本特許出願Ａ２９６０３３／８９ｒｃ、明らかにされ
た、１９８８年１１月１４日に受付は番号ムＣＮ（３Ｍ
ニー８１４の下にＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌｓｄｅ　ｃｕｘｔｕｒｅｓ　ｃｕｅ　Ｍｌｃｒｏｏ
ｒｇａｎｌｓｍａ、　Ｉ’ａｒ１Ｂ、Ｆｒａｎｃｅに寄
託された抗−ＩＮＦ−７レセプターモノクローナル抗体
Ａ１７７−１をアガａ−スーポリアクリルヒドラジド（
０，５−ビーズに対し４．５１１１１）に結合させた。

例１または２の尿タンパク質の濃縮物を４℃で０．２ｍ
＋７／分の流速で固定化抗体アがロースカラムに適用し
ｋ。ＰＢ８で洗滌した後、結合したタンパク質をクエン
酸（２５ｍＭｐＨ２，５）で溶出し、直ちに中和した。

例６・２において得られた材料（６６０Ｐｇ）をアがロ
ースに結合させた固定化インターフェロンｒ（１ｍ、２
．５１１Ｐの結合インターフェロンγを含む）上にのせ
た。カラムを工、ＰＢ８　（３５ｍ　）で洗滌し、結合
タンパク質は、次ｔｃｐ）１２の２５　ｍＭクエン散で
溶出した。溶出分画（１−ずつ）は、直ちにＩ　Ｍ　Ｈ
ｅｐｅｓで中和し、８ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析しに
０可溶インターフェロン−ｒレセプター（６２μｇ）の
大部分を含む分画２〜５を合体し、ＢＤＢを加え（最終
Ｉ＃度肌２優）、そして、試料は、ＹＭ　−Ｉ　Ｑ膜（
ｃｅｎｔｒｉｃＯｎ−１０＊ムｍ１ｃｏｎ　ＵＳＡ　）
上で最終容量１２５μＪで、全タンパク質量２０μｇに
濃縮した。この調製物の一部一足量（１６０ｎｇ）　Ｙ
　ＥＩＤ日−ＰＡＧＥで分析し、還元条件下で、Ｍｒ４
０．０００の主要な幅広いバンドを与えた（図１゜レー
ンＡ）。

例６・３（５μｇ）の可溶性インターフェロン−ｒレセ
プター断片の調製物を７０％蟻酸溶液とし、（ＪＪＢｒ
を最終濃度２０ｑ／−まで加えた。混合液を暗所で一夜
放置し、ＣＮＢｒと蟻酸の完全な除去ｔＴＭ実にするた
め、数回水を加えては凍結乾燥を繰返した。

凍結乾燥した材料は、還元条件下で、ＢＤＢ−ＰＡＧＴ
Ｂにかけた。デルは、次にＰＶＤＦ膜（工ｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ。

ＭｉｌｌｉｐＯｒｅ　Ｏ，４５ｐ　）上へエレクトロプ
ロットシ、ＭＯＯｅら（ＭＯＯＢら、　１９８８　、　
：ｒ、　Ｂｌｏｌ、　ｃｈｅｍ。

２６３．６００５−６００８）にしたがって、クーマシ
ーブルーで染色した。開裂したレセプターの別の１部一
定量（１μｇ）を、８Ｄ８−ＰＡＧＦｉと銀染色（第１
図、レーンＢ）によって分析した。見て分るように、分
子量が、３５０００．３００００゜２０．０００−２６
．０００及び１４．０００−１８．０００の４種の明確
なバンドが得られた。分子量２０．０００〜２６．００
０に相当するバンドを、ＰＶＤ？膜から切出し、ｙａｔ
ｓｕｄａｉｒａ　（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　。

Ｐ、、　１９８７．　：ｒ、　Ｂｌｏｌ、ｃｈｅｍ、、
　２６２．１００３５−１００３８）にしたがって、タ
ンパク質ミクロ配列決定を行い、ヒトインターフェロン
ガンマ−（Ａｇｕｅｔ、　）１ら、１９８８．Ｃｅ１１
．５５．２７３）（第２図、下線を引いた配列）の細胞
表面レセプターの５４−７０の位置に相当する主要アミ
ノ酸配列を示された。かくして、尿の可溶性インターフ
ェロン−ｒレセプター断片は、相当するＩＮＦ−７細胞
表面レセプターの一断片、として同定された。

（ＨＰＬＯ）逆相ＨＰＬＣ！　力９　Ａ　ＡｑｕａｐＯｒａ　ＲＰ　
３００　４．６　Ｘ３０１ＬＩ　（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　
Ｌａｂｓ　）　４．０．３％）リフルオロ酢酸水溶液（
ＴＰＡ）　（／’？ッ７７−１　）テ、フルオロレサミ
ン検知システムによって、安定な基線が得られる１で、
前もって洗滌した。段階３・１と６・２そして／または
３・３のアブニティーカラムから溶出された活性分画を
プールし、１回１．６−の部分をカラム上に注入した。

カラムは、フルオロメーターが、タンパク質を検知しな
くなるまで、バッファーＦで０．５　ｄ／分の流速で洗
滌した。

次に、カラムをバッファーＦ中のアセトニトリル０−２
０％の直線グレーデイエンドで、０．５−ｄ／分の速度
で５分間溶出し、続いて２０−９１：ｌのアセトニトリ
ルの直線グレーデイエンドで１２０分間溶出した。次に
カラムは、８０チアセトニトリルで１５分間洗滌した。

０．５−の分画を集め、タンパク質の含量と生物活性に
ついて試験した。

活性タンパク質は、単一タンパク質ピークとして溶出す
る。

６・６　溶出されたタンパク質のモニターリング各カラ
ムからの溶出タンパク質は、タンパク質含量、生物活性
（ＩＮＦγの抗ウィルス活性の中和〕、１２５ニー■Ｆ
Ｎ−７の固相フェーズラジオイムノアッセイ（Ｒ工Ａ）
におけるそのモノクローナル抗体に対する結合の阻害、
モノクローナル及びポリクローナル抗−ＩＮＦ−γレセ
プター抗体の２１抗体ＫＬ工８Ａにおける結合、ＩＮＦ
−７レセプターに対する抗体または不安定リガンド（１
２５エーエＩＦＮ−ｒ）でのウェスターンプロットによ
ってモニターした。

■ＩＦＮ−ｒレセプターに対するバイオアッセイは、■
ＦＮ−γの抗ウィルス活性の中和に基いている。

■ＰＮ−７に結合するタンパク質の存在について試験さ
れるべき試料は、１０優ウシ胎児血清（Ｈ１！１Ｍ−０
Ｂ）を含むイーグルの最小必須培地（ＭＫＭ）中で、連
続的［２倍希釈を行った。Ｗ工８Ｈ細胞（ＡＴＯＯｃａ
′Ｌ２５）乞９６穴の底の平なミクロタイタープレート
中に１００μｊ　ＭＫＭ−ＣＥ＋とともに接種した（　
２　Ｘ　１０’細胞／ウエル）。５０μｍ部分の連続的
に希釈したタンパク質を各ウェルに加え、細胞は、さら
に３７℃で２時間インキュベートした。工’ＦＮ−γ（
２単位／ｄ、５０μｊ）を加え、さらに３７℃で２４時
間インキュベートした。水痘性口内炎ウィルス（ｖｅａ
ｌｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　）
　Ｙ加え、さらに６７℃で２４時間インキュベートした
。細胞変性効果の程度は、クリスタルバイオレット染色
によって決定した。１中和率位は１単位のＩＰＮ−７を
中和するに足るタンパク質の量として定義される。工１
’Ｎ−ｒ　Ｇ　２３−９０１−５０３　（７）　Ｎｘａ
対照標品が、すべてのアッセイで使用された。

ＢＤＢ−ＰＭｋＨ（ナトリウムドデシルサル７エートポ
リアクリルアミド２ル電気泳動）による精製された調製
物の分析は、非還元条件下で行われ（第３図）、続いて
銀染色またはニトロセルローズシート上のエレクトロプ
ロッティングによって行われた。アブイニテイーカラム
１７：は逆相ＨＰＬＣ！から溶出してくる活性分画は、
ＢＤＢとβ−メルカゾトエタノールを含まないバッファ
ーを、濃度試料に３倍加え１２嘩アクリルアミドｒル上
にのせた。

第３図においては：レーン１：分子１マーカー（αラク
トアルデζン１４．１４に、大豆、トリズシンインヒビ
ター２０．１に、カルボニックアンヒドラーゼ３０に、
オボアルデミン４３に、ウシ血清アルプｉン６７に、そ
してホスホリラーゼｂ９４Ｋ　）：レーン２：固定化組
換え体ＩＮＦ−７カラムの溶出物（３００ｎｇ）ニレー
ｙ３：抗−ＩＰＮ−ｒレセプターモノクローナル抗体の
溶出物（２５０ｎｇ　）。デルを１６０ボルトで展開し
た。そして、タンパク質バンドは銀染色によって可視化
された。

レーン２で示されるように、精製されたＩＮＦ−γ断片
は、みかけの分子量４０Ｋをもった単一のバンドとして
移動した。抗−ＩＮＦ−γレセプターモノクローナル抗
体Ａ１７７−１０結合は、５Ｄ８−ＰＡＧＥの後、非還
元的条件で行い、ニトロセルローズ膜へのエレクトロプ
ロッティングは、実質上、ウェスターンプロッティング
法の通りに遂行された。

レーン４：固定化組換え体重ＦＮ−ｉカラムの溶出物（
６００ｎｇ　）　ｐレーン５：抗ＩＦＮ−ｒレセプター
モノクローナル抗体カラムの溶出物（９００ｎｇ）ｊレ
ーン６：組換え体インターロイキン−６（ｒｌＬ−６）
カラムの溶出物（１２［１０ｎｇ　）　（負の対照）；
レーン７：１４１：！−分子量マーカー。レーン４−７
は、オートジオグラフィーによって可視化された。

第６図、レーン２及び３に＃いてみられるように、分子
量４０に、５３Ｋ及び９３により太きり）分子量の２つ
のタンパク質に相当するタンパク質バンドの同様なパタ
ーンが、例３・１と例３・２の両方の７フイニテイカラ
ムの溶出液から得られた。ニトロセルロース膜へエレク
トロプロッティングしに後、両方の調製物における４０
にタンパク質のみが、抗−ＩＮＦゴレセプターモノクロ
ーナル抗体と特異的に反応した（第６図、レーン４と５
）。同シバンドは、１２５エーＩＦＮ−７とも特異的に
反応したが、そのシグナルは、微かであった（データは
示していない）。得られた結果から、４０Ｘタンパク質
がＩＮＦ−γレセゾタ−のりガント結合領域を含むＩＮ
Ｆ−γレセプター断片であると結論された。

発明の４０にタンパク質が、工Ｆトγレセプターの１断
片であるという確証は、さらに、２つの追加試験によっ
て得られた。例６・１の組換え体重ＰＮ−ｒカラムの溶
出物は、抗−ＩＮＦ−７モノクローナル抗体６〜３に対
する１２５１−工？Ｎ−７の固相Ｒエムにおける結合ｔ
１用量依存的に阻害した（第４図（その１））。同じ溶
出液は、モノクローナル及びポリクａ−ナル抗−ＩＮＦ
−７レセプター抗体に基いた２１抗体ＥＬ工ＥＪＡ　に
おいて特異的なシグナルを与えた（第４図（その２））
。

第４図（その１）は、固相［Ａにおけるそのモノクロー
ナル抗体に対する１２５■−ＩＮＦ−７の結合の例３・
１の、溶出液のｘｙ’ｐ−ｒ結合タンパク質による、阻
害を示している。種々の濃度の溶出液が、Ｎ０ＶｉＣｋ
ら＜　１９８３　）、Ｔｈｅ　ＦｉＭＢＯ、ＴＯｕｒｎ
ａｌ　。

７０１．２．Ａ９．ｐｐ、１５２７−１５３０に＃いて
明らかにされている５μｇ／−の抗−ＩＦＮ−１モノク
ロ一ナル抗体でコートされたＰｖＣミク０タイタープレ
ートに対するｘｚｓ工ｙトγ（２，５Ｘ　１０６ｃｐｍ
　／　ｐｇ　１０．００００ｐｌｎ　）の結合を阻害す
る能力について試験された。バックグラウンドの結合（
２００ｃｐｍ　）は、過剰の非標識工ｐＮ−１の存在に
おいて決定され、そしてすべての判定から差引かれた。

ヒト胎盤イムノアフイニテイによって精製したＩＮＦ−
γレセプター（８μｇ／ｍ）が、正の対照として使用さ
れ、８０％の阻害を与えに０尿からのりがンドアブイニ
テイで精製した工’ｒａ−６しセゾター（１０μｇ／−
）は、負の対照として使用され１０％の阻害を与えたに
過ぎなかった（参考文献：　Ｎ０Ｖｉ（！ｋ　Ｄ、ら、
Ｊ、工Ｎｐｕｅｓ、９．３）５（１９８９）ン。

第４図（その２）は、例６・１の溶出液のＩＮＦ−γ結
合タンパク質の２重抗体ＥＩ、工８ＡによるＩＦＮ−７
レセデターとしての特徴づけを示す。溶出液は、２重抗
体ＥＬ工８Ａによって抗−ＩＮＦ−γレセプター抗体に
対するその結合能力について試験した。

抗−■ＦＮ−γレセプターモノクローナル抗体ム１抗体
−１７７〜１ｇ／−）でコートされ、ＢＢＡで遮断され
ｒ９６穴のＲＬ工８人プレートを用い、種々の濃度の例
６・１のＩＮＦ−ｉカラム溶出液がインキュベートされ
、次にアブイニテイクロマトで精製したヒト胎盤工ＩＰ
Ｎ−７レセプターに対して調製されたウサギ抗−ＩＦＮ
−γレセプター血清、そして、次に西洋ワサビペルオキ
シダーゼに結合したヤ’Ｆ［−ウサギ抗体でインキュベ
ートした。プレートハ、次に洗滌し、ペルオキシダーゼ
の基質とインキュペ−）Ｌ、、ＫＬ工ＳＡリーダーによ
って測定した。イムノアフイニテイで精製したヒト胎盤
（０，５μｇ／−）からのＩＮＦ−γレセプターを陽性
対照として使用し、０．４５０．Ｄ、６００の値が得ら
れた。リガンドアブイニテイで精製した尿からの工Ｌ−
６レセプター（０，５μｇ／−）は負の対照として使用
し、０．０６　ｏ、Ｄ、　６００の値が得られた。

本発明の４０にタンパク質の工Ｆ’Ｎ−γレセプター断
片としての同定についてのさらに結論的な確証は、両分
子の配列の比較によって例６・４中に示されている。

子操作本発明は、さらにＩＮＦ−ｒレセプター可溶ヒト細胞外
断片をコードするヌクレオチド配列な含むＤＮＡ分子、
該ＤＮＡ分子を含む複製可能な発現ビークル、それで形
質転換された宿主、及びこのような形質転換宿主の発現
によって生産される可溶性ヒトＩＦＮ−７−レセノター
に関する。

ＩＮＦ−γ−レセプター可溶性細胞外断片のクローニン
グは異った複数の技術によって行うことができる。第１
の方法においては、ＩＮＦ−７レセプタ一断片をコード
するＣＤＮＡクローンが、（ｃＤＮＡライブラリーから
得られる。別の方法においては、全ヒトＩＦＮ−γレセ
プターをコードするＤＮＡがまず得られ、■ＦＮ−ｒレ
セプター断片ｔコードするＭＡ配列？得るために、知ら
れている技術で切断することである。１つの方法によれ
ば、Ｗ工８ＨやＨｅ１ａ細胞のよ５７ｚ、工？Ｎ−γレ
セプター産生細胞からｍＲＮＡが抽出され、ＣＤＮＡは
、逆転写酵素を使用して調製される。ＣＤＮＡは、可溶
性の細胞外断片配列のみを含むように切断され、次にラ
ムダ−ｇｔエエのような発現ベクターにりａ−ニングさ
れ、日本特許出願Ａ３６７４９／８７と、ム２９６０３
３／８９において明らかにされているＩＮＦ−γレセプ
ターに対する特異的抗体（ポリクローナル１にはモノク
ローナル）の使用によってスクリーニングされる。ラム
ダ−ｇｔ　１１発現ベクターは、β−がラクトシダーゼ
ターミネーションコドンから５３塩基上流の独特の１！
：ＯＯＲＯＲ工部刃いて、長さ７　ＫｂまでのＤＮＡの
挿入のために使用することができる。

それゆえ、ＤＮＡの外米配列は、この部位に挿入するこ
とができ、適切な条件下で融合タンパク質として発現す
ることができる。ラムダ−ｇｔ　１１発現ベクターは、
ここで概説されるように抗体プローブ（Ｄａｖｉｄ　Ｇ
ｌｏｖｓｒ　（編）　、　ＤＮＡ　ＣｌｏｎｉｎｇＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ、工ＲＬｐｒｅｓｓ　、　ｏｘｆｏｒｄ　
（１９８４）　ｐｐ、　４９−７８におけるＨｕｙｎｈ
　、　Ｔ、Ｖ、ら〕でスクリーニングにかけられるべき
ＣＤＮＡライブラリーの構築のために特に有用であるヶ別の方法によると、その配列が既知の配列、例えば工Ｉ
ＰＮ−γレセプターのＮ−末端アミノ酸配列に由来して
いる合成オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオ
チドの混合物が作られ、このオリゴヌクレオチドもしく
はオリゴヌクレオチドの混合物が、ＩＮＦ−γレセプタ
ーをコードするところの（ｃＤＮＡまたはデノムＤＮＡ
をクローニングするためのプローブとして使用される。

これらのＤＮＡ分子は、次にその可溶性細胞外断片ｔコ
ードするＤＮＡ配列を含むように切断され、本分野の技
術でよ（知られている技術によって適切に構築された発
現ベクター中に挿入される（前掲の引用書中Ｍａｎｉａ
ｔｉａらを参照）。全レセプターｔコードするＤＮＡ自
体適当に構築されたベクター中に挿入されることができ
、そうすれば、真核細胞を形質転換するのに使用するこ
とができ、その細胞は、発現後タンパク質を開裂して最
終産物として本発明の可溶性細胞外レセプター断片を与
えることができる。２重鎖ＣＤＮＡは、合成りＮＡリン
カ−またはプラント末端連結技術の使用を含めて、ホモ
ポリメリックティリング１ｒ＝はレストリクジョンリン
キングによってプラスミドベクターと連結される。

ＤＮＡ分子を連絡するために、ＤＮＡリガーゼが用いら
れ、望１しくない結合は、アルカリホスファターゼで処
理することによって避けられる。

望まれるタンパク質を発現することができるためには、
発現ベクターは、望まれるタンパク質をコードするＤＮ
Ａに、その遺伝子の発現とタンパク質の産生が許される
ようなやり方で連結された転写並に翻訳調節情報を含む
特異なヌクレオチド配列も含んでいるべきである。第１
＃Ｃ１遺伝子が転写されるためには、その上流に、ＲＮ
Ａポリメラーゼがそこに結合し、そうすることによって
転写の工程を開始するＲＮＡポリメラーゼによって認識
されるプロモーターが存在しなければならない。使用さ
れる様々な種類のこのようなプロモーターがあり、それ
ぞれ異った効率で作動する（強い及び弱いゾａモーター
ノ。それらは、原核細胞と真核細胞とで異なる。

本発明において用いることができるプロモーターは、例
えば、バクテリオファージラムダ−のト±プロモーター
　ｐＢＲ３２２のβ−２クタマーゼ遺伝子の１）ｌａデ
ａモーター及びｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子のＯＡＴプロモーター
などのような構底的箇たはバクテリオファージラムダ−
のメジャーライト及びレフトプロモーター（ＰＬとＰＲ
）　、Ｅ、ｃｏｌｉの雪、　ｒ８ｃＡ　、　１ａＯＺ　
、　竺ｃ　Ｉ　、　Ｏｍｐ　Ｆ及びμ５ゾａモアターま
たはｔｒａｐ−１ａｃハイブリツドプロモーターなどを
はじめとする原核細胞のプロモーターのような誘導可能
なプロモーターであっても工いｃＧｌｌｃｋ、　Ｂ、Ｒ
，（１９８７）　：ｒ、工ｎｄ０Ｍｉｃｒｏｌ＋ｉｏ１
゜１　：　２７７−２８２　）。

原核細胞において高水準の遺伝子発現を連取するために
は、多量のｍＲＮＡ　！：発生するために、強いプロモ
ーターを使用することの外に、ｍＲＮＡが効率的に翻訳
されることを確保するために、リポゾーム結合部位も使
用することが必要である。１つの例は、イニシェーショ
ンコドンから適切な位置にあり、１６８ＲＮＡの６７−
末端配列に対して、相補的なシャインーダルガルノ配列
（ＳＤ配列）である。

真核細胞の宿主については、宿主の性質に応じて異なっ
た転写及び翻訳調節配列が使用されることができる。そ
れらは、アデノウィルス、ウシパビα−マウイルス、シ
ミアンウィルスといった調節シグナルが、高水準の発現
ンもつ特殊な遺伝子と結びついているウィルスの源から
白米することができる。例をあげれば、ヘルペスウィル
スのＴＫ７°ｃ１モーター　８Ｖ　４　Ｑの初期プロモ
ーター酵母ｇａｌ　４遺伝子プロモーターなどがある。

遺伝子の発現が調整できるように抑制と活性化ができる
ようにする転写開始調節シグナルを選ぶことができる。

その上流にシグナルペプチドとのヌクレオチド配列及び
作動可能なように結合された転写及び翻訳遺伝子シグナ
ルが存在する本発明の全ヒトＩＦＮ−γレセプター、ま
たはＩＮＦ−ルセゾター可溶性細胞外断片をコードする
ヌクレオチド断片を含むＤＮＡ分子が、この望ましい遺
伝子配列を、宿主細胞染色体中に統合することができる
ベクターの中に挿入される。導入されたＤＮＡを、それ
らの染色体中に安定に統合された細胞は、発現ベクター
を含む宿主の選択ができるようにする１こ以上のマーカ
ーも導入することによって選抜することができる。マー
カーには、栄養要求性宿主に対して原栄養性を用意する
こともあれば、例えば抗性物質や銅のような重金属とい
ったバイオサイドに対する抵抗性を用意することもある
。選択を可能にするマーカー遺伝子は、発現されるべき
ＤＮＡ遺伝子＃Ｃ直接結合することもできるし、或は、
同じ細胞に同時トランスフェクションによって導入する
こともできる。１本鎖のタンパク質結合ｍＲＮＡの最適
合成のためには、ｆたさらに諸要素が必要となり得る。

これらの要素のなかには、スプライスシグナルならびに
転写プロモーター、エンハンサ−及びターミネーション
シグナルが含まれる。このような要素を組込んでいるＣ
ＤＮＡ発現ベクターは、ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，、（１
９８３）　ＭＯｌ−Ｃｏ１．Ｂ１０１．３：２８０によ
って記載されたベクターを含んでいる。

より好ましい１つの態様においては、導入されたＤＮＡ
分子は、受容体宿主において、自主的に複製することが
できるプラスミドかウィルスベクターに組込まれる。特
別なプラスミドまたはウィルスベクターを選ぶ際の重要
な因子には：ベクターを含む受容体細胞が認識され、そ
のベクターを含まない受容体細胞から選抜される容易さ
：特別な宿主においχ望まれるベクターのコピー数：そ
して、ベクターを異なる種の宿主細胞間に１シヤトル（
往復）″できることが望ましいかどうかが含まれる。

より好ましい原核細胞性ベクターには、例えば、ｐＢＲ
３３２，Ｃｏ１Ｍ１　、　ｐＢｃ　ｊ　Ｄ　１　、　ｐ
ＡＣＹｃ１８４において複製できるようなプラスミド；
ｐｃ１９４゜ｐｃ２２１．ｐＴ１２７など（Ｇｒｙｃｚ
ａｎ、　Ｔ、　、　ＴＭＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｌｌｌｌ、　Ａｃａｄｅ
ｍｔｃＰｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９８２）　、　ＰＩ）
、　３０７−３２９　）のようなりａｃｉｌｌｕｓのプ
ラスミド：ｐ工Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ、　Ｋ、Ｊ、
ら（１９８７）　：ｒ、　Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ。

１６９；４１７７−４１８３）をはじめとする放Ａｋａ
ｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ　、Ｂｕｄａｐｅｓｔ　、Ｈ
ｕｎｇａｒｙ（１９８６）、Ｉ）ｐ、４５−５４におけ
るＱｈａｔｅｒ。

Ｋ、Ｆ、ら）のよ５な放線菌バクテリオファージ、そし
てｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ８　（縁膜菌属）のシラスミド
（Ｊｏｈｎ、　Ｊ、Ｆ、、ら（１９８６）　Ｒｅｖ、工
ｎｆｅｏｔ、　ｐｉｅ。

８；６９３−７０４）、及び工ｚａｋｉ、　Ｋ、　（１
９７８）Ｊｐｎ、Ｊ、ＢａＣｔ６１ｒｉＯＬ　３３　ｙ
　７２９−７４２　）が含まれる。

より好ましい真核細胞性プラスミドの中には、ＢＶＰ、
７クシニア、５ｖ４０，２−ミクＱ７サークルなど、ま
たは、それらの誘導体が含まれる。

このようなプラスミドは、この分野の技術においては、
十分知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、（ｆ　９
８２　）　Ｍｉａｍｉｖｒｉｎｔ、　Ｓｙｍｐ、　１９
　：　２６５−２７４　；　Ｂｒｏａｃｈ　。

Ｃｏ１ｔｌ　　Ｓｐｒユｎｇ　　Ｈａｊ、１）Ｏｒ　　
ＬａｂＯｒａｔＯｒ７．　　ａｏｌｔｉ　　８ｐｒｉｎ
ｇａａｒｂｏｒ、　　ＮＹ、　　ｐｐ、　４４５−４７
０　（１９８１）　ｐＢｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、（１９
８２）０８１１２８　　：　　２０３−２０４　；　Ｂ
ｏｌｌｏｎ、　Ｄ、Ｐｏ、ら（１９８０）　Ｉ。

ｃｌｌｎ、ａｅｍａｔｏｌ、ｏｎｃｏｘ、　　１　０　
　：　　３９　−　４８　　；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅＢｓ、　ＮＹ、　　ｐｐ、　５６３−６［１８（１９
８０））。

ひと度、ベクターまたは構造体（単数または複数）を含
むＤＮＡ配列が発現のために用意されたならば、ＤＮＡ
′Ｉｍ造体（単数１には複数）は、以下の種々の適切な
手段のうちのいずれによっても、適切な宿主に導入され
てよい：すなわち、形質転換、トランスフェクション、
抱合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、プロトシラスト融
合、エレクトロボーレーション、リン酸カルシウム沈澱
、直接ミクロインジェクションなどである。

本発明に使用されるべき宿主細胞は、原核細胞性、真核
細胞性のいずれであってもよい。原核細胞の宿主には、
Ｋ　ｃｏｌｉ　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　、　Ｂｔｒｆ３
ｐｔＯｍ７ＱＥ３Ｂ。

Ｐ８θｕｄｏｍｏｎａｓ、　　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、
　５ｅｒｒａｔｉａなどのようなバクテリアが含１れる
。最も望ましい原核細胞宿主は、ｌｉ：、ｃｏｌｌであ
る。格別に興味あるバクテリアの宿主には、Ｅｉ、ｃｏ
ｌｉＫ１２　２９４株（ＡＴＣ！０３）４４６　）　、
　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７６　（ＡＴＯＣ３）５３７
）、ｕ旦月工ｖｒ３）１０（Ｆ−、ラムダ−１原栄養性
（ムＴＣＯ２７３２５）　）　、及びＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ　　ｔ７　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　　まｒｔ工　ｓｅｒ
ｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及び種々のＰｓ　ｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ種のような他の腸内細菌が含まれる。こ
のような条件下では、タンパク質がグルコシル化されな
いであろう。原核細胞性宿主は、発現プラスミド中のレ
プリコン及び調節配列と適合性がなければならない。

より好ましい真核性宿主は、それらが正しい折りＣ７，
−み、または正しい位置でのグリコジル化、またはその
全レセプター分子の細胞外断片への開裂を含むタンパク
質分子に対する翻訳後の修飾を提供するので、例えば、
ヒト、サル、マウス、チャイニーズハムスター卵巣（ｃ
Ｈり細胞である。また酵母及び昆虫の細胞は、グリコジ
ル化を含む翻訳後ベゾチド修飾を行うことができる。酵
母においてを工、望むタンパク質の生産に利用すること
ができる強力なゾロモーター配列、及びプラスミドのコ
ピー数が多いことを利用する多数の組換え体ＤＮＡの戦
略が存在する。酵母は、クローニングされた哨乳動物遺
伝子産物に関するリーダー配列を認識し、リーダー配列
（例えばプレーペテチドンヲ担っているベゾチドを分泌
する。

ベクターの導入後、宿主細胞は選択培地中において培養
される。この培地は、ベクターを含む細胞を、その生育
によって選択する。クローニングされた遺伝子配列の発
現の結果、望まれるヒト可溶性ＩＮＦ−ｒレセプター細
胞外断片の生産ができる。

発現されたタンパク質は、次に本特許出願中に記述され
ている精製法、または抽出、沈澱、クロマトグラフィー
、電気泳動といったものを含む他のいかなる従来の操作
手順によっても、単離精製される。

１月」Ｌζ里１」１ヒト可溶性工？Ｎ−γレセプター細胞外断片と塩、官能
基誘導体、前駆体及びそれらの活性分画は、例えば、内
生的に過剰のＩＮＦ−７が生氏されたり、または外から
投与され、悪性疾患や他の病気が誘発される場合の状１
ｉ！’に治療するためのように、哨乳動物において、Ｉ
ＮＦ−７の望ましくない作用に拮抗するために指示され
る。

本発明は、さらに、医薬として容認できる担体及びヒト
可溶性工ＩＦＮ−γレセプター細胞外断片または塩、官
能基誘導体、前駆体または、それらの活性分画を活性成
分として含む医薬組成物に関する。

これらの組成物は、内生工Ｆｌ！−γの過剰産生がある
いかなる状態においても使用することができる。

投与の方法は、同様な薬剤に対する容認できる投与法の
いずれによることもでき、治療すべき状態に依存する。

発明の医薬組成物は、投与のために該タンパク質または
その誘導体に、生理学的に容認できる担体、安定剤と賦
形剤と混合することによって調製され、そして、投与形
態において、例えば投与バイアル中に凍結乾燥すること
によって調製される。

投与されるべき活性化合物のｉは、投与経路、処理され
るべき病気及び患者の状態に依存する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、８ＤＳ−ＰＡＧＩＩ！！による分析結果を示
す写真である。第２図は、ヒトインターフェロンガンマの細胞長面レセ
プターの主要アミノ酸配列ヶ示す。第６図は、８ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真
である。第４図（その１）は組換え体ＩＮＦ−ｉカラムの溶出物
による結合阻害を示すグラフであり、第４図（その２）
は工ＩＰＮ−７カラム溶出物の結合能力乞示すグラフで
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）可溶性ヒトインターフェロソ−ガンマ−（ＩＦＮ
−γ）レセプター細胞外断片、その塩、官能基誘導体、
前駆体及びそれらの活性分画。
（２）十分に精製した形の特許請求の範囲第１項記載の
可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片。
（３）十分に精製したタンパク質であつて、非還元状態
で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによつて分析するとき、約４０Ｋ
の分子量をもつ特許請求の範囲第１項または第２項記載
の可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片。
（４）逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
上で単一ピークとして移動する特許請求の範囲第２項ま
たは第６項記載の可溶性ヒトＩＮＦ−γレセプター細胞
外断片。
（５）ＩＮＦ−γの生物活性を阻害する特許請求の範囲
第１項から第４項のいずれか１項記載の可溶性ヒトＩＮ
Ｆ−γレセプター細胞外断片、その塩、官能基誘導体、
前駆体、及びそれらの活性分画。
（６）以下のアミノ酸配列を含む特許請求の範囲第１項
から第５項のいずれか１項記載の可溶性ヒトＩＮＦ−γ
レセプター細胞外断片。ＭＰＱＶＰＶＦＴＶＥＶＫＮＹＧＶＫＮ
（７）（ａ）人尿の透析濃縮物から粗タンパク質分画を
回収し；（ｂ）段階（ａ）の該粗タンパク質分画を、固定化ＩＮ
Ｆ−γのカラム、または固定化抗−ＩＮＦ−γレセプタ
ーモノクローナル抗体のカラム上で、アフイニテイーク
ロマトグラフイーにかけ；そして、（ｃ）十分に精製し
た可溶性ＩＮＦ−γレセプター細胞外断片、そして、該
タンパク質は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
約４０Ｋの分子量をもつ、を回収するとからなる。十分精製した可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプターの細胞外
断片を生産する方法。
（８）段階（ａ）の粗タンパク質分画を、段階（ｂ）の
アフイニテイークロマトグラフイーにかける前にイオン
交換クロマトグラフイーにかける場合の特許請求の範囲
第７項記載の方法。
（９）段階（ｃ）の活性分画を、さらに逆相ＨＰＬに適
用する場合の特許請求の範囲第７項または第８項記載の
方法。
（１０）段階（ｃ）の固定化抗−ＩＦＮ−γレセプター
モノクローナル抗体カラムからの溶出物をさらに固定化
ＩＦＮ−γカラム上で精製する特許請求の範囲第７項ま
たは第８項記載の方法。
（１１）特許請求の範囲第７項から第１０項までのいず
れか１項記載の方法によつて製造される可溶性ヒトＩＦ
Ｎ−γレセプター細胞外断片。
（１２）組換え体タンパク質である特許請求の範囲第１
項による可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片。
（１３）許請求の範囲第１項の可溶性ヒトＩＦＮ−γレ
セプター細胞外断片をコードするヌクレオチド配列を含
むＤＮＡ分子。
（１４）特許請求の範囲第１３項のＤＮＡ分子を含み、
形質転換宿主細胞中で、特許請求の範囲第１項から第６
項のいずれか、項記載の可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプタ
ー細胞外断片を発現することができる複製可能な発現ビ
ークル。
（１５）特許請求の範囲第１４項記載の複製可能な発現
ビークルで形質転換された原核性、または真核性細胞か
ら選ばれた宿主細胞。
（１６）（ａ）特許請求の範囲第１５項記載の形質転換
宿主細胞を、適切な培地中で培養し、そして（ｂ）該可
溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片を単離する段
階を含む特許請求の範囲第１２項による組換え体、可溶
性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片を生産する方法
。
（１７）医薬的に容認し得る担体とともに、可溶性ＩＦ
Ｎ−γレセプター断片、またはその塩、官能基誘導体、
前駆体またはそれらの活性分画を活性成分として含む医
薬組成物。
（１８）可溶性ヒトＩＦＮ−γレセプター細胞外断片ま
たは塩、官能基誘導体、前駆体、または、それらの活性
分画の、特に自己免疫疾患におけるＩＦＮ−γの有害効
果に対して防御作用を示すための医薬的活性物質として
の使用。